CN110650630A - 从原始生物质中提取增值产品的基于酶的过程 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了从油料种子和谷物生物质中提取增值产品的基于酶的方法。该方法包括碱性预处理步骤，随后利用蛋白水解酶的处理，其提供增加的产物产量和溶解度。获得的产物可以是可溶性蛋白质/肽和纯化的膳食纤维。还描述了这种方法在生产食品、饮料、化妆品、饲料或饲料添加剂产品中的用途。

Description

从原始生物质中提取增值产品的基于酶的过程
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月25日提交的美国临时申请序列号62/489,646的权益，所述临时申请的内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开涉及来自油料种子和谷物作物的生物质的加工，并且更具体地涉及将油料种子和其他谷物的废产物或副产物中的蛋白质与纤维素-半纤维素纤维分离。
背景
将油籽作物和谷物原料加工成有用的食品和饮料产品通常会导致大量的基于纤维的废物或副产品。尽管这些废品包含有价值的蛋白质和纤维组分，但它们的浓度和纯度低，因此通常被作为废品处理，并且处理者去除其所花费用很高。一些油料种子副产品通常用作低价值的动物饲料。
例如，全世界从磨碎的大豆生产豆腐和豆浆的过程每年产生数百万吨的称为豆渣的固体副产品。豆渣含有75％的水分。按干物质计，豆渣含约50％的膳食纤维，25％的蛋白质，10％的脂质和其他营养物质。然而，由于其高营养价值和高水分含量，其在潮湿状态下可发酵并在生产后很短的时间内变质。大量豆渣的废弃带来了重大的环境和经济问题。目前，豆渣中只有极小部分在干燥后被用于食品工业或用作动物饲料。豆渣的大部分被作为肥料倾倒在田间，或作为废物燃烧，对生产者和环境都造成了损失。
同样，当前将玉米和大麦加工为有用产品(诸如乙醇)的方法会导致产生称为干酒糟(DDG)的富含纤维的副产物。目前，DDG主要作为低价值产品用于动物饲料。其高价值组分(诸如蛋白质和膳食纤维)一直未被用作人消费的食品来源，尽管已经报道了一些健康益处，诸如降低心脏病风险(Daniel D.Gallaher,17th Annual Distillers GrainsSymposium，2013年5月15-16日；http://www.distillersgrains.org/files/ scholarships/2013％20Daniel％20Gallaher.pdf)。
同样，来自诸如大豆、棉花、向日葵、油菜和亚麻等的油料种子的各种种子粕也被用作动物饲料，作为大多数牲畜的蛋白质来源。从历史上看，一些油籽诸如野鼠尾草(chia)、亚麻和大麻，也因其声称的来自油和其他组分的健康益处而被人类消费。所有这些农作物的油籽粕都含有与膳食纤维和其他组分混合的高价值的蛋白质。
然而，当油籽粕由于不同原因而被直接消费时，蛋白质的饲喂价值无法得到充分利用。油提取过程中采用的高温工艺降低了粕粉的蛋白质溶解度，还降低了营养价值。对于诸如鱼、鸡和幼猪等动物，高水平的纤维会稀释粕中的蛋白质和能量含量，几乎没有饲喂价值。另外，油籽生物质中包含的抗营养因子诸如胰蛋白酶抑制剂和植酸也有负面影响。动物饲料中胰蛋白酶抑制剂活性的存在会降低生长速度和蛋白质效率比(PER)(Wilson和Poe,1985,Aquaculture,46:19-25)。植酸很难被单胃物种如猪、鸡和鱼消化。植酸可与矿物质、氨基酸和蛋白质形成复合物，从而降低营养物质的消化率。另外，植酸分子中的磷在很大程度上是动物无法利用的，并且随排泄物一起排泄，导致环境破坏。总的来说，由于高纤维、高抗营养因子和高植酸含量，油籽粕或废料直接用作饲料组分时，作为单胃动物(诸如猪、鸡和鱼)的蛋白质来源，其饲用价值有限。
开发简单的绿色技术以从这些生物质中分离出有价值的蛋白质具有巨大的工业应用潜力。
为了从诸如大豆的油料种子中生产高价值的浓缩蛋白和蛋白质分离物，在许多情况下已经开发了不同的水处理系统和技术并将其商业化。然而，几乎所有现有的加工系统和技术都集中在生成单一的高价值蛋白质产品上，而几乎没有或根本没有考虑原料中富含非蛋白质纤维的成分的价值。另外，用于从油料种子生产单一高价值蛋白质产品的当前技术和处理系统经常消耗大量的水和化学品(诸如盐、酸或碱)，以提高蛋白质的提取和分离效率。除了水和化学品费用以外，处置低价值的副产品或废物流也会导致额外的费用。
美国专利号5,658,714描述了通过首先将提取介质的pH调节至碱性条件来从植物粉中提取蛋白质的方法，浓缩后，通过将超滤渗透液的pH调节至3.5-6.0来沉淀提取的蛋白质。美国专利号4,420,425描述了使用碱性条件对脱脂大豆进行水提取的方法。通过过滤除去固体后，通过超滤以＞100kD的分子量截留值来浓缩溶解的蛋白质提取物以产生浓缩蛋白。美国专利号5,989,600描述了用诸如植酸酶和/或蛋白水解酶之类的酶提高植物蛋白溶解度的方法。美国专利号3,966,971教导了通过在水分散体中使用酸性植酸酶来提取植物蛋白的方法。
已报道了使用化学或酶促方法将豆渣的膳食纤维或蛋白质成分分离为单一产品的不同方法。Ma等(1997,Food Research International,29(8):799-805)通过碱性提取和等电沉淀分离了豆渣蛋白。在干燥和脱脂后，所得产物包含83％的蛋白质。然而，与市售产品相比，分离的蛋白质的溶解度降低，限制了其在食品工业中的有用性。可通过冗长的酸修饰方法(Chan和Man,1999,Food Research International 32:119-127)来提高溶解度，但该两步法(先分离蛋白质然后进行化学修饰)将导致生产成本增加，从而降低商业化的可能性。另外，该方法仅回收豆渣中53％的蛋白质，而未利用富含纤维的成分。蛋白酶和植酸酶的组合已被用于提高大豆蛋白的溶解度(Bae等，2013,J.Food Biochemistry,37:511-519)。然而，报道的方法始于大豆蛋白质分离物，仅增加了产品在酸性pH范围内的溶解度。
已经报道了制备豆渣纤维的不同方法。在一项这样的研究(Tian等，2007,ChinaOils and Fats,32(9):64-66)中，将湿豆渣干燥，磨成粉，并浸泡在碱性溶液中，然后进行酶促水解，漂白，乙醇沉淀和干燥。Surel和Couplet(2005,J Sci Food Agric 85:1343–1349)报道了豆渣蛋白的蛋白酶水解以用于纯化豆渣纤维。该方法包括通过化学试剂或脂肪酶水解的蛋白质水解和脱脂步骤。这些方法没有回收蛋白质含量，并且复杂的步骤增加了生产成本。
已报道的从豆渣中提取纤维或蛋白质的方法会导致另一种成分的浪费，并且大多数情况下还包括使用强化学试剂和有机溶剂。另外，据报道所得产物在功能上具有缺陷，诸如纤维的持水量(WHC)降低或蛋白质溶解度降低。迄今为止，尚未开发出针对这两种产品中任何一种的商业化方法，尤其是，还没有报道过可在整合的温和方法中充分利用这种大豆废料来生产富含纤维和富含蛋白质的产品的方法。
需要开发不仅可以解决生物质(例如豆渣)废物的处理问题，而且可以充分利用生物质(例如豆渣)中有价值的成分(特别是蛋白质和纤维)的技术。
本说明书提及多个文件，其内容通过引用整体并入本文。
发明概述
提供以下项目1至项目43：
1.一种用于从生物质生产富含蛋白质和/或肽的级分和富含膳食纤维的级分的方法，所述方法包括：
a)在温和的碱性条件下，在约85℃或更高的温度下，在水溶液中孵育生物质，以获得含水浆料；
b)在适合于蛋白水解酶活性的条件下用蛋白水解酶处理含水浆料；以及
c)从b)的经蛋白水解酶处理的浆料中获得液体级分和固体级分，其中液体级分富含蛋白质和/或肽，而固体级分富含膳食纤维。
2.根据项目1的方法，其中所述生物质呈湿形式。
3.根据项目1的方法，其中所述生物质呈干形式。
4.根据项目3的方法，其中所述方法还包括在步骤a)之前研磨所述干生物质。
5.根据项目4的方法，其中所述方法还包括使磨碎的干生物质通过筛网，任选地为50至200μm的筛网或100μm的筛网。
6.根据项目1-5中任一项的方法，其还包括在步骤a)之前使生物质脱脂。
7.根据项目1-6中任一项的方法，其中所述温和碱性条件包括高于7且不高于约11的pH，为约9至约11的pH或为约10的pH。
8.根据项目1至7中任一项的方法，其中步骤a)在约90℃至约100℃的温度下进行。
9.根据项目8的方法，其中步骤a)在约90℃至约95℃的温度下进行。
10.根据项目1至9中任一项的方法，其中步骤a)进行约15分钟至约2小时、约30分钟至约90分钟或约1小时的一段时间。
11.根据项目1至10中任一项的方法，其中步骤b)在约7至约11的pH下进行。
12.根据项目1至11中任一项的方法，其中步骤b)在约50℃至约80℃的温度下进行。
13.根据项目12的方法，其中步骤b)在约55℃的温度下进行。
14.根据项目1至13中任一项的方法，其中步骤b)进行约15分钟至约2小时，约30至约90分钟或约1小时的一段时间。
15.根据项目1至14中任一项的方法，其中所述水溶液中生物质的量为约0.5％至约20％(w/v)。
16.根据项目1至15中任一项的方法，其中所述蛋白水解酶包括枯草杆菌蛋白酶。
17.根据项目16的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
18.根据项目1至17中任一项的方法，其中步骤c)包括将b)的经蛋白水解酶处理的浆料离心以获得液体级分和固体级分。
19.根据项目1至18中任一项的方法，其中所述方法还包括在步骤b)之后使蛋白水解酶失活。
20.根据项目19的方法，其中所述灭活是热灭活。
21.根据项目20的方法，其中所述热灭活在约80℃至约100℃的温度下进行约5分钟至约30分钟的一段时间。
22.根据项目1-21中任一项的方法，其中所述方法还包括用包含二价阳离子的溶液处理(i)b)的经蛋白水解酶处理的浆料和/或(ii)c)的液体级分。
23.根据项目22的方法，其中所述溶液包含CaCl2、MgCl2、MnCl2和FeCl2中的至少一种。
24.根据项目22或23的方法，其中所述方法包括用包含二价阳离子的溶液处理c)的液体级分以使植酸盐沉淀，并且其中所述方法还包括将所述液体级分与植酸盐沉淀物分离。
25.根据项目22至24中任一项的方法，其中包含二价阳离子的所述溶液以约1.5倍至约20倍当量的量使用。
26.根据项目1至25中任一项的方法，其中所述方法还包括使所述液体级分进行尺寸排阻色谱法或过滤。
27.根据项目1-26中任一项的方法，其还包括浓缩所述液体级分。
28.根据项目1-27中任一项的方法，其中所述生物质是谷物生物质、植物生物质、干酒糟(distiller’s dried grains,DDG)、大豆生物质、菜籽粕或亚麻籽粕。
29.根据项目28的方法，其中所述生物质是大豆生物质。
30.根据项目29的方法，其中所述大豆生物质是豆渣。
31.根据项目1至30中任一项的方法，其还包括干燥所述液体级分以获得富含蛋白质和/或肽的干产品。
32.根据项目31的方法，其中所述富含蛋白质和/或肽的干产品具有比市售大豆浓缩蛋白(soy protein concentrate,SPC)低至少50％的残余胰蛋白酶抑制剂活性。
33.根据项目31或32的方法，其中所述富含蛋白质和/或肽的干产品具有比市售大豆浓缩蛋白(SPC)低至少60％的残余植酸盐含量。
34.根据项目32或33的方法，其中所述市售SPC是
Figure BDA0002278904860000061
F。
35.根据项目1至34中任一项的方法，其还包括干燥所述固体级分以获得富含纤维的干产品。
36.根据项35的方法，其中所述富含纤维的干产品具有约70％或更高的碳水化合物含量和约10％或更低的蛋白质含量。
37.一种具有以下特征的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物：
a)在约3至约11的pH下水溶性大于80％；
b)蛋白质和/或肽含量约为40％或更高；
c)提取物中至少75％的蛋白质和/或肽的分子量小于20kDa；
d)相对于市售大豆浓缩蛋白(SPC)，胰蛋白酶抑制活性和植酸盐含量降低。
38.项目37的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物，其中所述提取物具有约20％碳水化合物的碳水化合物含量和/或约10％的脂质含量。
39.项目37或38的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物，其通过项31-33中任一项的方法获得。
40.通过项目35或36的方法获得的富含纤维的干生物质提取物。
41.饮料、化妆品、食品或饲料产品，其包含项目37-39中任一项的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物和/或项目40的富含纤维的干生物质提取物。
42.一种制备饮料、化妆品、食品或饲料产品的方法，所述方法包括：(i)进行项目31-33中任一项的方法以获得富含蛋白质和/或肽的干产品；以及(ii)将所述富含蛋白质和/或肽的干产品掺入饮料、化妆品、食品或饲料组合物中。
43.一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括：(i)进行项目35或36的方法以获得富含纤维的干产品；以及(ii)将所述富含纤维的干产品掺入食品或饲料组合物中。
在以下详细描述的过程中，将描述其他特征或将使其他特征变得显而易见。
附图简述
在附图中：
图1显示本文所述的使用豆渣的方法的示意图。
图2描绘了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，其显示蛋白酶E1浓度对豆粕水解的影响。
图3是显示蛋白酶E1浓度对豆粕和豆渣提取物中蛋白质释放的影响的图。
图4是显示不同提取步骤后上清液和沉淀中蛋白质含量的图。
图5是描述pH和温度对蛋白质提取的影响的图。
图6是描述pH和温度对碳水化合物提取的影响的图。
图7A是显示不同蛋白酶对豆渣提取物中的胰蛋白酶抑制剂活性的影响的图。NE＝无酶；酶E1至E10描述于下表4中。
图7B是显示不同蛋白酶对豆粕(SBM)中胰蛋白酶抑制剂活性的影响的图。NE＝无酶；酶E1至E10描述于下表4中。
图8是显示不同浓度的CaCl2对豆渣肽提取物中植酸盐含量的影响的图。
图9是显示通过蛋白酶E1制备的豆渣肽提取物的溶解度与商品
Figure BDA0002278904860000081
F的溶解度的比较的图。
图10描绘了豆渣和大豆蛋白提取物的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。
图11描绘了来自不同生物质的水解上清液的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。
发明详述
除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。
除非以其它方式标明，否则此处引用的数值范围仅仅意欲用作单独指示落入该范围内的每个独立数值的速记方法，并且每个独立数值都包含在该说明书内，就如同它是单独在此处描述的一样。范围内的值的所有子集也被并入说明书中，就如同它们在本文中被单独叙述一样。
除非本文另外说明或除非上下文中明显矛盾，否则可按任何合适的顺序进行本文所述的所有方法。
除非另外声明，否则任何和所有实例的使用或本文所提供的示例性语言(例如，“例如”)仅旨在更好地阐明本发明而并不是对本发明的范围构成限制。
在本文中，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用于表示一个数值包括用于确定该数值的设备或方法的误差的固有变化，或包括接近所述数值的值，例如在列举的数值(或数值的范围)的10％或5％之内。
本发明涵盖本文公开的实施方案和特征的任何和所有组合和子组合。例如，本发明涵盖可在其下进行本文所述方法的条件(温度、pH、时间等)的各种实施方案的所有组合和子组合。
本发明人已经开发了酶促方法，以在预处理步骤之后直接从原始生物质中水解蛋白质。进行了高温温和碱性预处理(例如，～60分钟，～90-95℃，pH～10)，这允许对原料进行灭菌，从而最大程度地降低后续酶促工艺被污染的风险，并且还有助于溶解蛋白质和纤维生物质并增加蛋白质和纤维生物质的酶可及性，从而导致良好的蛋白质回收和纯化的纤维成分。在预处理之后，调节温度和pH以适合蛋白酶功能。酶促反应(例如约60分钟)后，大多数蛋白质显示被高效地水解为<20KDa肽和/或氨基酸，并且可将固体级分与液体级分分离。显示利用所选酶的水解导致可溶产物中胰蛋白酶抑制活性降低。与市售大豆浓缩蛋白(SPC)相比，来自豆渣的可溶性产物包含少得多的植酸盐，如果需要，可使用会使大部分剩余的植酸盐沉淀的二价阳离子溶液(诸如CaCl2)进一步降低可溶性产物中的植酸盐含量。将固体级分干燥以获得富含纤维的产物，并将液体部分浓缩并干燥以获得富含蛋白质/肽的产物。
因此，本发明涉及用于从生物质生产富含蛋白质和/或肽的级分和富含膳食纤维的级分的方法，所述方法包括：
a)在温和的碱性条件下，在约85℃或更高的温度下，在水溶液中孵育生物质，以获得含水浆料；
b)在适合于蛋白水解酶活性的条件下用蛋白水解酶处理含水浆料；以及
c)从b)的经蛋白水解酶处理的浆料中获得液体级分和固体级分，其中液体级分富含蛋白质和/或肽，而固体级分富含膳食纤维。
从诸如豆渣和豆粕等生物质中提取高价值产品的工艺开发
大豆生物量
豆渣可作为废物以湿形式广泛地从豆腐或豆浆厂获得，也可作为目前主要用于饲料工业以及小部分用于食品工业的干产品形式获得。豆粕也可在提取油后从油籽加工厂获得。这样的油提取可作为热机械提取或溶剂提取来进行。
其他生物质
本文开发的方法可适用于从其他类型的生物质中提取蛋白质/肽和/或纤维，所述生物质包括植物生物质；谷物生物质；含有显著量(～10％或更多)的与碳水化合物混合的蛋白质的其他生物质；诸如浮萍和海藻等水生植物；以及诸如藻类、酵母、真菌和细菌等微生物生物质。如下文中的实施例所示，该方法已成功应用于大豆生物质(SBM，豆渣)以及其他生物质，包括干酒糟(DDG)、菜籽粕、亚麻籽粕、全麻种子和去皮大麻种子。取决于生物质，必须调整最佳反应条件(例如，pH、温度和时间)，但是在本文定义的范围内。对于所有测试的生物质，蛋白质成分在短时间内被有效地水解，并且在用该方法处理后，蛋白质的回收率显著提高。对于一些样品，提取产物中的蛋白质含量也增加了。
在一个实施方案中，生物质呈湿形式。在另一个实施方案中，生物质呈干形式。
水提取工艺(AEP)的条件：
使用豆渣和豆粕为主要起始生物质，在常规水提取工艺的基础上，在中性或碱性条件下用水悬浮，测试了不同因素对包含蛋白质作为主要成分的可溶性级分的提取的影响。这些因素包括：原料的粒度、提取时间和温度；萃取液条件：pH调节和缓冲系统。
关于原料的粒度，本发明人发现，虽然粗磨将大块破碎可能比较优选的；但并不需要精磨步骤。例如，对于豆粕，最小磨碎粒度大于1μm会产生与细磨到0.125μm相似的效果；类似地，对于干豆渣，与更细的研磨相比，粒度约为1μm的简单研磨同样有效。
特别是对于豆粕，通过研磨减小固体大豆颗粒的尺寸对于提高提取效率可能是优选的。通常将豆粕研磨至一定尺寸，使得颗粒可以通过No.100目(美国标准)筛子。
因此，在一个实施方案中，本文定义的方法还包括在步骤a)之前研磨生物质(干生物质)。在另外一个实施方案中，该方法还包括例如通过使磨碎的干生物质通过筛子，优选通过50至200μm的筛子，更优选100μm筛子来分离尺寸小于约200μm、150μm、100μm、50μm、25μm或10μm的磨碎的颗粒。
在一个实施方案中，本文定义的方法还包括在步骤a)之前使生物质脱脂(例如，去除油)的步骤。用于使生物质诸如大豆生物质(豆渣)脱脂的方法是本领域已知的。脱脂可以通过例如使用合适的溶剂的化学萃取或通过脂肪酶水解来实现。
关于提取时间对蛋白质产量的影响，发现在室温下，随着时间的增加，蛋白质的释放逐渐增加，并且通常在约60分钟后达到稳定。因此，在一些实施方案中，预处理步骤进行少于约2小时，或少于约90分钟，或少于约75分钟的一段时间。在其他实施方案中，预处理步骤进行至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟或至少45分钟的一段时间。在另外的实施方案中，预处理步骤进行约15分钟至约90分钟、约30分钟至约75分钟、约45分钟至约75分钟、约50分钟至约70分钟或约60分钟的一段时间。
当探索提取温度时，较高的温度通常导致比室温(例如，约20-25℃)更高的提取(最高测试温度为90℃)，并且对于豆粕和豆渣提取均获得了一致的结果。因此，在一些实施方案中，预处理步骤在至少约85℃，至少约86℃，至少约87℃，至少约88℃，至少约89℃或至少约90℃的温度下进行。在一些实施方案中，预处理步骤在约85℃至约100℃、约85℃至约95℃或约88℃至约92℃或约90℃的温度下进行。
当测试pH对大豆蛋白质提取的影响时，发现在酸性pH(～3.5至4)时溶解度最低，偏离pH范围的变化增加了溶解度，而温和的碱性条件则导致了最高溶解度。另外，如通过SDS-PAGE所示，在不同pH下提取的蛋白质表现出不同的组成特征。特别地，pH 2提取导致总蛋白质增加，但高分子量种类减少。研究了悬浮在水或缓冲液(pH 8 0.03M Tris-HCl)中的豆粕和豆渣两者的蛋白质提取物，发现缓冲剂可显著提高两种生物质的蛋白质提取率。然而，比较缓冲剂与提取前调节至不同pH(通过NaOH)的水悬浮液的进一步分析表明，蛋白质提取量的增加主要归因于pH值的提高，与调节至同一pH的水悬浮液相比，缓冲的生物质显示出相同的提取效率。
因此，在一些实施方案中，预处理步骤在温和碱性pH下进行，例如在约7至约11、约8至约11、约9至约11或约10的pH下进行。水溶液可以例如是水、盐溶液或缓冲液(例如，Tris缓冲液)。
用于预处理步骤的水溶液中的生物质的浓度可以是适合进行该方法的任何浓度，例如至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％或至少约10％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，水溶液中生物质的浓度为约0.1％至约40％，或者水溶液中生物质的浓度为约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％或约10％至约40％，约30％或约20％。
当测试pH和温度的组合影响时，发现在整个测试pH范围内，升高温度会导致蛋白质提取能力增强。当将反应条件设置在约pH 8-10和约80-90℃时，蛋白质提取相当高效。高温和高pH条件也可导致碳水化合物溶解度增加，从而降低可溶性级分中的总蛋白质含量。分析了温度与pH的组合对总碳水化合物释放的影响。在pH 4与pH 11之间，碳水化合物的释放量很低，受pH值或温度的影响不太显著。在较低的pH值下，在所有测试温度下糖的释放均显著增加。在高于11的pH值下，仅在最高测试温度下才测量到糖的释放增加。因此，约pH 8-10和约80-90℃的反应条件有利于从豆渣获得高质量、良好收率的蛋白质提取，而不增加碳水化合物的释放。因此，在实施方案中，所述预处理在约88℃至约92℃，例如约90℃的温度和为约9至约11，例如为约10的pH下进行。
为了探索在无预处理(pH 10和90℃)的情况下可直接从豆渣中释放多少蛋白质，将豆渣直接用水提取3次，然后将提取的蛋白质合并在一起。与起始材料中的总蛋白质相比，释放出非常少的级分(7-8％)。在一个单独的实验中，在90℃、pH 10(预孵育)下预处理豆渣水悬浮液1小时，然后洗涤3次。该预孵育步骤提高了可溶性蛋白质的回收率。但是，豆渣中只有33％的总蛋白以可溶形式提取。因此，接下来评估了酶处理是否可进一步改善蛋白质回收率。
用于从大豆生物质中提取产品的酶促水性提取方法(EAEP)
使用豆粕(SBM)和豆渣测试了纤维素酶、半纤维素酶、纤维二糖酶、淀粉酶和脂肪酶对油籽生物质的蛋白质提取效率的影响。纤维素酶(SpezymeTM CP)、果胶酶(PectinexTMU)和木聚糖酶(HTX4)均导致糖释放增加。三种酶的组合导致甚至更高的糖释放。用淀粉酶和脂肪酶处理不会导致糖释放。但是，用这些酶处理不会导致蛋白质从生物质中的释放显著增加。
然后评估蛋白酶对总蛋白回收率的影响。选择市售蛋白酶(碱性蛋白酶，CAS号：9014-01-1，在本文中称为蛋白酶E1)以测试该方法。将豆粕和豆渣悬浮在反应缓冲液(pH8，0.03M Tris-Cl)中并用蛋白酶E1(55℃，1小时)处理时，即使极低剂量(0.025％v/v)的酶也可直接在短时间内从原始生物质中有效地将蛋白质水解为小肽。出乎意料的是，与在相同条件下孵育的非酶对照相比，蛋白酶处理还显著增加了提取的蛋白质含量。用豆渣进行了更详细的分析，与非酶对照相比，提取的蛋白质增加了66％。
如上所述，将酶直接添加到悬浮的生物质中导致蛋白质提取增加。进一步探索了添加酶之前的预处理组合是否可导致进一步改善的蛋白质提取。通过在与酶反应相同的温度(55℃)下将生物质悬浮在酶反应缓冲液(pH 8)中来进行预处理。固液分离后，将上清液中释放的蛋白质处理为未经酶处理的基线蛋白质释放。将沉淀进一步重悬并用酶处理，以查看与未经酶处理的样品相比，是否可以释放更多的蛋白质。当引入预处理步骤以及随后对沉淀进行酶处理时；预处理步骤释放出只需测量O.D.280即可轻松检测到的大量蛋白质。随后的蛋白酶处理进一步改善了蛋白质回收率。与未经酶处理的样品相比，提取的蛋白质增加了89％。然而，总蛋白质的回收率仅为约30％，大部分蛋白质仍保留在沉淀不溶级分中。当在较高温度(90℃)和pH 8下进行预处理1小时然后进行酶处理时，总蛋白回收率达到59％，相比之下未经酶处理的回收率达到38％。当在90℃和pH 10的条件下进行预处理然后进行酶处理时，来自豆渣生物质中的总蛋白质回收率可达到85％。富含纤维的不溶级分中的蛋白质含量显著降低。这些结果表明，在温和的碱性条件(pH 10)和高温下进行预处理然后进行蛋白酶处理步骤的结合对于蛋白质提取是高效的。此外，这种酶辅助的水性提取方法具有双重好处，不仅可以提高总蛋白提取效率，而且还可生产相对于全长蛋白/肽混合物具有更好功能(诸如提高的营养消化率)的肽产品。
表征了10种不同蛋白酶(参见下表4中的酶E1至E10)对标准底物的活性，并使用豆粕和豆渣两者以及标准化的酶剂量分析了大豆蛋白质水解特征谱。本发明人发现，使用不同的蛋白酶产生的水解模式类似，所述不同的蛋白酶包括来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(丝氨酸型蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，
Figure BDA0002278904860000141
目录号P5459和EMDMillipore目录号126741)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(丝氨酸型蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，
Figure BDA0002278904860000142
目录号P1236)，米曲霉(Aspergillus oryzae)(内切蛋白酶和外肽酶，
Figure BDA0002278904860000143
目录号P6110)、芽孢杆菌属某种(Bacillus sp.)(丝氨酸型蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，
Figure BDA0002278904860000144
目录号P3111、P5985、P5860)的蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶，
Figure BDA0002278904860000151
目录号P3375和P76220)。大多数水解过程导致蛋白质和肽的所有大小逐渐减小，以及短肽的一些早期积累。对于所有测试的酶，大多数水解肽的分子量小于30kDa。
即使基于SDS-PAGE分析，大多数这些酶似乎释放在相似的分子大小范围的肽，但是这些肽的产量和特性可以并不相同。例如，由于组成不同，来自不同蛋白酶水解的肽的物理和神经营养功能可以不相同。技术人员将理解，可以基于期望的标准，例如在某些条件下更好的水解效率、期望的活性等，来选择要在该方法中使用的蛋白酶(或其组合)。
测试了所述10种蛋白酶产生具有降低的胰蛋白酶抑制活性的产物的能力。与未经酶处理的材料相比，用不同的酶处理会导致胰蛋白酶抑制程度有不同程度的降低，这可能是由于所得水解产物的组成不同所致。
因此，在一些实施方案中，本文描述的方法可使用任何蛋白水解酶(蛋白酶)或其组合来进行，包括内切蛋白酶、外切肽酶、丝氨酸型蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)、半胱氨酸型蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)、苏氨酸-型蛋白酶、天冬氨酸型蛋白酶、谷氨酸型蛋白酶、金属蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶。这些蛋白酶可从任何合适的生物体(细菌、真菌、植物、动物等)中分离，或使用常用技术重组产生。在一个实施方案中，本文定义的方法包括使用一种或多种丝氨酸型蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶。在另一个实施方案中，本文定义的方法包括使用一种或多种半胱氨酸型蛋白酶，例如木瓜蛋白酶。在另一个实施方案中，本文定义的方法包括使用表4中描述的酶E1-E10中的一种或多种。在一个实施方案中，起始生物质是豆渣，并且本文定义的方法包括使用表4中描述的酶E1、E3、E8和E10中的一种或多种酶。在一个实施方案中，起始生物质是SBM，并且本文定义的方法包括使用表4中描述的酶E3、E4和E9中的一种或多种。
可基于所使用的一种或多种蛋白酶来调节蛋白水解步骤的条件(例如，温度、pH、时间)。在一个实施方案中，蛋白水解步骤的温度为约20℃至约80℃，约30℃至约70℃，约40℃至约60℃或约50℃至约60℃。在一个实施方案中，蛋白水解步骤在为约4至约12、为约7至约11、为约8至约11、为约9至约11或为约10的pH下进行。蛋白水解步骤可以在与预处理步骤相同的水溶液中，或在不同的溶液中进行。可在预处理步骤与蛋白水解步骤之间重新调节pH和温度。
在一些实施方案中，蛋白水解步骤进行少于约2小时，或少于约90分钟，或少于约75分钟的一段时间。在其他实施方案中，蛋白水解步骤进行至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟或至少45分钟的一段时间。在另外的实施方案中，蛋白水解步骤进行约15分钟至约90分钟、约30分钟至约75分钟、约45分钟至约75分钟、约50分钟至约70分钟或约60分钟的一段时间。
在一个实施方案中，本文定义的方法还包括在蛋白水解步骤之后使蛋白水解酶失活的步骤。使蛋白酶失活的方法是本领域公知的，包括例如化学灭活(例如，使用蛋白酶抑制剂)、pH灭活(例如，通过添加酸或碱使得混合物/浆料的pH与蛋白水解活性不相容)或热灭活。在一个实施方案中，使蛋白水解酶失活的步骤包括热灭活，例如通过将浆料加热至至少70或80℃的温度持续至少5或10分钟来进行热灭活。在一个实施方案中，热灭活包括将浆料加热至80至约100℃(例如80℃、85℃、90℃或95℃)的温度，持续约5至约30分钟，优选约10-20分钟或约15分钟的一段时间。
产品中的植酸盐(植酸)含量的减少
希望减少使用本文所述方法获得的产品中的植酸盐含量。值得注意的是，植酸盐通常被称为抗营养素，因为其会干扰某些营养物诸如矿物质(钙、镁、铁、铜和锌)的吸收。为了实现该目的，测试了选定的二价阳离子(CaCl2,MgCl2,MnCl2和FeCl2)以减少(通过沉淀)肽产品中抗营养性的植酸盐的浓度。在所测试的生产条件(pH 10)下，MnCl2似乎最有效地诱导植酸盐沉淀，尤其是在较低浓度下。在1.5倍当量(1当量，即1倍，被定义为每分子植酸盐为六分子的二价阳离子诸如钙)和更高的浓度下，CaCl2和FeCl2的表现也很好。当在实验室规模实验中进行测试时，在优化的条件下以及当以更高的浓度使用时，CaCl2能够使最终产品中的植酸盐浓度降低95％。
因此，在一个实施方案中，本文定义的方法还包括减少植酸盐含量的步骤。降低组合物中的植酸盐含量的方法是本领域公知的，包括例如利用植酸盐分解酶(例如植酸酶)或二价阳离子进行处理。植酸酶可来自任何来源/起源，例如真菌、细菌、酵母或植物。在另外一个实施方案中，该方法包括用包含一种或多种二价阳离子的溶液，例如包含CaCl2、MgCl2、MnCl2和FeCl2中的一种或多种的溶液处理步骤b)的经蛋白水解酶处理的浆料。在另外一个实施方案中，溶液包含CaCl2。在一些实施方案中，浆料中二价阳离子的量为约0.5倍至约50倍当量，或约1倍至约40倍当量，或约1.5倍至约25倍当量。
针对产品回收和质量开发的最终工艺
随着两步蛋白酶过程、用于蛋白水解和降低胰蛋白酶抑制活性的合适的候选酶以及添加二价阳离子用于植酸盐沉淀的条件的确定，最终确定了用于获得最佳的产品回收率和质量的工艺。根据本文所述的一个实施方案，所鉴定的最佳参数是：在约90℃，pH 10下预处理约1小时，然后用选定剂量的酶处理约1小时，并以鉴定的剂量加入CaCl2。然后将上清液(液体级分)与固体级分分离(例如，使用离心、过滤或用于分离液体和固体级分的任何其他合适的方法)，并且可将所述上清液浓缩并干燥以获得富含蛋白质/肽的可溶性产物。可干燥富含纤维的固体级分以用作食品或饲料的纤维产品。
因此，本发明涉及由生物质生产富含蛋白质和/或肽的级分和富含膳食纤维的级分的方法，所述方法包括：
a)获得干或湿形式的生物质；
b)任选地研磨生物质；
c)用pH调节至碱性条件且温度调节至90℃或更高的水溶液溶解和提取生物质或磨碎的生物质；
d)重新调节含水浆料的温度和pH并用蛋白水解酶处理其；
e)任选地降低植酸盐的含量，例如通过向浆料中添加二价阳离子溶液(例如，CaCl2)以沉淀植酸盐内容物；
f)任选地使蛋白水解酶失活；
g)分离液体和固体级分；
h)任选地浓缩液体级分以获得液体浓缩物；
i)任选地干燥液体浓缩物以获得可溶的富含蛋白质和/或肽的产物；以及
j)任选地干燥固体级分以获得不溶于水的富含纤维的产物。
在一些实施方案中，步骤e)可在步骤g)之后进行，然后进行另一轮固/液分离以消除沉淀的植酸盐内容物。可将液体级分进一步浓缩并干燥为最终产物。
在一些实施方案中，在步骤h)之前，可对液体级分进行一个或多个纯化步骤，例如使用基于目标产物的特征的膜过滤系统基于分子量或大小差异进行的纯化。
在一个实施方案中，本文定义的工艺不包括使用有机溶剂。
产品特征
表1显示了
Figure BDA0002278904860000181
F(来自Archer Daniels Midland，ADM)与通过本文所述方法获得的两种肽产物之间的组成比较。从豆渣中提取的蛋白质/肽样品的氨基酸谱分析表明，与来自ADM的市售大豆浓缩蛋白(SPC)
Figure BDA0002278904860000182
F相比，必需氨基酸和非必需氨基酸两者的比率相似，这表明如果其他特征相同，则可预期营养价值相同。然而，溶解度分析表明，通过本文所述方法获得的提取的蛋白质/肽产物在很宽的pH值范围(3至11)中始终表现出较高的溶解度(>80％)，而市售的SPC
Figure BDA0002278904860000183
F在pH 3与pH 9之间仅显示约10％的溶解度，并且仅在pH 11时才提高至25％。与
Figure BDA0002278904860000184
F相比，通过本文所述方法获得的豆渣来源的肽产品包含较低量的蛋白质，这主要归因于原料中较低的蛋白质含量(豆渣的25％对比豆粕的通常>50％)以及豆渣和肽产品中的多余脂质。然而，相对于F，在通过本文所述的方法获得的豆渣提取物中检测到较低浓度的抗营养因子。酶促方法还导致蛋白质/肽产物大部分小于20kDa，水解度＞20％。该过程还导致较低的胰蛋白酶抑制活性和植酸含量。因此，通过本文描述的方法获得的提取的蛋白质/肽产物可用于更广泛的应用范围，包括食品、饲料、饮料、化妆品并且具有良好的功能性和营养价值。
表1：通过本文所述的方法获得的豆渣产品与市售大豆浓缩蛋白
Figure BDA0002278904860000191
F的成分比较
Figure BDA0002278904860000192
因此，在另一方面，本发明涉及富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物，优选大豆生物质提取物，其包含本文所述的多个特征中的一个或多个特征。在一个实施方案中，所述富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物包含本文所述特征中的至少2个、3个、4个或5个特征。在另外一个实施方案中，提取物包含以下特征中的至少1个、2个、3个或全部特征：
a)在约3至约11的pH下水溶性大于80％；
b)蛋白质和/或肽含量约为40％或更高；
c)提取物中至少75％的蛋白质和/或肽的分子量小于20kDa；
d)相对于市售大豆浓缩蛋白(SPC)，胰蛋白酶抑制活性和植酸盐含量降低。
在另外一个实施方案中，提取物中至少80％、至少85％或至少90％的蛋白质和/或肽的分子量为约20kDa。
在一个实施方案中，如使用以下实施例中描述的方法所测量的，提取物具有的胰蛋白酶抑制活性小于约3、2.5或2TUI/mg。
在一个实施方案中，如使用以下实施例中描述的方法所测量的，提取物的植酸盐含量小于约25或20mg/g。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物。
在另一方面，本发明提供了富含纤维的干生物质提取物，优选大豆生物质提取物，其包含本文所述的多个特征中的一个或多个。在一个实施方案中，通过本文所述的方法获得富含纤维的干生物质提取物。
在一些实施方案中，可将本文所述的提取物掺入各种食品诸如饮料(例如，软饮料)；奶制品；调味料；糖果，诸如烤制的糖果、营养棒、谷物、糖果、树胶、果冻等；片剂；面包；米饭；素食食品(汉堡、香肠、格兰诺拉麦片产品、肉酱
Figure BDA0002278904860000201
等。在一个实施方案中，将本文所述的提取物掺入动物饲料(家畜、宠物)中。
在一些实施方案中，可将本文所述的提取物掺入化妆品/组合物中。此类化妆品/组合物可以例如呈乳膏、乳剂、泡沫、凝胶、洗剂、牛奶、慕斯、软膏、糊剂、粉末、喷雾剂或混悬剂的形式。化妆品/组合物任选地包含至少一种化妆品可接受的助剂。化妆品上可接受的助剂包括但不限于载体、赋形剂、乳化剂、表面活性剂、防腐剂、香料、芳香油、增稠剂、聚合物、凝胶剂形成剂、染料、吸收色素、光保护剂、稠度调节剂、抗氧化剂、消泡剂、抗静电剂、树脂、溶剂、溶解度促进剂、中和剂、稳定剂、灭菌剂、推进剂、干燥剂、遮光剂、化妆品活性成分、毛发聚合物、毛发和皮肤调理剂、接枝聚合物、水溶性或可分散的含硅聚合物、漂白剂、护理剂、着色剂、调色剂、鞣剂、保湿剂、加脂剂、胶原蛋白、蛋白质水解物、脂质、润肤剂和软化剂、调色剂、鞣剂、漂白剂、角蛋白硬化剂、抗菌活性成分、滤光片活性成分、驱避剂活性成分(repellant active ingredients)、充血物质、角质溶解和角质形成物质、去头皮屑活性成分、消炎药、角质化物质、用作抗氧化剂和/或自由基清除剂的活性成分、皮肤增湿或保湿剂物质、加脂活性成分、除臭活性成分、皮脂过多活性成分、植物提取物、抗红斑或抗过敏活性成分及其混合物。
本发明还涉及饮料、化妆品、食品或饲料产品，其包含本文所述的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物或富含纤维的干生物质提取物。
本发明还涉及制备饮料、化妆品、食品或饲料产品的方法，该方法包括：(i)进行本文所述的方法以获得富含蛋白质和/或肽的干产品；以及将所述富含蛋白质和/或肽的干产品掺入饮料、化妆品、食品或饲料组合物中。
本发明还涉及制备饮料、化妆品、食品或饲料产品的方法，该方法包括：(i)进行本文所述的方法以获得富含纤维的干产品；以及将所述富含纤维的干产品掺入饮料、化妆品、食品或饲料组合物中。
实施例
为了可以更清楚地理解本发明，现在将参照附图通过非限制性实施例来详细描述其实施方案。
实施例1：关于豆渣和豆粕水解的蛋白酶E1的剂量分析
为了分析蛋白酶是否可以直接从原始生物质中高效地水解大豆蛋白质而无需先纯化该蛋白质，将冻干的脱脂豆粕样品以2.8％的固液比(W/V)悬浮在0.03M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，并在55℃下加入酶孵育1小时。将流行的市售的蛋白酶之一(Sigma P5459；在本文中定义为蛋白酶E1)用于测试对大豆蛋白质水解的剂量作用。对于空白，反应在不添加酶的单独试管中进行。测试的酶剂量为0.0025％、0.005％、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％(v/v)。1小时后，通过将反应管在95℃下孵育15分钟来终止反应。将反应管以20,000xg离心20分钟以分离液体与固体级分。在SDS-PAGE凝胶上分析上清液。将来自每个反应的等体积(15μl)液体加载到12％丙烯酰胺凝胶上，并将SDS-PAGE凝胶在130伏特下运行1小时，然后用考马斯兰染色。结果示于图2中。与无酶对照相比，极低剂量的酶足以将较高分子量的蛋白质水解至大部分低于40kDa。剂量增加导致较高分子量的蛋白质以及约30-40kDa的较低分子量的蛋白质的密度进一步降低，这表明更多的蛋白水解为低于30kDa的较小肽。在0.04％的剂量下，除非常弱的约30-40kDa肽级分外，大部分蛋白质水解为短肽。随着剂量进一步增加至0.08％，约30kDa的肽几乎变得不可见。这些结果表明，大豆蛋白质可在小剂量的蛋白酶E1存在的情况下在1小时内高度水解为短肽或氨基酸。
为了分析蛋白酶E1剂量对大豆和豆渣蛋白质提取的影响，将豆粕和豆渣样品冷冻干燥，并以2.8％的固液比(W/V)悬浮在0.03M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中。反应孵育、蛋白酶E1剂量和固液分离与之前描述的相同。通过测量在O.D.280nm处的吸收来测试上清液的释放的蛋白质含量。将O.D.280值针对酶剂量作图(图3)。对于豆渣和豆粕两者，该酶在非常低的剂量下影响蛋白质的释放。剂量增加导致蛋白质释放增加，其在约0.05％的剂量时达到稳定。由蛋白酶水解导致的豆粕或豆渣的蛋白质释放的该显著增加是出乎意料的。在以下实施例中报告了这种影响的进一步详细表征。
实施例2:蛋白酶对来自豆渣的蛋白质提取率的影响
为了进一步确定蛋白酶处理对从豆渣中提取蛋白质的影响，将冻干的豆渣悬浮在固液比为2.8％的0.03M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，并在55℃孵育1小时。通过在台式离心机上以20,000g离心10分钟来分离固体和液体，并保留上清液。以0.01％v/v的比例加入蛋白酶E1，并将反应物在55℃下孵育1小时。之后，通过在95℃孵育15分钟来终止反应。对于无酶对照，并行地进行不添加酶的单独反应。在95℃经过15分钟的步骤后，离心后收集上清液，并在55℃用相同的缓冲液将沉淀再次提取1小时。进行固液分离后，按照制造商的方案，利用Coomassie PlusAssay试剂盒(Thermo Scientific)，使用Bradford蛋白质测定(BPA)方法对分别保存和冷冻干燥的所有液体的蛋白质含量进行分析。或者，将豆渣样品悬浮在Tris缓冲液中，并如前所述直接用蛋白酶处理，然后进行洗涤步骤。在单独的反应中进行了并行的非酶对照实验。使用相同的试剂盒分析每个步骤在上清液中释放的蛋白质。结果概述于表2中。
当将蛋白酶直接加入豆渣悬浮液中时，酶步骤中提取的蛋白质量是非酶对照中提取的蛋白质量的两倍。当包括处理后步骤时，总提取蛋白质相对于非酶对照增加了66％。当引入预处理步骤时，相对于非酶对照，单独的酶处理步骤导致蛋白质提取多了4.5倍。当将所有三个步骤的总蛋白质相加时，总的提取蛋白质增加了89％。
表2：不同提取步骤的上清液中的可溶性蛋白质含量
Figure BDA0002278904860000231
实施例3：蛋白酶对豆渣的可溶性形式和纤维沉淀中的蛋白质含量的影响
固体生物质、豆渣、纤维沉淀和提取的可溶性级分的蛋白质含量均通过凯氏定氮法(AOAC Official Methods 2001.11；J AOAC Int.1999,82:1389-1398)利用GerhardtKjeldatherm消化器，Gerhardt VapodestTM 20s蒸馏器进行测定，并用SI AnalyticsTitrolineTM6 000滴定。
为了测定水释放的蛋白质，将冷冻干燥的豆渣(250mg)在室温下以2.8％的固液比悬浮在水中。通过在AllegraTM X-12R(Beckman Coulter)离心机上以2800g离心15分钟来分离固体和液体，并保存上清液。将沉淀重悬，并将该过程再重复两次。合并来自三个重复的上清液。将合并的上清液和沉淀物冷冻干燥，并通过凯氏定氮法测定蛋白质含量。
为了进行豆渣的预孵育和洗涤，如最后一个步骤一样，将冻干的豆渣悬浮，在pH8.0(用4N NaOH调节)和90℃下孵育1小时。将孵育的上清液和三个洗涤液合并。如最后一个步骤中所述测定上清液和沉淀的蛋白质含量。
对于酶空白，将豆渣洗涤3次，在90℃下于pH 8.0中孵育1小时。如上所述将液体与固体分离，并将沉淀洗涤三遍。然后将沉淀重悬于水中至原始体积，将pH调节至8.0，并在无酶的情况下于55℃孵育1小时。如上所述将液体与固体分离，并将沉淀洗涤3次。合并所有液体上清液。将合并的液体和洗涤的沉淀均冷冻干燥，并通过凯氏定氮法测定蛋白质含量。对于酶辅助提取，除在55℃下添加0.005％(V/V)蛋白酶E1并持续1小时外，所有操作均与酶空白相同。
表3和图4显示了不同操作后上清液中的蛋白质回收率和沉淀中剩余的蛋白质含量。在室温下进行3次洗涤可导致10％的蛋白质释放；高温、pH 8的预孵育，然后3次洗涤，导致33％的蛋白质回收率；当添加另一步骤(55℃持续1小时)的非酶处理并进行3次洗涤后，实现38％的蛋白质回收率；在55℃下进行的1小时步骤期间添加酶导致上清液中蛋白质回收率达到59％。相应地，沉淀中残留的蛋白质含量从87％降至36％。
表3：以下不同提取步骤的上清液和沉淀中的蛋白质含量
Figure BDA0002278904860000241
实施例4:PH和温度对蛋白质提取的影响
将冷冻干燥的豆渣以2.5％(W/V)的比例悬浮在水中，用4N HCl(pH 1.5→7)或4NNaOH(pH 7→12)调节pH。将不同pH的豆渣悬浮液在不同温度下孵育1小时。通过以2800g离心10分钟来进行固液分离。按照制造商的方案，使用Protein DC试剂盒分析上清液中的蛋白质含量。
pH和温度的组合影响示于图5中。在整个测试pH范围内，温度升高导致蛋白质提取能力提高。蛋白质溶解度在pH值3至5之间最低，并且在将pH值调整为更高或更低时，蛋白质溶解度在两个方向上均增加。在90℃下，pH 1和pH 10导致相似的高蛋白质释放。在pH10和90℃下，蛋白质回收率很高，并且这些条件可与实际生产过程相容。
实施例5：PH和温度对碳水化合物提取的影响
总碳水化合物通过加以改进的苯酚/硫酸法(Nielsen,2003,Food AnalysisLaboratory Manual,Chapter 6；DuBois等，1956,Anal.Chem.,28:350–356；Mecozzi,2005,Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,79:84–90)进行了分析。将豆渣样品悬浮并在不同的温度和pH下孵育，并如上所述提取1小时。将来自不同提取物的上清液(10μL)放入15mL FalconTM管中。加入水和80％苯酚后，将H2SO4母液直接添加到试管中。将样品涡旋并在室温下放置10分钟，然后在25℃水浴中冷却10分钟，然后利用紫外光谱仪进行O.D.490读取。如图6所示，将O.D.值相对pH绘图。
此工艺开发的主要目标之一是提高提取产物中的蛋白质回收率和蛋白质含量。蛋白质含量还受提取产品中释放的碳水化合物影响。测试了pH和温度对糖释放的组合影响。在pH 4至11之间，碳水化合物的释放量很低，受pH值或温度的影响不显著。在较低的pH下，在所有测试温度下糖的释放均显著增加。在高于11的pH下，仅在测试的最高温度下才测量到糖释放增加。因此，即使蛋白质释放高，酸性条件也不是有利的。在较高的pH和温度下，碳水化合物的释放未增加，而蛋白质的释放增加，因此，提取物中增加的蛋白质回收率和更高的蛋白质含量是可能的。
实施例6：酶处理对大豆样品的胰蛋白酶抑制剂活性的影响
根据已建立的EAEP工艺，用豆渣和脱脂豆粕测试了表4中列出的十种市售蛋白酶(E1至E10)。基于通用蛋白酶活性测定法
Figure BDA0002278904860000263
使用非特异性底物酪蛋白
Figure BDA0002278904860000262
测试了蛋白酶的相对活性。用标准化量的每种酶水解经预处理的豆渣和豆粕(SBM)。
胰蛋白酶抑制剂活性测定按照加以微小改进的公开的方法(Kakade等，1969,Cereal Chem 46:518-526；Kakade等，1974,Cereal Chem 51:376–381)进行。将干燥的样品(0.5g)磨碎，使其通过60目筛网，并用25ml 0.01N NaOH提取3小时，同时在室温下以150rpm的速度摇动(悬浮液的pH值约为9.5至9.8)。稀释该悬浮液，从而获得40-60％的胰蛋白酶抑制作用。与胰蛋白酶溶液混合后，将反应物在37℃水浴中孵育10分钟，然后添加苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(BAPA)溶液，再孵育10分钟。用乙酸终止反应后，针对试剂空白和样品空白测量O.D.410。
胰蛋白酶单位(TU)被任意定义为在所使用的条件下，每10ml反应混合物在410nm处增加0.01个吸光单位。抑制胰蛋白酶单位(TUI)是在有和无大豆样品的情况下测定的胰蛋白酶单位的差异。
如图7A和图7B所示，与对照样品相比，用所有酶处理导致胰蛋白酶抑制活性不同程度的降低。酶1、3、8和10对豆渣表现出最显著的影响，而酶3、4和9对豆粕最有效。
表4：筛选过程中使用的酶的列表
实施例7：从豆渣提取的蛋白质的植酸盐含量
按照加以小改进的公开的方法(等，2011,Actaperiodicatechnologica 42:11-21；Gao等，2007,Crop Science 47:1797-1803)进行植酸含量测定。
将豆渣的干燥样品(0.5g)通过60目筛网，并在室温下与HCl和TCA孵育2小时，同时以250rpm摇动。在10℃下以10,000g离心20分钟后，将上清液用0.22μM注射器式过滤器过滤，然后用去离子H2O稀释25倍。
通过在反应管中加入韦德试剂(0.03％FeCl3 6H2O和0.3％磺基水杨酸)进行植酸含量的比色测定。离心后，在500nm处测量吸光度。
计算：O.D.500的减小值反映了样品中植酸盐的含量，这通过从样品吸光度中减去试剂空白吸光度而获得。用植酸钠标准曲线计算植酸盐的量。
检查了添加CaCl2对从豆渣中提取的肽产物中植酸盐浓度的影响。在单独的实验中，在提取过程中添加了不同量的CaCl2，并在不同的时间点取样。如图8所示，随着水解过程中CaCl2当量的增加，提取的可溶性产物中植酸盐的量以剂量依赖性方式降低。在以15当量和更高当量加入CaCl2后30分钟，植酸盐含量降至最低。在该过程结束时，豆渣的对照浆液(未添加CaCl2)的植酸盐约为240μg/mL，而以较高浓度添加CaCl2导致最终产品中的植酸盐减少高达95％，如图8中所示。
实施例8：豆渣肽的水解度(％DH)
将豆渣生物质以10％的固液比悬浮在水中，用4N NaOH将pH调节至10，并在90℃提取1小时，然后将温度调节至55℃，并使用4N HCl将pH重新调节至8。以0.005％的剂量添加蛋白酶1，并在不同时间点采集水解样品。重复实验并且并行地进行不含酶的对照实验作为比较。通过测量水解度(％DH)来监测水解过程。
按照加以小改进的公布的方法(Nielsen等，2001,J Food Sci.66:642-646；Vigo等，1992,Food Chem.44:363–365)，用邻苯二甲醛(OPA)进行％DH。将样品稀释至每mL含有1-10mg蛋白质，并记录稀释倍数。加入所有反应试剂后，将混合物静置恰好2分钟，然后测量A340。
DH计算为：％DH＝h/htot*100；
h＝(丝氨酸-NH2-β)/α；
大豆蛋白的参数：β＝0.342；α＝0.970；htot＝7.8。
如下获得来自OD读数的等效丝氨酸-NH2：
根据反应条件获得反应体积(L)、样品重量(g)和蛋白质浓度。将样品的蛋白质百分比输入为百分比，而不是分数。
表5中显示的结果表明，在反应的5分钟内水解降解增加，并且DH持续增加直至最后时间点。在60分钟时，达到24％至27％的DH百分比，而对照样品则恒定地保持在7％与10％之间。
表5：90分钟的时间过程中豆渣肽的DH(％)
时间(分钟) 对照1 对照2 实验1 实验2
0 9.1 6.8 7.1 7.2
5 10.1 6.8 12.9 12.9
15 8.8 6.7 15.9 17.69
30 9.1 6.8 19.5 22.3
45 9.3 6.7 22.5 25.3
60 8.9 7.0 23.6 26.6
90 9.7 6.9 26.9 31.0
实施例9:来自豆渣的产品溶解度与市售产品
Figure BDA0002278904860000282
F的比较
通过使用加以小改进的Lee和Morr的方法(Lee等，2003,JAOCS 80,85–90；Morr等，1985,J.Food Sci.50:1715–1718)测量蛋白质的溶解度。将一批由蛋白酶E1制备的豆渣肽产物和商品
Figure BDA0002278904860000283
F(ADM)以2％(W/V)的浓度悬浮在0.1M NaCl溶液中。用1N NaOH或1NHCl溶液调节pH后，将悬浮液用空气振荡器在室温、100rpm下充分混合30分钟。然后将悬浮液以20,000g离心15分钟。使用凯氏定氮法和6.25的转换系数测量上清液和原始固体粉末中的蛋白质含量。蛋白质溶解度计算为上清液中蛋白质占原始样品的总蛋白质的百分比。
与在pH 3与9之间仅显示约10％的溶解度和在pH 11下显示25％的溶解度的市售大豆浓缩蛋白F相比，通过本文所述方法获得的提取的蛋白/肽产物在整个pH的测试范围(3至11)内始终显示出高溶解度(>80％)(图9)。
实施例10：酶和CaCl2处理对豆渣可溶性提取物中蛋白质和抗营养因子浓度的影响
通过在酶步骤中添加5当量的CaCl2以降低抗营养植酸盐的浓度来进行所建立的方法(包括预处理步骤，然后酶处理)。提取以1L规模进行了3次。无酶和/或无CaCl2的对照提取也进行了三次。将最终提取物的样品冻干并分析其产量和抗营养因子(胰蛋白酶抑制活性和植酸)。利用酶和CaCl2进行的提取方法导致53％的蛋白质回收率，这略低于不使用CaCl2的提取率(60％)，这表明当在酶水解过程中将CaCl2添加到生物质悬浮液中时，CaCl2可能还会降低溶解度或沉淀一些可溶性蛋白质。然而，利用或不利用CaCl2的酶促过程产生的蛋白质产量要比未使用酶的提取(47％)高。另外，水解产物中的蛋白质含量也增加。在重现性方面，所有三种提取方法产生的蛋白质产量变化幅度均不超过8.5％(标准偏差)。在提取的产物中，当在方法中使用CaCl2和蛋白酶时，抗营养因子降低。如表6所示，添加CaCl2可使植酸减少40％，添加酶可使胰蛋白酶抑制活性降低60％。取决于最终产品的需要，当需要时可通过增加CaCl2浓度来进一步降低植酸盐的含量。
表6：酶和CaCl2处理对提取的肽产物中蛋白质和抗营养因子浓度的影响
Figure BDA0002278904860000301
实施例11:从豆渣和完整大豆提取的蛋白质的比较
如上所述，通过将干燥的豆渣悬浮于pH 8Tris-Cl缓冲液或调节至不同pH值(pH6、7、8、9和10)的水中来提取豆渣蛋白。通过将干大豆在室温下在水中浸泡2小时，然后研磨10分钟，随后将研磨的悬浮液煮沸30分钟来由与豆渣相同种类的大豆制备豆浆。通过经过3层粗滤布的过滤获得豆浆。通过运行SDS-PAGE凝胶，然后进行考马斯蓝染色比较提取的样品。从豆渣中提取的蛋白质的肽谱显示出非常相似的模式，包括贮藏大豆11S/7S蛋白和其他次要组分(图10)。这表明豆渣提取的蛋白质与完整大豆提取的蛋白质之间的蛋白质/肽组成没有显著差异。
另外，将四种不同批次的豆渣肽提取物的氨基酸谱与市售大豆浓缩蛋白F进行了比较。按照常规方法，用HCl水解
Figure BDA0002278904860000303
F和豆渣肽提取物。按照制造商的说明(Agilent Application Note 5990-454，用于食品和药物)，使用AgilentZORBAXTM Eclipse Plus C18 AA方法和ZorbaxTM Extend C18柱(Agilent p/n 763954-302)进行氨基酸谱分析。按照制造商的说明以0.42mL/分钟的流速选择氨基酸内标制剂、流动相和梯度。还按照制造商的说明进行了利用二极管阵列检测器(DAD)的检测和定量(内标和校准溶液)。对于每个样品，将测定重复两次，并将重复的平均值报告于表7中。
表7：四个不同批次的豆渣肽提取物(R1P-R4P)和市售大豆浓缩蛋白
Figure BDA0002278904860000304
F的氨基酸谱分析
AAs(g/100g蛋白I) SPC(Arcon F) R1P R2P R3P R4P
苏氨酸 3.37 3.62 3.35 3.30 2.82
缬氨酸 3.36 3.88 3.39 3.65 3.78
异亮氨酸 3.33 3.59 3.19 3.25 3.26
亮氨酸 6.40 3.54 6.03 6.34 6.41
酪氨酸 2.82 2.87 2.58 2.57 2.64
苯丙氨酸 4.12 4.25 3.85 NA 4.11
赖氨酸 4.76 4.55 3.92 4.08 3.92
半胱氨酸<sup>*</sup> 0.5 0.24 0.36 0.25 0.26
甲硫氨酸<sup>*</sup> 0.88 0.81 0.65 0.97 0.79
丙氨酸 3.53 3.92 3.51 3.59 3.69
天冬氨酸 9.66 10.58 9.25 9.20 8.85
谷氨酸 16.66 18.59 16.10 15.90 15.31
丝氨酸 4.53 4.62 4.16 4.34 4.18
组氨酸 2.20 2.45 2.08 2.32 2.35
甘氨酸 3.28 3.61 3.11 3.24 3.39
精氨酸 6.17 7.04 5.97 6.31 5.65
必需氨基酸以粗体标示。*半胱氨酸和甲硫氨酸被酸水解部分氧化，因此所报告的值被低估。色氨酸被酸水解完全破坏，因此未报告于表中。
实施例12：开发的方法在其他生物质中的应用
已在100mL规模上针对其它生物质测试基于豆渣提取物的已建立的方法；对每种生物质测定提取产物中的蛋白质回收率和含量。通过将提取的蛋白质的量与原始生物质中的总蛋白质进行比较来测定蛋白质的回收率。通过将提取蛋白质的量与提取产物的总重量(基于干物质)进行比较来确定蛋白质含量。为了提高蛋白质产量，对于提取干酒糟(DDG)和菜籽粕，将预处理的pH升高至11。另外的步骤和其他样品均遵循上述方法。对于所有测试材料，如表8中所示，酶促过程显著提高了蛋白质回收率。与非酶对照相比，在DDG中看到蛋白质回收率的最大增加(40％至74％)，在菜籽粕中看到蛋白质回收率的第二大增加(65％至87％)。就提取产物中的蛋白质含量而言，DDG和菜籽粕显示最大的增加，而亚麻和大豆则略有增加。
表8：使用本文所述方法获得的来自不同生物质的提取物中的蛋白质回收率和含量
Figure BDA0002278904860000321
为了确定先前描述的主要基于豆渣的方法是否可用于水解其他生物质；用蛋白E1对豆渣、豆粕、DDG和菜籽粕进行小规模提取。对于每种生物质，在15％的丙烯酰胺凝胶上并排分析具有和不具有酶的上清液。如图11所示，当将各种材料与酶一起孵育时，存在从较大分子量的材料至较小分子量的材料的明显转化。对于豆渣而言，大多数蛋白质被水解为小于15kDa的肽，对于豆粕而言大部分在25kDa以下，对于DDG而言大部分在10kDa以下，对于菜籽粕而言大部分在10kDa以下。
权利要求书的范围不应该被实施例中所示的优选实施方案限制，而应该以与整个说明书一致的最宽泛方式解释。

Claims (43)

1.一种用于从生物质生产富含蛋白质和/或肽的级分和富含膳食纤维的级分的方法，所述方法包括：
a)在温和的碱性条件下，在约85℃或更高的温度下，在水溶液中孵育所述生物质，以获得含水浆料；
b)在适合于蛋白水解酶活性的条件下用蛋白水解酶处理所述含水浆料；以及
c)从b)的所述蛋白水解酶处理的浆料中获得液体级分和固体级分，
其中所述液体级分富含蛋白质和/或肽，而所述固体级分富含膳食纤维。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质呈湿形式。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质呈干形式。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括在步骤a)之前研磨所述干生物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括使磨碎的干生物质通过筛网，任选地为50至200μm的筛网或100μm的筛网。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括在步骤a)之前使所述生物质脱脂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述温和的碱性条件包括高于7且不高于约11的pH，为约9至约11的pH或为约10的pH。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤a)在约90℃至约100℃的温度下进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤a)在约90℃至约95℃的温度下进行。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤a)进行约15分钟至约2小时、约30分钟至约90分钟或约1小时的一段时间。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)在为约7至约11的pH下进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤b)在约50℃至约80℃的温度下进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤b)在约55℃的温度下进行。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中步骤b)进行约15分钟至约2小时，约30至约90分钟或约1小时的一段时间。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述水溶液中生物质的量为约0.5％至约20％(w/v)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述蛋白水解酶包括枯草杆菌蛋白酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶来自地衣芽孢杆菌。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中步骤c)包括将b)的经蛋白水解酶处理的浆料离心以获得所述液体级分和所述固体级分。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤b)之后使所述蛋白水解酶灭活。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述灭活是热灭活。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述热灭活在约80℃至约100℃的温度下进行约5分钟至约30分钟的一段时间。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用包含二价阳离子的溶液处理(i)b)的经蛋白水解酶处理的浆料和/或(ii)c)的液体级分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述溶液包含CaCl2、MgCl2、MnCl2和FeCl2中的至少一种。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述方法包括用包含二价阳离子的溶液处理c)的液体级分以使植酸沉淀，并且其中所述方法还包括将所述液体级分与植酸沉淀物分离。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中包含二价阳离子的所述溶液以约1.5倍至约20倍当量的量使用。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述液体级分进行尺寸排阻色谱法或过滤。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其还包括浓缩所述液体级分。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述生物质是谷物生物质、植物生物质、干酒糟(0DDG)、大豆生物质、菜籽粕或亚麻籽粕。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述生物质是大豆生物质。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述大豆生物质是豆渣。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其还包括干燥所述液体级分以获得富含蛋白质和/或肽的干产品。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述富含蛋白质和/或肽的干产品具有比市售大豆浓缩蛋白(SPC)低至少50％的残余胰蛋白酶抑制剂活性。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述富含蛋白质和/或肽的干产品具有比市售大豆浓缩蛋白(SPC)低至少60％的残余植酸盐含量。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述市售SPC是
Figure FDA0002278904850000031
F。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其还包括干燥所述固体级分以获得富含纤维的干产品。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述富含纤维的干产品具有约70％或更高的碳水化合物含量和约10％或更低的蛋白质含量。
37.一种具有以下特征的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物：
a)在为约3至约11的pH范围内水溶性大于80％；
b)蛋白质和/或肽的含量为约40％或更高；
c)所述提取物中至少75％的蛋白质和/或肽具有小于20kDa的分子量；
d)相对于市售大豆浓缩蛋白(SPC)，胰蛋白酶抑制活性和植酸盐含量降低。
38.如权利要求37所述的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物，其中所述提取物具有约20％碳水化合物的碳水化合物含量和/或约10％的脂质含量。
39.如权利要求37或38所述的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物，其通过权利要求31至33中任一项所述的方法获得。
40.一种富含纤维的干生物质提取物，其通过权利要求35或36所述的方法获得。
41.饮料、化妆品、食品或饲料产品，其包含权利要求37-39中任一项所述的富含蛋白质和/或肽的干生物质提取物和/或权利要求40所述的富含纤维的干生物质提取物。
42.一种制备饮料、化妆品、食品或饲料产品的方法，所述方法包括：(i)进行权利要求31-33中任一项所述的方法以获得富含蛋白质和/或肽的干产品；以及(ii)将所述富含蛋白质和/或肽的干产品掺入饮料、化妆品、食品或饲料组合物中。
43.一种制备食品或饲料产品的方法，其包括：(i)进行权利要求35或36的方法以获得富含纤维的干产品；以及(ii)将所述富含纤维的干产品掺入食品或饲料组合物中。
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