KR20200012152A - 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 효능의 기능성 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 효능의 기능성 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20200012152A KR1020180087059A KR20180087059A KR20200012152A KR 20200012152 A KR20200012152 A KR 20200012152A KR 1020180087059 A KR1020180087059 A KR 1020180087059A KR 20180087059 A KR20180087059 A KR 20180087059A KR 20200012152 A KR20200012152 A KR 20200012152A
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Abstract

본 발명은 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화 효능의 기능성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내며 세포에 대한 독성이 없어 항산화용 식품 조성물 등으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 효능의 기능성 조성물 및 이의 제조방법{Peptides Production from Protein of Crab and Antioxidant Composition Comprising Peptides }
본 발명은 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 효능의 기능성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 꽃게(Ovalipes punctatus)의 단백질을 가수분해 공정을 통하여 최적화하고, 가수분해하여 수득한 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 함유하는 항산화 효능을 나타내는 기능성 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
항산화제(antioxidant)는 산화반응을 억제하는 물질로서 활성산소 또는 산소자유라디칼이라고 하는 히드록실라디칼, 수퍼옥시드아니온, 과산화수소 등을 포함하는, 소위 산화물질의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질을 총칭하는 의미이다. 저분자화합물로는 글루타티온, N-아세틸시스테인, 아스코르빈산, α-토코페롤, 부틸화히드록시아니졸(BHA), 카테킨, 케르세틴, 요산, 빌리루빈, 포도당, 플라보노이드 등이 알려져 있으며, 최근에는 레드와인 추출물, 토마토, 블루베리 등 천연 항산화 제품들이 각광을 받고 있다.
프리 라디칼에 관련된 지방의 산화, 산화적 스트레스 및 항산화제에 관한 연구들은 최근에 집중적으로 연구되어 왔다. BHA(butylated hydroxy-anisole) 및 BHT(butylated hydroxytoluene)등 합성 항산화제들이 상업화하여 사용되고 있지만 최근 이들 유도체에 의한 DNA 손상 및 독성에 대하여 밝혀지고 있다. 생리 활성 펩타이드들은 그들이 속해있던 단백질에서는 불활성화 상태로 있지만 가수분해에 의하여 생리 활성을 나타내면 호르몬과 같은 기능을 나타내는 것으로 발표되고 있다. 다양한 원료들 중에서 수산물 단백질에서 항산화, 항고혈압, 항암, 엔지오텐신 전환효소억제 기능을 나타내는 펩타이드 형태의 단백질 가수분해물들이 보고되고 있다.
대부분의 꽃게는 가공되지 않은 상태로 찜 또는 찜육 등 반가공 형태로 상업화하고 있다. 하지만 최근에 블루 게 또는 머드 게 등으로부터 기능성 펩타이드 생산 및 특성을 밝히는 연구가 진행되어 오고 있다. 머드 게로부터 두 가지 종류의 항균활성 펩타이드의 분리 및 특성 연구가 발표되었다. 스노우 게의 가수분해물에서는 항암효과가 있는 분자량 228, 241, 291, 536 Da 펩타이드가 발표되었다. 대서양 바위게의 효소 가수분해물에서는 항균작용이 있는 펩타이드들이 분리 동정 되었는데 분자량은 200에서 750 Da이었다. 아미노산들의 구성은 주로 lysine, leucine, arginine, aspartic acid, glutamic acid 로 이루어 졌다고 보고되었다. 블루 게에서도 역시 분자량이 3.7 kDa인 항균 펩타이드의 분리 및 특성에 대한 연구가 발표되었다.
따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 항산화 효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.
이러한 항산화 효과가 있는 물질로서는 대한민국 등록특허 제10-1703411호에서는 항산화 활성이 우수하고 관능미가 우수한 홍게 자숙액을 유효성분으로 포함하는 소스 조성물을 개시하고 있다.
이에 본 발명자들은 천연물질로서 인체에 안전하면서도 항산화 효과가 우수한 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 깨다시 꽃게 단백질의 효소종류에 따른 가수분해물들이 항산화 효과가 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 전혀 없다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1703411 B1, 2017년 01월 31일
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 꽃게(Ovalipes punctatus) 단백질의 효소종류에 따른 가수분해물들의 항산화 활성을 평가하고, 최적 생산 공정을 통한 꽃게 단백질 유래 펩타이드 제조방법 및 천연 식용물질로서 안전하고 항산화 효과가 우수한 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 (a) 꽃게의 껍질을 벗기지 않고 그대로 분쇄하여 슬러리 형태로 제조하는 단계, 및 (b) 상기 꽃게 슬러리에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 항산화 조성물 및 식품 조성물은 상기 제조방법에 의하여 제조된 것을 특징으로 하는 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에서, 꽃게는 갑각류로서 우리나라에서 잡히는 매끈 꽃겟속, 주름 꽃겟속, 톱날 꽃겟속, 민 꽃겟속, 두 갈래 민꽃겟속 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 꽃겟속들 중에서 학명이 Ovalipes punctatus 인 깨다시 꽃게를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어 항산화 효과는 산화반응을 억제하는 물질로서 활성산소 또는 자유라디칼이라고 하는 히드록실라디칼, 수퍼옥시드아니온, 과산화수소 등을 포함하는, 소위 산화물질의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질을 총칭하는 의미로서, 항산화용 조성물, 산화방지제, 산화방지용 조성물 등의 용어와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서, 단백질 가수분해 효소는 단백질의 펩타이드 결합을 절단하는데 특이성에 관련된 활성부위에 따라 4종류 serine, thiol, carboxyl 및 metallo로 구분된다. 가수분해 메커니즘에 따라서 endoproteinases 와 exopeptidases로 구분되고 각각 단백질의 내부에 존재하는 펩타이드 결합과 N 말단 및 C 말단으로부터 가수분해한다. 식품 산업에서는 주로 endoproteinases를 사용하나 혼합하여 사용하기도 한다.
본 발명에서, 단백질 가수분해 효소는 Bromelain을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
Bromelain은 파인애플의 조직 안에 존재하는 단백질 가수분해효소로서 식품, 제약 및 화장품 원료제조 분야에 널리 시용되고 있다. Bromelain을 이용한 블루 게육 단백질 최적 가수분해는 약 3.1%의 효소농도에서 2시간 반응에서 생산되었다.
본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는 DPPH 라디컬을 소거함으로써 우수한 항산화 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 단독으로 포함하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다.
본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 유효용량은 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 어묵류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 꽃게 단백질 유래 펩타이드 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드가 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드는 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 필요에 따라 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.
본 발명의 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 DPPH 라디컬 소거능이 우수하여 항산화 효과를 나타내며 세포에 대한 독성이 없어 항산화용 식품 조성물 등으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해도의 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른, 꽃게육의 효소별 가수분해물의 항산화 능 특성을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해에 대한 효소의 반응 온도, pH 및 농도의 영향에 대한 표면 반응의 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해에 대한 반응 변수들에 대한 가수분해 경향을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 꽃게육 단백질을 bromelain 효소로 가수분해하였을 때의 구성아미노산의 분포를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해물의 펩타이드들의 분자량 분포에 대한 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 꽃게육 단백질 가수분해물의 LC-MS에 의한 펩타이드 구조분석결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 꽃게 단백질 유래 기능성 펩타이드 분말 및 엑기스 제조 공정을 간략하게 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 함유하는 어묵 제조 공정을 간략하게 나타낸 것이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
1. 재료 및 시약
본 발명에서 사용된 꽃게는 매끈꽃겟속·주름꽃겟속·톱날꽃겟속·민꽃겟속·두갈래 민꽃겟속 중에서 학명이 Ovalipes punctatus 깨다시 꽃게로서 냉동상태로 수산회사로부터 공급되었다. 본 실험에서 단백질 및 펩타이드 분석은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하였다(Thermo scientific, Seoul, Korea). 펩타이드 및 단백질 침전을 위해서 Tri-chloro-acetic(TCA)를 사용하였다(Sigma Company, Seoul, Korea). 단백질 분해효소 alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, papain와 protamex는 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. Trypsin은 Sigma company (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
2. 냉동 꽃게 전처리
본 실험에 사용된 꽃게는 냉동된 상태로 공급되었다. 일부 냉동 꽃게는 꽃게를 찐 다음 몸통에서 살만을 분리하여 살, 몸통, 다리를 60℃ dry oven 에서 12시간 건조한 다음 각각 분쇄하여 분말화 하였다. 꽃게 살, 다리, 몸통 분말은 실험 전까지 샘플 병에 넣어 상온에서 보관하였다. 나머지 냉동 꽃게는 40℃ 항온수조에서 20분 동안 해동하고 껍질이 충분히 연하기 때문에 껍질을 벗기지 않고 그대로 분쇄하여 슬러리 형태로 만들어 대부분은 냉동 보관하였다. 분리 된 꽃게육은 실험을 수행하기 전까지 냉동 보관하였다.
[실험예 1] Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해
꽃게육 단백질 가수분해반응은 1000 mL 삼각플라스크에 pH 6.0, 7.0 및 8.0으로 보정된 0.1 M phosphate 완충용액 200 mL를 넣은 다음 꽃게 슬러리 20 g 과 효소 1%(w/v)를 넣고 진탕배양기에서 3시간 동안 반응하였다. 사용된 단백질 가수분해 효소 protease는 alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, papain, protamex 이고, 반응 pH와 온도는 공급회사에서 효소마다 제공된 범위에서 수행하였다. 반응이 끝난 후 0.3 M TCA 용액을 넣거나 90℃에서 20분간 가열하여 효소 불활성화시킨 다음 부직포를 사용하여 꽃게 고형물들을 제거하고 마지막으로 원심분리하여 미세 고형물을 제거하였다. 정제된 가수분해물들은 다음 실험에 사용할 때까지 동결건조하여 보관하였다.
(1) 꽃게육 단백질 가수분해도 측정(degree of hydrolysis)
꽃게육 단백질 가수분해도 측정은 BCA 방법에 의하여 수행되었다. 꽃게 단백질 가수분해 반응 후에 생성물을 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액 0.1 mL 에 2 mL BCA 시약을 넣은 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후에 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 가수분해도(DH, degree of hydrolysis)는 꽃게 슬러리를 해동 후에 원심 분리하여 꽃게 고형물을 제거한 후 동결 건조한 꽃게육의 양에 해당하는 흡광도를 Dmax로 하였다. 가수분해 후 TCA 침전물을 제거한 상등액의 양을 Dat time t 로 하였다. 따라서 가수분해도는 아래와 같은 식으로 계산되었다.
Figure pat00001
(2) Protease 종류에 따른 꽃게육 단백질 가수분해도 측정결과
냉동 꽃게로부터 꽃게육의 분리는 주로 몸통에 존재하는 육을 분리하여 수행하였다. 부드러운 육을 분리하는 과정에서 발생하는 수분은 부직포를 이용하여 제거하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 효소들에 의한 가수분해도는 평균 18.67 ~ 52.13들의 분포를 이루었다. 최고의 가수분해는 효소 bromelain 사용 시 52.13% 이었다. 평균값을 비교하면 bromelain, flavourzyme, alcalase papain, neutrase, protamex 순으로 높았다.
[실험예 2] 꽃게육 단백질 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거능 측정
일반적으로 산화과정에서 항산화제는 프리라디칼과 반응을 하여 안정한 화합물을 생산하여 산화과정을 종결한다. 이러한 물질 중에서 DPPH는 메탄올 용매에서 안정한 라디칼을 유지하며 517 nm에서 최대흡광도를 나타내기 때문에 천연물(natural compounds)의 환원반응에 널리 사용되고 있다. 이러한 DPPH는 항산화제와 같은 프로톤공여(proton donating) 물질을 만나면 라디칼이 소거(scavenging)된다. 그리고 항산화제의 프로톤공여 능력에 따라 용액의 색이 퍼플에서 노란색으로 변한다. 따라서 DPPH는 펩타이드 및 천연 항산화 물질의 항산화력을 비교하는데 매우 유용한 분석 수단으로 사용되어 왔다.
DPPH 라디칼 소거능 측정은 단백질 가수분해시료를 일정한 농도로(10%) 증류수에 용해한 후 시료가 포함된 용액 2 mL와 DPPH-radical(0.2 mM) 용액 0.5 mL를 혼합하였다. 혼합물은 30분 간 실온에서 암실 보관한 후 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식에 의해 값을 산출하였다.
DPPH radical scavenging activity(%) =[(B-A)/Bㅧ100]
A : 시료 첨가시의 흡광도, B : 시료 무 첨가시의 흡광도
(1) 꽃게육의 효소별 가수분해물의 항산화 능 특성
꽃게육 단백질 가수분해물의 분리는 효소반응 후에 반응를 멈추고 반응하지 않은 단백질 등을 침전시키기 위해서 0.3M TCA 용액을 1: 2의 비율로 첨가하였다. 상등액을 동결건조하여 분말화한 다음 항산화 능 측정을 하였다. 효소에 따라 생산된 단백질 가수분해물에 대한 결과는 도 2에 나타내었다. 항산화 활성의 능력은 bromelain, flavourzyme, protamex, papain, neutratse, alcalase 순으로 높았다. 단백질 가수분해물들의 항산화 활성의 차이는 protease 마다 단백질의 펩타이드 결합을 분해하는 지점이 다르기 때문으로 다른 아미노산 서열을 지닌 가수물이 생산되기 때문인 것으로 사료된다. Bromelain으로 생산된 단백질 가수분해물이 가장 높은 활성(68.9%)을 보여주어서 계속된 실험에서 사용하였다.
[실험예 3] 꽃게육 단백질 가수분해물 최적 공정(RSM)
꽃게육 단백질 가수분해 생산 최적 조건을 구하기 위하여 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 효소반응 온도, 반응 pH, 효소의 농도(%)를 각각 50℃, pH 7, 2 % 로 하는 center run을 5번 반복을 포함하여 총 17 개의 처리 조합으로 구성된 Box-Benken Design을 전 연구에서 수행된 방법을 조정하여 수행하였다. 본 실험에서의 반응 변수는 단백질 가수분해도(DH, degree of hydrolysis)로 하였다. 통계적인 계산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code) 하여 사용하였다. 세 개의 변수들 각각 X 1 (온도), X 2 (pH), X 3 (효소 농도) 로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z 로 하였다.
Figure pat00002
---(1)
X o 는 표준화 값의 중심 값이고 X 는 표준화 값이다. △X 는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
Figure pat00003
---(2)
여기서 Y는 predicted response 이고 본 실험처럼 3개의 변수가 있을 경우에는 k값이 3이 되고 궁극적으로 다음과 같은 식으로 표현된다.
Figure pat00004
----(3)
실험 후에 확정 된 결과들의 통계분석은 Design Expert (Couresy: Stat-ease Inc.,Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택하여 X 1 (온도)는 40℃ (-1), 50℃ (0), 60℃ (+1) 로 정하고, X 2 (pH)는 5.0 (-1), 6.0 (0) 7.0 (+1) 로하고 X 3 (효소의 농도)는 1 (-1), 2 (0), 3 (+1) %로 하였다.(Table 1.) Bromelain에 의한 꽃게육 가수분해물 생산 공정은 10% 꽃게 분말과 50 mL 0.1 M PBS용매를 250 mL 플라스크에 넣고 디자인에 주어진 조건에 따라 4시간 반응하였다. 반응 후에 BCA 방법에 의하여 가수 분해도를 측정하였다.
X i Independent variables Level
-1 0 +1
X 1 Culture temperature (℃) 40 50 60
X 2 Culture pH 6 7 8
X 3 Enzyme (%) 1 2 3
(1) 표면반응 분석법에 의한 효소반응 최적 조건 확립
꽃게육의 단백질 효소가수분해 공정조건 요인들인 반응 온도, pH, 효소양의 3개의 실험변수에 대하여 Box-Behnken Design으로 실험을 설계하여 얻어진 가수분해도(%)를 실험결과가 표 2에서 보여준다. 실험결과 가수분해도의 값은 실험 범위 내에서 15.07~70.70% 범위에서 측정값이 얻어졌다.
Sample
numbers
pH Temperature
(℃)
Amount of enzyme
(%)
Degree of hydrolysis
(%)
1 6 40 2 20.40
2 8 40 2 34.13
3 6 60 2 17.83
4 8 60 2 26.53
5 6 50 1 17.80
6 8 50 1 15.07
7 6 50 3 38.47
8 8 50 3 44.50
9 7 40 1 16.90
10 7 60 1 21.77
11 7 40 3 70.70
12 7 60 3 55.87
13 7 50 2 59.93
14 7 50 2 66.13
15 7 50 2 55.13
16 7 50 2 67.07
17 7 50 2 55.93
표 3은 실험 결과에서 나타난 가수분해도에 대한 회귀식의 분산분석의 결과를 보여준다. Quadratic 회기 모델의 분석 결과는 모델의 적합성 여부를 나타내는데, bromelain 효소에 의한 꽃게육의 가수분해는 반응온도, 반응 pH 및 효소의 농도에 의하여 영향을 받는 다는 것이 95% 수준 이내에서 유의성이 인정되었다.
Source DF Sum of Squares
Degree of hydrolysisa
Model 9 6234.84b
Residual 7 348.62
Lack of Fit 3 224.37
Pure Error 4 124.25
Cor Total 16 6583.47
a Coefficient of correlation (R 2) was 0.947
b Significant at 5% level.
모델 결정계수(determination coefficient) R2 값은 실험 값(observed value)과 예측 값(predicted value) 그리고 상호연관(correlation) 정도를 보여주는데 0.947 이었다. 따라서 본 결정계수 값은 반응변수의 95% 이상이 가수분해 수율에 대한 반응변수의 함수로 표면반응 모델로 적용될 수 있다는 것을 보여준다. 적합결여(lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있다. 표 4에서는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 꽃게육의 단백질의 효소 가수분해는 효소의 반응 온도, 반응 pH, 및 효소의 농도에 의해서 영향을 받는 것으로 나타났다(p<0.05). 효소반응온도와 효소의 농도가 pH 보다 영향을 더 미치는 것으로 나타났다. 이러한 경향은 2차 항에서도 비슷한 경향을 보여주었다. 반응온도, 반응 pH, 및 효소의 농도는 교호항에서 모두 유의성이 나타나 요인들이 단독 또는 교호적으로 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이들에 대한 희귀식은 표 5에 있다.
Factor Coefficient
Degree of hydrolysis
Intercept +60.84
Linear
Temperature +3.22
pH -2.52
Enzyme concentration +17.25
Quadratic
Temperature2 -24.23
pH2 -11.88
Enzyme concentration2 -7.65
Interactions -1.26
Temperature × pH
Temperature × enzyme concentration +2.19
pH × enzyme concentration -4.93
Response Second oder polynomial equations R 2
Degree of Hydrolysis Y= 60.84 + 3.22X 1 - 2.52X 2 + 17.25X 3 - 24.23X 1 2 - 11.88X 2 2 - 7.65X 3 2 - 1.26X 1 X 2 + 2.19 X 1 X 3 - 4.93X 2 X 3 0.947
X 1 : pH, X 2 : Temperature (℃), X 3 : Enzyme concentration (%)
(2) 꽃게육 단백질 가수분해에 대한 효소의 반응 온도, pH 및 농도의 영향
반응 온도와 pH의 영향에 대한 꽃게육 단백질 가수분해는 도 3의 A 3D 표면과 등고선 식으로 보여준다. 투입한 효소 농도를 2% 로 고정하고 반응 온도 범위인 40~60℃와 반응 pH 범위인 6-8 에서 표면 반응의 분석결과 반응 온도와 pH는 단백질 가수분해에 영향을 주는 것으로 나타났다. 반응 온도에 따른 가수분해는 40℃에서 50℃까지 점차 증가하다가 약 52℃부근에서 정상점을 지나 점차 감소하였고, pH에 따른 가수분해는 pH 6에서 서서히 증가하다가 약 pH 6.8 일 때 정상점을 지나 서서히 감소하였다. 따라서 투입한 효소 농도를 2%로 하였을 때 가수분해도의 최대값은 정상점(stationary point)으로 반응온도 약 52℃와 반응 pH 약 6.8에서 결정되었으며, 이때의 가수분해도는 약 61.06% 이었다.
반응 온도와 bromelain 농도의 영향에 대한 꽃게육 단백질 가수분해는 도 3의 B 에서 3D 표면과 등고선 식으로 보여준다. 효소 반응 pH를 7 로 고정하고 반응 온도 범위인 40-60℃와 효소 농도 범위인 1-3% 에서 표면 반응의 분석결과 반응 온도와 효소 농도는 단백질 가수분해에 영향을 주는 것으로 나타났다. 반응 온도에 따른 가수분해는 40℃에서 50℃까지 점차 증가하다가 약 51℃ 부근을 지나서부터 점차 감소하는 경향을 보여주었고, 효소 농도에 따른 가수분해는 효소 1%에서 부터 서서히 증가하다가 효소 3%까지도 꾸준히 증가하는 경향을 보여주었다. 따라서 반응 pH를 7로 고정하였을 때 가수분해도의 최대값은 실험 범위에 나타나지 않았지만 능선 분석 결과 반응온도 약 51℃와 효소 농도 3%에서 결정되었으며, 이때의 가수분해도는 약 70.74% 이었다.
반응 pH와 bromelain 농도의 영향에 대한 꽃게육 단백질 가수분해는 도 3의 C 에서 3D 표면과 등고선 식으로 보여준다. 효소 반응 온도를 50℃로 고정하고 반응 pH 범위인 6~8 와 효소 농도 범위인 1~3% 에서 표면 반응의 분석결과 반응 pH와 효소 농도는 단백질 가수분해에 영향을 주는 것으로 나타났다. 반응 pH에 따른 가수분해는 pH 6 에서 서서히 증가하다가 약 pH 6.5 부근을 지나서부터 점차 감소하는 경향을 보여주었고, 효소 농도에 따른 가수분해는 효소 1%에서 부터 서서히 증가하다가 효소 3%까지도 꾸준히 증가하는 경향을 보여주었다. 따라서 온도를 50℃로 고정하였을 때 가수분해도의 최대값은 실험 범위에 나타나지 않았지만 능선 분석 결과 반응온도 약 pH 6.5 와 효소 농도 3%에서 결정되었으며, 이때의 가수분해도는 약 71.60% 이었다. 이러한 결과들로부터 표면 반응 분석에서 얻어진 최적 공정은 효소 반응온도 55℃, 반응 pH 6.5, 효소의 양은 3%(w/v)에서 결정되었다. 최적 조건에서 단백질 가수분해도는 71.60%에 도달하였다.
(3) 반응 조건들이 꽃게육 가수분해에 미치는 영향
꽃게육 단백질 가수분해에 대한 반응 변수들에 대한 가수분해 경향은 도 4에서 보여준다. 결과를 종합해 보면 표면 반응의 분석결과 최대값은 실험 범위에 나타나지 않았지만 능선 분석 결과 꽃게육 단백질 가수분해에 미치는 가장 영향을 미치는 것은 온도이다. 온도는 올라갈수록 급격하게 가수분해도가 증가하였다가 또한 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있다. 반면에 가장 영향을 받지 않는 것은 효소의 농도이며 반응 pH 및 온도에 상관없이 효소의 농도가 증가함에 따라서 가수분해도는 꾸준히 증가는 경향을 보여주었다. 따라서 가수분해에 미치는 영향이 온도, pH, 효소의 농도 순으로 크다고 볼 수 있다.
[실험예 4] 꽃게육 단백질 가수분해물의 분리 및 정제
(1) 한외여과를 이용하여 펩타이드 분리 및 정제
분획이 필요한 시료는 동결건조시킨 가수분해물 분말을 이용하여 1000 ppm의 용액으로 사용하거나, 가수분해물을 원심분리하여 상등액을 수거하여 한외여과기(Amicon TCF-10; Amicon Co., USA) 를 이용하여 실온에서 300 rpm으로 N2 가스를 180 psi (1241 kPa) 의 압력을 주어 여과하였다. 시료는 3 kDa 의 여과지를 이용하여 각각 분획하였다. 여과하여 얻어진 시료는 동결건조하였다.
(2) 이온교환수지를 이용하여 펩타이드 분리 및 정제
Dowexⓡ 1ㅧ2, 200수지를 column (2.5ㅧ100cm)에 평형화시켰으며, 평형화된 수지에 펩타이드 1 g을 10 mL의 3차 증류수 용해시킨 후 5 mL을 주입하였다. 용출액은 3차 증류수 75 mL 후 0.1 M Nacl, 0.5 M Nacl 마지막으로 1 M Nacl 용출액을 각각 75 mL 씩 순차적으로 사용하였다. 분획은 Teledyne ISCO사의 자동분획기(Retriever 500)를 사용하였으며, 용출액은 5mL/90sec 씩 분획하여 수집하였다. 각 분획의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다.
(3) 겔 여과에 의한 펩타이드 분리 및 정제
펩타이드 1 g을 10 mL 의 3차 증류수 용해시킨 후 5 mL 을 평형화된 sephadex G-25, column (2.5ㅧ100 cm)에 주입하였으며, 용출액을 5 mL/90 sec 씩 분획하여 수집하였다. 용출액은 3차 증류수를 사용하였으며, 각 분획의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 분획은 Teledyne ISCO사의 자동분획기(Retriever 500)를 사용하였으며, 90초 동안 5mL씩 분획물을 수득하였다.
[실험예 5] 꽃게육 단백질 가수분해물의 특성 분석
(1) 단백질 가수분해물 구성 및 유리 아미노산 분석
동결건조 단백질 가수분해물 0.1 g을 18 mL test tube에 칭량하여 6 N HCl 5 mL를 가하여 감압 밀봉(질소가스 충진)한 후 110℃로 setting된 heating block에 24시간 이상 동안 가수분해시켰다. 가수분해가 끝난 후 50℃에서 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium dilution buffer로 10 mL 정용한 다음, 이 중 1 mL를 취하여 membrane filter 0.2 μm로 여과시켜 아미노산 자동분석기(S433-H, Sykam GmbH, Germany, Munich)로 정량 분석하였다. 아미노산 자동분석기 컬럼은 Cation separation column(LCA K06/Na)을 사용하였고, 컬럼 크기는 4.6 ㅧ 150 mm, 컬럼 온도는 57-74℃, 완충용액과 OPA 시약의 flow rate는 각각 0.45 mL/min, 0.25 mL/min 였으며, 이때 완충용액의 pH 범위는 3.45-10.85이었고, 파장은 440 nm과 570 nm이었다. 유리아미노산 분석은 동결건조 단백질 가수분해물 0.1 g을 1 mL에 용해를 한 후에 구성 아미노산 분석 방법과 같이 분석하였다.
(2) 꽃게육 단백질 가수분해물의 아미노산 분포
가. 꽃게육 단백질 가수분해물의 구성아미노산
꽃게육 단백질을 bromelain 효소로 가수분해하였을 때의 구성아미노산의 분포를 도 5와 표 6에 나타내었다. 구성아미노산 분포는 glutamic acid(6.08%), aspartic acid(10.07%), arginine(8.72%) 순으로 높은 함량으로 나타났고, 그 중에서 필수아미노산 (threonine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, histidine, lysine)의 함량이 40.55%으로 나타났다. 단백질 및 단백질 가수분해물의 아미노산 구성은 기능성에 크게 양향을 미치는 것으로 알려졌다. 펩타이드 소수성의 특성은 세포막의 인지질 층의 통과하여 표적 지점에 도달하기 용이하기 때문에 기능성이 높은 것으로 알려졌다. 꽃게 단백질 가수분해물의 소수성 아미노산은 전체 42.54%를 차지하여 항산화 기능과 관계된 것으로 보인다. 항산화 기능을 나타내는 라이신과 타이로신은 전자를 제공하는 반면에 히스티딘은 이미다졸 구조로 강한 라디칼 소거능력을 지닌 것으로 발표되었다.
Amino acids Comostion of percent of amino acids (%)
Nonpolar side chains
Proline 5.53
Alanine 5.95
Valine 5.73
Methionine 2.50
Isoleucine 4.89
Leucine 7.44
Phenylalanine 4.41
Polar side chains
Threonine 4.73
Serine 4.46
Glycine 6.09
Cystine 0.48
Tyrosine 3.66
Charged side chains
Basic
Histidine 3.44
Lysine 7.41
Arginine 8.72
Acids
Aspartic acid 10.07
Glutamic acid 14.49
Total 100.00
N. D. : Not detected
나. 꽃게육 단백질 가수분해물의 유리아미노산
꽃게육 펩타이드 생성물의 유리 아미노산 함량은 다음 표 7과 같다. 유리아미노산의 분포는 Arginine(17.26%), Leucine(8.61%), Alanine(7.23%), Asparagine(6.03%) 순으로 나타났다. 유리 아미노산 중 구성아미노산을 제외한 아미노산 분포는 asparagine(6.03%), phosphoserine(5.51%), taurine(4.99%) 등의 순으로 존재하였다. 아미노산 함량은 식품의 기호성에 영향을 미치는 중요한 요소이고, 식품의 풍미를 예측하는 하나의 중요한 요소이다. 또한 glutamic acid, aspartic acid, alanine 및 glycine 등은 식픔의 향기와 맛을 부여하게 된다.
Free amino acids Percent of amino acids (%)
Phosphoserine 5.51
Taurine 4.99
Phosphoethanolamine 3.01
Urea N. D.
Aspartic acid 1.38
Hydroxyproline N. D.
Threonine 3.18
serine 3.80
Asparagine 6.03
Glutamic acid 4.78
Sarcocine N. D.
α-aminoadipic acid N. D.
Proline 3.44
Glycine 5.49
Alanine 7.23
Citrulline N. D.
α-aminobutyric acid N. D.
Valine 4.50
Cystine N. D.
Methionine 3.09
Isoleucine 5.03
Leucine 8.61
Tyrosine 5.62
phenylalanine 0.74
β-alanine 3.78
β-aminoisobutyric acid N. D.
γ-amino-n-butyric acid 0.13
Histidine 1.69
1-methylhistidine 0.17
3-methylhistidine N. D.
Carnosine 0.03
Anserine N. D.
Tryptopan 0.44
Hydroxylysine N. D.
Ornitine N. D.
Lysine 0.09
Arginine 17.26
Total 100.00
N. D. : Not detected
(3) 꽃게육 단백질 가수분해물의 분자량 분석
가수분해물 분자량 측정을 위해 matrix는 alpha-cyano -4-hydroxy -cinnamic acid 1 mg을 0.1 mL 70% acetonitrile, 0.1% formic acid에 용해 후 만들었다. 샘플의 농도는 50- 100 ppm 정도로 준비하였으며, matrix시료와 시료를 1:1비율로 섞었다. MS plate위에 1 mL 정도 떨어뜨려 건조한 후 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기 (MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applied biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
(4) 꽃게육 단백질 가수분해물의 펩타이드 분자량 분포
도 6에 나타낸 바와 같이, 꽃게육 단백질 가수분해물의 펩타이드들의 분자량 분포에 대한 분석을 시행하였는데 MALDI-TOF의 그래프에서 X 축은 mass(m/z)를 나타내고 Y축은 이온화 된 물질의 강도를 나타낸다. 불순물이 어느 정도 포함이 되어있지만 대부분의 펩타이드는 m/z 500에서 2,500 이하 분자량 분포를 보여주었다. 따라서 꽃게육 가수분해물 펩타이드들은 아미노산 염기 13에서 23개 정도의 분포를 보여주었다.
꽃게육 단백질의 bromelain 가수분해물의 펩타이드들의 분자량 분포는 7 종류의 이상의 펩타이드들로 구성되었음을 보여준다. 펩타이드 분자량의 분포는 500 ~ 3,200 Da 로 이루어졌음을 보여주었다. 수산물 유래 단백질에 대한 효소 bromelain를 이용한 전갱이 단백질 가수분해물은 항바이러스를 보이는 5 kDa 펩타이드 생산을 보고하였으며, 새우 가공 부산물로부터 생산된 펩타이드는 699 Da, 고등어 근육 1,400 Da, 참치육 가수분해물에서는 분자량이 각각 1305 Da, 938 Da, 584 Da로 보고되었다.
(5) 꽃게육 단백질 가수분해물의 아미노산 구조 분석(Q-TOF)
가수분해물 아미노산 서열 측정을 위해 동결건조된 펩타이드 30 mg을 1mL 펠콘 튜브에 칭량하여 0.1% CF3COOH를 가하여 녹인 다음 Waters Sep-Pak  Silica를 이용하여 펩타이드의 염을 제거한 후 2 mL 70% HCN으로 C18에 부착되어있는 펩타이드를 용출하여 15 uL를 고성능질량분석기(Triple TOF 5600+, ABsciex, Germany)로 정량 분석하였다. 고성능질량분석기 LC method의 컬럼은 ACQUITY UPLC (peptide CSH,1.7um)을 사용하였고, DW와 Acrtonitrile 시약의 flow rate는 300 uL/min 였으며, MS method PDA의 범위는 200-500 nm 이고 MS 범위는 200-2500 m/z 이었다. 이때 전위는 20V이고 온도는 350℃이었다.
(6) 꽃게육 단백질 가수분해물의 LC-MS에 의한 펩타이드 구조분석
펩타이드 동결 건조 분획물을 LC-MS를 이용하여 아미노산의 구조 및 분자량을 측정하였다. 도 7의 A는 RF-HPLC의 크로마토 그램을 보여주고 B는 가장 높은 항산화력을 보여주는 피크의 아미노산 mass 크로마토그램을 보여준다. 연구결과 아미노산 서열은 IISMQMGGDLGQVYR 로 나타났다. 분자량은 1666.81 이었다. 이 서열은 Ile-Ile-Ser-Met-Glu-Met-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly -Glu-Val-Tyr-Arg 이다.
[실시예 1] 꽃게 단백질 유래 기능성 펩타이드 분말 및 엑기스 제조
Bromelain에 의한 꽃게육 가수분해물 시제품 생산 공정은 도 8에서 보여준다. 시제품 생산은 1.5 ton 꽃게에 4.8 kg bromelain을 넣고 50℃에서 2시간 반응하였다. 반응 후 잔사처리를 한 꽃게 단백질 가수분해물의 농도는 12 Brix 였고, 30 Brix까지 농축한 다음 소금과 저감미당을 순서대로 처리하고 난 뒤에 농도를 측정하니 55 Brix로 나타났고 이를 펩타이드 엑기스라고 칭하였고, 열풍건조시켜 펩타이드 분말을 200 Kg을 제조하였다.
[실시예 2] 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 함유하는 어묵 제조
꽃게 펩타이드 어묵 제조 공정도는 도 9에서 보여준다. 냉동상태의 동태어육을 4℃에서 해동시키고 먼저 67.16% 연육에 1.68% 정제염을 넣고 초벌갈이를 한 다음 나머지 부재료를 배합 기준에 따라 넣고 두 번 갈이를 한다. 꽃게 펩타이드 어묵제조 배합표는 표 8에서 보여준다. 분쇄한 생선살을 동그랗게 빚어서 자연응고 시킨다. 그 다음 110-120℃에서 자연응고시킨 동그란 생선살을 튀겨낸다. 튀겨낸 어묵을 4℃에서 20분간 식히면 어묵이 완성된다.
원료번호 재료명 역할 fish cake 1%CP 3%CP 5%CP 10%CP
1 동태연육 주원료 67.16 66.16 64.16 62.16 57.16
2 게펩타이드 기능성원료 0.00 1.00 3.00 5.00 10.00
3 감자전분 증량제 3.36 3.36 3.36 3.36 3.36
4 소맥분 증량제 6.72 6.72 6.72 6.72 6.72
5 정제염   1.68 1.68 1.68 1.68 1.68
6 소르빈산칼륨 보존제 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13
7 GDL 젤강화제 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13
8 설탕 감미 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67
9 정제수   20.15 20.15 20.15 20.15 20.15
  합 계 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00

Claims (3)

  1. (a) 꽃게의 껍질을 벗기지 않고 그대로 분쇄하여 슬러리 형태로 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 꽃게 슬러리에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 꽃게 단백질 유래 펩타이드의 제조방법.
  2. 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
  3. 꽃게 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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