KR20190024611A - 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물 및 그 제조 방법 - Google Patents
저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물 및 그 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조방법 및 상기 제조방법을 이용한 대두 단백 농축물과 이를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 출원은 저수분에서 가수분해되어 저분자 펩타이드의 함량이 높은 대두 단백 농축물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 동물 사료에는 단백질 원으로 어분이 포함되지만, 최근 어분 생산국 내의 어분 생산이 감소하거나 어분 수급이 불안정해짐에 따라 전 세계적으로 어분의 가격은 상승하고 있다. 이에 따라 어분을 대체하는 식물성 소재의 단백질원의 필요성이 증가하고 있으며 이를 개발하고자 하는 노력이 계속되어 왔다.
식물성 소재 단백질인 대두를 이용한 탈지 대두박은 단백질과 지방의 함량이 높은 대두로부터 유지를 추출한 후 남은 부산물이며, 상기 탈지 대두박으로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 대두 단백이 추출된다 (대한민국 등록특허 제 10-1612600호). 이러한 대두 단백은, 수용성 및 비수용성 탄수화물과 같은 비단백 성분을 탈지 대두박에서 제거하는 정도에 따라, 탈지 대두 가루 (defatted soy flour), 대두 단백 농축물 (soy protein concentrate), 조직 대두 단백 (structured soy protein), 가수분해 대두 단백질 (hydrolyzed soy protein) 또는 대두 단백 분리물 (soy protein isolate)의 대두 단백질 가공품으로 구분될 수 있다. 대두 단백은 단백질 함량이 높기 때문에, 육가공 식품, 우유 가공 식품, 빵이나 스낵류 식품 외에도, 가축 사료에도 활용될 수 있다.
하지만, 대두 단백은 대두 유래의 사포닌이 함유되어 있어 연어를 포함하는 어류 체내에서 염증반응을 일으켜 생장에 부정적인 영향을 미치는 문제점이 있다. 또한, 대두 단백은 단백질의 서브유닛들로 이루어진 분자량 1,000kDa이상의 고분자 단백질을 포함하고 있어 소화를 저해하는 다양한 항영양인자(anti-nutritional factor, ANF)를 다수 포함하고 있다. 이러한 항영양인자는 주로 식물성 소재의 단백질 내에 존재하며, 동물의 소화 능력을 저해시키는 요인으로 작용한다 (Li et al., J Anim. Sci., 68:1790,1990).
따라서, 대두 단백을 동물 사료에 사용하기 위해서는, 사료 소화율을 높일 수 있도록 항영양인자를 감소시키고, 고분자량의 단백질을 저분자량의 펩타이드로 전환시키는 연구가 필요하다.
한편, 현재 생산되고 있는 대두 단백 농축물 (soy protein concentrates), 대두 단백 분리물 (soy protein isolate) 또는 가수분해 대두 단백질 (hydrolized soy protein) 등과 같은 대두 단백질 가공품은 화학적 처리 또는 효소적 처리에 의하여 생산되고 있다. 하지만, 이러한 단백질 가공품의 생산을 위해 화학 물질이 첨가되거나, 효소 반응 조건에 관련된 공정이 추가되는 경우, 가공품의 품질이 변질되고 대두 단백 가수분해물을 생산하는데 소요되는 시간과 비용이 증가할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 종래의 대두 단백 가수분해물을 제조하는 방법은, 수용액 상태에서 효소를 첨가하는 단계를 포함하므로, 생성물을 건조하는 단계가 추가적으로 포함되어야 하는 단점이 있다. 또한, 신규 바실러스 균주를 이용하는 발효 대두 단백질의 제조방법은 예컨대, 대한민국 등록특허 제10-1139027호와 공개특허 제10-2015-0129238호에 공지되어 있다. 하지만, 상기 효소 가수분해법 또는 미생물 발효법은 모두 목적하는 저분자량의 대두 단백질을 수득하기 위해서 반드시 장시간과 고비용의 건조 공정이 추가로 수반된다는 문제점이 있다.
이 밖에도 관련 선행기술로서 미국 공개특허 US 12/811518가 있으나 이는 대두 (soy bean)에 열처리 후 단백질 분해 효소인 펩신, 판크레아틴 등을 사용하여 가수분해를 진행시키는 수단이, 그리고 미국 등록특허 US 06/227602는 콩과 식물(legumes)의 식용 단백질의 수율 개선을 위하여 브로멜린(bromelin)이나 파파인(papain) 함유 효소를 처리하는 방법이 개시되어 있고, 미국 등록특허 US 06/541208은 불가사리 트립신(DIT1)과 카르복시펩티다아제 B (carboxypeptidase B)를 처리하여 트립신 저해제를 분해하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 일본 등록특허 1994-170414 및 등록특허 2004-252174가 있으나, 이들은 각 수용액 상태에서의 대두 단백질의 가수분해 방법과 알칼리 프로테아제를 이용한 대두 트립신을 억제하는 가수분해를 통하여 식물성장 촉진제로 사용하는 방법을 개시하고 있을 뿐이다. 또한, 유산균(lactic acid bacteria)을 이용한 대두 단백질의 효소적 가수분해 방법이 공지되어 있으나, 본 출원 저수분 조건에서의 대두 단백질 농축물의 가수분해에 대하여는 개시하거나 암시하고 있지 않다 (Aguirre et al., Enzymatic hydrolysis of soybean protein using lactic acid bacteria, Food Chemistry 111(2008) 976-982). 따라서 저수분에서 가수분해된 저분자 펩타이드의 대두 단백 농축물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 대두 단백 농축물은 상기 선행기술 어디에도 개시되거나 암시된 바 없다.
본 출원의 명세서에는 다수의 특허문헌의 인용이 표시되고 설명되어 있다. 이러한 인용문헌에 개시된 기술내용은 그 전체로서 본 명세서를 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상의 기술자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 저분자 펩타이드의 함량이 높고 항영양인자의 함량이 적어 동물의 소화율을 향상시킬 수 있는 사료 원료로 활용 가능한 대두 단백 농축물을 제조함으로써 본 출원을 완성하였다.
Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990
Aguirre et al., Enzymatic hydrolysis of soybean protein using lactic acid bacteria, Food Chemistry 111(2008) 976-982
본 출원의 목적은 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
종래의 대두 단백 가수분해물을 제조하는 방법은 수용액 상태에서 효소를 첨가하고 생성물을 건조하는 단계를 추가적으로 포함하여 장시간과 고비용의 건조 공정이 수반된다는 문제점이 있다. 따라서 비용과 시간을 절감할 수 있는 고체 상태와 가까운 대두 단백 농축물의 가수분해물의 개발이 필요하게 되었다.
본 출원은 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 대두 단백 농축물을 준비하는 단계, 상기 단계에서 얻은 대두 단백 농축물의 수분 함량을 측정하는 단계, 상기 단계에서 측정된 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하는 단계, 상기 단계에서 수분 함량이 조절된 대두 단백 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계 및 상기 단계에서 가수분해된 대두 단백 농축물을 수득하는 단계를 포함하는, 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은, 공정단계를 최소화하면서도 가수분해 효율을 높일 수 있다. 따라서, 효소의 종류에 따른 반응 조건에 관련된 공정을 추가하지 않고도, 소화율이 향상된, 가수분해된 대두 단백 농축물을 매우 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 출원에 따른 상기 방법은, 고체인 대두 단백 농축물에 효소를 첨가하여 가수분해 반응을 진행시키는 단계를 포함하므로, 건조하는 단계를 추가적으로 포함하지 않더라도, 대두 단백 농축물의 가수분해 효율을 향상시킬 수 있다.
본 출원에 따른 상기 방법으로 가수분해된 대두 단백 농축물은, 가축의 소화율을 향상시킬 수 있도록 항영양인자의 함량은 적고, 저분자 펩타이드의 함량은 증가되어 있으므로, 사료의 단백질 원료로 적합한 특징을 갖는다.
본 출원에서 용어 "대두 단백 농축물"이란 대두에서 추출한 단백질의 농축물을 지칭한다. 대두에서 추출한 단백질은 콩에서 유기용매 핵산을 이용하여 콩기름을 추출한 후 남은 건더기인 탈지 대두에서 수용성 및 비수용성 탄수화물과 같은 비단백질을 제거한 것이다.
본 출원에서 용어 "가수분해"란 화학 반응시 물과 반응하여 원래 하나였던 큰 분자가 몇개의 이온이나 분자로 분해되는 반응으로 녹말의 알파 결합, 지방의 에스테르 결합, 단백질의 펩티드 결합의 분해에 적용된다.
본 출원에서 용어 "단백질 분해 효소"란 단백질 가수분해 효소를 지칭하고 아미노산 또는 펩티드 혼합물을 만드는 효소이다. 사용되는 효소의 종류로는 펩신(pepsin), 펩티데이즈(peptidase) 그리고 트립신(trypsin) 등이 있다.
본 출원에서 용어 "단백질 용해도"란 단백질이 물에 녹는 정도를 지칭하고 친수성인 아미노산이 표면에 많이 존재할수록 용매의 이온 그룹과 상호작용하여 단백질의 용해도를 증가시킨다.
일 실시예에 따르면 본 출원 대두 단백 농축물의 준비 단계는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 대두 단백은 동일한 품질을 유지할 수 있도록 동일한 지역에서 지속적으로 동일한 종류의 대두를 공급받아 이용하는 것이 바람직하다. 특히, 대두의 종류에 따른 단백질 함량의 차이는 최종 산물인 단백질 함량의 차이를 나타내고, 대두의 단백질 함량이 높을수록 가수분해된 대두 단백 농축물의 품질은 증가한다. 상기 대두 단백 농축물의 준비는 우선 대두 단백을 알코올로 수세하고 Hexane 등 유기용매를 사용하여 콩기름을 추출한 후, 남은 탈지 대두박에서 알코올을 추가로 더 첨가하여 단백 이외의 수용성 및 비수용성의 탄수화물과 같은 비단백 성분을 제거하여 수행할 수 있다.
본 출원의 일 실시 양태에 따르면, 대두 단백 농축물의 단백질 함량은 목적하는 최종 저분자 펩타이드의 종류, 양, 수용도, 용해도에 따라 준비단계에서 조절될 수 있다. 상기 단백질 함량 측정에는 질소 적정법이 이용되거나 킬달 기기가 이용될 수 있다. 상기 대두 단백 농축물의 단백질 함량은, 예를 들면, 50~70 중량 %을 포함할 수 있고 구체적으로는 55 내지 65 중량%, 58 내지 62 중량%를 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 일 실시 양태에 의하면, 대두 단백 농축물의 수분 함량은 용량적정법이나 전량적정법 등을 이용한 수분 측정기를 통하여 측정될 수 있다. 수분 함량이 조절되기 전 단계에서, 상기 대두 단백 농축물의 수분 함량은 5 내지 10%, 구체적으로는 6 내지 8% 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 대두 단백 농축물의 단백질 분해도 및 분자량 분포도를 측정하기 위하여 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)와 GPC(Gel Permeation Chromatography)가 사용될 수 있다. 가수분해 전 대두 단백 농축물은 30KDa 이상의 고분자 펩타이드를 70% 이상, 30KDa 이하의 저분자 펩타이드는 30% 이하 함유할 수 있다. 본 출원에서 펩타이드는 다양한 조합의 아미노산이 펩타이드 결합에 의한 중합물을 형성하고 있는 것으로, 일반적으로는 2 내지 50개의 아미노산이 결합되어 있는 형태를 지칭한다. 저분자 펩타이드는 분자량(Molecular Weight)이 작은 펩타이드로, 소화시 흡수를 용이하게 하여 동물 사료로 적용시 소화율을 증가시킬 수 있다는 장점이 있다. 최종적으로 제조하고자하는 목적의 가수분해물이 포함하는 저분자 펩타이드 종류와 구성비에 따라 상기 원료인 대두 단백 농축물의 수분함량, 단백질 함량 조건 등을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 출원 가수분해 전 대두 단백 농축물은 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 스타키오스(stachyose), 라피노스(raffinose)와 같은 수용성 당 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 출원의 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조방법은, 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 수분 함량은 대두 단백 농축물 총 중량을 기준으로 10 내지 40 중량%로 조절되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 수분 함량은 대두 단백 농축물 총 중량을 기준으로 10 내지 30 중량%, 10 내지 25 중량%, 10 내지 20 중량%, 10 내지 15 중량%로 조절되는 것일 수 있다.
대두 단백 가수분해물의 제조시 저수분 함량 조건을 사용할 경우 일반 액상에서 반응되는 단백질 가수분해와 달리 생산 공정에 있어서 추가로 대두 단백 농축물의 건조 단계를 거치치 않아도 되어 생산 소요 시간 및 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.
일 실시예에 따르면, 본 출원의 방법을 이용하여, 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물은 30 KDa 이하의 펩타이드를 30 내지 90% 이상 포함할 수 있다. 상기 30 KDa 이하의 펩타이드 함량은, 보다 구체적으로, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 50 내지 85%, 60 내지 90%, 60 내지 85%, 70 내지 90%, 70 내지 85%, 80 내지 90% 또는 80 내지 85% 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용되는 효소의 양이나 반응 시간 등에 따라 달라질 수 있다. 저분자 펩타이드의 함량이 높을수록 동물의 소화율을 향상시킬 수 있으므로, 본 출원의 방법을 이용하여 소화율이 향상된 대두 단백 농축물 및 이를 포함하는 사료 조성물을 제조할 수 있다.
본 출원의 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조방법은, 상기 수분 함량이 조절된 대두 단백 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계를 포함한다. 상기 첨가되는 단백질 분해 효소의 양은 대두 단백 농축물 총 중량을 기준으로 0.05 내지 0.5 중량% 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 첨가되는 단백질 분해 효소의 양은, 0.05 내지 0.35 중량%, 0.1 내지 0.35 중량%, 또는 0.2 내지 0.35 중량% 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 단백질 분해 효소는 화학적 효소 또는 미생물 유래를 포함하는 생물학적 효소, 구체적으로 바실러스 아밀로리퀴페시언스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리체니포미스 (Bacillus licheniformis) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물 유래의 효소일 수 있다. 단백질 분해 효소는 목적하는 가수분해된 대두 단백 농축물의 펩타이드 구성이나 함량에 따라 적절한 효소의 종류와 농도, 및 반응 시간을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 일 실시예에 의하면 본 출원 상기 가수분해는 30 내지 90 ℃에서, 보다 구체적으로 50 내지 85℃, 60 내지 80℃의 온도에서, 30 내지 300분 동안, 보다 구체적으로 100 내지 280분, 150 내지 250분, 180 내지 240분 동안 효소 반응을 수행할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 방법에 의해 제조된 대두 단백 가수분해물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다. 본 출원에 따른 사료 조성물 내 대두 단백 농축물의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 보다 구체적으로는 10 내지 90 중량%, 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 사료 조성물은 투여를 위해서 가수분해된 대두 단백 농축물 이외에 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
또한, 본 출원의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
본 출원의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 바람직하기로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다.
본 출원에 따른, 저수분에서 대두 단백 농축물을 제조하는 방법은, 공정 단계를 최소화하면서 가수분해 효율을 높일 수 있다. 또한 본 출원에 따른 방법으로 제조된 대두 단백 농축물은 저분자 펩타이드의 함량이 높고 항영양인자의 함량이 적으므로 동물의 소화율을 향상시킬 수 있어 사료 원료로 활용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
도 1 은 대두 단백 농축물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 2는 대두 단백 농축물의 TLC 결과를 나타내는 사진도이다.
도 3은 Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소를 이용한 수분 함량에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 4는 25 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 5는 15 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 6은 수분 함량 및 효소에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 7은 Bacillus subtilis 유래의 단백질 분해 효소를 이용한 수분 함량에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 8은 고온 조건에서 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 2는 대두 단백 농축물의 TLC 결과를 나타내는 사진도이다.
도 3은 Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소를 이용한 수분 함량에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 4는 25 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 5는 15 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 6은 수분 함량 및 효소에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 7은 Bacillus subtilis 유래의 단백질 분해 효소를 이용한 수분 함량에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 8은 고온 조건에서 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
이하 본 출원에 따른 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물 및 그 제조방법을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 출원의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 이하, 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
[실시예 1] 대두 단백 농축물의 준비
대두 단백을 알코올로 수세하여 대두 단백 이외의 성분들을 제거한 후, 단백질을 농축하여 대두 단백 농축물을 준비하였다.
[실시예 2] 대두 단백 농축물 분석
실시예 1에 따라 준비된 대두 단백 농축물의 수분 함량, 단백질 함량, 단백질의 분해도 및 분자량 분포도, 그리고 수용성 당 성분을 다음과 같이 분석하였다.
1) 대두 단백 농축물의 수분 및 단백질 함량 측정
실시예 1에 따라 준비된, 대두 단백 농축물의 수분 함량은 수분 측정기기를 이용하여 측정되었고, 단백질 함량은 킬달 기기를 이용하여 측정하였다.
표 1은 대두 단백 농축물의 조단백 및 수분 함량(%)의 4회 측정 결과를 나타내며, 측정 결과 본 발명 대두 단백 농축물은 수분을 6 내지 8% 함유하고 단백질은 약 60% 포함하는 것으로 나타났다.
| No. | 조단백(%) | 수분 (%) |
| 1 | 59.33 | 8.27 |
| 2 | 58.59 | 7.92 |
| 3 | 61.13 | 7.12 |
| 4 | 59.5 | 6.18 |
2) 대두 단백 농축물의 SDS-PAGE와 GPC를 통한 단백질의 분해도 및 분자량 분포도 측정
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 이용한 단백질의 분자량 분포도를 측정하기 위하여 대두 단백 농축물 100mg을 8M의 우레아 용매 5mL에 현탁(suspension)시키고 초음파 처리(sonication)한 후, 8000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액은 bicinchoninic acid로 정량하여 SDS-PAGE의 젤에 로딩하였다.
도 1은 대두 단백 농축물의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진도이다. 도 1을 참고하면, 2번 레인의 대두 단백 농축물은 20 내지 75 kDa 범위의 다양한 분자량의 서브유닛으로 이루어진 단백질을 포함하였다 (도 1, 레인 1: 바이오마커; 2 : 대두 단백 농축물). 대두 단백 농축물이 포함하고 있는 단백질은, 예를 들면 glycinin, β-conglycinin 등이 있다.
GPC(Gel Permeation Chromatography) 방법은 분자량이 서로 다른 표준 단백질을 분석하여 각각의 용출지연 시간(retention time)을 확인한 후, 분자량과 용출지연 시간 관계의 표준 곡선을 산출하고, 이에 따라 측정하고자 하는 시료 내의 단백질 분자량 분포도를 도출할 수 있는 방법이다. 보다 구체적으로는, 특정 분자량을 갖는 단백질의 용출지연 시간을 계산한 후, 그 시간에 따라 크로마토그램의 부분을 나누고, 전체 크로마토그램 면적 중 각 분자량 범위별 부분면적 비율을 계산하여 단백질 분자량 분포도를 도출할 수 있다. 이러한 GPC 방법을 이용한 대두 단백 농축물의 단백질의 분자량 분포도를 측정하기 위하여 대두 단백 농축물 100mg을 8M의 우레아 용매 5mL에 현탁(suspension)시키고 초음파 처리(sonication) 한 후, 8000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 다음, 상기 상등액을 0.45μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과한 후, 여과액을 GPC 방법으로 분석하였다.
| 분자량(kDa) | 단백분포도(%) |
| > 75 | 36.4 |
| 30 ~ 75 | 34.4 |
| 10 ~ 30 | 15.7 |
| 5~10 | 4.9 |
| <5 | 8.6 |
| Total | 100.0 |
상기 표 2는 GPC를 이용한 대두 단백 농축물의 단백질 분자량 분포도 측정 결과를 나타낸다. 표 2에 따르면, 대두 단백 농축물은 30KDa 이상의 단백질들을 70% 이상 포함하며 대부분 고분자 펩타이드로 구성되어 있음을 확인하였다.
3) 대두 단백 농축물의 TLC를 통한 수용성 당 성분 측정
TLC(Thin Layer Chromatography) 방법을 이용한 대두 단백 농축물 내 수용성 당의 정성 분석을 위하여, 대두 단백 농축물 1g을 증류수 25mL과 혼합하여 혼합액의 끓는 점에서 20분간 추출하였다. 상기 추출 과정 후 37°C에서 2시간 동안 180rpm의 교반 과정을 거쳐 수용성 당을 충분히 추출하였다. 수득한 추출액은 원심분리한 후 상등액으로부터 TLC를 통해 수용성 당 구성 성분을 확인하였다.
도 2는 대두 단백 농축물의 TLC 결과를 나타낸 사진도이다. 도 2를 참고하면, 대두 단백 농축물은 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 스타키오스(stachyose), 라피노스(raffinose) 와 같은 수용성 당 성분을 함유하였다 (도 2, 레인 1: 대조군; 2-6: 각 5종의 생산배치).
| 수용성 당 | 생산배치 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Glucose | 극소량검출 | 극소량검출 | 극소량검출 | 극소량검출 | 극소량검출 |
| Sucrose | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 |
| Stachyose | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 |
| Raffinose | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 | 검출 |
상기 표 3은, 대두 단백 농축물 (5종의 생산배치, 1 내지 5) 에서 확인된 수용성 당 성분을 나타낸 것이다. 상기 대두 단백 농축물은 글루코스, 수크로스, 스타키오스 및 라피노스는 포함하였으며, 특히 글루코스는 매우 적은 함량을 포함하였다.
[실시예 3] 대두 단백 농축물의 수분 함량 조절 및 단백질 분해 효소 첨가에 따른 단백질 가수분해도 측정
상기 실시예 1에서 수득한 대두 단백 농축물을 7개 실험군으로 준비하였다.
각 실험군의 대두 단백 농축물 내 수분을 측정한 후, 물을 첨가하여 수분 함량을 전체 중량 기준으로 각 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량% 및 40 중량%이 되도록 조절하였다. 각 실험군에는 Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소 (Prozyme AK)를 대두 단백 농축물 중량을 기준으로 0.35 중량% 첨가하였다. 상기 물과 단백질 분해 효소가 첨가된 대두 단백 농축물 실험군들은 4시간 동안 60℃ 에서 효소 반응을 유도하였다. 효소 반응이 완료된 상기 실험군들 내 단백질 분해도를 측정하기 위하여 20분 동안 100℃에서 열처리하여 효소 반응을 중단시켰다. 효소 반응이 중단된 각 실험군의 대두 단백 농축물은 건조되고 분쇄되어 수득되었다. 각 실험군 내 단백질의 분해도 및 분자량 분포는 실시예 2, 2)에 기재된 SDS-PAGE 및 GPC 방법으로 측정되었다.
도 3은 Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소를 이용한 수분 함량에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다. 도 3을 참고하면, 효소 반응시 수분 함량이 감소할수록 저분자 펩타이드가 증가하여 단백질 분해도는 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3, 레인 M: 바이오마커 ; 1: 대두 단백 농축물 원료 ; 2: 수분 40 중량% ; 3: 수분 35 중량% ; 4: 수분 30 중량% ; 5: 수분 25 중량% ; 6: 수분 20 중량% ; 7: 수분 15 중량% ; 8: 수분 10 중량%).
구체적으로, 수분 함량 40 중량%, 35 중량%, 30 중량% 의 고수분 조건의 가수분해물에서는 대두 단백 농축물을 구성하고 있는 기존의 고분자 단백질 서브유닛들(주로 30kDa 이상)이 비교적 선명하게 나타났다. 그러나 수분 25 중량% 조건에서 단백질 서브유닛들의 일부 고분자 밴드들이 사라지고 저분자 펩타이드의 밴드들이 강하게 나타나기 시작했으며, 수분 15 중량%, 10 중량% 조건의 가수분해물은 대부분 약 25kDa 이하의 단백질로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
| MW(kDa) | 수분 함량 | ||||||
| 40 중량% | 35 중량% |
30 중량% |
25 중량% |
20 중량% |
15 중량% |
10 중량% |
|
| >75 | 25.3 | 19.7 | 10.8 | 4.7 | 3.8 | 5.6 | 5.1 |
| 30~75 | 22.4 | 25.5 | 25.5 | 15.6 | 13.2 | 11.6 | 11.0 |
| 10~30 | 13.4 | 16.4 | 23.8 | 30.6 | 26.6 | 18.9 | 18.8 |
| 5~10 | 11.2 | 11.6 | 14.2 | 21.0 | 25.1 | 27.0 | 27.3 |
| <5 | 27.8 | 26.7 | 25.7 | 28.2 | 31.4 | 36.9 | 37.8 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
표 4는, 가수분해 전 수분 함량에 따른, 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 측정 결과를 나타낸 것이다. 표 4를 참고하면, 수분 함량이 감소함에 따라 75kDa 이상의 단백질 비율은 줄어들고, 저분자 펩타이드의 비율이 점차 증가하였다. 구체적으로, 대두 단백 가수분해물은 수분 25 중량% 조건에서 30kDa 이하의 저분자 펩타이드의 구성이 약 80%에 이르고, 이보다 수분 함량이 더 감소할수록 30kDa 이하의 저분자 펩타이드의 함량이 증가하였다.
즉, 수분 함량이 25% 이하로 조절된 대두 단백 농축물을 이용하여 가수분해를 수행하는 경우, 30kDa 이하의 저분자 펩타이드의 함량이 크게 증가하는 것이 확인되었고, 저수분 조건에서 가수분해를 진행하는 경우, 일반적으로 액상에서 반응되는 단백질 가수분해 반응과는 달리, 반응의 최종 산물이 고체이므로, 최종 산물을 건조하는 과정을 생략할 수 있고, 결과적으로는 가수분해물 제조에 소요되는 시간 및 비용을 감소시킬 수 있다.
[실시예 4] 대두 단백 농축 가수분해물의 효소 농도별 단백질 분해도 및 분자량 분포도 측정
동일한 수분 함량을 갖는 대두 단백 농축물 (전체 중량 대비 수분 함량 25 중량% 또는 15 중량%를 포함) 에 처리하는 효소 농도에 따른 단백질 분해도 및 분자량 분포도를 측정하였다.
단백질 분해도 및 분자량 분포도의 측정을 위해 실시예 3에서와 동일한 방법을 사용하였으며, 다만 수분 함량은 전체 중량 기준 25 중량% 또는 15 중량%로 조절하고, 단백질 분해 효소를 각각 농도 0.05 중량%, 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.35 중량% (대두 단백 농축물 중량 대비)로 처리한 후, 60°C에서 반응시켰다. 효소 반응은 1시간 단위로 4시간까지 반응시켰으며, 각 시간별, 효소 농도별 시료는 효소 반응이 끝난 후 100°C에서 20분 동안 가열하여 실활하였다. 이후 건조 및 분쇄를 통해 분석시료를 준비하였으며, 실시예 2, 2)에 기재된 SDS-PAGE와 GPC 방법으로 이들의 단백질 분해도 및 분자량 분포도를 측정하였다.
도 4는, 25 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다. 도 4를 참고하면, 수분을 25 중량% 포함하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도 및 반응 시간이 증가함에 따라 단백질 분해도도 증가하였다 (도 4, 레인 M: 바이오마커 ; 1: 대두 단백 농축물 원료 ; 2: 0.05 중량%, 1시간 ; 3: 0.05 중량%, 2시간 ; 4: 0.05 중량%, 3시간 ; 5: 0.05 중량%, 4시간 ; 6: 0.1 중량%, 1시간 ; 7: 0.1 중량%, 2시간 ; 8: 0.1 중량%, 3시간 ; 9: 0.1 중량%, 4시간; 10: 0.2 중량%, 1시간 ; 11: 0.2 중량%, 2시간 ; 12: 0.2 중량%, 3시간 ; 13: 0.2 중량%, 4시간 ; 14: 0.35 중량%, 1시간 ; 15: 0.35 중량%, 2시간 ; 16: 0.35 중량%, 3시간 ; 17: 0.35 중량%, 3시간)
표 5는, 25 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 측정 결과를 나타낸 것이다.
| MW(kDa) | 효소 0.05 중량% | 효소 0.1 중량% | ||||||
| 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | |
| >75 | 8.5 | 8.5 | 9.0 | 5.9 | 8.7 | 6.2 | 8.0 | 4.7 |
| 30~75 | 47.4 | 42.8 | 43.0 | 34.8 | 44.4 | 36.6 | 40.1 | 29.6 |
| 10~30 | 24.4 | 27.5 | 27.0 | 33.2 | 26.2 | 32.6 | 29.6 | 36.2 |
| 5~10 | 8.1 | 9.4 | 9.4 | 12.4 | 8.9 | 11.9 | 10.3 | 14.7 |
| <5 | 11.6 | 11.8 | 11.7 | 13.7 | 11.7 | 12.7 | 11.9 | 14.9 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| MW(kDa) | 효소 0.2 중량% | 효소 0.35 중량% | ||||||
| 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | |
| >75 | 5.7 | 3.4 | 2.9 | 3.0 | 2.2 | 2.4 | 2.2 | 2.3 |
| 30~75 | 37.2 | 25.3 | 22.7 | 21.3 | 18.3 | 17.3 | 16.3 | 14.7 |
| 10~30 | 32.7 | 38.2 | 38.3 | 37.5 | 35.6 | 35.4 | 33.8 | 29.3 |
| 5~10 | 11.8 | 17.0 | 18.4 | 19.2 | 23.4 | 22.8 | 23.8 | 26.0 |
| <5 | 12.7 | 16.1 | 17.7 | 19.0 | 20.5 | 22.1 | 23.9 | 27.8 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
표 5를 참고하면, 효소의 농도 또는 반응 시간이 증가할수록 고분자량의 단백질이 저분자량의 펩타이드로 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로는, 농도 0.1 중량% 의 효소가 사용된 경우, 30KDa 이하의 펩타이드 함량은 평균적으로 약 50% 이상이었으며, 0.2 중량%의 효소가 사용된 경우, 30KDa 이하의 펩타이드 함량은 평균적으로 약 70% 이상이었다. 또한, 0.35 중량%의 효소가 사용된 경우, 30KDa 이하의 펩타이드 함량은 평균적으로 약 80% 이상이었다.
도 5는 15 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 5를 참고하면, 수분을 15 중량% 포함하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도 및 반응 시간이 증가함에 따라 단백질 분해도도 증가하였다. (도 5, 레인 M: 바이오마커 ; 1: 0.05 중량%, 1시간 ; 2: 0.05 중량%, 2시간 ; 3: 0.05 중량%, 3시간 ; 4: 0.05 중량%, 4시간 ; 5: 0.1 중량%, 1시간 ; 6: 0.1 중량%, 2시간 ; 7: 0.1 중량%, 3시간 ; 8: 0.1 중량%, 4시간 ; 9: 0.2 중량%, 1시간 ; 10: 0.2 중량%, 2시간 ; 11: 0.2 중량%, 3시간 ; 12: 0.2 중량%, 4시간 ; 13: 0.35 중량%, 1시간 ; 14: 0.35 중량%, 2시간 ; 15: 0.35 중량%, 3시간 ; 16: 0.35 중량%, 3시간))
표 6은, 15 중량%의 수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 단백질 분해 효소의 농도와 시간에 따른 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 측정 결과를 나타낸 것이다.
| MW(kDa) | 효소 0.05 중량% | 효소 0.1 중량% | ||||||
| 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | |
| >75 | 2.5 | 2.2 | 2.2 | 2.6 | 2.4 | 2.5 | 2.3 | 2.9 |
| 30~75 | 14.9 | 16.1 | 15.0 | 14.9 | 14.8 | 14.2 | 13.7 | 12.4 |
| 10~30 | 26.4 | 31.5 | 27.7 | 26.2 | 27.3 | 25.0 | 23.0 | 20.5 |
| 5~10 | 27.9 | 25.9 | 27.7 | 27.8 | 27.8 | 28.7 | 29.3 | 30.1 |
| <5 | 28.4 | 24.3 | 27.4 | 28.5 | 27.7 | 29.6 | 31.7 | 34.1 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| MW(kDa) | 효소 0.2 중량% | 효소 0.35 중량% | ||||||
| 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | 1hr | 2hr | 3hr | 4hr | |
| >75 | 2.6 | 2.7 | 2.2 | 2.6 | 2.4 | 2.4 | 2.2 | 2.2 |
| 30~75 | 13.4 | 12.8 | 11.9 | 12.3 | 11.2 | 10.8 | 10.6 | 8.9 |
| 10~30 | 23.3 | 20.7 | 18.3 | 18.0 | 18.0 | 16.3 | 15.1 | 14.0 |
| 5~10 | 29.2 | 29.8 | 30.3 | 30.1 | 30.2 | 30.0 | 29.6 | 29.3 |
| <5 | 31.6 | 34.1 | 37.3 | 36.9 | 38.2 | 40.5 | 42.5 | 45.6 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
표 6을 참고하면, 효소의 농도 또는 반응 시간이 증가할수록 고분자량의 단백질이 저분자량의 펩타이드로 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 0.1 중량%의 효소가 사용된 경우 10KDa 이하의 펩타이드 함량은 평균적으로 약 60% 이상이었고, 0.35 중량% 효소가 사용된 경우 10 KDa 이하의 펩타이드 함량은 평균적으로 약 70% 이상이었다. 하지만, 30KDa 이하의 펩타이드 함량은 효소의 농도가 0.05 중량% 에서 0.35 중량%로 증가하더라도 크게 증가하지 않았으며, 평균적으로 약 82 내지 87% 이상이었다.
즉, 효소의 농도 및 반응 시간이 증가할수록 가수분해율이 증가할 뿐만 아니라, 대두 단백 농축물의 수분 함량이 감소할수록 가수분해율이 증가한다는 점을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 다양한 종 유래의 단백질 분해 효소를 사용한 단백질 분해도 측정
(1) Bacillus amyloliquefaciens 및 Bacillus licheniformis 유래 단백질 분해 효소
상기 실시예 1에서 수득한 대두 단백 농축물 내 수분을 측정한 후, 물을 첨가하여, 수분 함량을 전체 중량 기준으로 각각 15 중량%, 및 25 중량%으로 조절하였다. 각 실험군에는 Bacillus amyloliquefaciens 유래의 단백질 분해 효소 (비전바이오캠, Alphalase NP) 또는 Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소 (비전바이오캠, FoodPro Alkaline Protease)를 대두 단백 농축물 중량 기준으로 0.35 중량% 첨가하였다. 상기 물과 효소가 첨가된 대두 단백 농축물은 4시간 동안 60℃ 에서 효소 반응을 유도하였다. 효소 반응이 완료된 상기 실험군 내 단백질 분해 정도를 측정하기 위하여, 이들을 100℃에서 20분 동안 열처리하여 효소 반응을 중단시켰다. 각 실험군의 대두 단백 농축물은 건조되고 분쇄되었다. 각 실험군 내 단백질의 분해도 및 분자량 분포는 실시예 2, 2)에 기재된 SDS-PAGE 및 GPC 방법으로 측정되었다.
상기 효소가 처리된 대두 단백 농축물에 대한 SDS-PAGE (도 6) 및 GPC (표 7) 실험 결과 모두 수분 함량 25 중량%에서 가수분해하였을 때보다 수분 함량 15 중량%에서 가수분해 한 경우 저분자 펩타이드의 양이 많은 것으로 확인되었다 (도 6, 레인 M: 바이오마커 ; 1: 대두 단백 농축물 원료 ; 2: Bacillus amyloliquefaciens 유래의 단백질 분해 효소, 수분 25 중량% ; 3: Bacillus amyloliquefaciens 유래의 단백질 분해 효소, 수분 15 중량% ; 4: Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소, 수분 25 중량% ; 5: Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소, 수분 15 중량%)). 구체적으로, 도 6에 따르면 수분 함량 15 중량%의 3, 5 레인에서는 기존의 고분자 펩타이드 밴드가 희미해진 반면 저분자 펩타이드 밴드가 강해졌다. 또한, 상기 두 효소를 처리한 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 실험 결과가 기재된 표 7에 따르면, 30kDa 이하의 저분자 펩타이드 구성비는 Bacillus amyloliquefaciens 유래의 단백질 분해 효소를 사용한 경우 수분 25 중량 %와 15 중량%에서 각 33.9%와 68.1%를 보였고, Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소를 사용한 경우 수분 25 중량 %와 15 중량%에서 각 69.1%와 83.6%를 보였다. 즉, 저수분 함량을 갖는 대두 단백 농축물을 가수분해함에 있어서, Bacillus amyloliquefaciens 및 Bacillus licheniformis 유래 단백질 분해 효소를 이용하였을 때, 대두 단백 농축물의 분해도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
| MW(kDa) | Bacillus amyloliquefaciens 유래의 단백질 분해 효소 | Bacillus licheniformis 유래의 단백질 분해 효소 | ||
| 수분 함량 25중량% |
수분 함량 15 중량% | 수분 함량 25 중량% |
수분 함량 15 중량% | |
| >75 | 22.9 | 8.6 | 6.0 | 4.2 |
| 30~75 | 43.2 | 23.3 | 24.8 | 12.2 |
| 10~30 | 15.6 | 31.7 | 32.9 | 16.4 |
| 5~10 | 5.6 | 16.7 | 15.8 | 26.9 |
| <5 | 12.7 | 19.7 | 20.4 | 40.3 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
(2) Bacillus subtilis 유래 단백질 분해 효소
상기 실시예 1에서 수득한 대두 단백 농축물 내 수분을 측정한 후, 물을 첨가하여 수분 함량을 전체 중량 기준으로 각각 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량% 및 40 중량%으로 조절하였다. 각 실험군에는 Bacillus subtilis 유래의 단백질 분해 효소 (베네솔, Alkaline protease)를 대두 단백 농축물 중량 기준으로 0.35 중량% 첨가하였다. 상기 물과 효소가 첨가된 대두 단백 농축물은 4시간 동안 45℃ 에 두어 효소 반응을 유도하였다. 다음, 효소 반응이 완료된 상기 실험군 내 단백질 분해 정도를 측정하기 위하여, 이들을 100℃에서 20분 동안 열처리하여 효소 반응을 중단시켰다. 각 실험군의 대두 단백 농축물은 건조되고 분쇄되었다. 각 실험군 내 단백질의 분자량 분포는, 실시예 2, 2)에 기재된 SDS-PAGE 및 GPC 방법으로 측정되었다.
측정 결과, 상기 효소를 이용하여 가수분해하였을 때, 대두 단백 농축물 내 수분 함량이 감소할수록 저분자 펩타이드의 양이 많아졌으며, 특히 수분 함량이 20 중량% 이하, 구체적으로는 15 중량% 이하에서 저분자 펩타이드의 양이 특히 많은 것을 확인할 수 있었다 (도 7, 레인 M: 바이오마커 ; 1: 수분 40 중량% ; 2: 수분 35 중량% ; 3: 수분 30 중량% ; 4: 수분 25 중량% ; 5: 수분 20 중량% ; 6: 수분 15 중량% ; 7: 수분 10 중량%).
표 8은, Bacillus subtilis 유래의 단백질 분해 효소를 사용한 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 측정 결과를 나타낸 것이다.
| MW(kDa) | 수분 40% | 수분 35% | 수분 30% | 수분 25% | 수분 20% | 수분 15% | 수분 10% |
| >75 | 18.1 | 22.7 | 18.6 | 18.2 | 6.7 | 5.2 | 5.1 |
| 30~75 | 36.4 | 39.7 | 42.8 | 44.3 | 28.9 | 17.0 | 15.6 |
| 10~30 | 19.6 | 16.5 | 18.9 | 19.3 | 35.7 | 32.0 | 29.3 |
| 5~10 | 9.8 | 7.3 | 7.2 | 6.8 | 14.1 | 22.0 | 23.4 |
| <5 | 16.1 | 13.8 | 12.4 | 11.4 | 14.6 | 23.9 | 26.6 |
| Total | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
표 8을 참고하면, 수분 함량 10 내지 20 중량%인 대두 단백 농축물을 가수분해한 경우, 30kDa 이하의 저분자 펩타이드의 함량이 약 64 내지 약 80% 였다. 즉, 저수분 함량을 갖는 대두 단백 농축물을 가수분해함에 있어서, Bacillus subtilis 유래 단백질 분해 효소를 이용하더라도 단백질 분해도가 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 고온에서의 대두 단백 농축물 가수분해물 제조
효소 반응 온도가 80℃ 인 경우, 대두 단백 농축물의 가수분해 수준을 확인하였다. 수분을 10 중량% 함유하는 대두 단백 농축물에 Bacillus licheniformis 유래 효소 (Prozyme AK) 0.2% (원료 중량 比)를 처리하여 4시간 동안 80℃ 에서 효소 반응을 진행하였다. 효소 반응이 완료된 시료는 실시예 2, 2)에 기재된 방법으로 SDS-PAGE 와 GPC를 통해 단백질의 분해도 및 분자량 분포도를 확인하였다.
도 8은 고온 조건에서 대두 단백 농축 가수분해물의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진도이다.
도 8을 참고하면, 80℃의 고온 조건에서도 대두 단백 농축물이 가수분해되어 저분자 펩타이드의 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. (도 8, 레인 M: 바이오마커 ; 1. 대두 단백 농축물 원료 ; 2. 효소 반응물)
표 9는 고온 조건에서 대두 단백 농축 가수분해물의 GPC 결과를 나타낸 것이다.
표 9를 참고하면, 30kDa 이하 저분자 펩타이드의 함량이 약 84.2%로 높은 수준임을 확인할 수 있었다. 따라서 저수분을 함유하는 대두 단백 농축물을 가수분해함에 있어서, 효소 반응이 80 ℃ 수준의 고온에서 수행되더라도 저분자 펩타이드 함량이 높은 대두 단백 농축물의 가수분해물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
| MW(kDa) | 수분 10 중량% |
| >75 | 5.1 |
| 30~75 | 10.8 |
| 10~30 | 18.6 |
| 5~10 | 30.7 |
| <5 | 34.9 |
| Total | 100.0 |
Claims (10)
- 대두 단백 농축물을 준비하는 단계;
상기 단계에서 얻은 대두 단백 농축물의 수분 함량을 측정하는 단계;
상기 단계에서 측정된 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하는 단계;
상기 단계에서 수분 함량이 조절된 대두 단백 농축물에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계; 및
상기 단계에서 가수분해된 대두 단백 농축물을 수득하는 단계;
를 포함하는 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 상기 대두 단백 농축물의 수분 함량을 조절하는 단계의 수분 함량은 대두 단백 농축물 총 중량 기준 10 내지 40 중량% 로 조절하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 가수분해된 대두 단백 농축물은 30 KDa 이하의 펩타이드를 30% 내지 90% 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소의 첨가는 대두 단백 농축물 총 중량 기준 0.05 % 내지 0.5 % 를 첨가하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis 및 Bacillus subtilis 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 미생물 유래의 효소인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대두 단백 농축물을 가수분해하는 단계는 30℃ 내지 90 ℃에서, 30분 내지 300분 동안 효소 반응하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대두 단백 농축물을 준비하는 단계는
단백질 함량이 50 내지 70 중량% 이고, 글루코스, 수크로스, 스타키오스, 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 당을 포함하는 대두 단백 농축물을 준비하는 것인 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 저수분에서 가수분해된 대두 단백 농축물.
- 제8항의 가수분해된 대두 단백 농축물은 30 KDa 이하의 펩타이드를 30% 내지 90% 포함하는 것인 대두 단백 농축물.
- 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항의 대두 단백 농축물을 포함하는 사료 조성물.
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