JP2003521908A - 動物飼料における酸安定性プロテアーゼの使用 - Google Patents
動物飼料における酸安定性プロテアーゼの使用Info
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Abstract
Description
物タンパク質を処理するための当該プロテアーゼの使用(in vitro)に関する。
くの人間は、植物タンパク質源から必須タンパク質を摂取する。重要な植物タン
パク質源は、例えば脂肪種子植物、マメ科植物及び穀物である。
なりの比率の当該ダイズ粉の固体が消化されない。例えば、子ブタ及び成長期の
ブタの回腸における、タンパク質の見かけ上の消化率は、約80%に過ぎない。
ンパク質消化が小腸で起こる。従って、胃の通過で生存し得る酸安定性プロテア
ーゼについての必要性が存在している。
は以下の文書によって知られている。
物を開示している。様々なタンパク質分解酵素がp.7に詳述されている。
開示している。適当なプロテアーゼがp.25に列挙されている。
プロテアーゼ及び動物飼料におけるその使用を開示している。
よって、植物タンパク質源からタンパク質を得る方法を開示する。適当なプロテ
アーゼは2段目に記載されている。
トミセスの様々な菌株に由来するプロテアーゼ調製物及び動物飼料におけるそれ
らの使用を記載している。
本明細書に記載のプロテアーゼと相同ではない。
ロテアーゼが今回同定された。
酵素である(プロテアーゼ活性を有する)。プロテアーゼはまた、例えばペプチ
ダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチド加水分解酵素、又はタンパク質分解酵素と称
される。
作用するエンド型のものである(エンドペプチダーゼ)。エンドペプチダーゼは
問題のプロテアーゼの特異性に関連する、N末端及びC末端でブロッキングされ
ているペプチドの基質に対する活性を示す。
されるECリスト(Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, 1992)のEC3.4酵素
群(それらの13個のサブクラスのいずれかを含む)に属する任意な酵素である
。例えば、http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.のワールドワ
イドウェブ(www)を参照のこと。
S)、システインプロテアーゼ(C)、アスパラギン酸プロテアーゼ(A)、メ
タロプロテアーゼ(M)、及び未知のもの、又は現時点で分類されていないもの
(U)、に分類される。Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N.
D. Rawlings, J. F. Woesesner (eds), Academic Press (1998)の、特にgenera
l introductionの項を参照のこと。
リンプロテアーゼである。
アーゼである。用語セリンプロテアーゼはセリンペプチダーゼ及び上文のHandbo
okで定義されているそれらの一族を言及する。このHandbookの1998年版にお
いて、セリンペプチダーゼ及びそれらの一族は第1章から第175章で論じられ
ている。セリンプロテアーゼは、触媒機構がペプチド結合を攻撃する求核試薬と
して働くセリン残基のヒドロキシル基に依存しているペプチダーゼとして定義さ
れ得る。本発明に従う使用のためのセリンプロテアーゼの例は、上文のHandbook
で定義されているように、SA族、例えばS2ファミリー(ストレプトグリシン
(Streptogrisin))、例えばS2Aサブファミリー(α分解性プロテアーゼ)の
プロテアーゼである。
含む基質が利用される、任意なアッセイを用いて測定され得る。アッセイpH及
びアッセイ温度も同様に問題のプロテアーゼに適合される。アッセイpH値の例
は、pH5,6,7,8,9,10,又は11である。アッセイ温度の例は25
,30,35,37,40,45,50,55,60,65,又は70℃である
。
えばSigma S-7388から入手可能)である。このpNA基質の大文字は、1文字ア
ミノ酸コードを表している。別の例はプロタザイムAK(Megazyme T-PRAKによ
って錠剤として調製されたアズリン色素架橋型カゼイン)である。pH−活性及
びpH−安定性の研究にとってpNA基質が好ましく、一方、温度−活性研究の
場合、プロタザイムAK基質が好ましい。
従って、用語プロテアーゼは、天然又は野生型プロテアーゼだけでなく、プロテ
アーゼ活性を示すその任意な突然変異体、変異体、フラグメント等、並びに合成
プロテアーゼ、例えば混合プロテアーゼ、及び共通プロテアーゼを含む。そのよ
うな遺伝子操作したプロテアーゼは、当業界で知られている様に、例えば部位指
定突然変異導入、PCR(PCR反応におけるプライマーの1つとして、所望の
突然変異を含むPCRフラグメントを用いる)、又はランダム突然変異法によっ
て調製され得る。共通タンパク質の調製は、例えばEP897985に記載されている。
cardiopsis alba)由来のプロテアーゼ; (ii) (i)のプロテアーゼの任意なものと少なくとも60,65,70,75,
80,85,90,又は少なくとも95%同一のプロテアーゼ; (iii) 配列番号1及び/又は配列番号2のいずれかと少なくとも60,65,
70,75,80,85,90,又は少なくとも95%同一のプロテアーゼ、 である。
ュータープログラムが使用され得る。そのようなコンピュータープログラムの例
は、Clustal V アルゴリズム(Higgins, D. G., and Sharp, P. M. (1989), Gen
e (Amsterdam), 73, 237-244)及びGCGバージョン8のプログラムパッケージ
において提供されるGAPプログラム(Program Manual for the Wisconsin Package
, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wiscon
sin, USA 53711)(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Mo
lecular Biology,48,443-453)である。
V アルゴリズムを用いる場合、PAM250残基重量表が、Lasergene ソフトウェアパ
ッケージ(DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715,
US)の、MegAlign プログラム, v4.03のデフォルト設定値と一緒に使用される。
マルチプルアラインメントのためのデフォルト設定値は、10のギャップペナル
ティ及び10のギャップレングスペナルティである。2つのタンパク質間の同一
性のパーセンテージを決定するために、以下の設定値が使用される;1のktuple
、3のギャップペナルティ、5のウィンドウ、及び5 diagonal saved。
0のGAPクリエーションペナルティ及び0.3のGAPエクステンションペナルティ
。
テアーゼであり、ここで、用語「微生物の(microbial)」は当該プロテアーゼが
微生物(microorganism)に由来し、又はそれから派生すること、あるいは微生物
に由来する類似体、フラグメント、変異体、突然変異体、又は合成プロテアーゼ
であることを示す。それは、本来の野生型微生物菌株、別の微生物菌株、又は植
物において産生し又は発現することがあり、すなわち当該用語は野生型の、天然
プロテアーゼの発現、並びに任意な宿主における組換え体の、遺伝子操作型又は
合成のプロテアーゼの発現を網羅する。
等を含む。
門の、例えばI綱:アクチノバクテリアの、例えばV亜綱:アクチノバクテリダ
エ(Actinobacteridae)の、例えばI目:アクチノマイセタレス(Actinomycetales
)、XII亜目:ストレプトスポランギネアエ(Streptosporangineae)、例えばII
科:ノカルディオプサセアエ(Nocardiopsaceae)、例えばI種:ノカルディオプ
シス、の細菌、例えばノカルディオプシスsp.NRRL18262、例えばノ
カルディオプシス・アルバ;あるいはプロテアーゼ活性を示す突然変異体又は変
異株である。この分類学は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2n d edition, 2000, Springer (preprint: Road Map to Bergey's)に基づいている
。
プロテアーゼの例は、メロン果肉由来のプロテアーゼである(Kaneda et al., J.
Biochem. 78, 1287-1296(1975))。
び反芻動物、例えばウシ、ヒツジ及びウマである。特定の態様において、動物は
非反芻動物である。非反芻動物は、単胃動物、例えばブタ又はイノシシ(swine
)(限定しないが、子ブタ、成長期のブタ、及び雌ブタを含む);家禽類、例え
ばシチメンチョウ及びニワトリ(限定しないが、ブロイラーのニワトリ、産卵ニ
ワトリを含む);若いウシ;及び魚類(限定しないが、サケを含む)を含む。
図される、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を意味する。
同時に、動物に給餌されることがある。後者のものが好ましい。
て次の緩衝液: 100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、
1mM CaCl2、150mM KCl、0.01% Triton(商標)X-100、pH3.5
、において37℃で2時間インキュベーションした後の、純粋なプロテアーゼ酵
素のプロテアーゼ活性が、本明細書の例2Cに記載のアッセイ(基質:Suc-AAPF
-pNA、pH9.0、25℃)を用いて測定した場合、参照活性の少なくとも40
%であることを意味する。
少なくとも45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、9
5、又は少なくとも97%である。
1mM CaCl2、150mM KCl、0.01% Triton(商標)X-100、pH9.0
、において5℃で2時間インキュベーションした後の、A280=1.0に相当する希釈
中での、純粋な型の、同一プロテアーゼのプロテアーゼ活性であって、上述の様
に決定される活性を言及する。
(I及びII)に分け; b)アリコートIを37℃及びpH3.5で2時間インキュベーションし; c)アリコートIの残留活性を測定し(pH9.0及び25℃); d)アリコートIIを5℃及びpH9.0で2時間インキュベーションし; e)アリコートIIの残留活性を測定し(pH9.0及び25℃); f)アリコートIIに対して相対的なアリコートIの残留活性(%)を計算す
ること、 を含んで成る。
.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、又は3.4
であってもよい。
、他の択一的な態様において、参照のものと比較した場合の残留プロテアーゼ活
性は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50
、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は少なくとも9
7%である。
pH値は段階d)の緩衝液に適用され得る。
して、1cmの光路長のキュベットにおいて、280nmで1.0の吸収を生じ
せしめる様な前記純粋プロテアーゼの濃度(希釈)を意味する。
70以上のA280/A260比を有する試料であって(例2Eを参照のこと)、クーマ
シー染色したSDS−PAGEゲルのスキャニングによって、前記プロテアーゼ
に相当するバンドのそのスキャニング強度の少なくとも95%を有することが測
定されるもの(例2Aを参照のこと)を言及する。あるいは、A280/A260比は、
1.50、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85以上
であるか、あるいは1.90以上である。
なく;それは、例えば他の酵素、他のプロテアーゼでさえも含むことがあり、こ
の場合、それはプロテアーゼ調製物と称されることがある。それでもなお、明確
に定義されるプロテアーゼ調製物が有利である。例えば、本質的に他のプロテア
ーゼから妨害を受けない又はそれを混入していないプロテアーゼの用量(dose)
を飼料に正確に添加するほうがより対処しやすい。用語「用量」は、正確に言え
ば、特に一貫性のある、且つ一定の結果を得る目的、及び所望の効果に基づいて
添加量を最適化した容量を言及する。
合のプロテアーゼは、明確に定義される。明確に定義される、は、サイズ排除ク
ロマトグラフィーによって決定した場合(例8を参照のこと)、プロテアーゼ調
製物が少なくとも50%純粋であることを意味する。
場合、少なくとも60、70、80、85、88、90、92、94、又は少な
くとも95%純粋である。
ーによるプロテアーゼ調製物の分画が、1つの主要なプロテアーゼ成分のみを明
らかにすることを意味する。
かを知っている。当業者は、例えば、Amersham Pharmacia BiotechのHiLoad26/6
0 Superdex75pgカラム上で調製物を分画することによって開始することがある(
例8を参照のこと)。ピークがはっきりと分かれない場合、当業者は異なるカラ
ム(例えば変更したカラムの粒子サイズ及び/又はカラムの長さを有するもの)
を試すことがあり、そして/あるいは試料の体積を変更することがある。単純且
つ一般的な試行錯誤の方法によって、当業者は、例8に記載される様に実施され
る純度の計算に基づいた、十分な分解能(ピークの明確な分離)を有するカラム
に到達するであろう。
ンパク質の処理工程で直接使用されてもよい)、あるいは(b)1又は複数の中
間組成物、例えば後に飼料に加えられる飼料添加物又はプレミックスの製造にお
いて使用されてもよい(又は処理工程で使用されてもよい)。上述した純度の程
度は、上文の(a)又は(b)のいずれかに従い使用される、本来のプロテアー
ゼ調製物の純度を言及する。
得ることができ、一方、それらは、当該プロテアーゼが伝統的な発酵法で産生さ
れる場合、そのように容易には得られず、そして更により大きなバッチ間の変動
性にもさらされる。
。
定性に加えて、中性に近い至適pH−活性も有する。
pH6.0〜11.0、又はpH7.0〜11.0、又はpH6.0〜10.0
、又はpH7.0〜10.0、又はpH8.0〜11.0、又はpH8.0〜1
0.0の間にあることを意味する(本明細書の例2B及び図2を参照のこと)。
性に加えて、熱安定性でもある。
、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃
、又は少なくとも70℃であることを意味する(本明細書の例2D及び図3を参
照のこと)。
の例4のin vitroモデルに従い、植物タンパク質を可溶化し得る。
なくとも1つのタンパク質、例えば修飾タンパク質及びタンパク質誘導体を含む
任意の化合物、組成物、調製物又は混合物を言及する。特定の態様において、植
物タンパク質のタンパク質含量は少なくとも10、20、30、40、50、又
は60%(w/w)である。
てもよく、例えばマメ科(Fabaceae)(マメ科(Leguminosae))、アブラナ科、ア
カザ科、及びイネ科の植物由来の材料、例えばダイズ粉、ルピナス粉及びナタネ
粉に由来してもよい。
ダイズ、ルピナス、エンドウマメ、又はマメ由来の材料である。
、例えばビート、テンサイ、ホウレンソウ又はキノア由来の材料である。
カラスムギ、トウモロコシ(コーン)、コメ、及びモロコシである。
う処理は、植物タンパク質の可溶化の増大をもたらす。
ーセンテージの例である:少なくとも74.0%、74.5%、75.0%、7
5.5%、76.0%、76.5%、77.0%、又は少なくとも77.5%(
本明細書の例4のin vitroモデルを参照のこと)。
する。その様な可溶化は、通常複合体の、天然の組成物、例えば飼料の、他の成
分からのプロテアーゼを介するタンパク質の放出に起因することがある。可溶化
はプロテアーゼ処理をしていない試料と比較した場合の、可溶性タンパク質の量
の増大として測定され得る(本明細書の例4を参照のこと)。
又はタンパク質源に対するその可溶化作用に影響する(又は働きかけ、又は影響
を及ぼす)。これを達成するために、植物タンパク質又はタンパク質源は典型的
に溶媒、例えば水性溶媒、例えば水の中で懸濁され、そしてpH及び温度の値は
、問題の酵素の特性に関して注意を払って調整される。例えば、当該処理は、実
際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも50、又は60、又は70、又は80
、又は90%である、pH値で行ってもよい。同様に、例えば、当該処理は、実
際のプロテアーゼの相対活性が少なくとも50、又は60、又は70、又は80
、又は90%である、温度で行ってもよい(これらの相対活性は本明細書の例2
で定義される)。当該酵素反応は所望の結果が得られるまで続けられ、この後、
それは酵素を不活性化することによって、例えば加熱処理段階によって停止して
も、又はしなくてもよい。
、これは、例えば当該プロテアーゼが植物タンパク質又はタンパク質源に加えら
れるが、その可溶化作用は、いわば、一度適当な可溶化条件が確立されると、又
は一度任意な酵素阻害剤が不活性化されると、又はどの様な他の手段が酵素の働
きを延長するために適用されても、後に所望とされるまで変化しないことを意味
する。
の植物タンパク質の前処理であり、すなわちタンパク質は摂取前に可溶化される
。
よってタンパク質抽出の増大、より高いタンパク質の収率、及び/又はタンパク
質の活用性の増大をもたらすことを意味する。その結果、当該飼料の栄養価が増
大し、そして動物の成長速度及び/又は体重増加及び/又は飼料転換(すなわち
体重増加と比較される摂取飼料の重量)が向上する。
物飼料に加えることが意図される他の成分と一緒に、すなわち動物飼料添加物の
型で、例えばいわゆる動物飼料のためのプレミックスとして、飼料に加えられ得
る。
脂溶性ビタミン、及び/又は少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は少な
くとも1つの微量元素、及び/又は少なくとも1つの多量元素を含む。
又は、フィターゼ EC3.1.3.8又はEC3.1.3.26;キシラナーゼ EC3.2.1.8;ガラク
タナーゼ EC3.2.1.89;及び/又はベータグルカナーゼ EC3.2.1.4の中から選択
される少なくとも1つの他の酵素がある(ECは、NC-IUBMB,1992に由来する、1
992年の酵素命名法に従う酵素分類を意味する)(http://www.chem.qmw.ac.u k/iubmb/enzyme/index.htmlの ワールドワイドウェブ(www)も参照のこと)。
ゼ調製物について上文で定義し、そして例示したもの。例8を参照のこと)。
図される、いわゆるプレミックスの一部を形成し、一方、多量元素は通常飼料に
対して別々に加えられる。これらの組成物の型のいずれも、本発明に従う酸安定
性プロテアーゼで強化された場合、本発明の動物飼料添加物である。
.01〜10.0%;更に詳細には0.05〜5.0%;あるいは0.2〜1.
0%(100gの飼料当たり1gの添加物を意味する%)のレベルで含めること
が意図される(又は含めねばならないと規定される)。このことは、特にプレミ
ックスについても同様である。
分の最終飼料中濃度に、それぞれ10〜10000;20〜2000;又は10
0〜500を掛けることによって明らかとなりうる(上記の、3つのパーセンテ
ージの算入間隔を参照のこと)。
についての指針を、以下の表Aに示す。
ンK、例えばビタミンK3である。
、ビタミンB2、ビタミンB6、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、例えばパン
トテン酸カルシウムDである。
ある。
列記する。栄養要求量は、これらの成分が、示した濃度で食餌に提供されるべき
であることを意味する。これらのデータは: NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subco
mmittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agri
culture, national research council. National Academy Press, Washington,
D. C. 1988;及び NRC, Nutrient requirements in poultry, ninth revised edition 1994, s
ubcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board o
f agriculture, national research council. National Academy Press, Washin
gton, D. C. 1994、 を編集したものである。
成分を含んで成る。少なくとも1つとは、1又は複数の、1個の、又は2個の、
又は3個の、又は4個の、更にそれ以上、最大で合計13個の、あるいは最大で
合計15個のいずれかの、個々の成分を意味する。
又は第6列に含まれる範囲内の飼料中濃度を提供するような量で、本発明の添加
物に含まれる。
に10〜10000;20〜2000;又は100〜500を掛けることによっ
て明らかと成り得る。例えば、ビタミンAのプレミックス含有量が10〜100
000IU/kgに相当することを考慮すると、この練習は以下の間隔を導く:添加
物1kg当たり100〜108IU;又は200〜2×107IU;又は1000〜5
×106IU。
言及したNational Research Council(NRC)の刊行物に従い、家禽類及びブタの食
餌は、以下の表Bの、列2〜3に示すように特徴づけられ得る。魚の食餌は、表
Bの列4に示すように特徴づけられ得る。更に、その様な魚の食餌は、通常20
0〜310g/kgの粗製脂肪含有量を有する。これらの魚の食餌はサケ科の食
餌で例示され、そしてAquaculture, principles and practices, ed. T.V.R. Pi
llay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, secon
d edition, ed. John E. Halver, Academic Press Inc.1989に基づいて設計され
る。
量を有し、そして更に本明細書の請求項に記載の、少なくとも1つのプロテアー
ゼを含んで成る。
の動物飼料組成物は、代謝エネルギー含有量10〜30MJ/kg;及び/又は
カルシウム含有量0.1〜200g/kg;及び/又は利用可能なリンの含有量
0.1〜200g/kg;及び/又はメチオニン含有量0.1〜100g/kg
;及び/又はメチオニン+システイン含有量0.1〜150g/kg;及び/又
はリジン含有量0.5〜50g/kgを有する。
メチオニン、メチオニン+システイン、及び/又はリジンの含有量は以下の表B
の範囲2、3、4又は5(R.2〜5)のいずれか1つの中にある。
Donald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Te
chnical, 1998, ISBN 0-582-40903-9)で述べられているように、6.25の因子
を掛けた窒素(N)として計算され、すなわち、粗製タンパク質(g/kg)=
N(g/kg)×6.25である。窒素含有量は、ケルダール法によって決定さ
れる(A. O. A. C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Associat
ion of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
pp. 2-6、及びEuropean Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Sp
elderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen,
The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, wageningen. ISBN
90-71463-12-5に基づいて計算され得る。
、飼料の表、例えばVeevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstel
ling, verteebaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoed
erbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7に基づいて計
算される。
1つの植物タンパク質又はタンパク質源を含む。
モロコシ;及び/又は0〜80%のモロコシ;及び/又は0〜70%のコムギ;
及び/又は0〜70%のオオムギ;及び/又は0〜30%のカラスムギ;及び/
又は0〜40%のダイズ粉;及び/又は0〜10%の魚粉;及び/又は0〜20
%のホエー、を含む。
又はペレット化された飼料として製造され得る。典型的には、ミル粉砕された飼
料は混合され、そして十分な量の必須ビタミン及び鉱物は問題の種の特徴に従い
加えられる。酵素は、固体又は液体酵素製剤として加えられることがある。例え
ば、固体酵素製剤は典型的に、混合段階の前又はその間に加えられ;そして液体
酵素調製物は典型的にペレット化段階の後に加えられる。当該酵素は、飼料添加
物又はプレミックス中に組み込まれることがある。食餌中の最終酵素濃度は食餌
1kg当たり0.01〜200mgの範囲内、例えば動物食餌1kg当たり5〜
30mgの酵素タンパク質の範囲内にある。
加える追加の段階も含まれる。そして追加の特定の態様において、フィターゼ及
びプロテアーゼを組み合わせた処理に加えて、追加の酵素が加えられることもあ
り、ここで、これらの酵素は他のプロテアーゼ、フィターゼ、脂肪分解酵素、及
びグルコシダーゼ/カルボヒドラーゼ酵素を含んで成る群から選択される。その
様な酵素の例は、WO95/28850に示されている。
ための有効量、すなわちそれに適した量で適用されるはずである。現段階で考え
られているのは、前記酵素が1又は複数の以下の量で投与されるということであ
る(投与範囲):0.01〜200;又は0.01〜100;又は0.05〜1
00;又は0.05〜50;又は0.10〜10であり、これらの範囲全てが飼
料1kg当たりのプロテアーゼタンパク質(mg)である(ppm)。
プロテアーゼは飼料組成物から精製され、そして精製プロテアーゼの比活性は、
関連するアッセイを用いて決定される(プロテアーゼ活性、基質、及びアッセイ
を参照のこと)。飼料組成物自体のプロテアーゼ活性も、同一のアッセイを用い
て決定され、そしてこれら2つの決定に基づいて、飼料1kg当たりのプロテア
ーゼタンパク質(mg)の量が算出される。
に応用される。
ロテアーゼに関して利用可能であるならば、比活性はこの試料から決定される(
飼料組成物又は添加物から当該プロテアーゼを精製する必要なし)。
イズの最も重要な抗栄養因子はレクチンダイズ凝集素(SBA)、及びダイズト
リプシン阻害剤(STI)である。
ンパク質であり、そして摂取された場合、それらは腸の上皮と結合する。これは
、腸細胞の生存可能性の低下及び栄養の吸収の低下を招くことがある。
との高い親和性を有する、グリコシル化された4量体レクチンである。
下させ、そして更に膵臓からの消化酵素の分泌を増大させ、消化酵素の形態でア
ミノ酸の損失を招く。トリプシン阻害剤の例は、約8kDaの分子量を有し、7
個のジスルフィド架橋を含み、そしてトリプシン様及びキモトリプシン様プロテ
アーゼに特異的な2つの阻害性ループを有するBowman-Birk阻害剤である。他の
例は、いわゆるFactorのkunitz阻害剤である(例えばトリプシン様プロテアーゼ
のための1つの結合部位を含み、そして約20kDaの分子量を有するダイズku
nitzトリプシン阻害剤)。
ン阻害剤であるBowman-Birk阻害剤及びダイズkunitz Factorの様な抗栄養因子を
加水分解することが証明された。実験の項の例5を参照のこと。
シン阻害剤、例えばBowman-Birk阻害剤、及びkunitz Factor、例えばダイズkuni
tz Factorを加水分解し、又はその量を減少させるための酸安定性プロテアーゼ
の使用に関する。
するプロテアーゼを同定するために、pH3での安定性について解析された。
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー
によって精製した(例えばProtein Purification, Principles, High Resolutio
n Methods, and Applications. Editors: Jan-Christer Janson, Lars Ryden, V
CH Publishers, 1989を参照のこと)。
arstenカゼインと一緒に、25℃、pH9.5で30分間インキュベートし、次
にTCA(トリクロロ酢酸)を2%(w/w)の終濃度で加え、混合物を濾過し
て沈降物を除去し、そして濾液を遊離第1級アミノ基について解析した(セリン
スタンダードを用いて340nmの吸光度を測定することによって、OPA(o-フタ
ル−ジアルデヒド)に基づいた比色アッセイで決定した)(Biochemische Tasche
nbuch teil II, Springer-Verlag(1964), p.93 and p.102)。1カゼインプロテ
アーゼユニット(CPU)は標準的な条件のもと、すなわち25℃及びpH9.
5で、1分当たり1mmolのTCA可溶性第1級アミノ基を遊離する酵素量と
して定義される。
のアリコートに分け、そして各アリコートを、続いてそれぞれ100mMリン酸
緩衝液、pH3及び100mMリン酸緩衝液、pH7で更に希釈した。希釈した
試料を37℃で1時間インキュベートし、そして20μlの試料を1%スキムミ
ルクを含む1%アガロースプレートの穴に適用した。当該プレート(pH7.0
)を37℃で一晩インキュベートし、そして透明になった範囲を測定した。
づけられた:ノカルディオプシス・アルバ及びノカルディオプシス sp.NR
RL18262プロテアーゼを例2に記載した。ノカルディオプシス・アルバの
菌株は、ブダペスト条約に従い、特許手続のための微生物の寄託の国際承認によ
り、DSMZ-Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mas
cheroder Weg 1b, D-38124 BraunSchweig, Germanyに、以下の通りに寄託された
。 寄託日:2001年1月22日 DSM番号:ノカルディオプシス・アルバDSM14010
譲渡された。
以下の組成を有する100mlのHG−23培地を含む振とうフラスコに接種し
た:カラスムギ45g/l、酵母抽出物2g/l、リン酸一水素二ナトリウム1
2g/l、リン酸二水素カリウム6g/l、Pluronic PE6100
0.2ml/l(蒸留水)。当該菌株を37℃で9日間醗酵させた。
、そして更にSeitz K-250 depthフィルタープレートを通過する濾過によって清
澄にした。透明な濾液を3kDaカットオフポリエーテルスルホンカセット(Fi
ltron)上での限外濾過によって濃縮した。濃縮した酵素を、G25 Sephadexカラム
(Amersham Pharmacia Biotech)上で、50mM H3BO3、5mM 3,3'-ジメチルグルタル
酸、1mM CaCl2,pH7(緩衝液A)に移し、そして緩衝液A中で平衡化したバシト
ラシンアガロースカラム(Upfront Chromatography A/S)にかけた。結合していな
いタンパク質を除去するために緩衝液Aでバシトラシンカラムを洗浄した後、前
記プロテアーゼは、25%2−プロパノール及び1M塩化ナトリウムを添加した
緩衝液Aを用いてカラムから溶出した。プロテアーゼ活性を有する画分を集め、
そしてG25 Sephadexカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上でのクロマトグラフ
ィーによって20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、pH4.5(緩衝液B)に移した。緩
衝液を交換したプロテアーゼのプールを、緩衝液Bで平衡化したSOURCE 30Sカラ
ム(Amersham Pharmacia Biotech)にかけた。緩衝液BでSOURCE 30Sカラムを洗浄
した後、緩衝液B中の直線NaCl勾配(0〜0.25M)を増大させてプロテ
アーゼを溶出した。カラム由来の画分をプロテアーゼ活性について試験し、そし
てプロテアーゼ含有画分をSDS−PAGEで解析した。純粋な画分を集め、そ
して更なる特徴付けに使用した。
オプシスに関して上文で広く記載したように、常用の方法を用いて調製した。
S−PAGE)の分子量を有することが明らかとなっており、そして以下の部分
的な(N末端(MVS))アミノ酸配列が決定された:ADIIGGLAYTMGGRCSV(配
列番号2)。
188アミノ酸配列を有する:
、それらのpH−安定性、pH−活性及び温度−活性プロファイルを研究するこ
とであった。
ens)由来のズブチリシンであり、そしてSub. Novo(Y217L)はWO96/05739に開示さ
れているその変異体である。Sub. Novoは常用の方法を用いて野生型菌株の培養
物から調製され、そして精製され、一方、前記変異体はEP130756の例1〜2、及
び15〜16に記載されているように調製した。
ルス・レンツス(Bacillus lentus)NCIB 10309)由来のズブチリシンであり、こ
れはNovozymes A/S(Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark)から販売され
ている。その調製は米国特許第3723250に記載されている。
%(w/v)TCA(トリクロロ酢酸)と氷上のエッペンドルフ管中で混合した
。30分後、氷上の管を遠心し(5分、0℃、14,000×g)、そして上清
を慎重に除去した。20μlのSDS−PAGE試料緩衝液(200μlのトリ
ス−グリシンSDS試料緩衝液(2倍)(125mMトリス塩酸、pH6.8、
4%(w/v)SDS、50ppmブロモフェノールブルー、20%(v/v)
グリセロール、NOVEX(商標)のLC2676)+160μlの蒸留水+2
0μlのβメルカプトエタノール+20μlの3Mの緩衝化されていないトリス
塩基(Sigma T-1503)を沈殿物に加え、そして管を3分間煮沸した。前記管を短
期間遠心し、そして10μlの試料をNOVEX(商標)の4〜20%のグラジ
エントトリス−グリシンプレキャストゲル(Laemmliの化学を基にしているが、
ゲル中にSDSを含まない、ポリアクリルアミドグラジエントゲル(Laemmili,
U.K., (1970) Nature, vol. 227, pp.680-685), EC60255)に適用した。電気泳動
は、ブロモフェノールブルーの追跡用色素がゲルの底面に達するまで、150V
の低電圧で、両方の緩衝液のリザーバー中で、トリス−グリシンランニング緩衝
液(2.9gのトリス塩基、14.4gのグリシン、1.0gのSDS、全体で
1Lの液体となるように加えられる蒸留水)を用いて行った。電気泳動後、ゲル
を100mlの蒸留水を用いて、穏やかに振とうすることによってそれぞれ3回
、5回すすいだ。次にゲルをGelcode(商標)Blue Stain試薬(PIERCEの製品,
コロイド性クーマシーG-250、PIERCEのカタログ番号24592)と共に1時間
穏やかに振とうし、そして蒸留水を用いて8〜16時間穏やかに振とうし、そし
て蒸留水を複数回交換して洗浄した。最後に、ゲルを2枚のセロハンの間で乾燥
した。乾燥したゲルをFotolook 95 v2.08ソフトウェアを備えたAGFAのArcus II
スキャナーでスキャニングし、そして以下の設定値(Fotolook 95 v2.08)を有
するFile/Acquireコマンドによってウィンドウズ(登録商標)用のイメージ評価
ソフトウェアCREAM(商標)(カタログ番号990001及び990005、Kem
-
En-Tec, Denmark)に取り込んだ:オリジナル=リフレクティブ、モード=カラ
ーRGB、スキャンリゾリューション=240ppi、アウトプットリゾリュー
ション=120lpi、スケールファクター=100%、レンジ=グローバルセ
レクションによるヒストグラム並びにMin=0及びMax=215、トーンカ
ーブ=無し、シャープネス=無し、デスクリーン=無し並びにフレーバー=無し
、これにより、SDS−PAGEゲルの*.imgピクチャーファイルが作り出され
、これはCREAM(商標)での評価に使用された。*.imgピクチャーファイル
は、メニューコマンドアナリシス/1−Dで評価された。2つのスキャンライン
はレーンプレイスツールで*.imgピクチャーファイル上に据えられた:試料スキ
ャンライン及びバックグラウンドスキャンライン。試料スキャンラインは、アプ
リケーションスロットの真下からブロモフェノールブルーの追跡用色素の真上の
位置の、中央の試料レーン(問題のプロテアーゼを有する)に据えられた。バッ
クグラウンドスキャンラインは、試料スキャンラインと平行であるが、試料が全
く適用されておらず、バックグラウンドスキャンラインが試料スキャンラインの
開始及び終了の点に垂直な、ピクチャー形式のSDS−PAGEゲルの位置に据
えられた。バックグラウンドスキャンラインはゲルの真のバックグラウンドを表
している。スキャンラインの幅及び形状は調整されていない。スキャンラインに
沿った強度は、直ちに中程度の感度による1−D/スキャンメニューコマンドで
記録された。1−D/エディターメニューコマンドを用いて、バックグラウンド
スキャンは試料スキャンから差し引かれた。次に、1−D/リザルトメニューコ
マンドが選択され、そしてCREAM(商標)ソフトウェアによって計算した場
合のプロテアーゼピークのエリア(%)がプロテアーゼのSDS−PAGE純度
として使用された。
に使用した。
0、7.0、8.0、9.0、10.0又は11.0に調整された、100mM
コハク酸(Merck 100682)、100mM HEPES(Sigma H-3375)、100
mM CHES(Sigma C-2885)、100mM CABS(Sigma C-5580)、1
mM CaCl2、150mM KCl、0.01% Triton(商標)X
−100。 アッセイ温度:25℃
で希釈したもの)を、1.5mlのアッセイ緩衝液と各pH値で混合し、混合物
のpHをアッセイ緩衝液のpHにした。反応は1.5mlのpNA基質(50m
gのものを1.0mlのDMSO中で希釈し、そして0.01% Triton
(商標)X−100で45倍に希釈した)を加えることによって開始し、そして
混合後、A405の増大を問題のpHでのプロテアーゼ活性の測定値として分光光
度計によってモニタリングした。当該アッセイは他のpH値のアッセイ緩衝液で
繰り返し、そして当該活性の測定値をpHに対する相対的な活性としてプロット
した。相対的な活性は最高の活性(至適pH)で標準化し、すなわち至適pHで
の活性を1、又は100%に設定した。プロテアーゼ試料は、全ての活性の測定
値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保証するた
めに希釈された。
めに使用した。
5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0又は
11.0に調整された、100mMコハク酸、100mM HEPES、100
mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM K
Cl、0.01% Triton(商標)X−100。
NaCl、pH6.0中であり、且つ10超のA280の吸光度を有する)を、試
験される各pH値のアッセイ緩衝液中でA280=1.0に希釈した。希釈したプ
ロテアーゼ試料を37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、
プロテアーゼ試料を100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM
CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl
、0.01% Triton(商標)X−100、pH9.0、中で希釈し、全
試料のpHをpH9.0にした。
イ緩衝液と混合し、そして活性反応は1.5mlのpNA基質(50mgのもの
を1.0mlのDMSO中で希釈し、そして更に0.01% Triton(商
標)X−100で45倍に希釈した)を加えることによって開始し、そして混合
後、A405の増大を(残留)プロテアーゼ活性の測定値として分光光度計によっ
てモニタリングした。37℃のインキュベーションを異なるpH値で行い、そし
て活性の測定値をpHに対する残留活性としてプロットした。残留活性を対応す
るインキュベーションの活性(コントロール)で標準化し、一方当該プロテアー
ゼをpH9.0のアッセイ緩衝液中でA280=1.0に希釈し、そして他のイン
キュベーションとして活性測定の前に5℃で2時間インキュベートした。当該プ
ロテアーゼ試料は、全ての活性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の
直線部分内に収まることを保証するために、活性測定の前に希釈した。
イムAK錠はMegazymeによって錠剤として調製されたアズリン色素架橋
型カゼインである。
100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1m
M CaCl2、150mM KCl、0.01% Triton(商標)X−
100。
% Triton(商標)X−100中で懸濁した。500μlのこの懸濁液及
び500μlのアッセイ緩衝液をエッペンドルフ管中で混合し、そして氷上に据
えた。20μlのプロテアーゼ試料(0.01%Triton(商標)X−10
0中で希釈したもの)を加えた。当該アッセイは、アッセイ温度に設定したエッ
ペンドルフサーモミキサーにエッペンドルフ管を移すことによって開始した。当
該管をエッペンドルフサーモミキサー上で、その最高振とう速度で15分間イン
キュベーションした。当該管を氷浴に戻すことによって、アッセイのインキュベ
ーションを停止させた。当該管を氷令した遠心管中で数分間遠心し、そして上清
のA650を分光光度計で読みとった。緩衝液のブラインドは当該アッセイに含め
られた(酵素の代わり)。A650(プロテアーゼ)−A650(ブラインド)をプロ
テアーゼ活性の測定値とした。当該アッセイは異なる温度で実施し、そして活性
の測定値をインキュベーション温度に対する相対活性としてプロットされた。相
対活性は最高の活性で標準化した(至適温度)。プロテアーゼ試料は、全ての活
性の測定値が当該アッセイについての量応答曲線の直線部分内に収まることを保
証するべく希釈した。
活性及び温度−活性プロファイルを図1〜3に示し、そして酸性pH値でのプロ
テアーゼについてのpH−安定性の詳細な比較を表2に示す。
、260nmでのプロテアーゼ試料の吸収を意味する。A280は、緩衝液ブラン
クと比較される、1cmの路長のキュベットにおける、280nmでの同一プロ
テアーゼ試料の吸収を意味する。
がその応答曲線の直線部分内に収まるまで緩衝液中で希釈した。A280/A260比
は、前記の読み取りから決定された:ノカルディオプシスsp.NRRL182
62の場合1.83、及びノカルディオプシス・アルバの場合1.75。
/消化不能部分を、消化酵素及び/又は加えられた外来性酵素にとって接近可能
にする能力について試験された。
テアーゼ、プロテアーゼI及びプロテアーゼIIと比較された。この文書は飼料中
でのそれらの使用も開示している。プロテアーゼIはアスペルギロペプシンII型
プロテアーゼであり、そしてプロテアーゼIIはアスペルギロペプシンI型プロテ
アーゼであり(共にアスパラギン酸プロテアーゼ、すなわち非ズブチリシンプロ
テアーゼである)、これらはアスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus acul
eatus)由来である(上文で言及したHandbook of Proteolytic Enzymesを参照の
こと)。
のパンクレアチン処理を含む、単胃動物の消化管を模倣した過程で生成した。
にとって接近可能なSBM成分を分解するために大量に加えられた。
(商標)2.4L、NEUTRASE(商標)0.5L、FLAVOURZYME(商標)1000L、ENERGEX(
商標)L、BIOFEED(商標)Plus L、PHYTASE NOVO(商標)L。使用したSBMは
、ペレット化された、飼料にとって標準的な48%タンパク質SBMとした。
。
で標識された:ダイズ残留物(25gの湿重量、〜5gの乾燥重量)を100m
lの0.1M炭酸緩衝液、pH9、中で懸濁され、そして40℃で1時間撹拌さ
れた。懸濁液をフルオレセイン5−イソチオシアネート(FITC)で一晩、暗室で処
理された。カップリングしていないプローブは限外濾過(10,000Mwのカ
ットオフ値)によって除去した。
するプロテアーゼの能力を試験するために使用した:0.4mlのプロテアーゼ
試料(A280=0.1を有する)を、0.4mlのFITCダイズ残留物(pH
6.5の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液中で10mg/mlの懸濁液)と37
℃で混合し、そしてインキュベーションの0時間後、そして22時間後に相対的
な蛍光単位(RFU485/535nm;励起/モニタリング波長)を測定した
。RFUの決定の前に、試料を20,000×Gで1分間遠心し、そして250
μlの上清を黒いマイクロタイタートレーに移した。測定はVICTOR 1420 Multil
abel counter(in vitro, Denmark)を用いて実施した。RFUはIain D. Johnson
によってIntroduction to Fluorescence Tecniques, Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6t h edition, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7)において広く記載されている。
って調製した。 RFU試料=ΔRFU試料−ΔRFUブラインド(ここで、ΔRFU=RFU(
22時間)−RFU(0時間)である)
的に+/−20,000の許容誤差を有する。プロテアーゼI及びプロテアーゼ
IIと反対に、ノカルディオプシスsp.NRRL18262由来のプロテアーゼ
は有効な程度までダイズ残留物を分解した。
スsp.NCIMB40484由来のプロテアーゼ(「PD498」、WO93/246
23の例1に記載されているように調製した)、及びアスペルギルス・オリザエ由
来のプロテアーゼ含有酵素調製物であるFLAVOURZYME(商標)(Novozymes A/S(Ba
gsvaerd, Denmark)より購入可能)と一緒に、in vitroでの消化系(単胃動物の消
化を模倣したもの)におけるトウモロコシ−SBM(トウモロコシ−ダイズ粉)
タンパク質を可溶化するその能力について試験された。ブランクの処理のために
、トウモロコシ−SBMを外来性プロテアーゼの非存在下でインキュベートした
。
BM食餌を使用した。タンパク質含量はSBM中で43%(w/w)であり、そ
してトウモロコシ粉中で8.2%(w/w)であった。10gのトウモロコシ−
SBM食餌中のタンパク質の合計量は2.21gであった。
8xU.S.P. (US Pharmacopeia))。
tical Biochemistry 182, 319-326, (1989)で概説されている原理を用いて、A2 80 値及びアミノ酸配列(アミノ酸組成)に基づいて計算される。
ゼ(0.1mg酵素タンパク質/g食餌、但しFLAVOURZYME(商標):3.3m
g/g食餌)を含む46mlのHCl(0.1M)を混合しながら加える。フラ
スコを40℃でインキュベートする。 3. 20〜25分時に、pHを測定する。 4. 45分時に、16mlのH2Oを加える。 5. 60分時に、7mlのNaOH(0.4M)を加える。 6. 80分時に、パンクレアチン(8.0mg/g食餌)を含む5mlの
NaHCO3(1M)を加える。 7. 90分時に、pHを測定する。 8. 300分時に、pHを測定する。 9. 320分時に、30mlのアリコートを除去し、そして遠心する(1
0000×G、10分、0℃)。 10. 上清中の合計の可溶性タンパク質を決定する。
)の決定;A. O. A. C., (1984), Official Methods of Analysis 14th ed., As
sociation of Official Analytical Chemists, Washington DC)。
計算した。
は2.21g/75ml、約2.95%であろう。
するために、消化酵素及び外来性酵素に起因するタンパク質は、可能な時に上清
中のタンパク質濃度から差し引くべきである。 パンクレアチン(X mg/g食餌)及びペプシン(Y U/g食餌)由来の
タンパク質(%)=((X mg パンクレアチン/g食餌×10g 食餌×0
.69×100%)/(1000mg/g×75g))+((Y Uペプシン/
g食餌×10g食餌×0.57×100%)/(539U/mg×1000mg
/g×75g)) (ここで、0.69及び0.57は使用したパンクレアチン及びペプシン調製物
中のタンパク質含量を表す(すなわち69%のパンクレアチン、及び57%のペ
プシンが上文で言及したケルダール法で決定した場合のタンパク質である)
mg EP/g食餌×10g食餌×100%)/(1000mg/g×75g
)
(消化酵素由来のタンパク質(%)+外来性タンパク質由来のタンパク質(%)
)
%)/2.95%
ーゼが、ブランクと比較した場合、そしてバチルスsp.NCIMB40484
プロテアーゼと比較した場合、タンパク質の可溶化に対してより有意な効果を有
することを示す。
40484由来のプロテアーゼの、ダイズ凝集素(SBA)並びにダイズBowman
-Birk及びkunitzトリプシン阻害剤を加水分解する能力が試験された。
阻害剤(ダイズ由来のトリプシン阻害剤、Boehringer Mannheim 109886)を、前
記プロテアーゼと一緒に37℃で2時間、pH6.5でインキュベートした(プ
ロテアーゼ:抗栄養因子=1:10、A280に基づく)。インキュベーション緩
衝液:50mMジメチルグルタル酸、150mM NaCl、1mM CaCl 2 、0.01%Triton X−100、pH6.5。
AGEゲル上の天然SBA及びトリプシン阻害剤のバンドの消失並びに低分子量
分解産物の出現から推定した。ゲルはクーマシーブルー染色し、そしてバンドの
強度をスキャニングによって決定した。
のインキュベーション後に、SBA、Bowman-Birk阻害剤又はkunitz阻害剤に対
する抗体を用いるウェスタン技術を利用することによって推定され得る(WO98/5
6260を参照のこと)。
う。性別毎に分けられた、生まれて1日目のブロイラーのニワトリ(「Ross PM3
」)は、商業的な孵化場から供給される。
れたバッテリーケージ内で飼育する。試料及び水道水は適宜供給する。
実験用食餌を受けるコントロール処理、又は飼料1kg当たり100mgのプロ
テアーゼの酵素タンパク質を添加した実験用食餌を受ける酵素処理のいずれかが
割り当てられる。
及び29日目に秤量される。中間期の飼料消費量が決定され、そして体重の増加
及び飼料変換率が計算される。
ンパク質)を基にしている(表5)。飼料は約70℃でペレット化される(ダイ
の構成:3×20mm)。適当な量のプロテアーゼを一定量の水で希釈し、そし
てペレット化された飼料に噴霧する。コントロール処理の場合、適切な量の水が
同様の方法で当該処理を扱うために使用される。
ASパッケージのGLMプロシージャ(SAS Institute Inc., 1985)を用いて実
施される。有意な処置効果(p<0.05)が示唆される場合、処置平均間の差
異はダンカン試験で解析される。体重増加の向上、及び/又は飼料変換の向上、
及び/又はダイズ粉の栄養価の向上が予期される(トウモロコシデンプンが高度
に消化可能な成分であることを考慮している)。
de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la
volaille. Journal Officiel des Communautes Europeennes, L130, 53-54 SAS Institute Inc. (1985):SAS(商標)User's Guide, Version 5 Edition. Ca
ry NC
来のプロテアーゼを、10gのプロテアーゼ酵素タンパク質/kgに相当する量
で加える(例2に記載のように調製)。
ラムであるAGROSOFT(商標)を用いることによって肉粉無しで再計算がされた)
に示す組成を有し、そして1kg当たり100mgのプロテアーゼ酵素タンパク
質を有する、ペレット化したシチメンチョウの開始用食餌及び生育用食餌を以下
のように調製する:
内で混合する。石灰岩、リン酸カルシウム及び塩10g/kg食餌の量の上記プ
レミックスと一緒に加え、続いて混合する。生じた混合物をペレット化する(蒸
気条件にペレット化段階が続く)。
際の組成を以下の表に示す(Refstie et al(1998), Aquaculture, vol.162, p.3
01-302から編集した)。推定される栄養分は、AGROSOFT(商標)の飼料最適化プ
ログラムを用いることによって再計算される。
が、1kg当たり100mgのプロテアーゼ酵素タンパク質に相当する量で食餌
に加えられる。
酵素産物の純度が、サイズ排除カラム上でのプロテアーゼ含有酵素産物の分画に
基づいた方法によって決定されうる。ゲル濾過クロマトグラフィーとしても知ら
れるサイズ排除クロマトグラフィーは、サイズにおいて分離され得るタンパク質
分子に匹敵する孔のサイズ分布を有する、多孔性ゲルマトリックス(カラム内に
詰め込まれる)を基にしている。比較的小さいタンパク質分子は、周囲の溶液か
らゲルの内部に拡散することがあり、一方、より大きな分子は、それらのサイズ
によって、同程度までゲル内部に拡散することが妨害されるだろう。結果として
、タンパク質分子は、それらのサイズに従い、より大きな分子と分離され、より
小さいものより前に当該カラムから溶出する。
セイキット(PIERCEのカタログ番号23225と同一のもの)によって決定され
る。ビシンコニン酸のナトリウム塩(BCA)は、アルカリ性の環境で第一銅イ
オン(Cu1+)と強力な紫色の複合体を形成し得る、安定な水溶性化合物である
。BCA試薬は、タンパク質とアルカリCu2+の反応(ビウレット反応)で産生
する第一銅イオンをモニタリングし得るBCAタンパク質アッセイキットの根底
を成す。この反応から生まれる色は安定性があり、そしてタンパク質濃度の増大
と共に比例の態様で増大する(Smith, P. K., et al. (1985), Analytical Bioc
hemistry, vol. 150, pp 76-85)。BCA検量用溶液は、50部の試薬Aと1部
の試薬Bを混合することによって作成される(試薬AはPIERCEのカタログ番号2
3223であり、アルカリ性炭酸緩衝液中にBCA及び酒石酸塩を含み;試薬B
はPIERCEのカタログ番号23224であり、4%CuSO4・5H2Oを含む)。
300μlの試料が3.0mlのBCA検量用溶液と混合される。37℃で30
分放置した後、当該試料を室温に冷却し、そしてA490を当該試料中のタンパク
質濃度の測定値として読み取る。ウシ血清アルブミン(PIERCEのカタログ番号2
3209)の希釈液をスタンダードとして本アッセイに含める。
100mM H3BO3、10mM 3,3’−ジメチルグルタル酸、2mM C
aCl2、pH6(緩衝液A)中で少なくとも15分間、5℃で溶解/懸濁され
、そしてこの段階での酵素が懸濁液である場合、当該懸濁液は0.45μのフィ
ルターで濾過され、透明な溶液を与える。当該溶液は、この時点から、液体プロ
テアーゼ含有酵素産物として処理される。
00Daのカットオフ値の、SpectraPorの透析チューブ(Spectrum Medical Ind
ustriesのカタログ番号132 670)内で、100倍量の緩衝液A+150
mMのNaCl(緩衝液B)に対して、プロテアーゼ含有酵素産物を高粘度にし
得る、サイズ排除クロマトグラフィーにとって有害な製剤化合物を除去するため
に5℃で少なくとも5時間透析される。
.45μのフィルターを介して濾過される。透析された酵素産物のタンパク質濃
度は、上述のタンパク質濃度アッセイで決定され、そして当該酵素産物は緩衝液
Bで希釈され、5mg/mlのタンパク質濃度を有するサイズ排除クロマトグラ
フィーに直ちに使用可能な試料を与える。当該酵素産物が5mg/ml未満のタ
ンパク質濃度を透析後に有する場合、そのままで使用される。
)を緩衝液Bで平衡化する(流速:1ml/分)。1.0mlのプロテアーゼ含
有酵素試料をカラムに適用し、そして当該カラムを緩衝液Bで溶出する(流速:
1ml/分)。2.0mlの画分を、適用した試料全てがカラムから溶出される
まで、カラムの出口から回収する。回収した画分は、適当なアッセイによってタ
ンパク質含量(上文のタンパク質濃度アッセイを参照のこと)及びプロテアーゼ
活性について解析される。適当なアッセイの例はSuc-AAPF-pNAアッセイである(
例2Bを参照のこと)。他の適当なアッセイは、例えばCPUアッセイ(例1を参
照のこと)、及びプロタザイムAKアッセイ(例2Dを参照のこと)である。プ
ロテアーゼ活性アッセイについての条件、例えばpHは、分画された試料中の、
出来る限り多くのプロテアーゼを測定できるように調整される。上文で言及した
アッセイの条件は、適当な条件の例である。他の適当な条件は、上記のプロテア
ーゼ活性の測定を扱う項目で挙げられている。1又は複数のプロテアーゼアッセ
イにおける活性を有するタンパク質のピークは、プロテアーゼピークとして定義
される。プロテアーゼピークの純度は、全ての同定されたプロテアーゼピーク中
の全タンパク質量で割ったピークのタンパク質量として計算される。
プロテアーゼピーク中のタンパク質量で割った酸安定性プロテアーゼピーク中の
タンパク質量として計算される。
インキュベーション後の、5つのプロテアーゼ(ノカルディオプシス由来の2つ
の酸安定性プロテアーゼ、及び3つの参照プロテアーゼ(Sub. Novo、及びSub.
Novo(Y217L)(共にバチルス・アミロリクエファシエンス由来)、及びSAVINASE
(商標))の、pH−安定性曲線、すなわち残留プロテアーゼ活性を示す;当該
活性はpH9.0、及び5℃での2時間のインキュベーション後の残留活性に関
連する。
を示し、これは同じ5つのプロテアーゼの至適pHでのプロテアーゼ活性と関連
する。
pH9.0でのプロテアーゼ活性を示し、これは同じ5つのプロテアーゼの至適
温度でのプロテアーゼ活性に関連する。
Claims (12)
- 【請求項1】 動物飼料における、 (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、少なくとも1つの酸安定性プロテ
アーゼの使用。 - 【請求項2】 動物飼料中での使用のための組成物における、 (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、少なくとも1つの酸安定性プロテ
アーゼの使用。 - 【請求項3】 プロテアーゼの量が飼料1kg当たり0.01〜200mg
のプロテアーゼ酵素タンパク質である、請求項1に記載の使用。 - 【請求項4】 プロテアーゼの意図される量が飼料1kg当たり0.01〜
200mgのプロテアーゼ酵素タンパク質である、請求項2に記載の使用。 - 【請求項5】 動物飼料の栄養価を向上させるための方法であって、 (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、少なくとも1つの酸安定性プロテ
アーゼが当該飼料に加えられる、方法。 - 【請求項6】 (a)少なくとも1つの酸安定性プロテアーゼ;及び (b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、及び/又は (c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は (d)少なくとも1つの微量元素、及び/又は (e)少なくとも1つの多量元素; を含んで成る動物飼料添加物であって、 当該プロテアーゼが (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、添加物。
- 【請求項7】 プロテアーゼの量が飼料1kg当たり0.01〜200mg
のプロテアーゼタンパク質の意図される添加に相当する、請求項6に記載の動物
飼料添加物。 - 【請求項8】 フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、及び/又はベ
ータ−グルカナーゼを更に含んで成る、請求項6又は7に記載の動物飼料添加物
。 - 【請求項9】 50〜800g/kgの粗製タンパク質含量を有し、そして (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、少なくとも1つの酸安定性プロテ
アーゼを含んで成る動物飼料組成物。 - 【請求項10】 プロテアーゼの量が飼料1kg当たり0.01〜200m
gのプロテアーゼタンパク質である、請求項9に記載の動物飼料組成物。 - 【請求項11】 植物タンパク質の処理方法であって、 (i)配列番号1、及び/又は (ii)配列番号2 に対して少なくとも70%の同一性を有する、少なくとも1つの酸安定性プロテ
アーゼを、少なくとも1つの植物タンパク質又はタンパク質源に加える段階を含
んで成る、方法。 - 【請求項12】 少なくとも1つの植物タンパク質源の中にダイズが含まれ
る、請求項11に記載の方法。
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