KR20210092890A - 꽃게 단백질 유래 항산화 기능성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화 효능의 기능성 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내며 세포에 대한 독성이 없어 항산화용 사료 첨가제 조성물 등으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

꽃게 단백질 유래 항산화 기능성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법{Pet Food Additive Composition Comprising Antioxidant Functional Peptides Derived from Protein of Crab and Method of production Thereof}

본 발명은 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 기능성 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 꽃게(Ovalipes punctatus)의 단백질을 가수분해 공정을 통하여 최적화하고, 가수분해하여 수득한 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 함유하는 항산화 효능을 나타내는 기능성 사료 첨가제 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

애완동물(愛玩動物, pet) 또는 반려동물(伴侶動物, companion animal)은 인간이 주로 즐거움을 위해 사육하는 동물을 말한다. 오늘날에는 애완동물을 인간의 즐거움을 위한 소유물이 아니라, 반려자(친구)로서 대우하자는 의미에서 '반려동물' 이란 표현이 점점 대중화되고 있다.

한국 반려동물 산업이 급성장하면서 그 덕을 톡톡히 보고 있는 곳이 사료 업계다. 반려동물 펫푸드 시장이 1조원짜리 블루오션으로 떠오르면서 기존 사료 업체는 물론 일반 식품 업체들도 전담 부서를 편성하고 전용 공장을 증설하는 등 대규모 투자에 나서고 있다. 양적으로만이 아니라 질적인 성장도 이어지고 있다. 오메가3, 홍삼 등 사람 몸에 좋다는 온갖 재료들이 반려동물 사료 원료로 이용되기 시작했다. 사료 등급도 고급화되고 있다. 전체 사료 원료의 95% 이상(미국 농무부 기준)이 유기농인 ‘오가닉(organic)’, 반려동물을 위해 전방위적으로 신경 썼다는 뜻의 ‘홀리스틱’, 사람이 먹을 수 있을 만큼 안전하다는 ‘휴먼그레이드’ 등이 있다. 다만 홀리스틱, 휴먼그레이드는 공식 기준이 아닌 업계에서 사용하는 마케팅 용어인 만큼 소비자들은 미 농무부 인증을 받은 오가닉 사료를 가장 높은 등급으로 인식하고 있다. 비만 또는 피부가 약한 반려동물이 먹을 수 있는 처방식 사료와 곡물에 알레르기 반응을 보이는 반려동물을 위한 ‘그레인 프리(grain free)’ 사료 등은 또 다른 틈새시장이다.

깨다시 꽃게는 학명이 Ovalipes punctatus (De Haan, 1833)로 꽃게과(Portunidae)에 속한다. 서해 남부, 남해, 동해 및 제주도 해역에 분포하며, 수심 10~350m의 모래나 모래진흙 또는 조개껍데기 바닥에 서식한다. 몸은 전체적으로 옅은 갈색 바탕에 자갈색의 점들이 촘촘히 있고 갑각 중앙에 넓은 H자모양의 흰무늬가 있다. 이마에는 4개의 작은 이가 있고, 갑각의 앞옆 가장자리에는 5개의 뚜렷한 이가 있다. 포란기는 5월경이며, 조에아유생 5기를 거친다. 최대 갑각나비는 90mm 정도이다.

대부분의 꽃게는 가공되지 않은 상태로 찜 또는 찜육 등 반가공 형태로 상업화하고 있다. 하지만 최근에 블루 게 또는 머드 게 등으로부터 기능성 펩타이드 생산 및 특성을 밝히는 연구가 진행되어 오고 있다. 머드 게로부터 두 가지 종류의 항균활성 펩타이드의 분리 및 특성 연구가 발표되었다. 스노우 게의 가수분해물에서는 항암효과가 있는 분자량 228, 241, 291, 536 Da 펩타이드가 발표되었다. 대서양 바위게의 효소 가수분해물에서는 항균작용이 있는 펩타이드들이 분리 동정되었는데 분자량은 200에서 750 Da이었다. 아미노산들의 구성은 주로 lysine, leucine, arginine, aspartic acid, glutamic acid 로 이루어 졌다고 보고되었다. 블루 게에서도 역시 분자량이 3.7 kDa인 항균 펩타이드의 분리 및 특성에 대한 연구가 발표되었다.

따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 항산화 효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.

이러한 항산화 효과가 있는 물질로서는 대한민국 등록특허 제10-1703411호에서는 항산화 활성이 우수하고 관능미가 우수한 홍게 자숙액을 유효성분으로 포함하는 소스 조성물을 개시하고 있다.

이에 본 발명자들은 천연물질로서 인체에 안전하면서도 항산화 효과가 우수한 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 깨다시 꽃게 단백질의 효소종류에 따른 가수분해물들이 항산화 효과가 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 전혀 없다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1703411 B1, 2017년 01월 31일

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 꽃게(Ovalipes punctatus) 단백질의 효소 종류에 따른 가수분해물들의 항산화 활성을 평가하고, 최적 생산 공정을 통한 꽃게 단백질 유래 펩타이드 제조방법 및 천연 식용물질로서 안전하고 항산화 효과가 우수한 사료 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 (a) 꽃게의 껍질을 벗기지 않고 그대로 분쇄하여 슬러리 형태로 제조하는 단계, 및 (b) 상기 꽃게 슬러리에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 상기 제조방법에 의하여 제조된 것을 특징으로 하는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에서, "사료"란 '「축산법」에 따른 가축이나 그 밖에 농림축산식품부장관이 정하여 고시하는 동물·어류 등(이하 “동물 등”이라 한다)에 영양이 되거나 그 건강유지 또는 성장에 필요한 것으로서 단미사료(單味飼料)·배합사료(配合飼料)및 보조사료(補助詞料)를 포함하며, 다만, 동물용 의약으로서 섭취하는 것은 제외한다. "보조사료"란 사료의 품질저하 방지 또는 사료의 효용을 높이기 위하여 사료에 첨가하는 것으로서 농림축산식품부장관이 정하여 고시하는 것을 말한다.

본 발명에서, "사료첨가제"는 생산성 개선이나 육질 개선의 목적으로 사료에 소량 배합하는 비영양소보조물질로 정의할 수 있으며, 항생제, 생균제, 효소제, 유기산제, 향미제, 감미제, 항산화제, 각종 천연물질 및 기능성 물질 등이 사료 첨가제로 분류될 수 있다.

본 발명에서, 꽃게는 갑각류로서 우리나라에서 잡히는 매끈 꽃겟속, 주름 꽃겟속, 톱날 꽃겟속, 민 꽃겟속, 두 갈래 민꽃겟속 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 꽃겟속들 중에서 학명이 Ovalipes punctatus 인 깨다시 꽃게를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 항산화 효과는 산화반응을 억제하는 물질로서 활성산소 또는 자유라디칼이라고 하는 히드록실라디칼, 수퍼옥시드아니온, 과산화수소 등을 포함하는, 소위 산화물질의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질을 총칭하는 의미로서, 항산화용 조성물, 산화방지제, 산화방지용 조성물 등의 용어와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에서, 단백질 가수분해 효소는 단백질의 펩타이드 결합을 절단하는데 특이성에 관련된 활성부위에 따라 4종류 serine, thiol, carboxyl 및 metallo로 구분된다. 가수분해 메커니즘에 따라서 endoproteinases 와 exopeptidases로 구분되고 각각 단백질의 내부에 존재하는 펩타이드 결합과 N 말단 및 C 말단으로부터 가수분해한다. 식품 산업에서는 주로 endoproteinases를 사용하나 혼합하여 사용하기도 한다.

본 발명에서, 단백질 가수분해 효소는 bromelain, flavourzyme, protamex, prozyme 을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 브로멜린(bromelain)은 파인애플의 조직 안에 존재하는 단백질 가수분해효소로서 식품, 제약 및 화장품 원료제조 분야에 널리 시용되고 있다, 사용온도 45-50℃, pH 6.0-8.0, endoprotease이고 Phe, Tyr, Arg 등의 carbonyl 기를 가수분해한다. 80℃ 이상에서 실활된다. 플라보르자임(flavourzyme)은 Aspergillus oryzae 에서 펩티다아제 제제로 판매되며, 효소 제제는 산업 및 연구 분야에서 단백질 가수 분해에 광범위하고 다양하게 사용된다. 사용온도 45-55℃, pH 5.0-7.0, endoprotease 와 exoprotease 가 혼합되어 있다. 75℃ 이상 10분 가열시 실활된다. 프로타멕스(protamex)는 Baciilus 로부터 유래된 효소로 사용온도 35-60℃, pH 5.5-7.5이고, 프로자임(proyme)은 복합 단백질 분해효소로 사용온도 50-60℃, pH 6.0-9.0, endoprotease이다.

본 발명에서, 최적 공정을 확립하기 위해서 단백질 가수분해 효소(프로티아제)의 사용량은 단백질 양에 대하여 2-5%(w/w)를 사용한다.

본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는 DPPH 라디컬을 소거함으로써 우수한 항산화 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 첨가제 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 첨가제 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제 조성물은 꽃게 단백질 유래 펩타이드 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다.

일반적으로, 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는, 사료 첨가제의 제조 시에 사료 첨가제의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다.

본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 유효용량은 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드가 혼합된 기능성 사료 첨가제 조성물의 제조 시, 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 첨가제 조성물의 대상이라 할 것이다.

본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물은 DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내며 세포에 대한 독성이 없어 항산화 효과를 나타내는 기능성 사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 꽃게 펩타이드를 함유한 사료 첨가제의 제조 공정도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 pH를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 효소 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해물의 항산화능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해물의 효소 종류에 따른 구성아미노산 분포에 대한 분석결과를 나타낸 것이다. A : bromelain, B : protamex
도 7은 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해물의 효소 종류에 따른 구성아미노산 분포에 대한 분석결과를 나타낸 것이다. C : flavourzyme, D : prozyme

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실험예 1] 꽃게 효소가수분해 공정 표준화를 위한 최적 공정

1. 냉동 꽃게로부터 효소가수분해를 위한 꽃게 육 분리 및 슬러리 제조

본 실험에 사용한 냉동 꽃게는 국내산으로 공급회사에서 -18℃로 보관되며, 유통기간은 보관 상태에서 24개월 이었다. 냉동 꽃게는 10 kg 단위로 냉동 상태로 공급되었다. 일부 냉동 꽃게는 꽃게를 찐 다음 몸통에서 살만을 분리하여 살, 몸통, 다리를 60℃ dry oven 에서 12시간 건조한 다음 각각 분쇄하여 분말화 하였다. 꽃게 살, 다리, 몸통 분말은 실험 전까지 샘플 병에 넣어 상온에서 보관하였다. 나머지 냉동 꽃게는 40℃ 항온수조에서 20분 동안 해동하고 껍질이 충분히 연하기 때문에 껍질을 벗기지 않고 그대로 분쇄하여 슬러리 형태로 만들어 대부분은 냉동 보관하였다. 분리 된 꽃게육은 실험을 수행하기 전까지 냉동 보관하였다.

2. Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 온도 설정

(1) 꽃게육 단백질 가수분해 최적 온도 설정을 위한 실험

꽃게육 단백질 가수분해반응 최적 온도 공정은 효소반응기에서 수행하였다. 효소반응기의 조건들은 Total 용량 1,000 ml, 작업 Working 용량은 500 ml 이고 효소반응 온도는 순환 수조를 이용하여 조절하였다. 고정한 반응조건들은 공급회사에서 제시한 pH 범위의 중간을 채택하여 수행하였다. 효소의 농도는 단백질 농도의 2% (w/w) 로 수행하였다. 반응이 끝난 후 가수분해물은 0.3 M TCA 용액을 넣거나 90℃에서 20분간 가열하여 효소 불활성화시킨 다음 부직포를 사용하여 꽃게 고형물들을 제거하고 마지막으로 원심분리하여 미세 고형물을 제거하였다. 가수분해물들은 후속 분리 정제 및 후속 과정을 수행할 때까지 - 20℃에 보관하였다. 꽃게육 단백질 가수분해도 측정은 BCA 방법에 의하여 수행되었다.

(2) Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 온도 실험 결과

도 2에 나타낸 바와 같이, 효소 반응결과 온도에 따라서 사용한 효소의 종류에 상관없이 가수분해 수율은 다르게 나타났다. 각각 사용한 효소들 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 온도애 따른 가수분해 수율을 보면 사용한 온도 범위에서 같은 패턴을 보여 주었다. 낮은 온도(30-40℃)에서 온도를 높힐수록 수율(약 20-40%)이 증가하다가 최적 온도에서 최적 수율(60-80%) 부터 서서히 떨어지다가 높은 온도(70-80℃)에서는 20-50% 까지 급격히 떨어졌다. 사용한 효소들 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 최적 온도는 60℃, 55-60℃, 50-60℃, 60-70℃ 범위에서 결정되었고 이때의 수율은 각각 평균 82.27±3.26, 67.23±2.29, 66.37±7.17, 81.67±4.91이었다.

3. Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 pH

(1) 꽃게육 단백질 가수분해 최적 pH 설정을 위한 실험

꽃게육 단백질 가수분해반응 최적 pH 공정은 효소반응기에서 수행하였다. 효소반응기의 조건들은 Total 용량 1,000 ml, 작업 Working 용량은 500 ml 이고 효소반응 온도는 실험을 수행한 결과에서 얻어진 최적온도를 적용하여 순환 수조를 이용하여 조절하였다. 본 실험에 적용한 최적 온도들은 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 최적 온도는 60℃, 55℃, 55℃, 65℃ 이었다. 효소 반응 최적 pH 는 4 - 9의 범위에서 수행하였다. 효소의 농도는 단백질 농도의 2% (w/w) 로 수행하였다. 반응이 끝난 후 가수분해물은 0.3 M TCA 용액을 넣거나 90℃에서 20분간 가열하여 효소 불활성화시킨 다음 부직포를 사용하여 꽃게 고형물들을 제거하고 마지막으로 원심분리하여 미세 고형물을 제거하였다. 가수분해물들은 후속 분리 정제 및 후속 과정을 수행할 때까지 - 20℃에 보관하였다. 꽃게육 단백질 가수분해도 측정은 BCA 방법에 의하여 수행되었다.

(2) Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 pH 실험 결과

도 3에 나타낸 바와 같이, 효소 반응결과 pH에 따라서 사용한 효소의 종류에 상관없이 가수분해 수율은 다르게 나타났다. 각각 사용한 효소들 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 온도애 따른 가수분해 수율을 보면 사용한 pH 범위에서 유사한 패턴을 보여 주었다. 낮은 pH(4-5)에서 수율은 약 30% 이하였고, pH를 높힐수록 수율이 증가하다가 최적 pH에서 최적 수율(70-80%) 부터 서서히 떨어지다가 높은 pH(8-9)에서는 30-40% 까지 급격히 떨어졌다. 사용한 효소들 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 최적 pH는 7, 7, 6, 7로 결정을 하였다. 이때의 수율은 각각 평균 78.77±6.30, 75.60±11.26, 80.63±3.80, 80.17±1.25이었다.

4. 효소와 기질의 최적 비율

(1) 꽃게육 단백질 가수분해 최적 비율 설정을 위한 실험

꽃게육 단백질 가수분해반응 최적 비율 공정은 효소반응기에서 수행하였다. 효소반응기의 조건들은 Total 용량 1,000 ml, 작업 Working 용량은 500 ml 이고 효소반응 온도는 실험을 수행한 결과에서 얻어진 최적온도를 적용하여 순환 수조를 이용하여 조절하였다. 본 실험에 적용한 최적 온도들은 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 최적 온도는 60℃, 55℃, 55℃, 65℃ 이었다. 효소 반응 최적 pH 각각 7, 7, 6, 7에서 효소와 단백질의 비율은 0.1, 0.5, 1.5, 2, 3 %(w/w)로 수행하였다. 반응이 끝난 후 가수분해물은 0.3 M TCA 용액을 넣거나 90℃에서 20분간 가열하여 효소 불활성화시킨 다음 부직포를 사용하여 꽃게 고형물들을 제거하고 마지막으로 원심 분리하여 미세 고형물을 제거하였다. 가수분해물들은 후속 분리 정제 및 후속 과정을 수행할 때까지 - 20℃에 보관하였다. 꽃게육 단백질 가수분해도 측정은 BCA 방법에 의하여 수행되었다.

(2) Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 최적 비율 실험 결과

도 4에 나타낸 바와 같이, 효소 반응결과 사용한 효소의 종류에 상관없이 가수분해 수율은 다르게 나타났다. 실험에 적용한 효소의 비율 범위에서 가수분해 수율은 낮은 비율에서 유도기 현상이 나타났고 높은 농도(2% 이상)에서는 유도기 없이 수율이 높아졌다가 효소반응시간 3시간 이후부터는 농도에 상관없이 지체기에 접어 들었다. 사용한 효소들 bromelain(A), flavourzyme(B), protamex(C), prozyme(D)의 최적 비율은 효소의 비용 및 공정 시간을 감안하여 효소에 상관없이 2%(w/w)로 하였다.

본 발명에서, 프로티아제 bromelain, flavourzyme, protamex, prozyme의 단백질 가수분해 최적 온도는 60℃, 55℃, 55℃, 60℃로 결정하였다. 이때의 가수분해 수율은 각각 평균 65-80% 이었다. 프로티아제 bromelain, flavourzyme, protamex, prozyme의 단백질 가수분해 최적 pH는 7, 7, 6, 7로 결정하였다. 이때의 수율은 각각 평균 75-80% 이었다. 사용한 효소들 bromelain, flavourzyme, protamex, prozyme의 최적 비율은 효소의 비용 및 공정 시간을 감안하여 효소에 상관이 없이 2%(w/w)로 하였다.

즉, 본 발명에 따른 꽃게 육 단백질을 이용하여 저분자 펩타이드를 생산하기 위한 최적 bromelain 효소 공정 조건은 반응 온도 60℃ 및 반응 pH 7 로 결정하였다. 최적 flavourzyme 효소 공정 조건은 반응 온도 55℃ 및 반응 pH 7 로 결정하였다. 최적 protamex 효소 공정 조건은 반응 온도 55℃ 및 반응 pH 6 으로 결정하였다. 최적 prozyme 효소 공정 조건은 반응 온도 60℃ 및 반응 pH 7 로 결정하였다.

[실험예 2] 꽃게 효소 가수분해 실험

1. Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해 공정

꽃게육 단백질 가수분해는 1000 mL 반응조에 pH 7.0 으로 보정된 정제수 500 mL를 넣은 다음 꽃게 슬러리 860 g과 효소 5%(w/w)를 넣고 50℃에서 5시간 동안 가수분해반응하였다. 사용된 단백질 가수분해 효소 protease는 bromelain, flavourzyme, protamex, prozyme이고, 반응 pH와 온도는 공급회사에서 효소마다 제공된 범위에서 수행하였다. 반응이 끝난 후 0.3 M TCA 용액을 넣거나 90℃에서 20분간 가열하여 효소 불활성화시킨 다음 부직포를 사용하여 꽃게 고형물들을 제거하고 마지막으로 원심분리하여 미세 고형물을 제거하였다. 정제된 가수분해물들은 실험에 사용할 때까지 동결건조하여 보관하였다.

2. 꽃게육 슬러리의 수율 및 저분자 펩타이드

효소 반응 후 생산물들의 수율을 계산하였고 예상 저분자 펩타이드 등을 계산하였다. 원료 꽃게들의 양은 각각 10 kg 이었고 수율은 bromelain 82%, protamex는 78.5kg, flavourzyme은 82.5%, prozyme 85% 이었다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 꽃게 슬러리의 구성 성분은 가식부 39.17%, 껍질 22.45%, 수분 31.88%, 탄수화물 0.79%, 단백질 5,38%, 회분 0.33% 이고 가식부를 기준으로 산정을 하면 수분 81.40%, 단백질 13.70%, 지질 0.80%, 탄수화물 2.0%, 식염 0.80% 이다. 따라서 본 실험에서 적용한 가식부는 수분을 포함하여 7.75 kg 이고 단백질은 1.06 kg 이다.

반응결과 저분자 펩타이드의 수율은 bromelain 82%, protamex 78.5 %, flavourzyme 82.5%, prozyme 85% 이었다. 저분자 펩타이드의 양은 bromelain 0.87 kg, protamex 0.83 kg, flavourzyme 0.88 kg, prozyme 0.90 kg들이 생산되어 총 수분을 포함하는 가식부에 대하여 각각 저분자 펩타이드는 11.2%, 10.8%, 11.4%, 10.8% 이었다. 꽃게육 펩타이드 수율 및 저분자 펩타이드 함량은 하기 표 2에 나타내었다.

3. 꽃게육 단백질 가수분해도 측정(degree of hydrolysis)

꽃게육 단백질 가수분해도 측정은 BCA 방법에 의하여 수행되었다. 꽃게 단백질 가수분해 반응 후에 생성물을 원심분리를 하여 상등액을 취하였다. 상등액 0.1 mL 에 2 mL BCA 시약을 넣은 다음 37℃에서 30분간 반응 시킨 후에 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 가수분해도(DH, degree of hydrolysis)도는 꽃게 가수분해물을 원심 분리하여 꽃게 고형물을 제거 한 후 상등액의 흡광도 Dmax로 하였다. 가수분해 후 TCA 침전물을 제거한 상등액의 양을 Dat time t 로 하였다. 따라서 가수분해도는 아래와 같은 식으로 계산되었다.

[실험예 3] 꽃게 단백질 가수분해물의 항산화능 분석

1. DPPH 라디칼 소거활성

항산화 활성을 측정하기 위하여 생산된 단백질 가수분해물을 한외여과를 통하여 분리 및 정제를 수행하였다. 이때 사용한 한외막의 크기는 평균 10 kDa 이었다. 여과액(permeate)를 모아서 진공 건조기를 이용하여 분말화 하였다. 측정 시료의 준비는 분말화된 가수분해물을 약 5 mg/ml의 농도로 조정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성 측정은 10%로 증류수에 희석한 단백질 가수분해물 2 mL와 DPPH-radical(0.2 mM) 용액 0.5 mL를 혼합하여 사용하였다. 혼합물은 30분간 실온에서 암실 보관한 후 spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래의 식에 의해 값을 산출하였다.

2. 하이드록시 라디칼 소거활성

항산화 활성을 측정하기 위하여 생산된 단백질 가수분해물을 한외여과를 통하여 분리 및 정제를 수행하였다. 이때 사용한 한외막의 크기는 평균 10 kDa 이었다. 여과액(permeate)를 모아서 진공 건조기를 이용하여 분말화 하였다. 측정 시료의 준비는 분말화 된 가수분해물을 약 5 mg/ml의 농도로 조정하였다. Hydroxyl 라디칼에 대한 소거활성 측정은 Fan의 방법을 변형하여 측정하였다. 하이드록시 라디칼 소거활성 측정을 위해서 대조구는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 사용하였다. 10%로 증류수에 희석한 단백질 가수분해물 300 μL 와 300 μL 3 mM 1,10-phenanthroline, 300 μL, 3 mM FeSO4, 300 μL 0.01% hydrogen peroxide를 혼합하였다. 혼합액은 37℃에서 1시간 동안 반응 후 spectrophotometer를 사용하여 536 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하이드록시 라디칼 소거활성은 대조구에 대한 시료의 흡광도를 비교하여 아래와 같은 식으로 계산하였다.

3. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성

항산화 활성을 측정하기 위하여 생산된 단백질 가수분해물을 한외여과를 통하여 분리 및 정제를 수행하였다. 이때 사용한 한외막의 크기는 평균 10 kDa 이었다. 여과액(permeate)를 모아서 진공 건조기를 이용하여 분말화 하였다. 측정 시료의 준비는 분말화 된 가수분해물을 약 5 mg/ml의 농도로 조정하였다. Superoxide radical에 대한 소거능은 Yu의 방법을 변형하여 측정하였다. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성 측정을 위해서 대조구는 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.3)용액을 사용하였다. 10%로 증류수에 희석한 단백질 가수분해물 500 μL 을 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.3)용액 500 μL와 400 uL 1.5 mM pyrogallol 용액에 혼합한 후 실온에서 4분 동안 반응시켰다. 반응 후 spectrophotometer를 사용하여 420 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 대조구에 대한 시료의 흡광도를 비교하여 아래와 같은 식으로 계산하였다.

4. Fe ²⁺ 킬레이션 활성

항산화 활성을 측정하기 위하여 생산된 단백질 가수분해물을 한외여과를 통하여 분리 및 정제를 수행하였다. 이때 사용한 한외막의 크기는 평균 10 kDa 이었다. 여과액(permeate)를 모아서 진공 건조기를 이용하여 분말화 하였다. 측정 시료의 준비는 분말화 된 가수분해물을 약 5 mg/ml의 농도로 조정하였다. 시료용액의 metal chelating effect는 Gulcin의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. Fe²⁺ 킬레이션 활성 측정을 위해서 대조구는 ethylene diamine tetra acetic acid(EDTA)용액을 사용하였다. 10%로 희석한 단백질 가수분해물 500 μL와 100 μL FeCl₂(0.6 mM), 900 μL methanol 을 넣고 혼합하였다. 혼합물은 5분 동안 상온에서 반응 시킨 후 100 μL ferrozine(5 mM)을 첨가하여 10분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 spectrophotometer를 사용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. Fe²⁺ 킬레이션 활성은 대조구에 대한 시료의 흡광도를 비교하여 아래와 같은 식으로 계산하였다.

5. Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해물의 항산화능 실험 결과

도 5에 나타낸 바와 같이, 저분자 펩타이드 크기의 단백질 가수분해물 들의 항산화능 평가를 DPPH 라디칼 , 수퍼옥사이드 라디칼, 하이드록시 라디칼 및 Fe 이온 킬레이션 능력을 평가하였다. 처리 효소별로 생산된 저분자 펩타이드들의 항산화능은 다르게 나타났다. DPPH 라디칼 소거 능력은 bromelain 과 flavouzyme에서 의미있는 차이가 없이 5 mg/ml 의 농도에서 약 65% 이상을 보여주었고 prozyme이 약 60% protamex 처리 저분자 펩타이드들은 약 31%를 보여주었다. 이러한 경향은 수퍼옥사이드 라디칼에서도 비슷하게 나타났다. 하지만 protamex 와 prozyme에서는 약 25%로 유사하게 나타났다. 하이드록시 라디칼 소거능은 역시 bromelain에서 최고로 나타났다. 최대 소거능력은 약 66.71±10.31% 로 나타냈는데 이어서 prozyme에서는 64.89±6.81로 나타났다. flavourzyme은 DPPH 나 수퍼옥사이드 라디칼 소거능 들은 비교적 높았지만 하이드록시 라디칼 소거능은 비교적 32.83±10.84로 낮았다. 주어진 농도에서 Fe²⁺ 킬레이션 능력도 펩타이드마다 다르게 나타났는데 라디칼 소거능과는 달리 prozyme에서 가장 높게 나타나고 protamex, flavourzyme, bromelain 순으로 낮았다.

[실험예 4] 꽃게육 단백질 가수분해물의 분리 및 정제

1. 한외여과를 이용하여 펩타이드 분리 및 정제

가수분해물을 원심분리하여 상등액을 수거한 다음 한외여과기(Amicon TCF-10; Amicon Co., USA) 를 이용하여 실온에서 300 rpm으로 N₂ 가스를 180 psi (1241 kPa) 의 압력을 주어 여과하였다. 시료는 100KDa 의 여과지를 이용하여 각각 분획하였다.

2. 이온교환수지를 이용하여 펩타이드 분리 및 정제

Dowex® 1×2, 200수지를 column (2.5×100cm)에 평형화시켰으며, 평형화된 수지에 펩타이드 1 g을 10 mL의 3차 증류수 용해시킨 후 5 mL을 주입하였다. 용출액은 3차 증류수 75 mL 후 0.1 M Nacl, 0.5 M Nacl 마지막으로 1 M Nacl 용출액을 각각 75 mL 씩 순차적으로 사용하였다. 분획은 Teledyne ISCO사의 자동분획기(Retriever 500)를 사용하였으며, 용출액은 5mL/90sec 씩 분획하여 수집하였다. 각 분획의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다.

3. 겔 여과에 의한 펩타이드 분리 및 정제

펩타이드 1 g을 10 mL 의 3차 증류수 용해시킨 후 5 mL 을 평형화된 sephadex G-25, column (2.5×100 cm)에 주입하였으며, 용출액을 5 mL/90 sec 씩 분획하여 수집하였다. 용출액은 3차 증류수를 사용하였으며, 각 분획의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 분획은 Teledyne ISCO사의 자동분획기(Retriever 500)를 사용하였으며, 90초 동안 5mL씩 분획물을 수득하였다.

4. 꽃게 단백질 유래 저분자 펩타이드 분자량 분포

꽃게 단백질 유래 저분자 펩타이드의 분자량 분포 측정을 위한 시료의 준비는 한외여과 및 크로마토그래피, 염제거 후에 수행하였다. 분석에 사용된 기기는 UltraflexIII TOF/TOF (Bruker Daltonics) 이었다. 분석을 위한 매트릭스 용액의 준비는 0.1% TFA / ACN (1:1, v/v)의 용매에 10 mg/ml의 농도로 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)를 용해하였다. MALDI-TOF target 를 위한 시료는 2 ul 샘플과 2 ul 매트릭스용액을 혼합하여 준비를 하였다. 분석기기의 조건들은; 1) Instrument control: Flex Control 3.0 (Bruker Daltonics), 2) Analysis mode: Reflectron mode, 3) Polarity: Positive, 4) Detection: m/z 100~6,000, 5) Laser repetition rate: 100 Hz, 6) Number of shot: 500 shot, 7) Deflection: On, 500 Da, 이었다. Voltage condition은 Ion Source Ⅰ; 25.00 kV, Ion Source Ⅱ; 21.90 kV, Lens; 9.00 kV, Reflector Ⅰ; 26.00 kV, Reflector Ⅱ; 13.60 kV, Reflector Detector; 1.803 kV 이었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 분석결과 생산된 저분자 펩타이드들은 사용한 프로티아제의 종류에 따라 분자량의 분포가 다르게 나타났다. 하지만 대부분 분자량이 500 - 1,500사이에 분포하였다. MALDI-TOF의 스펙트럼은 피크에 대한 아미노산의 서열을 나타내지는 않는다. 가장 큰 단백질로 알려진 titin 은 27,000 AAs으로 구성되어 있고 아미노산 평균 분자량이 110 Da 임으로 분자량은 약 3,000,000 Da으로 평가할 수 있다. 따라서 본 실험에 따르면 bromelain 가수분해물들은 분자량의 분포가 550-717 Da 이므로 아미노산 개수는 4-6 으로 구성되었고 펩타이드 결합의 수는 3-4 로 추측할 수 있다. 같은 방법으로 flavourzyme 가수분해물들은 분자량의 분포가 530-1,220 Da 이므로 아미노산 개수는 4-10 으로 구성되었고 펩타이드 결합의 수는 3-9 범위에 있는 것으로 추측할 수 있다. protamex 가수분해물들은 분자량의 분포가 530-1,220 Da 이므로 아미노산 개수는 4-10 으로 구성되었고 펩타이드 결합의 수는 3-9 범위에 있는 것으로 추측할 수 있다. 효소 prozyme 가수분해물들은 분자량의 분포가 524-740 Da 이므로 아미노산 개수는 3-5 로 구성되었고 펩타이드 결합의 수는 2-3으로 추측할 수 있다.

[실험예 5] 꽃게육 단백질 가수분해물의 특성 분석

1. 단백질 가수분해물 구성 및 유리 아미노산 분석

한외 여과기를 이용하여 10KDa로 여과시킨 용액을 아미노산 자동분석기(S433-H, Sykam GmbH, Germany, Munich)로 정량 분석하였다. 아미노산 자동분석기 컬럼은 Cation separation column(LCA K06/Na)을 사용하였고, 컬럼 크기는 4.6 × 150 mm, 컬럼 온도는 57-74℃, 완충용액과 OPA 시약의 flow rate는 각각 0.45 mL/min, 0.25 mL/min 였으며, 이때 완충용액의 pH 범위는 3.45-10.85이었고, 파장은 440 nm과 570 nm이었다.

(1) 구성아미노산

꽃게육 단백질 가수분해물들은 사용된 효소의 종류에 따라 아미노산의 분포가 다르게 나타났다. bromelain, protamex 효소로 가수분해된 아미노산의 분포는 도 6과 같다. A는 bromelain 효소를 이용하여 가수분해된 아미노산의 분포, B는 protamex 효소를 이용하여 가수분해된 아미노산의 분포를 나타낸 것이다.

도 6 A에 나타낸 바와 같이, bromelain 효소로 가수분해 하였을 때의 구성아미노산과 필수아미노산(valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine)의 분포를 나타내었다. 구성아미노산 분포 중에서는 glutamic acid이 13.80% 로서 가장 높은 함량이 나타났고, leucine(11.73%), lysine(10.45%), glycine(10.40%)순으로 높게 나타났으며, 필수아미노산 중에서는 leucine이 11.73%로서 가장 많은 함량을 차지하고 있었으며 다른 세가지 효소(protamex, flavourzyme, prozyme)로 가수분해 하였을 때와 비슷한 경향을 보여주었다. 반면에 구성아미노산 분포 중에서 arginine은 flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해 하였을 때는 높은 함량을 나타났으나, bromelain, protamex 효소로 가수분해 하였을 때는 낮은 함량을 보여주었다. 따라서 bromelain 효소로 가수분해 하였을 때의 아미노산 분포는 bromelain 효소로 가수분해 하였을 때와 가장 비슷한 경향을 보여준다고 볼 수 있다.

도 6 B에 나타낸 바와 같이, protamex 효소로 가수분해 하였을 때의 구성아미노산과 필수아미노산(valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine)의 분포를 나타내었다. 구성아미노산 분포 중에서는 glutamic acid이 13.54%로서 가장 높은 함량이 나타났고, leucine(11.76%), lysine(10.22%), glycine(9.68%)순으로 높게 나타났으며. 필수아미노산 중에서는 leucine이 11.76%로서 가장 많은 함량을 차지하고 있었으며 다른 세가지 효소(bromelain, flavourzyme, prozyme)로 가수분해 하였을 때와 비슷한 경향을 보여주었다. 반면에 구성아미노산 분포 중에서 arginine은 flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해 하였을 때는 높은 함량을 나타냈으나, bromelain, protamex 효소로 가수분해 하였을 때는 낮은 함량을 보여주었다. 따라서 protamex 효소로 가수분해 하였을 때의 아미노산 분포는 bromelain 효소로 가수분해 하였을 때와 가장 비슷한 경향을 보여준다고 볼 수 있다.

꽃게육 단백질 가수분해물들은 사용된 효소의 종류에 따라 아미노산의 분포가 다르게 나타났다. flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해된 아미노산의 분포는 도 7과 같다. C는 flavourzyme 효소를 이용하여 가수분해된 아미노산의 분포, D는 prozyme 효소를 이용하여 가수분해된 아미노산의 분포를 나타낸 것이다.

도 7 C에 나타낸 바와 같이, flavourzyme 효소로 가수분해하였을 때의 구성아미노산과 필수아미노산(valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine)의 분포를 나타내었다. 구성아미노산 분포 중에서는 glutamic acid이 11.94%로서 가장 높은 함량이 나타났고, arginine(11.12%), leucine(9.87%), glycine(8.69%)순으로 높게 나타났으며. 필수아미노산 중에서는 leucine이 9.87%로서 가장 많은 함량을 차지하고 있었으며 다른 세가지 효소(bromelain, protamex, prozyme)로 가수분해하였을 때와 비슷한 경향을 보여주었다. 반면에 구성아미노산 분포 중에서 arginine은 flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해 하였을 때는 높은 함량을 나타났으나, bromelain, protamex 효소로 가수분해 하였을 때는 낮은 함량을 보여주었다. 따라서 flavourzyme 효소로 가수분해 하였을 때의 아미노산 분포는 prozyme 효소로 가수분해 하였을 때와 가장 비슷한 경향을 보여준다고 볼 수 있다.

도 7 D에 나타낸 바와 같이, prozyme 효소로 가수분해 하였을 때의 구성아미노산과 필수아미노산(valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine)의 분포를 나타내었다. 구성아미노산 분포 중에서는 glutamic acid이 11.09%로서 가장 높은 함량이 나타났고, arginine(11.06%), leucine(10.24%), glycine(8.69%)순으로 높게 나타났으며. 필수아미노산 중에서는 leucine이 10.24%로서 가장 많은 함량을 차지하고 있었으며 다른 세가지 효소(bromelain, protamex, flavourzyme)로 가수분해하였을 때와 비슷한 경향을 보여주었다. 반면에 구성아미노산 분포 중에서 arginine은 flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해 하였을 때는 높은 함량을 나타났으나, bromelain, protamex 효소로 가수분해 하였을 때는 낮은 함량을 보여주었다. 따라서 prozyme 효소로 가수분해 하였을 때의 아미노산 분포는 flavourzyme 효소로 가수분해 하였을 때와 가장 비슷한 경향을 보여준다고 볼 수 있다.

bromelain, protamex, flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해 시킨 꽃게육 가수분해물의 구성 아미노산을 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 양이온 아미노산, 음이온 아미노산으로 분류하여 하기 표 4에 나타내었다.

비극성 아미노산의 함량은 bromelain, protamex, flavourzyme, prozyme 효소에서 가수분해시켰을 때 공통적으로 leucine이 가장 높은 함량으로 보이며 그 다음 alanine, valine순으로 사용된 4가지 효소의 비극성 아미노산의 분포는 비슷한 경향을 보여주었다. 극성 아미노산의 함량은 bromelain, protamex, flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해시켰을 때에는 공통적으로 glycine이 8.69%에서 10.40%로 가장 높은 함량으로 나타내며, cystine이 0.08%에서 0.67%로 가장 낮은 함량으로 사용된 4가지 효소의 비극성 아미노산의 분포는 비슷한 경향을 보여주었다.

양이온 아미노산의 분포는 사용된 효소의 종류에 따라 다르게 나타났다. bromelain, protamex 효소로 가수분해시켰을 때 양이온 아미노산의 함량은 lysine이 가장 높은 함량으로 나타났으나, flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해시켰을 때 양이온 아미노산의 함량은 arginine이 가장 높은 함량으로 나타났다.

음이온 아미노산 함량은 bromelain, protamex, flavourzyme, prozyme 효소로 가수분해시켰을 때 공통적으로 비슷한 함량으로 aspartic acid 보다 glutamic acid이 높은 함량으로 사용된 4가지 효소의 음이온 아미노산의 분포는 비슷한 경향을 보여주었다.

(2) 유리아미노산

bromelain 효소로 가수분해하였을 때의 유리아미노산의 분포는 glutamic acid(10.71%), leucine(9.10%), ornitine(8.15%), lysine(8.11%)순으로 나타났고, 유리 아미노산 중 구성아미노산을 제외한 아미노산 분포는 ornitine(8.15%), Taurine (5.00%), 1-methylhistidine(3.23%) 등의 순으로 존재하였다.

protamex 효소로 가수분해 하였을 때의 유리아미노산의 분포는 glutamic acid(10.57%), leucine(9.18%), ornitine(8.14%), lysine(7.98%)순으로 나타났고, 유리 아미노산 중 구성아미노산을 제외한 아미노산 분포는 ornitine(8.14%), Taurine (5.11%), 1-methylhistidine(3.28%) 등의 순으로 존재하였다.

flavourzyme 효소로 가수분해 하였을 때의 유리아미노산의 분포는 glutamic acid(10.34%), arginine(9.63%), leucine(8.55%), glycine(7.53%)순으로 나타났고, 유리 아미노산 중 구성아미노산을 제외한 아미노산 분포는 Taurine(4.95%), 1-methylhistidine(3.23%), asparagine(1.73%) 등의 순으로 존재하였다.

prozyme 효소로 가수분해 하였을 때의 유리아미노산의 분포는 glutamic acid(9.65%), arginine(9.62%), leucine(8.91%), glycine(7.56%)순으로 나타났고, 유리 아미노산 중 구성아미노산을 제외한 아미노산 분포는 Taurine(4.54%), 1-methylhistidine(3.65%), asparagine(1.58%) 등의 순으로 존재하였다.

2. 단백질 가수분해물의 분자량 분석 (MALDI-TOF)

가수분해물 분자량 측정을 위해 matrix는 alpha-cyano -4-hydroxy -cinnamic acid 1 mg을 0.1 mL 70% acetonitrile, 0.1% formic acid에 용해 후 만들었다. 샘플의 농도는 50- 100 ppm 정도로 준비하였으며, matrix시료와 시료를 1:1비율로 섞었다. MS plate위에 1 mL 정도 떨어뜨려 건조한 후 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기 (MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applied biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

3. 단백질 가수분해물의 아미노산 구조 분석(Q-TOF)

가수분해물 아미노산 서열 측정을 위해 동결건조된 펩타이드 30 mg을 1mL 펠콘 튜브에 칭량하여 0.1% CF₃COOH를 가하여 녹인 다음 Waters Sep-Pak® Silica를 이용하여 펩타이드의 염을 제거한 후 2 mL 70% HCN으로 C₁₈에 부착되어있는 펩타이드를 용출하여 15 uL를 고성능질량분석기(Triple TOF 5600+, ABsciex, Germany)로 정량 분석하였다. 고성능질량분석기 LC method의 컬럼은 ACQUITY UPLC (peptide CSH,1.7um)을 사용하였고, DW와 Acrtonitrile 시약의 flow rate는 300 uL/min 였으며, MS method PDA의 범위는 200-500 nm 이고 MS 범위는 200-2500 m/z 이었다. 이때 전위는 20V이고 온도는 350℃이었다.

[실시예 1] 깨다시 꽃게육 슬러리 제조

꽃게 기능성 펩타이드 생산을 위해서 냉동 깨다시 꽃게 10 kg를 가공할 효소별로 준비를 하였다. 냉동 꽃게들은 그대로 껍질이 연하기 때문에 별도의 해동 과정이 없이 분쇄기를 이용하여 껍질과 함께 분쇄를 하였다. 분쇄를 위해서 정제수 2.3 kg 씩 각각의 배치에 투여를 하였다. 효소반응을 위한 슬러리는 배치 당 전체 12.30 kg이고 이중에서 6.16 kg은 껍질로서 잔사처리 시 제거가 된다.

[실시예 2] 꽃게 육 슬러리 효소가수분해 공정

본 실시예에서 선택된 효소와 꽃게육 슬러리 약 12.30 kg 을 효소 반응기에 투여하여 저분자 기능성 펩타이드를 함유하는 가수분해물을 생산하였다. 효소반응 조건들은 상기 효소별 반응 최적 조건에 따랐다.

효소를 투여하기 전에 반응기의 조건을 각 효소의 최적 조건에 해당하는 하도록 조절하였다. 효소반응 동안에 반응의 속도를 높이기 위하여 교반을 수행하였다. 효소들은 bromelain, protamex, flvourzyme, prozyme 이었다.

효소 반응 후에 효소불활성화를 위하여 90℃에서 30분 동안 유지하였다. 반응 후에 생산물들은 수율를 계산하였고 예상 저분자 펩타이드 등을 계산하였다. 원료 꽃게들의 양은 각각 10 kg 이었고 수율은 bromelain 82%, protamex는 78.5%, flavourzyme은 82.5%, prozyme 85% 이었다.

꽃게 슬러리의 구성 성분은 가식부 39.17%, 껍질 22.45%, 수분 31.88%, 탄수화물 0.79%, 단백질 5,38%, 회분 0.33% 이고 가식부를 기준으로 산정을 하면 수분 81.40%, 단백질 13.70%, 지질 0.80%, 탄수화물 2.0%, 식염 0.80% 이다. 따라서 본 실시예에서 적용한 가식부는 수분을 포함하여 7.75 kg 이고 단백질은 1.06 kg 이다. 반응결과 저분자 펩타이드의 수율은 bromelain 82%, protamex 78.5 %, flavourzyme 82.5%, prozyme 85% 이었다. 저분자 펩타이드의 양은 bromelain 0.87 kg, protamex 0.83 kg, flavourzyme 0.88 kg, prozyme 0.90 kg들이 생산되어 총 수분을 포함하는 가식부에 대하여 각각 저분자 펩타이드는 11.2%, 10.8%, 11.4%, 10.8% 이었다.

단백질 가수분해물의 양은 bromelain, protamex, flavourzyme, prozyme 각각 358.38 g, 343.08 g, 362.75 g, 371.49 g 이었다. 이와 같은 결과는 가수분해 수율과는 무관하기 때문에 전체 제품개발에 사용할 수 있는 가수분해물의 총합은 6.23 kg, 이었다. 따라서 생산속도를 계산하면 전체 단백질 가수분해물을 대상으로 103.83 g/L-h,이었다. 저분자 펩타이드 (> 10 kDa)를 기준으로 계산을 하면 생산속도는 적용한 효소별로 다른데, 5.97 g/L-h, 5.72 g/L-h, 6.05 g/L-h, 6.19 g/L-h 이었다. 효소별 꽃게단백질 가수분해도는 하기 표 6에 나타내었다.

[실시예 3] 꽃게 육 슬러리 농축 공정

효소 반응 후에 생산된 효소 가수분해물을 농축 또는 분말화하기 위해, 본 실시예에서는 효소 반응물들의 브릭스를 측정하여 농축을 진공상태에서 30 Brix 까지 수행하였다. 꽃게 가수분해물을 63cmhg, 48℃에서 30 brix 가 될 때까지 농축시켰다. 약 30 brix 로 농축된 가수분해물에 NaCl과 저감미 덱스트린을 첨가하여 농축물을 제조하였고, 계속하여 분말화를 수행하였다.

효소 반응 후에 전체 효소 가수분해물의 양은 6.23 kg 이었는데 이 중에서 고형분의 함량은 약 740 g 이었다. 이에 대한 브릭스를 측정한 결과 약 11.28이 나왔다. 계속해서 농축하여 30 brix 까지 수행하여 약 2.47 kg 이되고 여기에 덱스트린과 소금을 더하여 50 brix 까지 높이면 최종 액상 제품의 양은 3.46 kg 이 되었다. 이 농축물을 건조하여 분말화(수분 약 8%) 하면 약 2 kg 의 분말 제품을 얻었다. 효소별 꽃게펩타이드 농축 및 분말 제품 특성은 하기 표 7에 나타내었다.

[실시예 4] 기능성 꽃게 펩타이드 함유 사료 첨가제의 일반분석

최종 레시피로 개발된 제품 4종을 한국사료협회 사료기술연구소에 성분분석을 의뢰하였으며 각 제품별로 식품성분 분석을 진행하였다. 성분분석 항목은 일반성분 분석(수분, 조단백질, 조지방, 탄수화물, 조회분 총 5가지 항목)이며 이에 대한 결과는 하기 표 8과 같다.

protamex, flavourzyme, prozyme 효소 가수분해 펩타이드의 일반성분 분석 함량은 수분함량이 57.67-58.11%로 가장 높게 나타났고, 그 다음은 조단백질, 조회분. 조지방 순으로 개발된 3종의 제품의 일반성분 분포는 비슷한 경향을 보여주었다. 반면에 bromelain 효소 가수분해 펩타이드의 일반성분 분석 함량은 수분함량이 59.83%으로 가장 높게 나타났고, 그 다음 조회분 함량이 15.61%, 조단백질 14.43%, 탄수화물 9.94%, 조지방 0.19% 순으로 조단백질 함량보다 조회분의 함량이 더 높게 나타났다.

[실시예 5] 꽃게 기능성 펩타이드 사료 첨가제를 이용한 사료 제조

1. 키블형 사료 배합

본 발명에 따른 꽃게 기능성 펩타이드를 활용한 사료 첨가제를 코팅하기 위하여, 키블형 사료를 제조하였다. 사료 제조 배합표는 하기 표 9에 나타내었다.

사료 배합표를 선정하기 위해서 시중에 판매되는 사료에 대해 사전 조사 후 원료를 선택하여 배합표를 선정하였다. 표 9는 사료 첨가제 코팅을 위한 사료 제조 배합표이다. 배합 재료는 물, 쌀, 보리, 현미, 귀리, 당근, 닭가슴살, 올리브유, 올리고당을 사용하였다. 물의 함량은 키블형태 사료에 맞는 반죽의 물성을 비교 실험한 후에 60 ml 로 선정하였다.

2. 사료 첨가제 코팅을 위한 사료 제조 방법

사료 제조를 위한 재료는 배합표에 맞게 측정하여 준비하였고, 재료 중 곡류(쌀, 보리, 현미, 귀리)는 분쇄기를 이용하여 분말형태로 만들어 사용하였고, 당근은 세척 후 믹서기를 이용하여 다져서 사용하였고, 닭 가슴살 또한 반죽에 용이하도록 최대한 잘게 잘라서 사용하였다. 준비된 재료에 물 1000 ml를 넣고 재료들을 반죽하였다. 그 다음 멸균전용 비닐에 담아 밀봉 후 Auto clave를 사용하여 100℃에서 40분간 반죽을 증숙시켰다. 증숙 후에 반죽을 성형기에 들어가기 알맞은 형태로 긴 막대모양으로 만들고 반죽을 키블 형태로 성형하였다. 성형기는 굿프라이스(펫푸드사료성형기-익스트루더 저압력)을 사용하였으며, 성형된 사료는 60℃ dry oven에서 12시간 동안 건조시켰다. 사료의 수분함량은 다음 표 10과 같다.

3. 꽃게 펩타이드 사료 첨가제 코팅을 통한 제조

꽃게 펩타이드 농축액 3 ml에 증류수 27 ml를 혼합하여 10% 꽃게 펩타이드 사료 첨가제를 제조한 다음 사료에 1:3 의 비율로 골고루 분무기를 사용해 뿌려 코팅시킨 다음 60℃ dry oven에 넣고 2시간 동안 건조시켰다.

[실시에 6] 기능성 펩타이드 코팅 사료에 대한 관능 평가

본 발명에서 제조한 항산화 기능성 펩타이드 코팅 키블에 대한 시중에서 판매되고 있는 제품과 비교를 하였다. 우선 본 발명에서 제조한 키블과 시중에서 판매를 하고 있는 키블에 펩타이드를 코팅하여 전후 관능의 차이를 비교하였다.

(1) 펩타이드 코팅 전 후의 관능(냄새)의 변화

기능성 펩타이드 코팅 전 후 주로 냄새의 차이점을 비교하기 위하여 편의상 후각기능이 반려동물에 비하여 떨어지는 것으로 알려졌지만 대학생 지원자 10명을 대상으로 수행하였다. 관능평가 방법은 차이식별 검사로서 단일 시료 제시법(A not A test)으로 코팅 전 샘플의 냄새를 맡고 30초 후에 코팅된 샘플의 냄새를 맞게 한 후에 차이를 판단하는 것으로 평가를 하였다.

냄새의 차이가 현저하게 크게 느끼는 경우는 (o) 그러하지 않은 경우는 (x) 로 표기를 하였다. 전체적으로 (o)는 75,71% 이고 (x) 는 24,29% 이었다. 따라서 전체적으로 볼 때는 코팅 전 후에 차이가 그리 크지 않은 것으로 판단된다. 개별 샘플로 보면 bromelain 과 commercial B의 경우에는 차이를 거의 느끼지 못하였고 prozyme의 경우에는 반반이었다. 그리고 나머지 샘플의 경우에는 차이를 느끼지 못하는 경우가 많았다. 펩타이드 코팅 전후의 관능평가는 하기 표 11에 나타내었다.

(2) 반려견을 대상으로 펩타이드 코팅 전 후의 관능(냄새)의 변화

기능성 펩타이드 코팅 전 후 주로 냄새의 차이점에 대한 선호도를 비교하기 위하여 수행하였다. 관능평가는 차이를 비교하고 보조 평가로서 시료에 대한 행동을 관찰하였다. 코팅 전 과 후의 샘플을 사료 그릇에 놓고 평상시처럼 반려견에 먹이를 주고 행동을 관찰한 결과 4개의 펩타이드 코팅한 키블과 상업적 키블에 구분 없이 평상시와 다름 없었다.

Claims (4)

1. 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 항산화 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 꽃게 단백질 유래 펩타이드는 bromelain, flavourzyme, protamex 또는 prozyme 효소로 단백질 가수분해된 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 조성물.
   
4. 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.

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