JP2016127823A - フィターゼ、フィターゼをコードする核酸並びにその製造および使用方法 - Google Patents

フィターゼ、フィターゼをコードする核酸並びにその製造および使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に曝露した後で活性を保持するフィターゼ、さらに胃での安定性が低下したフィターゼの提供。【解決手段】フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ特定の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列であって、前記ポリペプチドが特定のアミノ酸配列において特定のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C.119(e)節にしたがい、米国仮特許出願出願番号（“USSN”）61/180,283号（2009年5月21日出願）の優先権を主張する。前述の出願はその全体が全ての目的のために参照により本明細書に含まれる。
本発明は、フィターゼ、フィターゼをコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および単離に関する。特に、本発明は、高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に曝露した後で活性を保持するフィターゼを提供する。本発明はさらに、胃での不安定性が増加したフィターゼを提供する。本発明のフィターゼを食品に用いてフィテートに富む成分の飼養価値を向上させることができる。本発明のフィターゼは、食品もしくは飼料または前記のどちらかのサプリメントとして、例えばフィテートの消化補助などのために処方することができる。本発明の食品または飼料は、ペレット、液体、粉末などの形状であり得る。ある特徴では、本発明のフィターゼは、ペレット化時の熱変性に対して安定であり、これによって、in vivo性能および飼料中の活性の検出を維持しながらフィターゼ製品のコストが削減される。
ミネラルは全ての生物の成長に必須の成分である。食物性ミネラルは、植物を含む多くの供給物質に由来する。例えば、植物の種子は、フィチン酸分子のリン酸基と複合体を形成するイオンを含むのでミネラルの豊富な供給源である。これらのフィテート結合ミネラルは、いくつかの事例では飼育動物のいくつかの種（例えば複胃反芻動物）の食物性要求に答える。したがっていくつかの事例では、反芻動物で無機ホスフェートおよびミネラルの食物による補充の必要性が軽減される。なぜならば、こぶ胃内の微生物がフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの変換を触媒する酵素を産生するからである。このプロセスで、フィテートと複合体を形成していたミネラルは遊離する。飼育動物の大半の種は、しかしながらフィテート結合ミネラルを効率よく利用できない。したがって、例えば単胃動物(例えばブタ、鳥類および魚類)の家畜生産では、飼料は一般的に成長速度を速めるためにミネラルおよび／または抗生物質（前記は消費動物の消化系微生物叢環境を変化させる）が補充される。
したがって、不十分なフィテートの加水分解に関連する多くの困難な課題（栄養、ex vivo処理工程、健康および医薬、環境保全および資源の管理に関係する）が、多くの応用で存在する。以下はこれらの問題の非限定的な例である：
1）無機ミネラルによる食餌の補充は高価な出費である；
2）加水分解されていないフィテートの存在は、多くのex vivoでの利用で（例えば望ましくないスラッジの存在をもたらすことによって）有害であり解決が困難である；
3）抗生物質による食餌の補充は、同様に多くの抗生物質耐性病原体の増加によりヒトおよび動物にとって医学的脅威となる；
4）糞便の未吸収ミネラルの環境への排出は、周辺の土壌、魚類飼育池および一般の地表水の生態系を混乱させ損傷する；
5）多くの潜在的食品の高栄養価提供物がほとんど利用されず浪費されたままである。
結果として、フィテート含有食品は、それらの不完全な栄養物の提供を修正するために、極めて多くの生物種による消費に際して、外因性栄養物および／またはフィターゼ活性供給源の補充を必要とする。
結果として、多様な分野において効率的で費用効果の高いフィテート加水分解を達成するための手段が希求される。特に、産業分野においてフィテート加水分解を最適化する手段が希求される。具体的な特徴では、ヒトおよび飼育動物によって消費されるフィテート含有食品の栄養物の提供を改善する、産業的処理方法の最適化が希求される。
本発明は、フィターゼ活性を有するポリペプチド、前記をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドを製造および単離する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に暴露後に活性を保持するフィターゼを提供する。本発明のフィターゼを食品で用いて、フィテートに富む成分の飼養価値を向上させることができる。本発明のフィターゼは、食品もしくは飼料またはそのどちらかのサプリメントとして、例えばフィテートの消化補助などのために処方することができる。本発明の食品または飼料は、ペレット、錠剤、ピル、液体、粉末、スプレーなどの形状であり得る。ある特徴では、本発明のフィターゼは、ペレット化時に熱変性に対して安定であり、これによって、in vivo性能および飼料中の活性の検出を維持しながらフィターゼ製品のコストが削減される。
要旨：
本発明は、以下を含む単離、合成または組換え核酸を提供する：
（a）（i）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列であって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異または前記の任意の組合せを含む、前記核酸配列；
（ii）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異または前記の任意の組合せを含む、前記ポリヌクレオチド；または
（a）（i）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列であって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異または前記の任意の組合せを含む、前記核酸配列；
（ii）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異または前記の任意の組合せを含む、前記ポリヌクレオチド；または
（iii）（i）または（ii）の核酸配列であって、前記配列同一性が、配列比較アルゴリズムによってまたは目視精査によって決定され、さらに場合によって配列比較アルゴリズムはBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションが規定値に設定される、前記核酸配列；
（b）（a）の核酸配列であって、少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SまたはY79Wである、前記核酸；
（c）（b）の核酸であって、ポリペプチドがさらにC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RまたはT349Yの少なくとも1つの変異を含む、前記核酸；または
（d）前記と完全に相補性の配列。
これらの核酸の全てが、“本発明のポリペプチド”をコードする“本発明の核酸”である。
ある特徴では、配列比較アルゴリズムはBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される。
ある特徴では、本発明の核酸配列は、シグナル配列、プロプロテイン配列またはプロモーター配列をコードする同種核酸配列を欠く。別の特徴では、本発明の核酸はさらに異種核酸配列を含み、前記異種核酸配列は、場合によって異種シグナル配列、タグ、エピトープ、またはプロモーター配列をコードする配列を含むかまたは前記から成る。別の特徴では、異種核酸配列は、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン、または植物の小胞体もしくはエンドメンブレン系を標的とするN-末端および／またはC-末端伸長部を含むかまたは前記から成る異種シグナル配列をコードするか、または異種配列は制限部位をコードする。さらに別の特徴では、異種プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーター、または植物特異的プロモーター、またはトウモロコシ特異的プロモーターを含むかまたは前記から成る。
ある特徴では、フィターゼ活性は、フィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの触媒作用、またはフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）の加水分解を含む。別の特徴では、フィターゼ活性は、飼料、食品もしくは飲料、または穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、ドー、果実もしくは野菜を含む飼料、食品もしくは飲料中のフィテートの加水分解の触媒作用；または微生物細胞、菌類細胞、動物細胞または植物細胞中のフィテートの加水分解の触媒作用を含む。
ある特徴では、本発明のフィターゼは耐熱性であり、場合によって、本ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する。ある特徴では、本発明のフィターゼ活性は熱安定性であり、場合によって本フィターゼは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度で活性を保持する。
別の実施態様では、本発明のフィターゼは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0または前記より低い酸性pHで耐熱性または耐熱活性を有するか、または本フィターゼポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5または前記より高いpHで耐熱性または耐熱活性を有する。
本発明は、本発明の核酸を含むか、またはその中に本発明の核酸を収納した発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターおよびクローニングベクターを提供する（本発明の核酸には本発明のポリペプチドをコードする核酸が含まれる）。場合によって、前記発現カセット、クローニングベヒクルまたはベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含むかまたは前記であり、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含むかまたは前記であり、または前記発現カセット、クローニングベクターまたはベクターは、細菌人工染色体（BAC）、バクテリオファージ、P1誘導ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）または哺乳動物人工染色体（MAC）を含むかまたは前記である。
本発明は、本発明の核酸を含むか、またはその中に本発明の核酸（本発明の核酸には本発明のポリペプチドをコードする核酸が含まれる）または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターもしくはクローニングベクターを収納している、形質転換細胞、形質導入細胞、宿主細胞などを提供する。場合によって前記細胞は細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である。
本発明は、本発明の核酸を含むか、または本発明の核酸（本発明の核酸には本発明のポリペプチドをコードする核酸が含まれる）、または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターもしくはクローニングベクターを保持しているトランスジェニック非ヒト動物を提供する。場合によって前記動物は、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタまたは乳牛である。
本発明は、本発明の核酸を含むか、または本発明の核酸（本発明の核酸には本発明のポリペプチドをコードする核酸が含まれる）、または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターもしくはクローニングベクターを保持しているトランスジェニック植物（植物部分、例えば処理または収穫した例えば葉、茎、根または果実を含む）または種子を提供する。場合によって、前記植物は、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード、ナタネ、ダイズ、またはタバコであり、場合によって前記種子は、トウモロコシ種子、コムギ穀粒、オイルシード、ナタネ、ダイズ種子、ヤシの実、ヒマワリ種子、ゴマ種子、またはタバコ種子である。また別の実施態様では、本発明の種子または植物から生産させる植物または種子、または本発明の植物または種子には、作物植物、例えばトウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ（Brassica）、ダイズ、サトウキビ、綿花、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、豆類作物（例えばエンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ）、澱粉質の塊茎／根（例えばジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナおよびサトウダイコン）などが含まれ得るか、または前記植物は、トウモロコシの植物、ジャガイモの植物、トマトの植物、コムギの植物、オイルシードの植物、ナタネの植物、ダイズの植物、またはタバコの植物、または飼い葉および／または動物または反芻動物のための飼料植物であり得るか、または前記植物は飼い葉であるかまたは飼い葉を含むことができるか、または飼料植物は牧草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年草、ソルガム、スーダングラス、ベルトグラス（veldt grass）またはビュッフェルグラス（buffel grass）である。前記種子は、トウモロコシ種子、コムギ穀粒、オイルシード、ナタネ、ダイズ種子、ヤシの実、ヒマワリ種子、ゴマ種子、ピーナツ（または落花生の種子）、アルファルファ種子、ワタ種子、ベニバナ種子、ソルガム種子、エンバク穀粒、ライムギ種子、アワ種子、オオムギ種子、コメ穀粒、エンドウマメ種子またはタバコ種子である。または前記植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、エンドウマメ、インゲンマメ、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはサトウダイコンである。
本発明は、本発明の核酸であって表４、５、６、７、９に記載の少なくとも一つの変異またはこれらの変異の任意の組合せをコードする核酸にアンチセンスである核酸を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、場合により前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０、約４０〜８０、約６０〜100または約５０〜１５０塩基の長さである。本発明はまた、本発明のアンチセンス配列を含むリボザイムおよび／またはiRNA（例えばsiRNAまたはmiRNA）を提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、または細胞で前記を発現させる工程を含む、細胞でフィターゼメッセージの翻訳を阻害する方法を提供する。
本発明は、以下を含む単離、合成または組換えポリペプチドを提供する：
（a）（i）本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列；
（ii）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異または前記の任意の組合せを含む、前記アミノ酸配列；または
（iii）（i）または（ii）のポリペプチドであって、前記配列同一性が、配列比較アルゴリズムによってまたは目視精査によって決定される、前記ポリペプチド；
（b）（a）のポリペプチドであって、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SまたはY79Wである、前記ポリペプチド；または
（c）（b）のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがさらにC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RまたはT349Yの少なくとも1つの変異を含む、前記ポリペプチド。
ある特徴では、フィターゼ活性は、フィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの触媒作用、またはフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）の加水分解を含む。別の特徴では、フィターゼ活性は、飼料、食品もしくは飲料、または穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、ドー、果実もしくは野菜を含む飼料、食品もしくは飲料中のフィテートの加水分解の触媒作用；または微生物細胞、菌類細胞、動物細胞または植物細胞中のフィテートの加水分解の触媒作用を含む。
本発明は、その活性が耐熱性であるフィターゼ活性を有する本発明のポリペプチドを提供し、さらに場合によって、前記ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する。本発明の耐熱性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度に暴露後に活性、例えばフィターゼ活性を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の耐熱性ポリペプチドは、上記の範囲の温度に暴露後に、約pH 3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5.0、約pH5、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0または前記より高いpHで活性、例えばフィターゼ活性を保持する。
本発明は、その活性が熱安定性であるフィターゼ活性を有する本発明のポリペプチドを提供する。例えば、本発明のポリペプチドは熱安定性であり得る。本発明の熱安定性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃ から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い温度範囲を含む条件下で、結合および／または酵素活性、例えばフィターゼ活性を保持することができる。本発明の熱安定性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃ から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度で活性、例えばフィターゼ活性を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の熱安定性ポリペプチドは、上記の範囲の温度において、約pH 3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0または前記より高いpHで活性、例えばフィターゼ活性を保持する。
本発明は、本発明のアミノ酸配列を含み、さらに以下の（a）−（c）の単離、合成または組換えポリペプチドを提供する：（a）同種シグナル配列（リーダーペプチド）またはプロプロテイン配列を欠くもの；（b）シグナル配列（リーダーペプチド）を欠き、さらに異種シグナル配列（リーダーペプチド）を含むもの；（c）さらに異種配列を含む（a）または（c）のアミノ酸配列であって、場合によって前記異種配列が異種シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種配列が識別ペプチドを含む、前記配列。ある特徴では、異種シグナル配列は、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン、または植物の小胞体もしくはエンドメンブレン系を標的とするN-末端および／またはC-末端伸長部を含むかまたは前記から成るか、または異種アミノ酸配列は酵素標的制限部位を含むかまたは前記から成る。別の特徴では、本発明のポリペプチドはさらに、シグナル配列（リーダー配列またはリーダーペプチド）と酵素との間に追加のアミノ酸残基を含む。
ある特徴では、本発明の任意のポリペプチドのフィターゼ活性は以下の比活性を含む（有する）：約37℃で約100から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性；または約500から約750単位/mgタンパク質；または約37℃で約500から約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性；または約37℃で約750から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性。ある特徴では、耐熱性フィターゼ活性は、約37℃の温度に曝露した後、約100から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は約500から約750単位/mgタンパク質の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は、37℃で約500から約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は、37℃で約750から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。ある特徴では、耐熱性フィターゼ活性は、約37℃の温度を含む条件下で約100から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は約500から約750単位/mgタンパク質の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は、37℃で約500から約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むか、または耐熱性フィターゼ活性は、37℃で約750から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含む．
ある特徴では、本発明のポリペプチドはグリコシル化されているか、または少なくとも1つのグリコシル化部位を含み、場合によって前記グリコシル化はN-結合グリコシル化またO-結合グリコシル化であり、さらに場合によって、前記ポリペプチドは酵母で発現後にグリコシル化され、前記酵母は場合によってP.パストリス（patoris）またはＳ．ポンベ（pombe）である。
ある特徴では、ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0または前記より低い（より酸性）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持する。或いは、本発明のポリペプチドは、約pH7.5、約pH8、約pH8.5、約pH9、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12、pH12.5または前記より高い（より塩基性）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持することができる。
本発明は、本発明のポリペプチドを含むタンパク質調製物（前記タンパク質調製物は、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物/処方物、固体、ピル、インプラント、ゲルを含む）、または医薬処方物、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または前記の食物性サプリメントを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドを含むヘテロダイマーを提供し、ある特徴では、前記ヘテロダイマーは第二のドメインを含み、場合によって前記第二のドメインはポリペプチドでありかつ前記ヘテロダイマーは融合タンパク質であり、さらに場合によって前記第二のドメインはエピトープまたはタグである。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む固定されたポリペプチドを提供し、前記固定化ポリペプチドは本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマーを含むことができ、場合によって、前記ポリペプチドは、細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、散剤、凝集物、表面、または多孔性構造物上にもしくは前記の内部に固定される。ある特徴では、本発明は、固定化ポリペプチドを含むアレイ（マイクロアレイ）を提供し、前記ポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたは本発明のダイマーまたは本発明の核酸または前記の組合せを含む。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離、合成または組換え抗体を提供し、場合によって前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。本発明は、本発明の抗体を含むハイブリドーマを提供する。
本発明は、以下の工程を含む組換えポリペプチドを製造する方法を提供する：（a）核酸を提供する工程（前記核酸は本発明の配列を含む）；および（b）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程。前記方法は、さらに場合によって（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを製造する工程を含む。また別の実施態様では、前記核酸は、宿主細胞を形質転換する前にプロモーターに作動できるように連結される。
本発明は、以下の工程を含むフィターゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）フィターゼ基質を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種を（b）の基質と接触させ、さらに基質の量の増加または反応生成物の量の減少を検出する工程（ここで基質の量の減少または反応生成物の量の増加によってフィターゼ活性を有するポリペプチドが検出される）。
本発明は、以下の工程を含むフィターゼ基質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）試験基質を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドを（b）の試験基質と接触させ、さらに基質の量の増加または反応生成物の量の減少を検出する工程（ここで基質の量の減少または反応生成物の量の増加によって試験基質がフィターゼ基質と同定される）。
本発明は、以下の工程を含む、化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する：（a）核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で、核酸または核酸を含むベクターを発現させる工程（前記核酸は本発明の配列を含む）；（b）ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程；および（c）試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定し、それによって前記化合物がポリペプチドと特異的に結合することを決定する。
本発明は、以下の工程を含む、フィターゼ活性の調節物質を同定する方法を提供する：（a）本発明のフィターゼポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；（c）（a）のポリペプチドを（b）の試験化合物と接触させ、フィターゼ活性を測定する工程（ここで、試験化合物が存在しないときの活性と比較して試験化合物が存在するときに測定されるフィターゼ活性が変化すれば、試験化合物はフィターゼ活性を調節するという決定がなされ、場合によってフィターゼ活性は、フィターゼ基質を提供し基質の量の増加または反応生成物の量の減少を検出することによって測定され、さらに場合によって、試験化合物の非存在下での基質または反応生成物の量と比較して試験化合物の存在下での基質の量の減少または反応生成物の量の増加があれば、試験化合物がフィターゼ活性のアクチベーターと同定され、さらに場合によって、試験化合物の非存在下での基質または反応生成物の量と比較して試験化合物の存在下での基質の量の増加または反応生成物の量の減少があれば、試験化合物がフィターゼ活性のインヒビターと同定される）。
本発明は、以下の工程を含む、イノシトール-ヘキサホスフェートをイノシトールと無機ホスフェートに加水分解する方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程（前記ポリペプチドは本発明のアミノ酸配列を含むか、または本発明の核酸によってコードされる）；（b）イノシトール-ヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドを（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-ヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールと無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程（ここで、場合によって前記条件は約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の温度を含み、さらに場合によって前記組成物はフィチン酸を含む）。
本発明は、以下の工程を含む油を脱ガムする方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程（前記ポリペプチドは本発明のアミノ酸配列を含むか、または本発明の核酸によってコードされる）；（b）植物油を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドを（b）の植物油と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させ、それによって植物油を脱ガムする工程。
本発明は、以下の工程を含む、飼料もしくは食品、または飼料もしくは食品サプリメント、または飼料もしくは食品添加物、または栄養補助物または食物サプリメントを製造する方法を提供する：（a）前記植物、植物部分または植物細胞をフィターゼ酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程（前記フィターゼは本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、または本発明の核酸によってコードされる）；（b）前記植物、植物部分または植物細胞をフィターゼ酵素が発現される条件下で培養する工程；および（c）前記植物、植物部分または植物細胞を、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントに適した組成物に転換するか、または前記培養植物、植物部分または植物細胞を、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントに添加し、それによって食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントを製造する工程（ここで、場合によって前記ポリヌクレオチドは発現ベクターに含まれ、さらに場合によって前記ベクターは植物細胞で核酸を発現することができる発現制御配列を含み、さらに場合によって前記食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントは動物用であり、さらに前記動物は単胃動物であり、さらに場合によって前記動物は反芻動物であり、さらに場合によって前記食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントは、デリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉の形である）。ある特徴では、フィターゼ酵素は、ペレット化条件で耐熱性または熱安定性を提供するためにグリコシル化され、さらに場合によって、デリバリーマトリックスは、穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によってペレットは水蒸気の適用を含む条件下で製造され、場合によってペレットは約5分間80℃を超える温度の適用を含む条件下で製造され、さらに場合によってペレットは、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む。
本発明はフィターゼ酵素サプリメントを動物またはヒトにデリバリーする方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）食用担体および本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィターゼ酵素を含む食用デリバリーマトリックスを製造する工程（前記マトリックスは、水性媒体中に置かれたとき容易に分散しフィターゼ酵素を放出する）；および（b）前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物またはヒトに投与する工程（場合によって、前記食用デリバリーマトリックスは顆粒状食用担体を含み、さらに場合によって前記食用デリバリーマトリックスはペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレーまたは散剤の形であり、さらに場合によって前記食用担体は、穀物胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズの外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズおよびひき割りコムギから成る群から選択される担体を含み、さらに場合によって前記食用担体は油の搾りかすである穀物胚芽を含む）。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む、動物またはヒト用の食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントを提供し、ここで場合によって、前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によってフィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。ある特徴では、前記食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養補助物または食物サプリメントは、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液体形で、懸濁物またはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む、食用または吸収性酵素デリバリーマトリックスを提供し、ここで場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によってフィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。ある特徴では、前記食用デリバリーマトリックスはペレットを含むか、または、前記食用または吸収性酵素デリバリーマトリックスは、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液体形で、懸濁物またはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される。
本発明は、顆粒状食用または吸収性担体および本発明のポリペプチドまたは本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む、食用または吸収性ペレットを提供し、ここで、前記ポリペプチドは場合によってグリコシル化され、さらに場合によってフィターゼ活性は耐熱性または熱安定性であり、さらに場合によって前記ペレットは、ペレットの形で、またはピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液体形として、懸濁物またはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含むひき割り粉、例えばひき割りダイズを提供し、さらに場合によって前記ひき割り粉、例えばひき割りダイズは、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、凍結乾燥処方物、または液体形として製造される。
本発明は、動物の消化系における酵素による不活化に対してフィターゼポリペプチドの耐性を増加させる方法を提供する。前記方法は、本発明のポリペプチドを含むフィターゼポリペプチドをグリコシル化し、それによって動物の消化系における酵素による不活化に対してフィターゼポリペプチドの耐性を増加させる工程を含み、場合によって、前記グリコシル化はN-結合グリコシル化であり、さらに場合によって、前記フィターゼポリペプチドは、フィターゼをコードするポリヌクレオチドの細胞内でのin vivo発現の結果としてグリコシル化され、さらに場合によって前記細胞は真核細胞であり、さらに場合によって前記真核細胞は菌類細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
本発明は、以下の工程を含む、トウモロコシおよびソルガムの実の処理方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程（前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドを含む）；（b）トウモロコシ浸漬液またはソルガム浸漬液を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドを（c）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させる工程。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む医薬または食物性処方物を提供し、ここで前記ポリペプチドは場合によってグリコシル化され、、さらに場合によってフィターゼ活性は耐熱性または熱安定性であり、さらに場合によって前記医薬または食物性処方物は、ペレッ、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、ローションまたは液体形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、またはインプラントとしてまたは顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマー、および（b）表2に示す任意の製品または表1に列挙する組成物のいずれかを含む組成物を提供し、ここで前記ポリペプチドは場合によってグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む、携帯口糧ユニット（Ready-to-Eat; MRE）、飲料または水和剤を提供し、ここで前記ポリペプチドは場合によってグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明は骨粗しょう症を緩和する（その進行を遅らせるか、治療または予防する）方法を提供する。前記方法は、その必要がある個体に本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む組成物の有効な量（用量）を投与する工程を含み、ここで前記ポリペプチドは場合によってグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明はフィターゼの胃での不安定性を高める方法を提供する。前記方法は、フィターゼ活性を有し、さらに当該ポリペプチドをコードする配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸をアルギニン、ヒスチジン、プロリン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはチロシンで置き換えたポリペプチドを提供する工程を含む。本発明はさらに、前記方法で使用される例示的フィターゼ、例えば以下の実施例2に詳細に記載する配列番号：2または本発明の他のフィターゼを提供する。
本発明は、実施例2で詳細に記載するように、酵素の少なくとも2つの異なる特性を変更する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）酵素活性を有するポリペプチドを提供する工程；（b）（a）のポリペプチドから変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドから単一アミノ酸変化を有する）；（c）（b）の変種を2つの異なる特性についてスクリーニングする工程；（d）所望される（c）の変種を選別し、各選別変種の単一アミノ酸変化を同定する工程；（e）（d）の選別単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種を作製する工程；（f）（e）の変種を2つの改変特性についてスクリーニングする工程；および（g）2つの改変特性を有する、所望される（f）の変種を選別する工程。本発明は、酵素の少なくとも2つの異なる特性を変更するまた別の方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）酵素活性を有するポリペプチドを提供する工程；（b）（a）のポリペプチドから変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドから単一アミノ酸変化を有する）；（c）（b）の変種を1つの改変特性についてスクリーニングする工程；（d）（b）の変種を別の改変特性についてスクリーニングする工程；（e）（c）および（d）の所望される変種を選別し、各選別変種の単一アミノ酸変化を同定する工程；；（f）（c）および（d）の選別単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種を作製する工程；（g）（f）の変種を2つの改変特性についてスクリーニングする工程；および（h）2つの改変特性を有する、所望される（g）の変種を選別する工程。本発明はさらに、変種作製のための例示的方法（例えばGSSM進化、ジーンリアッセンブリー（GeneReassembly）進化および／またはTMCA進化による）を提供する。
本発明は、下記実施例2で詳細に記載するように、フィターゼの耐熱性から胃安定性を切り離す方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；（b）（a）のポリペプチドから変種フィターゼを作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドから単一アミノ酸変化を有する）；（c）（b）の変種フィターゼを胃安定性および改変耐熱性についてスクリーニングする工程；（d）所望の胃安定性および改変耐熱性を有する（c）の変種を選別し、各選別変種の単一アミノ酸変化を同定する工程；（e）（d）の選別した単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種フィターゼを作製する工程；（f）（e）の変種を改変胃安定性および改変耐熱性についてスクリーニングする工程；および（g）所望の胃安定性および耐熱性を有する（f）の変種を選別する工程。本発明は、フィターゼの耐熱性から胃安定性を切り離すまた別の方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；（b）（a）のポリペプチドからフィターゼ変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドから単一アミノ酸変化を有する）；（c）（b）の変種フィターゼを改変胃安定性についてスクリーニングする工程；（d）（b）の変種フィターゼを改変耐熱性についてスクリーニングする工程；（e）所望される胃安定性または耐熱性を有する（c）および（d）の変種を選別し、各選別変種の単一アミノ酸変化を同定する工程；；（f）（c）および（d）の選別単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種フィターゼを作製する工程；（g）（f）の変種を改変胃安定性および改変耐熱性についてスクリーニングする工程；および（h）所望の胃安定性および耐熱性を有する（g）の変種を選別する工程。本発明はさらに、変種作製のための例示的方法（例えばGSSM進化、ジーンリアッセンブリー（GeneReassembly）進化および／またはTMCA進化による）を提供する。本発明は、前記方法で使用される例示的フィターゼ、例えば配列番号：2および本発明の他のフィターゼを提供する。本発明は、耐熱性から胃安定性を切り離す例示的変異、例えば表4、5、6、7、9に列挙される変異または前記の組み合わせを提供する。
本発明は、下記実施例2で詳細に記載するように、胃で不安定でありかつ耐熱性であるフィターゼを提供し、ここで前記フィターゼは、例えば下記の実施例2で詳細に記載する本発明のフィターゼは、刺激胃液（SGF）中で10分未満、8分未満、6分未満、4分未満、または2分未満で完全に分解され、さらにフィターゼは約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、または約80℃から約86℃の範囲の温度に暴露後に活性を保持する。ある特徴では、本発明の胃不安定性および耐熱性フィターゼは、刺激胃液（SGF）中で4分未満に完全に分解し、さらに前記フィターゼは約80℃から約86℃の範囲の温度に暴露後活性を保持する。
本発明の1つまたは2つ以上の特徴の詳細は添付の図面および下記の説明で示される。本発明の他の特徴物、目的および利点は本説明および図面からさらに特許請求の範囲から明白であろう。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、全ての目的のために参照により明白に本明細書に含まれる。
以下の図面は本発明の特徴の例証であり、特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を制限しようとするものではない。
精製した本発明のポリペプチド（本発明の単一変異の例示的配列）を種々の温度で30分熱処理した後の残留活性の要旨を示す。前記フィターゼ活性を蛍光基質でアッセイし、下記実施例1で詳細に説明するように、その比率を各々対応する非処理サンプルの比率と比較した。 “ブレンドした”単一残基変異を含む本発明の精製ポリペプチド（マルチ変異を含むフィターゼ）をサーモサイクラーで熱処理した後の残留活性の要旨を示す。前記フィターゼ活性を蛍光基質でアッセイし、図1に要約し下記実施例1で詳細に説明するように、その比率を各々対応する非処理サンプルの比率と比較した。 下記実施例1で詳細に説明するように、図1のグラフの作成に用いたデータのまとめである。 親フィターゼ配列番号：2の配列および、下記で詳細に説明するようにジーンリアッセンブリー(商標)（GeneReassemblyTM）ライブラリー構築物のために選択した遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)-生成配列改変を示す。 下記で詳細に説明するように、親の配列番号：2に対してマルチ残基改変を有する例示的フィターゼを示す。 下記で詳細に説明するように、親の配列番号：2に対して単一残基改変を有する例示的フィターゼを示す。 下記実施例1で詳細に説明するように、蛍光基質4-メチルウンベリフェリルホスフェート（MeUMB-ホスフェート）を用いる本発明の例示的フィターゼアッセイを模式的に示す。 下記実施例1で詳細に説明するように、蛍光基質MeUMB-ホスフェートを用いる本発明の例示的フィターゼアッセイを模式的に示す。 図8で説明し、下記実施例1で詳細に説明するように、例示的ライブラリースクリーニングのためのプロトコルを模式的に示す。 本発明のフィターゼの使用を取り込むことができる、例示的アルコールプロセスを示す。 AおよびBは、下記実施例2で詳細に説明するように、appAフィターゼ（GenBankアクセッション番号M58708）、appA-配列番号：2中間体および配列番号：2の熱安定性およびSGF不安定性の要旨を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、親フィターゼ（配列番号：2）の精製his-タグおよび非his-タグバージョンのSGFアッセイにより決定したSGF安定性に対するhis-タグの影響を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、グリコシル化-マイナス配列番号：2変種（変種GLY1−GLY4）および2つの配列番号：2コントロールの耐熱性を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、配列番号：2-HISおよび配列番号：2-6X変種のSGF安定性を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、配列番号：2のGSSM進化による選抜変異体のSGF活性の消失を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、SGF不安定性に対する種々のアミノ酸の影響を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、SGF変異のホットスポットを示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、種々のペプシン投与量における配列番号：2-HISおよび変種OのSGF不安定性を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、配列番号：2-HISおよび変種Oの半減期を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、SGF不安定性フィターゼ変種の残留活性を示す。 下記実施例2で詳細に説明するように、配列番号：2と比較したSGF不安定性変種フィターゼの比活性を示す。
種々の図面の同じ参照記号は同じ要素を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、上記に記載したように、配列番号：2に対して特異的な残基改変を含むフィターゼポリペプチドおよびそれらをコードする（例えば配列番号：1に対して特異的な塩基対改変を含む）ポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用方法に関する。図6は親の配列番号：2に対して単一残基改変を有する例示的フィターゼを示し、さらに図5は親の配列番号：2に対してマルチ残基改変を有する例示的フィターゼを示す。
本発明のポリペプチドのフィターゼ活性は、任意のフィターゼ活性を有する酵素、例えばフィテートの分解を触媒することができる酵素、例えばフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの分解を触媒することができる酵素を含むことができる。本発明のフィターゼは耐熱性および熱安定性酵素を含むことができる。
本発明のフィターゼおよび前記をコードするポリヌクレオチドは多数のプロセス、方法および組成物で有用である。例えば、上記で考察したように、フィターゼは、動物飼料および飼料サプリメントで用いるとともに、環境またはサンプルから過剰なフィテートを分解または除去するために用いることができる。上記で考察した教示を含む、本明細書に提供される教示を土台にして、他の使用も当業者には明白であろう。
ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、単独でまたは他の試薬（酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない）と併用して、食品の処理において例えば不適当なトウモロコシのスラッジの防止のために、およびフィテートの加水分解が所望される他の応用において利用される。
ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、特に、加水分解されていないフィテートがex vivoプロセスで有害な結果をもたらす場合に（食品の処理プロセスが含まれるが、ただし前記に限定されない）、非加水分解フィテートの存在を除去または減少させるために用いられる。ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、EP0321004-B1（Vaara et al.）に記載されているような方法で用いられる（前記は、トウモロコシおよびソルガムの堅い実を水に浸漬してそれらを軟らかくするトウモロコシおよびソルガムの処理の工程を含む）。前記プロセスの間に浸出した水溶性物質はトウモロコシ浸漬液の部分になり、前記は蒸発によって濃縮される。トウモロコシ浸漬液中の加水分解されないフィチン酸（大半はカルシウム塩およびマグネシウム塩の形である）はリンと結合し、タンパク質および金属イオンを含む望ましくないスラッジを堆積させる。このスラッジは、トウモロコシ浸漬液の蒸発、輸送および保管を困難にする。本発明のフィターゼ分子はこのスラッジの加水分解に用いられる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、以前に同定されたフィターゼ分子（例えば菌類起源のフィターゼ分子）よりも実質的に優れた産業性能を提供することができる。ある特徴では、本発明の酵素は約4400U/mg、ほぼ50から100、または50から1000、または100から4000U/mgタンパク質以上であり得る。
本発明はまた、変異導入および他の方法によって、下記で詳細に考察するように本発明のフィターゼの特徴を変化させる方法を提供する。
核酸の作製および操作
本発明は、本発明のポリペプチドおよびフィターゼをコードする核酸を提供する。本発明はまた、発現カセット、ベクター、例えば発現またはクローニングベクター、クローニングベヒクル、例えばウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体（前記は本発明の核酸を含むことができ、またはその中に本発明の核酸を収納している）を提供する。
本発明はまた、本発明の核酸を用いて新規なフィターゼ配列を見つける方法を含む。さらにまた提供されるものは、例えば合成連結再アッセンブリー、最適化定方向進化系および／または飽和変異導入によって、本発明の核酸を改変する方法である。
ある特徴では、本発明は、親の配列番号：1の合成により作製される変種である核酸類を提供し、これらの本発明の核酸は、親の配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せをコードする。
参照のために、親の配列番号：1は以下のとおりである：
atgaaagcga tcttaatccc atttttatct cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca 60
ttcgctcaga gtgagccgga gctgaagctg gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt 120
gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca 180
acctggccgg taaaactggg tgagctgaca ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc 240
ggacattact ggcgtcagcg tctggtagcc gacggattgc tgcctaaatg tggctgcccg 300
cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa 360
gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt gcaataaccg tacataccca ggcagatacg 420
tccagtcccg atccgttatt taatcctcta aaaactggcg tttgccaact ggataacgcg 480
aacgtgactg acgcgatcct cgagagggca ggagggtcaa ttgctgactt taccgggcat 540
tatcaaacgg cgtttcgcga actggaacgg gtgcttaatt ttccgcaatc aaacttgtgc 600
cttaaacgtg agaaacagga cgaaagctgt tcattaacgc aggcattacc atcggaactc 660
aaggtgagcg ccgactgtgt ctcattaacc ggtgcggtaa gcctcgcatc aatgctgacg 720
gagatatttc tcctgcaaca agcacaggga atgccggagc cggggtgggg aaggatcacc 780
gattcacacc agtggaacac cttgctaagt ttgcataacg cgcaatttga tttgctacaa 840
cgcacgccag aggttgcccg cagccgcgcc accccgttat tagatttgat caagacagcg 900
ttgacgcccc atccaccgca aaaacaggcg tatggtgtga cattacccac ttcagtgctg 960
tttatcgccg gacacgatac taatctggca aatctcggcg gcgcactgga gctcaactgg 1020
acgcttcccg gtcagccgga taacacgccg ccaggtggtg aactggtgtt tgaacgctgg 1080
cgtcggctaa gcgataacag ccagtggatt caggtttcgc tggtcttcca gactttacag 1140
cagatgcgtg ataaaacgcc gctgtcatta aatacgccgc ccggagaggt gaaactgacc 1200
ctggcaggat gtgaagagcg aaatgcgcag ggcatgtgtt cgttggcagg ttttacgcaa 1260
atcgtgaatg aagcacgcat accggcgtgc agtttgtaa 1299
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニングおよび発現、PCRによるメッセージまたはゲノムDNAの増幅などによって作製、単離および／または操作できる。本発明の方法を実施するとき、同種遺伝子は、本明細書に記載するように鋳型核酸を操作することによって改変することができる。本発明は、当分野で公知である、学術文献および特許文献に詳しく記載されている任意の方法またはプロトコルまたは装置を一緒に用いて実施できる。
一般的技術：
本発明の実施に用いられる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたは前記のハイブリッドのいずれであっても、種々の供給源から単離、遺伝的に操作、増幅、および／または組換えにより発現／作製することができる。これらの核酸から作製された組換えポリペプチドは個々に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系（細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む）を用いることができる。
あるいは、これら核酸は周知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている：Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えばクレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献および特許文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。
本発明の方法の実施に用いられる核酸を入手および操作するために有用なまた別の手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、および所望の場合には、例えばゲノムクローンもしくはcDNAクローンから単離または増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、哺乳動物人工染色体（MAC）（例えば米国特許5,721,118号、同6,025,155号を参照されたい）、ヒト人工染色体（Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（Woon (1998) Genomics 50:306-316）、P1誘導ベクター（PAC）（Kern (1997) Biotechniques 23:120-124）、コスミド、組換えイルス、ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが含まれる。
また別の特徴では、“核酸”または“核酸配列”という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または前記のいずれかのフラグメント、ゲノム由来もしくは合成起源のDNAまたはRNA（例えばmRNA、rRNA、tRNA、）（これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表していてもよい）、ペプチド核酸（PNA）または任意のDNA様もしくはRNA様物質、天然もしくは合成起源（例えばiRNAを含む）のリボヌクレオプロテイン（例えばiRNP）を指す。前記用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）を包含する。前記用語はまた合成骨格をもつ核酸様構造物を包含する（例えば以下を参照されたい：Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）。
ある特徴では、本発明の組換えポリヌクレオチドは“骨格”核酸に隣接する配列を含むが、前記配列はその天然の環境では前記骨格核酸に隣接していない。ある特徴では、核酸は、核酸“骨格分子”集団における核酸挿入物の数の5%以上を表す。本発明の“骨格分子”には、核酸、例えば発現ベクター、自己複製核酸、組込み核酸、および関心がある核酸挿入物を維持または操作するために用いられる他のベクターまたは核酸が含まれる。ある特徴では、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団中の核酸挿入物の数の15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上を表す。
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な局面でアッセンブリングされる。
本発明は融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば所望の特性（例えば安定性増強または精製の簡便化）を付与するN-末端識別ペプチドと融合させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、例えばより強い免疫原性をもつペプチドを製造するため、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するため、抗体および抗体発現B細胞を同定および単離するためなどの目的のために、前記に結合した1つまたは2つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成および発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば金属キレートペプチド（例えばポリヒスチジン鎖およびヒスチジン-トリプトファンモジュール（固定化金属上での精製を可能にする）、プロテインAドメイン（固定化免疫グロブリン上での精製を可能にする）、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immune Corp, Seatle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインおよびモチーフ構成ペプチドまたはポリペプチド間の切断可能リンカー配列（例えばXa因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA））の挿入は精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、6つのヒスチジン残基とそれに続くチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば以下を参照されたい：Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414）。前記ヒスチジン残基は検出および精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献および特許文献に詳しく記載されている（例えば以下を参照されたい：Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53）。
ある特徴では、“単離”という用語は、材料がその本来の環境（例えば、材料が天然に存在する場合はその天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に出現するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に一緒に存在する物質のいくつかまたは全てから分離されている前記と同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよいし、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおそのようなベクターまたは組成物は前記の天然の環境の一部分ではないという点で、それらは単離されている。ある特徴では、“精製される”という用語は完全な純度を要求せず、むしろ相対的な定義と考えられる。ライブラリーから得られる個々の核酸は電気泳動による均質度まで通常的に精製されている。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーからもまたはヒトの全DNAからも直接入手することはできないであろう。本発明の核酸はその生物体のゲノムDNAの残余のものから少なくとも104−106倍精製されてある。また別の特徴では、“精製される”という用語はまた、ゲノムDNAの残余のものから、またはライブラリーもしくは他の環境中の他の配列から少なくとも1桁、あるいは2または3桁、または4または5桁精製された核酸を含む。
転写および翻訳制御配列：
本発明は、RNA合成／発現を誘導または調節するために、発現（例えば転写または翻訳）制御配列（例えばプロモーターまたはエンハンサー）に機能的に連結された本発明の核酸（例えばDNA）配列を提供する。発現制御配列は発現ベクター内に存在することができる。例示的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIが含まれる。
細菌でポリペプチド発現または過剰発現させるために適切なプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
発現ベクターおよびクローニングビヒクル：
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のフィターゼをコードする配列を含む発現系、例えば発現カセット、ベクター、クローニングビヒクルなどを、本発明のポリペプチド（および核酸、例えばアンチセンス）の発現および過剰発現のために提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心のある特定宿主（例えばバシルス、アスペルギルスおよび酵母）に特異的な他の任意のベクターを含むことができる。本発明のベクターは染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列を含むことができる。多くの適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。例示的なベクターには以下が含まれる：細菌系：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミドまたは他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能でさらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
利用可能な発現ベクターの代表的な例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心のある特定宿主（例えばバシルス、アスペルギルスおよび酵母）に特異的な他の任意のベクターを挙げることができる。したがって、例えばDNAは、ポリペプチド発現用の多様な発現ベクターの任意のものに挿入することができる。そのようなベクターは染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列を含む。多くの適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。以下のベクターが例示として提供される：細菌系：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミドまたは他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能でさらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
本発明で使用される例示的ベクターはf-因子複製起点を含む。大腸菌のf-因子（または稔性因子）は、接合時のそれ自体の高頻度の伝達およびより頻度は低いが細菌染色体自体の伝達に影響を与えるプラスミドである。ある特徴では、“フォスミド”または細菌人工染色体（BAC）ベクターと称されるクローニングベクターが使用される。これらは大腸菌のf-因子に由来し、ゲノムDNAの大きなセグメントを安定的に組み込むことができる。未培養の混合環境サンプル由来のDNAとともに組み込まれたとき、これは、安定な“環境DNAライブラリー”の形態で大きなゲノムフラグメントを獲得することを可能にする。
本発明で使用できる別のタイプのベクターはコスミドベクターである。最初コスミドベクターは、ゲノムDNAの大きなセグメントのクローニングおよび増殖のために設計された。コスミドベクターによるクローニングは以下に詳細に記載されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結され、DNA合成を誘導する。具体的に列挙される細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。真核細胞プロモーターにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR並びにマウスのメタルチオネイン-Iが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選別は当業者の技術レベル内である。発現ベクターはまた転写開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた発現増幅のために適切な配列を含むことができる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選別可能マーカーをもつ他のベクターを用いて任意の所望遺伝子から選択することができる。さらにまた、発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能マーカー遺伝子を含み、形質転換宿主細胞の選別のために表現型の特質（真核細胞培養については例えばジヒドロホレートレダクターゼもしくはネオマイシン耐性、または大腸菌については例えばテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性）を提供する。
ある特徴では、本発明の発現カセットは本発明の配列およびヌクレオチド配列を含み、後者のヌクレオチド配列は、そのような配列と適合する宿主内で構造遺伝子（すなわちタンパク質コード配列、例えば本発明のフィターゼ）の発現に影響を与えることができる。発現カセットは、ポリペプチドコード配列（および場合によって他の配列、例えば転写終了シグナル）と機能可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。発現の実施に必要なまたは有用なさらに別の因子（例えばエンハンサー）もまた用いることができる。ある特徴では、本明細書で用いられる“機能的に連結される”とは、DNA配列の上流のプロモーターが前記DNA配列の転写を仲介できるような前記プロモーターの連結を指す。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え“裸のDNA”ベクターなどを含む。ある特徴では、“ベクター”は、細胞に感染、トランスフェクト、一過性もしくは永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体を形成した核酸であり得る。ベクターは場合によってウイルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質および／または膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ある特徴では、ベクターには、DNAフラグメントが結合し複製できるようになったレプリコン（例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ）が含まれるが、ただし前記に限定されない。ある特徴では、ベクターには、RNA、自律的自己複製性環状もしくは線状DNAまたはRNA（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば米国特許出願第5,217,879号参照）が含まれ（ただし前記に限定されない）、さらに発現および非発現プラスミドが含まれる。組換え微生物または培養細胞が“発現ベクター”を宿主として受け入れていると記述されている場合には、染色体外環状および鎖状DNA並びに宿主染色体に取り込まれたDNAの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持されている場合は、前記ベクターは自律性構造物として有糸分裂時に細胞によって安定的に複製されるか、または宿主のゲノム内に取り込まれることができる。
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むことができる。発現を増幅させるために、ベクターはまた適切な配列を含むことができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5’フランキング非翻訳配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライスから誘導されたDNA配列およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
ある特徴では、発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌にテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、およびS.セレビシアエ（S. cerevisiae）のTRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクターまたは選別可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、所望される任意の遺伝子から選抜できる。
真核細胞中でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させるためのベクターはまた、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作動性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。その例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
DNA配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物およびベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。多様なクローニング技術が当業界で公知であり、例えばAusubel および Sambrookに記載されている。そのような方法および他の方法は当業者の技術範囲内であろう。
ベクターはプラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態を有し得る。他のベクターには染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞および真核細胞宿主で使用できる多様なクローニングベクターおよび発現ベクターは例えばSambrookによって記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、以下の周知のクローニングベクターの遺伝的要素を含む市販のプラスミドが含まれる：pBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174、pBluescript IIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK232-8およびpCM7。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。しかしながら他のベクターのいずれも宿主細胞内で複製可能で生存可能である限り使用することができる。
宿主細胞および形質転換細胞：
本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば本発明のフィターゼをコードする配列を含むか、または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクターを含む形質転換細胞を提供する。前記宿主細胞は、当業者に周知の任意の宿主細胞であって、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞が含まれ得る。例示的な細菌細胞には、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞（例えば大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンスを含む）が含まれる。例示的な菌類細胞には、アスペルギルス属内の任意の菌類細胞（アスペルギルス・ニゲルを含む）が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞（ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベを含む）が含まれる。例示的な昆虫細胞には、スポドプテラ（Spodoptera）またはドロソフィラ（Drosophila）の任意の種（ドロソフィラS2およびスポドプテラSf9を含む）が含まれる。例示的な昆虫細胞には、ドロソフィラS2およびスポドプテラSf9が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエまたはシゾサッカロミセス・ポンベが含まれる。例示的な動物細胞にはCHO、COSまたはボウズ・メラノーマまたは任意のマウスもしくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主を選択することは当業者の技術範囲内である。
ベクターは、多様な任意の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi仲介遺伝子伝達が含まれる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（L. Davis, M. Dibner, I. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, 1986）。
適切な場合には、操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化に適切なように改変した通常の栄養培地で培養して、形質転換体を選別するか、または本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに適切な細胞密度に前記宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに追加の期間培養して所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持することができる。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は任意の一般的な方法によって破壊することができる。そのような方法には、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。そのような方法は当業者には周知である。発現されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、組換え細胞培養から以下を含む方法によって回収および精製することができる：硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて用いることができる。所望の場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用い、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え生産方法で用いる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、またグリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニン残基を含んでいることも含まないこともある。
無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの製造に利用することができる。無細胞翻訳系は、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いることができる。いくつかの特徴では、DNA構築物は、in vitro転写反応実施前に線状化することができる。続いて適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギ網状赤血球抽出物）とともに転写mRNAをインキュベートし、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する。
発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能な遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選別用表現型特性（真核細胞の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、大腸菌では例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供することができる。
本発明の核酸は、任意のin vitroまたはin vivo発現系で発現または過剰発現させることができる。いずれの細胞培養系（細菌、昆虫、酵母、菌類または哺乳動物培養を含む）も、組換えタンパク質の発現または過剰発現に利用できる。過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、ベクター（例えばレプリコンベクター、二シストロン性ベクターの使用（例えば以下を参照されたい：GuRu, Biochem Biophys Res Commun, 1996, 229:295-8））、培地、培養系などを適切に選択することによって達成できる。ある特徴では、選別マーカー（例えばグルタミンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Sanders Dev Biol Stand, 1987, 66:55-63））を細胞系で用いて、本発明のポリペプチドが過剰発現される。
種々の哺乳動物細胞培養系を組換えタンパク質の発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株（以下に記載されている：”SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants”（Gluzman, 1981））および適合ベクターからタンパク質を発現することができる他の細胞株（例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらにまた必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5’フランキング非翻訳配列を含むであろう。SV40スプライスから誘導されたDNA配列およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
関心のあるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、プロモーターの活性化に適切なように改変した通常の栄養培地で培養して、形質転換体を選別または遺伝子を増幅することができる。培養条件（例えば温度、pHなど）は発現のために選択した宿主細胞で以前に用いられたものであり、当業者には明白であろう。特定の酵素活性を有することが確認されたクローンの配列を続いて決定し、活性が強化された酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定することができる。
核酸の増幅：
本発明を実施するとき、本発明のポリペプチドをコードする核酸または改変核酸は例えば増幅によって複製することができる。本発明は、フィターゼ活性および上記に示す特異的な配列改変の少なくとも１つを有するポリペプチドをコードする核酸またはその部分配列を増幅するための増幅プライマー配列対（例示的な配列番号：1を含む核酸配列を増幅できる）を提供する。当業者は、これら配列の任意の部分またはその完全長のための増幅プライマー配列対を設計することができる。
“親”の配列番号：1は上記に示したとおりである。したがって、この親配列または上記に示す特異的な配列改変の少なくとも１つを有する本発明の例示的配列の1つを増幅するための増幅プライマー配列対は、配列番号：1の残基1から21（すなわちATGAAAGCGATCTTAATCCCA）および配列番号：1の最後の21残基の相補鎖（すなわちTGCAGTTTGAGATCTCATCTAの相補鎖）であり得る。
増幅反応はまたサンプル中の核酸の量（例えば細胞サンプル中のメッセージの量）の定量、核酸の標識（例えば前記核酸をアレイまたはブロットに適用する）、前記核酸の検出、またはサンプル中の特定の核酸の量の定量に用いることができる。本発明のある特徴では、細胞またはcDNAライブラリーから単離したメッセージが増幅される。当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計することができる。増幅方法はまた当業界で周知であり、例えば以下が含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば以下を参照されたい：PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, NY (1990); PCR Strategies (1995) ed. Innis, Academic Press, Inc., NY）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば以下を参照されたい：Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117）、転写増幅（例えば以下を参照されたい：Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、およびセルフサステイン配列複製（例えば以下を参照されたい：Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、自動Q-ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）および他のRNAポリメラーゼ仲介技術（例えば以下を参照されたい：NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）。さらにまた以下を参照されたい：Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; US Patent Nos. 4,683,195および4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564。
配列同一性の程度の決定
本発明は、配列番号:1と少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有し、さらに上記に考察したように配列番号：1に対して具体的に列挙した改変の少なくとも１つを含む核酸配列を含む、単離、合成または組換え核酸を提供する。ある特徴では、配列同一性（相同性）の程度は、任意のコンピュータプログラムおよび付属のパラメーター（本明細書に記載されたもの、例えばBLAST2.2.2またはFASTA ver. 3.0t78を含む）を規定値パラメーターとともに用いて決定することができる。
相同な配列にはまたRNA配列が含まれる（RNA配列では核酸配列中のチミンはウリジンに置換されている）。相同な配列は本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて入手できるが、またシークェンシングエラーの修正から得ることができる。
本特許明細書で特定される多様な配列比較プログラムを本発明のこの特徴で使用することができる。タンパク質および／または核酸配列の同一性（相同性）は、当業界で公知の多様な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALWが含まれるが、ただしこれらに限定されない（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993）。
相同性または同一性は配列分析ソフト（例えばジネティクスコンピュータグループ（Universty of Wisconsin Bitechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）の配列分析ソフトウェアパッケージ）を用いて測定できる。そのようなソフトは、種々の欠失、置換および他の改変に対して相同性の程度を決めることによって類似の配列を合致させる。2つまたは3つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“相同性”および“同一性”という用語は、比較ウィンドウまたは指定の領域上で、多数の配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手動アラインメントおよび目視精査による測定にしたがって最大一致を求めて比較およびアラインメントを実施したとき、特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つまたは3つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較の場合、一方の配列は参照配列（本発明の例示的配列）として機能し、前記に対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列および参照配列はコンピュータに入力され、部分配列同等物が必要な場合に指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを用いることができるが、また別のパラメーターを指定することもできる。続いて配列比較アルゴリズムは、前記のプログラムパラメーターを基にして参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書で用いられる“比較ウィンドウ”は、任意数の連続残基セグメントに対する参照を含む。例えば本発明のまた別の特徴では、本発明の例示的な配列で20から完全長の間のいずれかの範囲の連続残基が、同じ数の連続した箇所の参照配列と前記2つの配列を最適にアラインメントした後で比較される。参照配列が本発明の例示的配列と必要な配列同一性、例えば配列番号：1、配列番号：2と98%の配列同一性を有し、さらに上記に記載の特定の配列改変の1つを有するならば、前記配列は本発明の範囲内にある。また別の実施態様では、約20から600、約50から200、および約100から150の範囲の部分配列が、同じ数の連続した箇所の参照配列と前記2つの配列を最適にアラインメントした後で比較される。配列比較のアラインメントを実施する方法は当業界では周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482, 1981）によって、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）によって、Pearson & Lipmanの類似性検索方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）によって、前記アルゴリズムのコンピュータによる実施によって（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アラインメントと目視精査によって実施できる。相同性または同一性決定のための他のアルゴリズムには、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information、例えばBLAST、BLAST2、BLASTNおよびBLASTX）の他に、例えばALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（BLocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、ラスベガスアルゴリズム、FASTA（Peason and Lipman, Proc Natl Acad Sci, USA. 85:2444, 1988）、FASTDB（Brutlag et al. Comp App Biosci 6:237-245, 1990）、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン、フレームサーチ、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）およびWHAT-IFが含まれる。本発明の実施に用いられる他のプログラムおよびデータベースには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：MacPattern（(EMBL)、 DiscoveryBase（Molecular Applications Group）、GeneMine（Molecular Applications Group）、Look（Molecular Applications Group）、MacLook（Molecular Applications Group）、Catalyst（Molecular Simulations Inc.）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.）、Cerius2.DBAccess（Molecular Simulations Inc.）、HypoGen （Molecular Simulations Inc.）、Insight II（Molecular Simulations Inc.）、Discover （Molecular Simulations Inc.）、CHARMm（Molecular Simulations Inc.）、Felix （Molecular Simulations Inc.）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.）、QuanteMM（(Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、Modeler （Molecular Simulations Inc.）、ISIS（Molecular Simulations Inc.）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.）、WebLab（Molecular Simulations Inc.）、WebLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.）、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medicinal Chemistryデータベース、Derwent’s World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、GenBankデータベース、GenSeqデータベース、およびGenomeQuestデータベース。本開示を提供された当業者には、他の多くのプログラムおよびデータベースも明白であろう。そのようなアラインメントプログラムもまたゲノムデータベースのスクリーニングに用いられ、実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を同定することができる。多数のゲノムデータベースが利用可能で、例えばNCBI（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイトを介して利用することができる。いくつかの機能的情報に関する注釈をもつゲノム情報を含むデータベースが種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
BLAST、BLAST2.0およびBLAST2.2.2アルゴリズムもまた本発明の実施に用いられる。前記アルゴリズムは例えば以下に記載されている：Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST分析を実施するソフトは、National Center for Biotechnology Informationを通して公開されている。このアルゴリズムは、クェリー配列内の長さがWの短いワードを特定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに特定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたは何らかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性測定の1つは最小合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率を示す。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較で最小合計確率が約0.2未満、好ましくは約0.01未満、もっとも好ましくは約0.001未満であるならば、前記核酸は参照配列と類似であると考えられる。ある特徴では、タンパク質および核酸配列相同性はベーシック=ローカル=アラインメント=サーチ=ツール（Basic Local Alignment Search Tool, “BLAST”）を用いて評価される。例えば、5つの特別なBLASTプログラムを用いて以下のタスクを実施することができる：（1）BLASTPおよびBLAST3はアミノ酸のクェリー配列をタンパク質配列データベースと比較する；（2）BLASTNはヌクレオチドのクェリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；（3）BLASTXはクェリーヌクレオチド配列（その両方の鎖）の概念的6フレーム翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；（4）TBLASTNはクェリータンパク質配列（両方の鎖）を全ての6つの読み枠で翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；さらに（5）TBLASTXはヌクレオチドクェリー配列の6枠翻訳をヌクレオチド配列データベースの6枠翻訳と比較する。BLASTプログラムは類似のセグメントを特定することによって相同な配列を特定する。前記セグメントは本明細書ではクェリーアミノ酸または核酸配列とテスト配列間の“高スコアセグメントペア”と称され、タンパク質または核酸配列データベースから入手できる。高スコアセグメントペアは、スコアリングマトリックス（その多くは当業界で公知である）によって特定される（すなわちアラインメントが実施される）。使用される例示的スコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである（Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992); Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993）。あるいは、PAMまたはPAM250を用いてもよい（例えば以下を参照されたい：Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation）。
本発明のある特徴では、核酸が本発明の範囲内のものであるために必要な配列同一性を有するか否かを決定するためにNCBI BLAST 2.2.2プログラムが用いられる。規定値オプションはblastpである。BLAST 2.2.2プログラムには約38の設定オプションがある。本発明のこの例示的な特徴では、全ての規定値がフィルタリング設定規定値を除いて用いられる（すなわち全てのパラメーターはフィルタリング（前記はOFFに設定される）を除いて規定値に設定される）。フィルタリングは規定値の代わりに“-FF”設定が用いられ、前記はフィルタリングを無効にする。規定値のフィルタリングの使用はしばしば、配列の長さが短いためにKarlin-Altschulバイオレーションを生じる。
本発明のこの例示的な特徴で用いられる規定値には以下が含まれる：
“低複雑度用フィルター：ON
＞ワードサイズ：3
＞マトリックス：Blosum62
＞ギャップコスト：エグジスタンス：11
＞エクステンション：1”
“低複雑度用フィルター：ON
他の規定値設定は以下のとおりである：低複雑度用フィルターはOFF、タンパク質のためのワードサイズは3、BLOSUM62マトリックス、ギャップ存在のペナルティーは-11、およびギャップ伸長のペナルティーは-1。
いくつかの特徴では、配列比較アルゴリズムは、本発明の核酸配列またはアミノ酸配列と参照配列との比較に用いることができる。例えば、配列比較アルゴリズムは、本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を親の配列番号：1および／または配列番号：2と、または参照配列と比較して、相同性または構造モチーフを確認することができる。配列の比較を実施して、第一の配列が第二の配列と同じか否かを決定することができる。このタイプの比較は、新規な配列とデータベース内の第一の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことを特記することは重要である。2つのヌクレオチドまたはタンパク質配列を、たとえそれらが同一ではなくても比較するための周知の方法を当業者は理解している。例えば、2つの試験配列間の相同性レベルを高めるために、ギャップを一方の配列に導入することができる。比較時にギャップまたは他の特色を配列に導入するか否かを管理するパラメーターは、通常は比較アルゴリズムの使用者が入力する。
2つの配列の比較がいったん実施されたら、2つの配列が同じかであるか否かが決定される。もちろん、“同じ”という用語は、完全に同一の配列に限定されない。配列比較は、比較される配列間の配列同一性レベル示すか、または構造モチーフを識別することができる。または配列比較は、これら核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列中の構造モチーフを識別することができる。配列同一性レベルは、第一の配列で配列の総数のうち同じであった配列間の記号の割合を計算することによって決定される。したがって、100ヌクレオチドの第一の配列中の全ての記号が第二の配列中の全ての記号とアラインメントされたならば、配列同一性は100%であろう。あるいは、アルゴリズムは参照配列を本発明の配列と比較して、それら配列が1つまたは2つ以上の位置で異なるか否かを決定する。比較の結果は、参照配列または本発明の配列のどちらかに関して挿入、欠失置換ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さおよび同一性を示すことができる。他の特徴では、アルゴリズムを用いて、本発明の核酸またはポリペプチド内の特色を識別することができる。例えばアイデンティファイアーの特色は、オープンリーディングフレーム（ORF）、“開始コドン”（例えば“ATG”）、“TAATAAボックス”またはモチーフ、例えばアルファヘリックス、ベータシート、または機能的ポリペプチドモチーフ、例えば酵素活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、ロイシンジッパー、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックス、ベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関係する配列、例えばホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位並びに当業者に公知の他のモチーフを含むことができる。
フィターゼの発現阻害
本発明は、本発明の核酸配列と相補的な核酸（例えばアンチセンス配列）を提供する。前記には、アンチセンス、iRNA、リボザイムを含む核酸が含まれる。アンチセンス配列は、フィターゼコード遺伝子の輸送、スプライシングまたは転写を阻害することができる。前記阻害は、ゲノムDNAまたはメッセンジャーRNAを標的とすることにより達成することができる。標的とされた核酸の転写または機能は、例えばハイブリダイゼーションおよび／または切断によって阻害することができる。本発明によって提供される特に有用な阻害物質セットには、フィターゼ遺伝子またはメッセージに結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（いずれの事例でもフィターゼ酵素の生成または機能を防止または阻害する）。前記の結合は配列特異的ハイブリダイゼーションによることができる。別の有用な種類の阻害物質にはフィターゼメッセージの不活化または切断をもたらすオリゴヌクレオチドが含まれる。前記オリゴヌクレオチドはそのような切断を引き起こす酵素活性を有することができる（例えばリボザイム）。前記オリゴヌクレオチドは化学的に改変するか、または相補性核酸を切断することができる酵素もしくは組成物と結合させることができる。所望の活性を有する前記のようなものについて、そのような多くの種々のオリゴヌクレオチドプールをスクリーニングすることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド：
本発明は、本発明の新規なフィターゼ配列の改変を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する（これらアンチセンスオリゴヌクレオチドはフィターゼメッセージと結合することができ、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはmRNAを標的とすることによってフィターゼ活性を阻害することができる）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなフィターゼオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするためのジーンウォーキング／RNAマッピングプロトコルは当業界で周知である。例えば以下を参照されたい：Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183。この文献はRNAマッピングアッセイを記載し、前記アッセイは標擬似的な分子技術を基にし、強力なアンチセンス配列選別のための簡単で信頼できる方法を提供する。さらにまた以下を参照されたい：Smith (2000) Eur. J. Phar. Sci. 11:191-198。
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであり得る。例えば、また別の特徴では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5から100、約10から80、約15から60、約18から40である。最適な長さは日常的なスクリーニングによって決定できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度で存在してよい。最適濃度は日常的なスクリーニングによって決定できる。この潜在的課題に用いることができる極めて多様な合成された天然に存在しないヌクレオチドおよび核酸類似体が知られている。例えば、非イオン性骨格（例えばN-（2-アミノエチル）グリシンユニット）を含むペプチド核酸（PNA）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（それらは以下に記載されている：WO97/03211; WO96/39154; Mata (1997) Toxicol. App. Pharmacol. 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal（Humana Press, Totowa, N.J., 1996））。本発明によって提供される合成DNA骨格類似体をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上記で述べたようにホスホロ-ジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3’-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3’-N-カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸が含まれる。
総当たり化学反応の手段を用いて膨大な数のオリゴヌクレオチドを生成することができる。前記オリゴヌクレオチドは、任意の標的（例えば本発明のセンスおよびアンチセンスフィターゼ配列）に対し適切な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば以下を参照されたい：Gold (1995) J. Biol. Chem. 270:13581-13584）。
阻害性リボザイム：
本発明は、本発明の新規なフィターゼ配列改変を含むリボザイムを提供する（本発明のリボザイムはフィターゼメッセージと結合することができ、前記リボザイムはmRNAを標的にすることによりフィターゼ活性を阻害することができる）。リボザイムを設計し、ターゲッティングのためにフィターゼ特異的アンチセンス配列を選別する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的RNAを切断するRNAの酵素部分に極めて近傍に保持されているリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAと結合することによって機能する。したがって、リボザイムは、相補性塩基対形成により標的RNAを認識し、これと結合する。正確な部位にいったん結合したら、リボザイムは酵素として機能し標的RNAを切断し、これを不活化する。切断がコード配列内で発生すれば、そのような態様での標的RNAの切断は、コードされるタンパク質の合成を誘導するその能力を破壊するであろう。リボザイムがそのRNA標的と結合し、これを切断した後、リボザイムは前記RNAから遊離し、新たな標的と繰り返し結合および切断することができる。
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術（アンチセンス技術では、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳または別の分子との結合を妨げるだけである）に比べて有利であろう。なぜならば、治療達成に必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれよりも低いからである。この潜在的な利点はリボザイムの酵素として機能する能力の結果である。したがって、ただ1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断することができる。さらにまた、リボザイムは典型的には特異性が高い阻害因子であり、阻害の特異性は塩基対形成による結合メカニズムだけでなく、リボザイムが結合するRNAの発現を前記リボザイム分子が阻害するメカニズムにも依存している。すなわち、阻害はRNA標的の切断によって生じ、したがって特異性は非標的RNAの切断速度に対する標的RNAの切断速度の比と定義される。この切断メカニズムは塩基対形成に関与する要因に加えて更に種々の要因に依存する。したがって、リボザイム作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合の特異性よりも高いであろう。
前記酵素性リボザイムRNA分子はハンマーヘッドモチーフとして形成できるが、またヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフまたはRNaseP様RNAモチーフ（RNAガイド配列と結合）として形成してもよい。ハンマーヘッドモチーフの例はRossi（Aids Research and Human Retroviruses 8:183 (1992)）によって、ヘアピンモチーフの例はHampel（Biochmistry 28:4929 (1989)およびNuc. Acids Res. 18:299, 1992）によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrotta（Biochemistry 31:16, 1992）によって、RNasePモチーフの例はGuerrier-Takada（Cell 35:849, 1983）によって、さらにグループIイントロンの例はCech（US Pat. No. 4,987,071）によって記載されている。前記の具体的なモチーフの記載はそれらに限定することを意図したものではない。当業者は、本発明の酵素性RNA分子は、標的遺伝子のRNA領域の1つまたは2つ以上と相補的な固有の基質結合部位を有し、基質結合部位内またはその周辺に前記分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することを理解していよう。
RNA干渉（RNAi）：
ある特徴では本発明は、本発明の酵素配列を含むRNA阻害分子、いわゆる“RNAi”分子を提供する。RNAi分子は二本鎖RNA（dsRNA）分子を含む。RNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAは、フィターゼ酵素遺伝子の発現を阻害することができる。ある特徴では、RNAi、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである。
本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、RNAiは細胞内に入り、類似または同一の配列を有する一本鎖RNA（ssRNA）（内因性mRNAを含む）の分解を引き起こす。細胞が二本鎖RNA（dsRNA）に暴露されるとき、相同な遺伝子に由来するmRNAは、RNA干渉（RNAi）と称される過程によって選択的に分解される。RNAiの背後にある可能な基本的メカニズムは、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖RNA（dsRNA）の短い破片（短小干渉性RNAと称される）への分解である。前記短小干渉性RNAは、その配列と一致するmRNAの分解の引き金となる。ある特徴では、本発明のRNAiは遺伝子サイレンシング療法で用いられる（例えば以下を参照されたい：Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046）。ある特徴では、本発明は、本発明のRNAiの分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAを用いて選択的にRNAを分解する方法を提供する。ある特徴では、微小阻害性RNA（miRNA）が翻訳を阻害し、siRNAが転写を阻害する。前記プロセスはin vitro、ex vivoまたはin vivoで実施できる。ある特徴では、本発明のRNAi分子を用いて細胞、器官または動物の機能低下変異を作出することができる。選択的にRNAを分解するためにRNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAを製造および使用する方法は当業界では周知である。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,506,559号、第6,511,824号、第6,515,109号および第6,489,127号。
核酸の改変
本発明は、本発明の核酸（例えばフィターゼをコードする核酸）の変種を作製する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によってコードされたフィターゼのそれとは変異したもしくは異なる活性または変異したもしくは異なる安定性を有するフィターゼ酵素を生成するために反復してまたは多様な組合せで使用することができる。これらの方法はまた、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳またはメッセージ安定性における変種を生成するために反復してまたは多様な組合せで用いることができる。別の特徴では、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のex vivo改変とそれに続く前記遺伝子の細胞への再挿入により改変される。
本発明はまた、変異導入および他の方法によって本発明のフィターゼの特徴を変化させる方法を提供する。前記他の方法には以下が含まれる：定方向進化、例えばDiversa Corporation（San Diego）の専有方法、例えばDirectEvolution（例えば米国特許5,830,696号参照）；遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）（例えば米国特許6,171,820号および6,579,258号参照）；定方向進化のエキソヌクレアーゼ仲介遺伝子アッセンブリ（例えば米国特許6,361,974号および6,352,842号参照）；定方向進化のエンドセレクション（例えば米国特許6,358,709号および6,238,884号参照）；組換えによる合成シャッフリング（例えば米国特許5,965,408号および6,440,668号およびオーストラリア特許AU724521参照）；好熱酵素の定方向進化（例えば米国特許5,830,696号および6,335,179号参照）。
ある特徴では、フィターゼの特徴は、以下の工程を含む定方向進化プロトコルによって改変される：a）1つまたは2つ以上の分子鋳型（例えば本発明のフィターゼ核酸）を変異導入に付して新規な分子を作製する工程；およびb）新規分子のこれら子孫種でより所望される特徴を有するものを選別する工程。定方向進化力は、出発鋳型（例えば本発明の“親”の配列番号：1または任意の配列）の最初の選択だけでなく選択される変異導入プロセスおよび使用されるスクリーニングプロセスによっても左右される。したがって、本発明は、新規で高度に活性で、生理学的に効率的で、経済的なフィターゼ活性の供給源を提供する。前記には以下のようなフィターゼが含まれる：a）1つまたは2つ以上の具体的な適用下（例えば食品の高温製造）で優れた活性を有し、したがってこれら具体的な適用で有用であり；b）更なる新規な分子への改善さえも達成できる定方向進化のための鋳型として有用であり；さらにc）例えばハイブリダイゼーションによるアプローチのような手段によってさらに別の関連分子を同定するためのツールとして有用である。
本発明の核酸は任意の手段、例えばランダム若しくは確率論的な方法、または非確率論的方法、または“定方向進化”方法によって改変できる。遺伝子のランダム変異導入の方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：米国特許5,830,696号）。例えば変異原を用いて遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば紫外線またはガンマ線照射、または化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独または併用して組換えによって修復されやすいDNA破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似物質、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリンまたはアクリジンである。これらの薬剤はPCR反応にヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって配列を変異させることができる。インターカレーション薬剤（例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）もまた用いることができる。
分子生物学の任意の技術、例えばランダムPCR変異導入（例えば以下を参照されたい：Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471）または総当たりマルチカセット変異導入（例えば以下を参照されたい：Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196）を用いることができる。あるいは、核酸（例えば遺伝子）をランダムにまたは“確率論的に”フラグメント化した後で再アッセンブリングすることもできる（例えば以下を参照されたい：米国特許第6,291,242号; 同6,287,862号; 同6,287,861号; 同5,955,358号; 同5,830,721号; 同5,824,514号; 同5,811,238号; 同5,605,793号）。また別の特徴では、改変、付加または欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、位置特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成および／またはこれらの組合せ並びに他の方法によって導入される。
以下の文献は、本発明の方法に取り入れることができる多様な反復組換え手順および／または方法を記載している：Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”, Tiumor Tageting 4:1-4; Ness (1999) NatureBiotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding”, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”, Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate dtoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screenig”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”, Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”, Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391; およびStemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
多様性を生成する変異導入方法には例えば以下が含まれる：位置特異的変異導入(Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7; および Kunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin))；ウラシル含有鋳型を用いる変異導入 (Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382;およびBass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245)；オリゴヌクレオチド誘導変異導入（Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500; および Zoller & Smith (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350)；ホスホロチオエート改変DNA変異導入(Taylor et al. (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802;およびSayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814)；ギャップをもつ二重鎖DNAを用いる変異導入(Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer et al. (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207; およびFritz et al. (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
本発明を実施するために用いることができるさらに別の方法には以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887)、修復欠損宿主株を用いる変異導入(Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323;およびGrundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖開裂修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。
上記の方法の多くに関する更なる詳細または別のプロトコルは以下で見出すことができる（Enzymology, vol,154）。この文献にはまた種々の変異導入方法に関する問題を解決するための有用な管理に関する記述がある。さらにまた以下を参照されたい：米国特許5,605,793号、1997年2月25日出願（Stemmer, “Methods for In Vitro Recombination）；米国特許5,811,238号、1998年9月22日出願 (Stemmer et al., “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”)；米国特許5,830,721号、1998年11月3日出願（Stemmer et al., “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；米国特許5,834,252号、1998年11月10日出願（Stemmer, et al., “End-Complementary Polymerase Reaction”）；米国特許5,837,458号、1998年11月17日出願（Minshull, et al., “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 95/22625（Stemmer and Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；WO 96/33207（Stemmer and Lipschutz, “End Complementary Polymerase Chain Reaction”）；WO 97/20078（Stemmer and Crameri, “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”）；WO 97/35966（Minshull and Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 99/41402（Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”）；WO 99/41383（Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”）；WO 99/41369（Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”）； WO 99/41368（Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”）；EP 752008（Stemmer and Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；EP 0932670（Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”）；WO 99/23107（Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”）；WO 99/21979（Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”）；WO 98/31837（del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”）；WO 98/27230（Patten and Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”）；WO 98/27230（Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”）；WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries”；WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”；WO 98/42832（Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”）；WO 99/29902（Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences”）；WO 98/41653（Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”）；WO 98/41622（Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”）；およびWO 98/42727（Pati and Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”）
米国特許出願は、種々の多様性を生成する方法に関する更なる詳細または別のプロトコルを提供する。前記には以下が含まれる："SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" 1999年9月28日出願(Patten et al. U.S. Ser. No. 09/407,800)；"EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION"1998年7月15日出願(del Cardayre et al., U.S. Ser. No. 09/166,188)および1999年7月15日出願(U.S. Ser. No. 09/354,922)；"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" 1999年9月28日出願 (Crameri et al., U.S. Ser. No. 09/408,392)および"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" 2000年1月18日出願(Crameri et al., PCT/US00/01203)；"USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" 1999年9月28日出願(Welch et al., U.S. Ser. No. 09/408,393)；"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" 2000年1月18日出願(Selifonov et al., PCT/US00/01202)および、例えば"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" 2000年7月18日出願 (Selifonov et al., U.S. Ser. No. 09/618,579)；"METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" 2000年1月18日出願(Selifonov and Stemmer, PCT/US00/01138)；および"SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" 2000年9月6日出願 (Affholter, U.S. Ser. No. 09/656,549)。
非確率論的、または“定方向進化”方法（例えば“遺伝子部位飽和変異導入”（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）または前記の組合せを含む）を用いて本発明の核酸を改変し、新規なまたは変異した特性（例えば強酸または強アルカリ条件下、高温または低温条件下などでの活性）を有するフィターゼが作製される。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、フィターゼまたは他の活性について試験する前に活性についてスクリーニングすることができる。任意の試験様式またはプロトコルを、例えばキャピラリーアレイ台を利用して用いることができる。例えば米国特許第6,361,974号、同6,280,926号、同5,939,250号を参照されたい。
飽和変異導入（またはGSSM）：
本発明はまた、本明細書および米国特許6,171,820号にも記載されている、遺伝子部位飽和（Gene Site Saturation）変異導入（またはGSSM）を用いて酵素を製造する方法を提供する。
ある特徴では、縮退N,N,G/T配列を含むコドンプライマーを用いて、ポリヌクレオチド（例えば本発明のフィターゼ酵素または抗体）に点変異を導入し、一組の子孫ポリペプチドが作製される。前記一組の子孫ポリペプチドでは、各アミノ酸の位置、例えば改変の標的となる酵素活性部位またはリガンド結合部位のアミノ酸残基で全範囲の単一アミノ酸置換が出現する。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列および場合によって第二の相同な配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物は、N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化を含む。ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば１つに縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の本来のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの本来のコドンを全範囲のコドン置換に付すために少なくとも2つの縮退カセットが（同じヌクレオチドまたは別個のヌクレオチドで）用いられる。例えば2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチド内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は連続していてもよいし、または1つもしくは2つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドは単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の組合せまたは並べ換えが導入される。
ある特徴では、2つまたは3つ以上の連続するアミノ酸位の同時変異は、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)n配列）を含むオリゴヌクレオチドを用いて実施される。別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退度の小さい縮退カセットが用いられる。例えば、いくつかの事例では、ただ1つのN（Nは前記トリプレットの第一、第二または第三番目の位置に存在できる）を含む縮退トリプレット配列を（オリゴヌクレオチドで）用いることができる。任意の組合せおよび並べ換えを含む他のいずれの塩基もトリプレットの残りの2つの位置において用いることができる。あるいはいくつかの事例で縮退N,N,N,トリプレット配列を（例えばオリゴヌクレオチドで）用いることができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/Tトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について天然アミノ酸の全範囲の（合計20アミノ酸）系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴では、前記方法はまた、各アミノ酸残基、コドン、位置の可能な全ての置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、100アミノ酸のポリペプチドの場合、2000個の別個の種（すなわち各位置につき20個の可能なアミノ酸x 100個のアミノ酸位置）が生成される。縮退N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットを使用することによって、32個の個々の配列が20個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも1つの前記のようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個のそれぞれ別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入では非縮退オリゴヌクレオチドを使用したとき、各反応容器につきただ1つの子孫ポリペプチド生成物が生じるだけである。場合によって非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーとともに用いることができる。例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを用いて対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を生成することができる。これは、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、並びに終止コドンおよびポリペプチドフラグメントの対応する発現を生じさせる点変異を生成する1つの手段を提供する。
ある特徴では、各飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異を導入されるコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において20個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド（例えばフィターゼ）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の特徴では20個未満の天然の組合せが用いられる）。各飽和変異導入反応容器から生成される32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば適切な宿主（例えば大腸菌宿主）に例えば発現ベクターを用いてクローニングする）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（例えば親のポリペプチドと比較したときアルカリ性または酸性条件下でグルカンの加水分解活性が増加する）、前記子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
ある特徴では、本明細書に開示したように、親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に飽和変異導入を用いて変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変化が2つ以上のアミノ酸位置で同定できることがある。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは一部分の組合せを含む1つまたは2つ以上の新規な子孫分子を生成することができる。例えば、2つの具体的な好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの3つのアミノ酸位置の各々で同定されるならば、この順列は各位置かつ3つの位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、3ｘ3ｘ3、または合計27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないものを含む。
さらに別の特徴では、スクリーニングと併せて、位置飽和変異導入をシャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の変異導入方法と一緒に用いることができる。本発明は任意の突然変異導入方法の使用を提供する。前記方法には反復態様で用いられる飽和変異導入が含まれる。ある実施態様では、任意の変異導入方法の反復使用がスクリーニングと併用して用いられる。
本発明はまた、点変異をポリヌクレオチドに導入して、全範囲の単一アミノ酸置換が各アミノ酸の位置で出現する一組の子孫ポリペプチドを作製するために専有コドンプライマー（縮退N,N,N配列を含む）の使用を提供する（遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）。使用されるオリゴは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,N配列および、ある特徴では（必ずというわけではない）第二の相同な配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物は、N,N,N配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化を含む。
ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退N,N,Nカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の本来のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの本来のコドンを全範囲のコドン置換に付すために、少なくとも2つの縮退N,N,Nカセットが（同じオリゴまたは別個のオリゴで）用いられる。したがって、2つ以上のN,N,N配列を1つのオリゴ内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,N配列は連続していてもよいし、または1つもしくは2つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴを単独またはN,N,N配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の組合せまたは並べ換えを導入することができる。
具体的な実施態様では、連続するN,N,Nトリプレット（すなわち縮退(N,N,N)n配列）を含むオリゴを用いて、2つまたは3つ以上の連続するアミノ酸位置で同時に変異を導入することが可能である。
別の特徴では、本発明は、N,N,N配列よりも縮退の程度が低い縮退カセットの使用を提供する。例えば、いくつかの事例では、Nがトリプレットの第一、第二または第三の位置に存在し得る、ただ1つのNを含む縮退トリプレット配列を（例えばオリゴで）使用することが望ましいことがある。トリプレットの残りの2つの位置で、任意の組合せおよびその並べ換えを含む他のいずれの塩基も用いることができる。あるいは、いくつかの事例では、縮退N,N,Nトリプレット配列、N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を（例えばオリゴで）使用することが所望されることもある。
しかしながら、本発明で開示したような縮退トリプレット（例えばN,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列）を使用することはいくつかの理由で有利であることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、ポリペプチド中の各々および全てのアミノ酸の位置で可能なアミノ酸の全範囲（合計20アミノ酸について）の置換が系統的且つ容易に得られる手段を提供する。したがって、100アミノ酸のポリペプチドについて、本発明は系統的にかつそこそこ容易に2000個の別個の種（すなわち各位置に付き20の可能なアミノ酸x 100個のアミノ酸の位置）を作製する方法を提供する。縮退N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20の可能なアミノ酸をコードする32個の配列が提供されることは理解されよう。したがって、1つのそのようなオリゴを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入において非縮退オリゴを使用した場合、反応容器に付きただ1個の子孫ポリペプチド生成物しか得られない。
本発明はまた、非縮退オリゴの使用を提供する。場合によって、前記オリゴは開示した縮退プライマーと一緒に用いることができる。いくつかの状況では、対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を作製するためには、非縮退オリゴを用いることが有利であることは理解されよう。これによって、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異および終止コドンを生成させる点変異並びにポリペプチドフラグメントの対応する発現をもたらす手段が提供される。
したがって、本発明のある特徴では、飽和変異導入の各反応容器は、20アミノ酸の全てが、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に対応する特定の１つのアミノ酸の位置で提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。飽和変異導入の各反応容器から生成された32倍の縮退子孫ポリペプチドはクローン増幅に付すことができ（例えば発現ベクターを用いて適切な大腸菌宿主でクローニングできる）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。（親のポリペプチドと比較したとき）個々の子孫ポリペプチドが好ましい特性変化を示すことがスクリーニングによって同定されたら、前記の配列を決定して、前記配列に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
本明細書に開示した飽和変異導入を用いて親のポリペプチド中の各々および全てのアミノ酸の位置に変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変異が2つ以上のアミノ酸の位置で同定できることは理解されよう。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは部分が組み合わされた1つまたは2つ以上の新規な子孫分子を作製することができる。例えば、あるポリペプチド中の3つのアミノ酸の位置の各々で2つの特定のアミノ酸の変異が同定された場合、この順列は各位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、合計3ｘ3ｘ3、または27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないものを含む。
したがって、非限定的な具体例では、本発明は、また別の変異導入プロセスと組み合わされた飽和変異導入の使用を提供する。前記別の変異導入プロセスは例えば、ハイブリッドポリヌクレオチドを組換えおよび還元的再組合せによって生成することができるように2つまたは3つ以上の関連ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入するプロセスである。
遺伝子の配列全体に変異を導入すること以外にも、本発明は、変異導入を用いてポリヌクレオチド中の任意の数の塩基の各々を置換することができる。この場合、変異を導入される塩基の数は、ある特徴では15から100,000の全て整数である。したがって、分子の全ての位置に変異を導入する代わりに、全ての塩基または所定の数の塩基（ある特徴では合計で15から100,000になるサブセット）に変異を導入することができる。ある特徴では、ポリヌクレオチド配列の各々の位置または位置群に変異を導入するために、別々のヌクレオチドが用いられる。変異を導入される3つの位置のグループはコドンであってもよい。前記変異は、変異原プライマー（異種カセットを含み、変異原カセットとも称される）を用いて導入することができる。例示的カセットは1つから500の塩基を有することができる。そのような異種カセットの各ヌクレオチドの位置はN、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、またはEで、ここでEはA、C、GまたはTではない任意の塩基である（Eはデザイナーオリゴと称することができる）。
一般的な意味では、飽和変異導入は、変異を導入される所定のポリヌクレオチド配列（この場合変異を導入される配列は、ある特徴では長さが約15から100,000塩基である）中の完全な一組の変異原カセット（この場合各カセットはある特徴では長さが約1−500塩基である）に変異を導入することを含む。したがって、変異群（1から100変異に及ぶ）が変異を導入される各カセットに導入される。1回の飽和変異導入の実施中に、1つのカセットに導入される変異群は、第二のカセットに導入される第二の変異群とは異なっていても同じであってもよい。そのような群の例は、欠失、付加、特定コドン群および特定ヌクレオチド群である。
変異を導入される所定配列には完全な遺伝子、経路、cDNA、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー/トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーターまたは任意のポリヌクレオチド機能群が含まれる。一般的には、この目的のための“所定配列”は、15塩基のポリヌクレオチド配列および15塩基から15,000塩基の長さのポリヌクレオチド配列のいずれかのポリヌクレオチドであり得る（本発明では特に15から15,000の間の全ての整数が含まれる）。コドン群の選択で考慮しなければならないことには、縮退変異原カセットによってコードされるアミノ酸のタイプが含まれる。
変異原カセットに導入することができる変異群のある具体例では、本発明は特に縮退コドン置換およびそれによってコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。前記は縮退オリゴを用いて提供され、前記オリゴは各位置で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18、19および20アミノ酸をコードする。
合成連結再アッセンブリ（SLR）：
本発明は、“合成連結再アッセンブリ”、または簡潔に“SLR”、“定方向進化プロセス”と称される、新規なまたは変異した特性を有するポリペプチド（例えば本発明のフィターゼ酵素または抗体）を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。SLRは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、またはキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば以下を参照されたい：米国特許6,773,900号、6,740,506号、6,713,282号、6,635,449号、6,605,449号、6,537,776号。
ある特徴では、SLRは以下の工程を含む：（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程（前記鋳型ポリヌクレオチドは相同な遺伝子をコードする配列を含む）；（b）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程（前記構築ブロックポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとあらかじめ定められた順序で交差再アッセンブリングを生じるように考案され、構築ブロックポリヌクレオチドは前記相同な遺伝子の変種である配列および前記変種配列にフランキングする前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む）；（c）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再アッセンブリングして相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成できるように、構築ブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと一緒にする工程。
SLRは、再編成を実施されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。したがって、本方法は、10100を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーの作製に用いることができる。したがって、本発明の特徴は、設計に従って選択された全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、および、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“有用”であると考えられる。したがって、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定される。2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。ある特徴では、アニールした構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。ある特徴では、合成連結再アッセンブリ（SLR）と称される非確率論的方法（前記は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、またはキメラ化されるのではなく非確率論的にアッセンブリングされるという点を除けば確率論的シャッフリングといくぶん関係がある）を用いて、変種を作製することができる。
SLRの方法は、シャッフリングされるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。本発明は、10100を超える異なるキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。おそらく、SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーを作製することができる。
したがって、ある特徴では、本発明は、設計に従って選択された全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、および、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
アッセンブリングされる互いに適合する連結可能な核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“有用”であると考えられる。したがって、ある特徴では、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定され、2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。本発明のある特徴では、アニールされた構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
別の特徴では、核酸構築ブロックの設計は、祖先核酸鋳型セットの配列を分析時に得られる（祖先核酸鋳型は完成したキメラ核酸分子の子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら祖先核酸鋳型は、変異が導入される（すなわちキメラ化またはシャッフルされる）核酸構築ブロックの設計に役立つ配列情報源として機能する。
ある具体例では、本発明は、関連遺伝子ファミリーおよびそれらによってコードされる関連生成物ファミリーのキメラ化を提供する。ある具体例では、前記コードされる生成物は酵素である。本発明で使用される酵素およびポリペプチドにはここに記載した方法に従って変異が導入される。
したがって本発明のある特徴にしたがえば、複数の祖先核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して1つまたは2つ以上の境界点が選択される。前記境界点は相同領域に位置することができる。前記境界点は作製される核酸構築ブロックの境界線を引くために用いることができる。したがって、祖先分子中で同定され選別される境界点は、子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。
典型的には、有用な境界点は、少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）であるが、前記境界点は、祖先鋳型の少なくとも半分、祖先鋳型の少なくとも2/3、祖先鋳型の少なくとも3/4、または祖先鋳型のほぼ全部によって共有される相同性領域であり得る。ある特徴では、有用な境界点は、祖先鋳型の全部によって共有される相同領域である。
ある特徴では、連結再アッセンブリ工程は網羅的ライブラリーを作製するために網羅的に実施される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットで出現する。同時に、各組合せにおけるアッセンブリの順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5’から3’方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は設計にしたがう（または非確率論的である）。本方法の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は極めて低くなる。
別の特徴では、前記方法は、例えば系統的に区画化されたライブラリー（例えば1つずつ系統的にスクリーニングすることができる区画を有する）を作製するために実施される連結再アッセンブリプロセスを提供する。換言すれば、本発明は、連続工程によるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される実験的な仕組みの達成を提供する。前記によって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。
特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、本方法は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、設計に従って選択された全体的なアッセンブリの順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含むことができる。具体的な特徴では、そのように作製されたライブラリーは103を超える種々の子孫分子種から101000を超える種々の子孫分子種を含む。
ある特徴では、記載のように生成された完成キメラ核酸分子はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、前記は人工遺伝子でもよい。別の特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、前記は人工遺伝子経路でもよい。本発明は、本発明により作製された1つまたは2つ以上の人工の遺伝子が人工の遺伝子経路（例えば真核生物（植物を含む）で作動できる経路）に取り込まれたものを提供する。
別の特徴では、構築ブロックが作製される工程の合成的な性質によって、in vitro過程（例えば変異導入により）またはin vivo過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することにより）で場合によって後で除去することが可能なヌクレオチド（例えば1つまたは2つ以上のヌクレオチドで、例えばコドンまたはイントロンまたは調節配列であり得る）を設計または導入することが可能になる。多くの事例で、有用な境界点を創出できるという潜在的な利点以外の他の多くの理由からこれらヌクレオチドの導入はまた望ましいものであり得ることは理解されよう。
したがって、別の特徴にしたがえば、本発明はイントロンを導入するために用いることができる核酸構築ブロックを提供する。したがって、本発明は、本発明の人工遺伝子に導入することができる機能的なイントロンを提供する。本発明はまた、本発明の人工遺伝子経路に導入することができる機能的イントロンを提供する。したがって、本発明は、人工的に導入された1つ（または2つ以上）のイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。
したがって、本発明はまた、1つの（または2つ以上の）人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。ある特徴では、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能を発揮する態様と同じように遺伝子スプライシングのために1つまたは2つ以上の宿主細胞で機能する。本発明は、組換えおよび／またはスプライシングのために宿主生物に導入されるべき人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
本発明を用いて作製された人工遺伝子はまた、また別の核酸との組換えのための土台として機能することができる。同様に、本発明を用いて作製された人工遺伝子経路はまた、また別の核酸との組換えのための土台として機能することができる。ある特徴では、前記組換えは、人工のイントロン含有遺伝子と核酸（組換えのパートナーとして機能する）との間の相同領域によって促進されるか、または前記相同領域で生じる。ある特徴では、前記組換えパートナーはまた、本発明によって生成された核酸（人工遺伝子または人工遺伝子経路を含む）であり得る。組換えは、人工遺伝子内に人工的に導入された1つ（または2つ以上）のイントロンに存在する相同性領域によって促進されるか、または前記領域で生じる。
本発明の合成連結再アッセンブリの方法は、複数の核酸構築ブロック（その各々は2つの連結可能末端を有する）を利用する。各核酸構築ブロックの2つの連結可能末端は2つの平滑端であるか（すなわち各々はヌクレオチドのオーバーハングをもたない）、または１つの平滑端および１つのオーバーハングを有するか、または2つのオーバーハングを有することができる。
この目的のために有用なオーバーハングは3’側のオーバーハングまたは5’側のオーバーハングであり得る。したがって、核酸構築ブロックは3’オーバーハングを有するか、あるいは5’オーバーハングを有するか、あるいは2つの3’オーバーハングまたは2つの5’オーバーハングを有することができる。核酸構築ブロックがアッセンブリングされて完成キメラ核酸分子が形成される全体的な順序は、意図をもった実験設計によって決定され、ランダムではない。
ある特徴では、核酸構築ブロックは、2つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも称される）を化学的に合成し、それらをアニールさせて二本鎖核酸構築物を形成することによって作製される。
二本鎖核酸構築ブロックのサイズは変動し得る。これら構築ブロックのサイズは小さくても大きくてもよい。構築ブロックの例示的サイズは1塩基対（オーバーハングを含まない）から100,000塩基対（オーバーハングを含まない）の範囲である。他の例示的なサイズ範囲もまた提供され、前記は1bpから10,000bp（その間の全ての整数値を含む）の下限から2bpから100,000bp（その間の全ての整数値を含む）の上限を有する。
本発明で有用な二本鎖核酸構築ブロックを作製することができる多くの方法が存在し、これらは当業者に公知であり、さらに当業者は容易にこれらを実施できる。
ある特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物は、先ず初めに2つの一本鎖核酸を作製し、さらにそれらをアニールさせて二本鎖核酸構築ブロック形成することによって作製される。二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものは別として全てのヌクレオチドと相補的であり得る。したがって、オーバーハングを除いてミスマッチを含まない。別の特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものは除いて、全ヌクレオチドより少ないヌクレオチドにおいて相補的である。したがって、この特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物を用いてコドンの縮退を導入することができる。ある特徴では、コドンの縮退は、本明細書に開示した位置飽和変異導入により、1つまたは2つ以上のN,N,G/Tカセット、または別には1つまたは2つ以上のN,N,Nカセットを用いて導入される。
本発明のin vivo組換え方法は未知のハイブリッドプールまたは特定のポリヌクレオチド配列の対立遺伝子プールで手当たり次第に実施することができる。しかしながら、前記特定のポリヌクレオチドのDNAまたはRNAの実際の配列を知ることは必須というわけではない。
遺伝子の混合集団内での組換えを用いるアプローチは、任意の有用なタンパク質、例えばインターロイキンI、抗体、tPAおよび成長ホルモンの作出に有用であり得る。このアプローチを用いて、変異した特異性または活性を有するタンパク質を作出することができる。前記アプローチはまた、ハイブリッド核酸配列、例えばプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の3’非翻訳領域または5’非翻訳領域の作出に有用であり得る。したがって、このアプローチを用いて発現速度が増した遺伝子を作出することができる。このアプローチはまた、反復DNA配列の研究で有用である。最後に、このアプローチはリボザイムまたはアプタマーに変異を導入するために有用であり得る。
ある特徴では、本明細書に開示したポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種は、高度に複雑な線状配列（例えばDNA、RNAまたはタンパク質）の組換えによる定方向分子進化を可能にする還元的組合せ、組換えおよび選別サイクルを繰り返して使用することによって得られる。
分子のin vivoシャッフリングは変種の提供に有用であり、マルチマーを組み換える細胞の天然の特性を利用して実施できる。in vivo組換えが分子の多様性への主要な天然のルートを提供する一方で、遺伝的組換えは相対的に複雑なプロセスである。前記プロセスは以下の工程を必要とする：1）相同性の認識；2）鎖の切断、鎖の侵襲および組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；および最終的に3）別個の組換え分子へのキアズマの分離。キアズマの生成は相同な配列の認識を必要とする。
別の特徴では、本発明は、少なくとも1つの第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を含む。本発明を用いて、少なくとも1つの第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド（前記は部分的配列相同性を有する少なくとも1つの領域を共有する）（例えば配列番号：1）を適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドポリヌクレオチドを生成することができる。前記部分的配列相同性を有する領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する配列再編成をもたらすプロセスを促進する。本明細書で用いられる、“ハイブリッドポリヌクレオチド”という用語は、本発明の方法から生じ、少なくとも2つの最初のポリヌクレオチド配列由来の配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列組換えを促進する分子間組換え事象から生じ得る。さらにまた、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、反復配列を利用してDNA分子内のヌクレオチド配列を改変する、分子内の還元的再組合せプロセスから生じ得る。
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えばハイブリッドフィターゼ）をコードすることができるハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。ある特徴では、最初のポリヌクレオチドは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。本発明の方法は、最初のポリヌクレオチドの配列を組み換える細胞性プロセスを利用することによって新規なハイブリッドポリペプチドを生成する（前記プロセスは、生じたハイブリッドポリヌクレオチドが最初の生物学的に活性なポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードできるように最初のポリヌクレオチドの配列を組み換える）。例えば、最初のポリヌクレオチドは異なる微生物から特定の酵素をコードすることができる。ある生物または変種から最初のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、例えば特定の環境条件下（例えば高塩分）で効率的に機能することができる。異なる生物または変種から第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、異なる環境条件下（例えば極端に高い温度）で効率的に機能することができる。第一および第二の最初のポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、最初のポリヌクレオチドによってコードされる両方の酵素の特徴を示す酵素をコードすることができる。したがって、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素の各々が共有する環境条件下（例えば高塩分および極端な温度）で効率的に機能することができる。
上記に記載した多様な方法に加えて、酵素特性が強化されたハイブリッドポリヌクレオチドを入手するために用いることができる多様な方法が当分野で知られている。以下の例は、関心のある野生型酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することにより熱安定性または耐熱性酵素を入手するためのそのような方法の使用を例示する。
例えば、ある特徴では、M. Lehmannら（Biochimica et Biophysica Acta 2000, 1543:408-415；“コンセンサスアプローチ”に関して記載）が記載した方法を用いる。前記では、相同な菌類フィターゼの配列アラインメントを用いてフィターゼのコンセンサスアミノ酸配列が計算される。対応するコンセンサス遺伝子を構築し、組み換え体を発現し、さらに精製したき、得られた組換えフィターゼは、設計に用いた全ての親フィターゼの展開温度（Tm）よりも15−22℃高いTmを示した。組換えタンパク質をコードする遺伝子の位置特異的変異導入を用いて、Tm値をさらに90.4℃に高めた。熱安定性効果は、タンパク質の全配列にわたって分布し主として表面露出残基に影響を与える多数のアミノ酸交換の組合せによるものであった。
ある特徴では、本発明は、L. Jermutusら（J Biotechnol 2001, 85:15-24）が記載した温度特性が強化された酵素を入手する方法を使用する。このアプローチでは、アスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）フィターゼの表面のイオン相互作用および水素結合が、相同であるがより熱安定性であるA.ニゲル由来の酵素に存在するフィターゼに一致するようにまず初めに修正された。A.ニゲルフィターゼの結晶構造を基準に同じ領域で全ての二次構造成分を置き換えた。A.テルレウスフィターゼの表面に存在する1つのβ-ヘリックスをA.ニゲルフィターゼの対応するストレッチで置換することにより、熱安定性が改善しかつ酵素活性は変化しない構造的キメラ酵素（融合タンパク質）がもたらされた。
ある特徴では、本発明は、L. Giverら（Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:12809-12813）が記載した方法を用いる。前記著者は、枯草菌のp-ニトロベンジルエステラーゼをコードするポリヌクレオチドの変異性PCRでランダム変異を導入し、その後でStemmerの方法を土台にしたin vitro組換えを実施した6世代が、低温での触媒活性を損なうことなく熱安定性が高められた（14℃を超えるTmの上昇）組換えエステラーゼを生成する方法を記載した。
ある特徴では、本発明は、C. Vetrianiら（Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:12300-12305）が記載した方法を用いる。前記著者は、超好熱菌のピロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）およびテルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（それぞれ最適増殖温度が100℃および88℃）由来の六量体グルタメートデヒドロゲナーゼの相同性によるモデリングおよび直接構造比較を用いて、必須の熱安定性特徴物を決定する方法を記載した。安定性が低下した酵素で実質的に減少することが観察されたサブユニット間のイオン対ネットワークを、そこに存在する2つの残基に変異を導入することによって改変し、より安定な酵素で見出される相互作用を復元させた。どちらの単一変異も熱安定性に悪影響を示したが、適切な場所の両変異に関しては、野生型酵素に対して4倍改善された安定性が104℃で認められた。
ある特徴では、本発明は、A. Tomschyら（Protein Science, 2000, 9:1304-1311）が記載した方法を用いる。前記著者は、アスペルギルス・ニゲルのフィターゼの結晶構造（2.5オングストロームの解像度）を利用して、酵素の全ての活性部位を特定する方法を記載している。続いて多数のアミノ酸配列のアラインメントを用いて、関心がある、ある好ましい特性と相関性を有する可能性がある非保存性活性部位の残基を同定した。このアプローチを用いて、A.フミガツス（A. fumigates）のフィターゼのGln27（前記はA.ニゲルのLeu27と異なる）が、基質結合および／または遊離に必要であり、A.フミガツスフィターゼのより低い比活性（pH5.0で196.6に対して26.5U/mgタンパク質）の原因であることを同様に同定した。A.フミガツスのフィターゼのGln27のLeu27への位置特異的変異導入は、変異酵素の比活性を92.1U/mgタンパク質に増加させた。
トランスジェニック植物および種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセット、クローニングメカニズムまたはベクターを含むトランスジェニック植物および種子、または本発明のトランスフェクトもしくは形質転換細胞を提供する。本発明はまた、本発明の核酸および／またはポリペプチドを含む植物生成物、例えば油、種子、抽出物などを提供する。前記トランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であり得る。本発明はまた、これらトランスジェニック植物および種子を作製または使用する方法を提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当分野で公知の任意の方法にしたがって構築することができる。例えば、米国特許6,309,872号を参照されたい。
本発明のフィターゼ分子の組換え体の発現または過剰発現は、1つまたは2つ以上のまた別の分子（例えば他の酵素）と一緒に達成することができる。このアプローチは、組合せ生成物、例えば本発明のフィターゼ分子だけでなく1つまたは2つ以上の別の分子を同様に含む植物または植物生成物を製造するために有用である。本発明のフィターゼ分子およびまた別の分子を組合せ処理で用いることができる。この組換えにより発現した生成分子は均質化および／または精製した形態で、また別には相対的に未精製な形態で（例えば、他の食品と混合したときにフィターゼの分解を触媒するために有用である消費可能な植物部分として）用いることができる。
具体的な特徴では、本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるフィターゼの発現およびその製造方法を提供する。DNA発現構築物は、フィターゼの発現を誘導することができる調節配列の制御下でフィターゼをコードする遺伝子により植物を形質転換するために提供される。これらの調節配列には、構成的にまたは成長段階特異的および／または組織特異的態様で植物における転写を誘導することができる配列が含まれる。
発現の態様は植物または植物の部分の使用に部分的に左右される。本発明によって提供されるトランスジェニック植物および植物器官は、直接的に（例えば動物飼料として）利用されるか、または別には、発現フィターゼは抽出され所望の場合には利用前に精製されて、多様な工業的プロセスに利用され得る。あるいは、組換え宿主植物または植物部分を直接用いてもよい。具体的な特徴では、本発明は、フィターゼの量が高められた種子を用いてフィターゼ加水分解反応を触媒する方法を提供する。前記方法は、（例えばすり潰されたまたは噛み砕いた形状の）トランスジェニックな非野生型種子をフィターゼ含有基質と接触させ、種子中の酵素の反応速度を高める工程を含む。種子をフィターゼ含有基質に直接添加することによって、本発明は、高価で問題の多い酵素の抽出および精製プロセスに対する解決を提供する。ある具体例では、本発明は、酵素の十分な供給を欠く生物に酵素量の増加した種子の形で酵素が投与される処理方法を提供する。ある特徴では、酵素投与のタイミングは、フィテート含有食品の消費と一体化される。
植物でのフィターゼの発現は多様な手段によって達成できる。特に、例えば多数の植物種（双子葉植物種（例えばタバコ、ジャガイモ、トマト、ペチュニア、アブラナ）および単子葉植物種を含む）を形質転換する技術が利用可能である。さらにまた、例えば植物で外来遺伝子を発現させる方法が利用可能である。さらにまた、植物および植物細胞で機能的に発現させることができるキメラ遺伝子の構築に有用な植物遺伝子由来の調節配列が同定された（例えば以下を参照されたい：Klee (1987) Ann Rev Plant Phys, 38:467-486；Clark et al. (1990) Virology, Dec;179(2):640-7；Smith et al. (1990) Mol Gen Genet, Dec;224(3):477-81）。
遺伝子構築物の植物への導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による形質転換を含むいくつかの技術を用いて達成できる。このようにして形質転換できる植物組織の非限定的な例には、プロトプラスト、小胞子または花粉、および外植片、例えば葉、茎、根、胚軸および子葉が含まれる。さらにまた、DNAは、プロトプラストおよび植物細胞または組織にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメントおよびDNA直接取り込みによって直接導入できる。
タンパク質は多様な発現系によって植物に導入できる。例えば、構成的プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Guilley et al. 1982））の使用は、実質的にトランスジェニック植物の全ての器官に発現タンパク質を蓄積させるために有用である。あるいは、所望の組織および／または所望の成長段階に対して発現を偏らせるために、高度に組織特異的および／または成長段階特異的なプロモーターの使用が本発明で有用である（Higgins, 1984；Shotwell, 1989）。本発明はまた、例えば米国特許5,770,413号（Van Ooijen et al）および米国特許5,593,963号（Van Ooijen et al.）（前記は菌類フィターゼの使用を教示する）に開示された、本発明のフィターゼ分子の植物での発現プロトコルを利用する。
コード配列および近傍配列の改変
異種供給源に由来する遺伝子の植物におけるトランスジェニックな発現は、植物におけるそれら遺伝子の発現の達成および最適化のためにそれらの改変を必要とする。特に、別々の酵素をコードするが天然の微生物では同じ転写物によってコードされる細菌ORFは、植物では別々の転写物としてもっとも良好に発現される。したがってある特徴では、前記を達成するために、微生物ORFの各々が個々に単離され、さらにORFの5’末端に植物のプロモーター配列をORFの3’末端に植物の転写ターミネーターを提供するカセット内にクローニングされる。前記単離ORF配列はATG開始コドンおよび終了STOPコドンを含むことができるが、前記開始ATGおよびSTOPコドンの他に別の配列を含むこともできる。さらにまた、ORFは切り縮めることができるが（ただし必要な活性は保持される）、特に長いORFについては、活性を保持する切端型がトランスジェニック生物での発現のために所望できる。
本発明の実施に用いることができる“植物プロモーター”および“植物転写ターミネーター”には、植物細胞内で作動できる任意のプロモーターおよび／または転写ターミネーターが含まれる。前記には、非植物性供給源、例えばウイルス（一例はカリフラワーモザイクウイルス）から誘導できるプロモーターおよび転写ターミネーターが含まれる。
いくつかの事例では、ORFコード配列および近傍配列の改変は要求されない。関心のあるORFを含むフラグメントの単離および植物プロモーターの下流へのその挿入で十分である。例えばGaffineyら（Science, 1993, 261:754-756）は、CaMVの35SプロモーターおよびCaMVのtmlターミネーターの制御下にあるシュードモナス（Pseudomonas）nahG遺伝子を、コード配列を改変せずにトランスジェニック植物で良好に発現させたが、nahG ORFにはATGの上流のシュードモナス遺伝子のヌクレオチドおよびSTOPコドンの下流のヌクレオチドがなお結合されていた。好ましくは、わずかなものとして近傍の微生物配列がATGの上流およびSTOPコドンの下流に結合したままで残されるべきである。実際には、そのような構築物は制限部位が利用可能であるか否かに左右され得る。
他の事例では、微生物性供給源から誘導される遺伝子の発現は発現時に問題を生じることがある。これらの問題は当分野では特徴がよく調べられ、ある種の微生物性供給源に由来する遺伝子に関しては特に一般的である。これらの問題は本発明のヌクレオチド配列にも適用することができ、これらの遺伝子の改変は当分野で今では周知の技術を用いて実施することができる。以下の問題に遭遇することがあろう：
コドン使用頻度：本発明は、植物で使用するために改変したコドンを含む核酸を提供し、いくつかの事例では、植物での好ましいコドン使用頻度はある種の微生物での好ましいコドン使用頻度とは異なる。クローニングした微生物ORF内のコドンの使用と植物遺伝子（および特に標的植物由来の遺伝子）内の使用とを比較することは、所望のように変化させるべきORF内のコドンの同定を可能にするであろう。典型的には、植物の進化は、単子葉植物では第三塩基の位置にヌクレオチドCおよびGが強く優先される傾向にあり、一方、双子葉植物はこの位置にヌクレオチドAまたはTがしばしば使用される。遺伝子を改変して特定の標的トランスジェニック種に好ましいコドン使用を取り込むことによって、GC/AT含有量および変則的スプライシングについて下記に記載する問題の多くが解決されよう。
GC/AT含量：本発明は、例えば植物での使用のためにそれらのGC含量が改変された核酸を提供する（植物遺伝子は典型的には35%を超えるGC含量を有する）。AおよびTヌクレオチドに富むORF配列は植物でいくつかの問題を生じることがある。第一に、ATTTAのモチーフはメッセージの脱安定化を引き起こすと考えられ、多くの短命なmRNAの3’末端で見出される。第二に、メッセージ内の不適切な位置のポリアデニル化シグナル（例えばAATAAA）の存在は、転写物の未熟な切端を引き起こすと考えられる。さらにまた、単子葉植物はATに富む配列をスプライス部位と認識することがある（下記を参照されたい）。
開始メチオニンの近傍の配列
本発明は、改変および／または付加されたATG近傍ヌクレオチドを有する核酸を提供する。植物は、それらのメッセージが規定のリボソーム結合部位をもたないという点で微生物とは異なる。そうではなくて、リボソームはメッセージの5’末端に結合し、翻訳を開始させるために最初の利用可能なATGを求めてスキャンすると考えられている。それにもかかわらず、ATGの近傍のある種のヌクレオチドに対して優先性が存在し、真核細胞のコンセンサス翻訳イニシエーターをATGに挿入することによって微生物遺伝子の発現を強化できると考えられる。Clontechは、大腸菌のuidA遺伝子の植物での発現のためのコンセンサス翻訳開始因子としてある配列を提唱した（1993年／1994年カタログ、210ページ、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。さらにまた、JoshiらはATG近傍の多くの植物配列を比較し、別のコンセンサス配列を提唱した（N.A.R., 1987, 15:6643-6653、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。植物で微生物のORFを発現する際に困難が出現する状況下で、開始ATGにこれらの配列の1つを挿入することによって翻訳を改善することができる。そのような事例では、コンセンサスの最後の3つのヌクレオチドの改変配列への挿入は二番目のAA残基の改変のために適切でないことがある。いくつかの特徴では、開始メチオニンの近傍の好ましい配列は異なる植物種間で異なることがある。GenBankデータベースに存在する14のトウモロコシ遺伝子の調査によって以下の結果が提供された：
この解析は、ヌクレオチド配列が取り込まれる所望の植物種、および好ましいヌクレオチドを取り込むために改変されるATGの近傍の配列について実施することができる。
変則的スプライス部位の除去
本発明は、変則的スプライス部位が改変もしくは除去された、または機能的に“ノックアウト”された核酸を提供する。非植物性供給源からクローニングされ、植物での発現が最適化されていない遺伝子はまた、5’または3’スプライス部位として植物で認識および切断され、したがって切端または欠失メッセージを生じ得るモチーフを含むことがある。
これらの部位は当分野で周知の技術を用いて除去することができる。
コード配列または近傍配列の改変技術は当分野では周知である。微生物ORFの初期発現が低く、上記のように配列の変更を実施することが適切と思われる事例では、合成遺伝子の構築を当分野で周知の方法にしたがって実施することができる。これらは、例えば公開特許出願EP385962（Monsanto）、EP359472（Lubrizol）およびWO93/07278（Ciba-Geigy）（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）に記載されている。ほとんどの事例で、遺伝子構築物をトランスジェニック植物に伝達する前に、一過性アッセイプロトコル（当分野で周知である）を用いてそれらの発現をアッセイすることが好ましい。
植物プロモーター
本発明の組成物は、核酸配列（例えばプロモーター）を、例えば関心のある植物での形質転換および発現のために含むことができる。核酸配列はDNA構築物または発現カセットに存在し得る。本発明の核酸は、適切な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる任意の核酸分子を含む、“発現カセット”であるかまたは発現カセットを含むことができる。前記任意の核酸分子は、終了シグナルに機能的に連結された前記関心のあるヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
本発明の組成物（例えば核酸配列）はまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要な配列を含むことができる。コード領域は、通常関心のあるタンパク質をコードするが、さらに関心のある機能的RNA、例えばアンチセンスRNAまたは非翻訳RNA（センスまたはアンチセンス方向にある）もまたコードすることができる。関心のあるヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってもよい。キメラは、その成分の少なくとも1つが他の成分の少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現のために有用な組換えの形態で既に得られているものであってもよい。しかしながら典型的には、発現カセットは宿主に対して異種である。すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は宿主細胞で天然には存在せず、宿主細胞または宿主細胞の祖先に形質転換事象によって導入されていなければならない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る（誘導性プロモーターは、宿主細胞が具体的な何らかの外部刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する）。さらにまた、プロモーターは、特定の組織もしくは器官または成長段階に特異的であってもよい。
本発明は、ポリヌクレオチドを発現することができる発現カセットによる植物の形質転換を含む。発現カセットは、転写の5’−3’方法で転写および翻訳開始領域（すなわちプロモーター）および関心のあるポリヌクレオチドを含むであろう。場合によって、発現カセットは植物で機能する転写および翻訳終了領域（すなわち終了領域）を含む。いくつかの実施態様では、発現カセットは選別可能なマーカー遺伝子を含み、安定な形質転換体の選別を可能にする。本発明の発現構築物はまた、リーダー配列および／または関心のあるポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする配列を含むことができる。例えば誘導性発現を可能にする配列に関しては、例えば以下を参照されたい：Guo et al. 2003, Plant J, 34:383-92；Chen et al. 2003, Plant J 36:731-40。
発現構築物の調節配列は関心のあるポリヌクレオチドに機能的に連結される。“機能的に連結される”とは、プロモーターと第二の配列との間の機能的結合を意味し、この場合、プロモーター配列は、第二の配列の対応するDNA配列の転写を開始および仲介する。一般的には、機能的に連結されるということは、連結されるヌクレオチド配列が連続していることを意味する。
関心のある植物で発現を駆動することができるいずれのプロモーターも本発明の実施に用いることができる。プロモーターは、植物宿主にとって天然のものでもアナローグでも外来性でもまたは異種であってもよい。“異種”および“外因性”という用語は、本明細書で核酸配列（例えばDNAまたはRNA配列）または遺伝子を指すために用いられるときは、当該宿主細胞にとって外来性供給源に由来する配列を指すか、または同じ供給源に由来する場合はその本来の形態から改変されている配列を指す。したがって、宿主細胞の異種遺伝子には、当該宿主細胞にとって内因性であるが既に改変されている遺伝子が含まれる。前記用語はまた、天然に存在するDNA配列の天然には存在しないマルチコピーを含む。したがって、前記用語は、細胞にとって外来性または異種であるDNAセグメント、または細胞にとって同種であるが、当該エレメントが通常見出されない宿主細胞の核酸内の位置に存在するDNAセグメントを指す。外因性DNAセグメントは発現されて外因性ポリペプチドを生じる。また別の実施態様では、“同種”核酸（例えばDNA）配列は、当該配列が導入される宿主細胞に自然に付随する核酸（例えばDNAまたはRNA）配列である。
挿入されるべきプロモーターの選択はいくつかの因子に左右される。前記因子には、効率性、選択性、誘導性、所望される発現レベル、細胞優先性または組織優先性発現が含まれるが、ただしこれらに限定されない。プロモーターおよび対応配列に対する他の調節領域を適切に選択し適切に配置することによって、配列の発現を調節することは当業者にとって日常的な事柄である。
いくつかの適切なプロモーターは、一定の細胞型でのみまたは前記で優先的に転写を開始する。したがって本明細書で用いられるように、細胞型または組織優先性プロモーターは、標的組織で優先的に発現を駆動するが、他の細胞型または組織でもある程度の発現を同様に誘導し得るプロモーターである。植物ゲノムDNAでプロモーター領域を同定し特徴を決定する方法は、例えば以下の参考文献に記載されているものである：Jordano, et. al., Plant Cell, 1:855-866 (1989)；Bustos, et. al., Plant Cell, 1:839-854 (1989)；Green, et. al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988)；Meier, et. al., Plant Cell, 3, 309-316 (1991)；およびZhang, et. al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996)。
いくつかの組織優先性調節遺伝子および／またはプロモーターが植物で報告されている。報告されたいくつかの組織優先性遺伝子には、種子貯蔵タンパク質（例えばナピン、クルシフェリン、ベータ-コングリシニンおよびファセオリン、プロラミン、グルテリン、グロブリンおよびゼイン）、ゼインまたは油小体タンパク質（例えばオレオシン）をコードする遺伝子、または脂肪酸生合成に必要な遺伝子（アシル担体タンパク質、ステアロイル-ACPデサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ（fad2-1）を含む）、および胚の発生時に発現される他の遺伝子（例えばBce4（例えばEP255378およびKridlら（1991, Seed Science Research, 1:209）を参照されたい））が含まれる。
既に記載されている組織特異的プロモーターの例には以下が含まれる：レクチン（Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 138;87 (1983)；Lindstrom et. al., (1990) Der. Genet., 11:160）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ（Dennis et. al., (1984) Nucleic Acids Res., 12:3983）、トウモロコシライトハーベスティングコンプレックス（light harvesting complex）（例えば以下を参照されたい：Simpson, (1986) Science, 233:34；Bansal (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654）、トウモロコシ熱ショックタンパク質（例えば以下を参照されたい：Odell et. al., (1985) Nature, 313:810）、エンドウマメ小サブユニットRuBPカルボキシラーゼ（例えば以下を参照されたい：Poulsen et. al., (1986) Mol. Gen. Genet., 205:193-200；Cashmore et. al., (1983) Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29-38）、Tiプラスミドマンノピンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Langridge et. al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223）、Tiプラスミドノパリンシンターゼ（Langridge et. al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223）、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（例えば以下を参照されたい：vanTunen (1988) EMBO J. 7:1257）、インゲンマメグリシン富裕タンパク質（例えば以下を参照されたい：Keller (1989) Genes Dev. 3:1639）、切端CaMV 35s（例えば以下を参照されたい：Odell (1985) Nature 313:810）、ジャガイモパタチン（例えば以下を参照されたい：Wenzler (1989) Plant Mol. Biol. 13:347）、根の細胞（例えば以下を参照されたい：Yamamoto (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449）、トウモロコシゼイン（例えば以下を参照されたい：Reina (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425；Lopes et. al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 603-613；Kriz (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90；Wandelt (1989) Nucleic Acids Res., 17:2354；Langridge (1983) Cell, 34:1015；Reina (1990) Nucleic Acids Res., 18:7449）、ADP-gppプロモーター（例えば以下を参照されたい：U.S. Patent No. 7,102,057）、グロビン-1（例えば以下を参照されたい：Belanger (1991) Genetics 129:863）、α-グロブリン（Sunilkumar, et. al. (2002), Transgenic Res. 11:347-359）、α-チューブリ、cab（例えば以下を参照されたい：Sullivan (1989) Mol. Gen. Genet., 215:431）、PEPCase（例えば以下を参照されたい：Hudspeth & Grula, (1989) Plant Molec. Biol., 12:579-589）、R遺伝子複合体関連プロモーター（Chandler et. al., (1989) Plant Cell, 1:1175）、エンドウマメヴィシリンプロモーター（Czako et. al., (1992) Mol. Gen. Genet., 235:33；U.S. Pat. No. 5,625,136）、GTL1プロモーター（Takaiwa et. al. (1991) Plant Mol. Biol. 16 (1), 49-58）、シャルコン（chalcone）シンターゼプロモーター（Franken et. al., (1991) EMBO J., 10:2605）、GY1プロモーター（Sims & Goldburg (1989) Nuc. Acid Res. 17(11) 4368）。
本発明は、任意の種類の果実優先性プロモーターを含む果実優先性プロモーターを用いることができる。前記プロモーターは、果実成長期に発現されるか、または反対に果実成長期間中、少なくとも後熟期の開始まで発現される（US 4,943,674に記載されている（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。ポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーターは、果実の後熟期に活性を示す。本発明は、例えば米国特許4,535,060号、米国特許4,769,061号、米国特許4,801,590号および米国特許5,107,065号（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されているようにポリガラクツロナーゼ遺伝子を用いことができる。
本発明は任意の組織優先性プロモーターを用いることができる。前記には、（例えば葉の食害昆虫による）葉の損傷後に葉で、塊茎で（例えばパパチン遺伝子プロモーター）、および線維細胞（成長に応じて調節される線維細胞タンパク質の例はE6である（John & Crow (1992) PNAS 89:5769-5773））で発現を誘導するものが含まれる。E6遺伝子は線維でもっとも活性が高いが、ただし葉、胚珠および花で転写レベルが低いことが見出されている。
本発明は、例えば緑色組織（例えば葉および茎）で転写を駆動するために、光合成組織で活性を有するプロモーターを用いることができる。それらプロモーターは、そのような組織でのみまたはそのような組織で優先的に発現を駆動させるときに適切である。あるいは、本発明はプロモーターを用いて、植物全体で構成的に、または緑色組織に対して弁別的に、または発現が生じる緑色組織の生長期に対して弁別的に、または外部刺激に応答して発現を行わせることができる。
本発明の実施に用いられる例示的プロモーターには以下が含まれる：リブロース-1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ（RbcS）プロモーター、例えば東部カラマツ由来RbcSプロモーター（Larix laricina）、マツcab6プロモーター（Yamamoto et. al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:773-778）、コムギのCab-1遺伝子プロモーター（Fejes et. al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:921-932）、ホウレンソウのCAB-1プロモーター（Lubberstedt et. al. (1994) Plant Physiol. 104:997-1006）、コメのcab1Rプロモーター（Luan et. al. (1992) Plant Cell 4:971-981）、トウモロコシのピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（PPDK）プロモーター（Matsuoka et. al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:9586-9590）、タバコLhcb1*2 プロモーター（Cerdan et. al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:245-255）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のSUC2シュクロース-H+シンポータープロモーター（Truernit et. al. (1995) Planta 196:564-570）、およびホウレンソウのチラコイド膜タンパク質プロモーター（psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS）。茎、葉および緑色組織で転写を駆動する他のプロモーターは、米国特許公開2007/0006346号（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。
いくつかの実施態様では、いくつかの“組織優先性”プロモーターの組織特異性は完全でなくてもよく、試験済みのレポーター遺伝子（例えばGusまたは緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）であってもよい。組織優先性発現はまた、種々の組織優先性プロモーターの組合せによる“リーキー”発現により達成できる。他の組織優先性プロモーターも当業者は単離することができる（米国特許5,589,379号参照）。
ある特徴では、植物ホルモン（例えばオーキシン）に曝露したときに誘導され得る植物プロモーターが本発明の核酸の発現に用いられる。本発明は例えば以下を使用できる：ダイズ（グリシン・マックスL.（Glycine max L.））のオーキシン応答エレメントE1プロモーターフラグメント（AuxRE）（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）、オーキシン応答シロイヌナズナGST6プロモーター（サリチル酸および過酸化水素にも応答性）（Chen (1996) Plant J. 10: 955-966）、タバコのオーキシン誘導性parCプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913）、植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）、およびストレスホルモンアブシジン酸に応答するプロモーター（Sheen (1996) Science 274:1900-1902）。
本発明の核酸はまた、植物に適用可能な化学試薬（例えば除草剤または抗生物質）に曝露したときに誘導され得る植物プロモーターに機能的に連結することができる。例えば、化学リガンド（エタノールを含む）存在下で活性化される遺伝子系は、例えばWO 96/27673、WO 93/01294、WO 94/03619、WO 02/061102（前記文献は参照により本明細書に含まれる）で見出すことができる。トウモロコシIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草薬毒性緩和剤によって活性化される）を用いることができる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって別個の遺伝子発現パターンが誘導される。前記発現パターンには、根、排水組織および茎頂の分裂組織における発現が含まれる。コード配列は例えば以下の制御下に置くことができる：テトラサイクリン誘導性プロモーター（例えばアベナ・サチバL.（Avena sativa L.（エンバク））アルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物に関して記載されている（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473））、エストロゲン、例えばエクジソンレセプター（WO 01/52620）またはサリチル酸応答性エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）。化学的に（例えばホルモンまたは農薬により）誘導されるプロモーター（すなわち野外でトランスジェニック植物に適用できる化学物質に応答するプロモーターを用いて、本発明のポリペプチドの発現を植物の特定の成長段階で誘導することができる。
本発明の実施に用いることができ、さらに既に報告されている例示的な構成的プロモーターには以下が含まれる：アクチン1（Wang et. al. (1992) Mol. Cell. Biol., 12:3399；米国特許5,641,876号）、他のアクチンアイソフォーム（McElroy et. al. (1990) Plant Cell 2: 163-171およびMcElroy et. al. (1991) Mol. Gen. Genet. 231: 150-160）、CaMV 35S（Odell et. al. (1985) Nature, 313:810）、CaMV 19S（Lawton et. al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324；米国特許5,639,949号）、nos（Ebert et. al. (1987) PNAS USA 84:5745-5749）、Adh（Walker et. al. (1987) PNAS USA 84:6624-6628）、シュクロースシンターゼ（Yang & Russell (1990) PNAS USA 87:4144-4148）、およびユビキチンプロモーター（例えばヒマワリ−Binet et. al. (1991) Plant Science 79: 87-94；トウモロコシ−Christensen et. al. (1989) Plant Molec. Biol. 12: 619-632；およびシロイヌナズナ−Callis et. al., J. Biol. Chem. (1990) 265:12486-12493；およびNorris et. al., Plant Mol. Biol. (1993) 21:895-906。
任意の転写ターミネーターを本発明の実施に、例えばベクター、発現カセットなどで用いることができる。これら因子は、トランスジーンを超える転写の終了および正確なmRNAのポリアデニル化をもたらすことができる。終了領域は転写開始領域に関して天然のものであるか、関心のある機能的に連結されたDNA配列に関して天然のものであるか、植物宿主に関して天然のものであるか、または別の供給源から誘導され得る（すなわち、プロモーター、関心のあるDNA配列、植物宿主、または前記の任意の組合せにとって外来性または異種である）。適切な転写ターミネーターは植物で機能することが知られているもので、CAMV 35S転写ターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウマメのrbcs E9ターミネーターが含まれる。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方で用いることができる。さらにまた、遺伝子の天然の転写ターミネーターを用いてもよい。
本発明は、転写ユニット内からの遺伝子発現を強化するために任意の配列を用いることができる。これらの配列は本発明の遺伝子と一緒に用いて、トランスジェニック植物でのそれらの発現を強化することができる。例えば、種々のイントロン配列が、特に単子葉植物細胞での発現を強化することが示された。例えば、トウモロコシAdhl遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞に導入されたときその同族のプロモーター下で野生型遺伝子の発現を顕著に強化することが見出された。
ウイルスから誘導された多数の非翻訳リーダー配列が発現を強化することが知られており、これらは双子葉植物細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイルス（TMV、“W-配列”）、トウモロコシクロロチックモットル（Chlorotic Mottle）ウイルス（MCMV）およびアルファルファモザイクウイルス（AMV）のリーダー配列は、発現の強化に有効であることが示された（例えば、Gallie et. al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711, 1987；Skuzeski et. al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79, 1990）。
細胞内の遺伝子生成物のターゲッティング
例えば植物細胞内の遺伝子生成物のターゲッティングのためのいずれのメカニズムも本発明の実施に用いることができる。そのようなメカニズムが植物に存在することは公知であり、これらメカニズムの機能を制御する配列はいくらか詳細に特徴が調べられている。遺伝子生成物を他の細胞区画へターゲッティングさせる配列の特徴が調べられた。アミノ末端配列が対象のタンパク質を任意の細胞区画、例えば空胞、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、タンパク質粒、小胞体、葉緑体、澱粉顆粒、アミロプラスト、アポプラストまたは植物細胞壁へターゲッティングするために必要であり得る（例えば、Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)；Rogers et. al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651；米国特許7,102,057号；WO 2005/096704、前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。場合によって、前記シグナル配列は、waxy由来のN-末端シグナル配列、γ-ゼイン由来のN-末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、C-末端デンプン結合ドメイン、葉緑体ターゲッティング配列（成熟タンパク質を葉緑体へ運び入れる）（Comai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109；van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363；米国特許5,639,949号）、または糊粉細胞由来分泌シグナル配列（Koehler & Ho, Plant Cell (1990) 2: 769-783）であり得る。さらにまた、カルボキシ末端配列と連係したアミノ末端配列が遺伝子生成物の空胞へのターゲッティングに必要である（Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357-368）。
ある特徴では、選択したシグナル配列は公知の切断部位を有するべきで、構築融合物は切断部位の後のいずれのアミノ酸も考慮されるべきである（それらは切断に必要である）。いくつかの事例では、この要請は、少数のアミノ酸を切断部位とトランスジェニックATGとの間に添加する、あるいはトランスジーン配列内のいくつかのアミノ酸を置換することによって満たされ得る。このような構築技術は当分野ではよく知られており、任意の細胞区画に対して同等に適用することができる。
ある特徴では、上記に記載した細胞のターゲッティングのためのメカニズムはそれらの同族プロモーターと連係させて利用するだけでなく、異種プロモーターと連係させて利用することができ、それによってターゲッティングシグナルが由来したプロモーターの発現パターンと異なるパターンを有するプロモーターの転写調節下で特異的な細胞ターゲッティングの目的を達成できる。
総合すれば、トランスジェニック植物、種子、器官または任意の植物部分でフィターゼの組換え発現を達成する任意の手段を含む、多様な手段を用いて本発明を実施することができる。そのようなトランスジェニック植物および植物部分は組換え発現フィターゼの供給源として有用である（前記はフィターゼ含有供給源に直接添加することができる）。あるいは、組換え植物が発現したフィターゼを当該植物供給源から抽出し、所望の場合はフィターゼ基質に接触させる前に精製することができる。
本発明の関係において、選択できる（本発明の実施に用いることができる）植物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：食用花を生じる作物、例えばカリフラワー（ブラシッカ・オレラセア（Brassica oleracea））、アーティチョーク（シナラ・スコリムス（Cynara scolymus））、果実、例えばリンゴ（マルス（Malus）、例えばドメスチクス（domesticus））、バナナ（ムサ（Musa）、例えばアクミナタ（acuminata））、ベリー（例えば干しブドウ、リベス（Ribes）、例えばルブルム（rubrum））、チェリー（例えばサクランボ、プルヌス（Prunus）、例えばアビウム（avium））、キュウリ（ククミス（Cucumis）、例えばサチブス（sativus））、ブドウ（ビチス（Vitis）、例えばビニフェラ（vinifera））、レモン（シトラス・リモン（Citrus limon））、メロン（ククミス・メロ（Cucumis melo））、ナッツ（例えばクルミ、ジュグランス（Juglans）、例えばレギア（regia）；ピーナッツ、アラキス・ヒポゲアエ（Arachis hypogeae））、オレンジ（シトルス（Citrus）、例えばマキシマ（maxima））、モモ（プルヌス、例えばペルシカ（persica））、ナシ（ピラ（Pyra）、例えばコムムニス（communis））、プラム（プルヌス、例えばドメスチカ（domestica））、イチゴ（フラガリア（Fragaria）、例えばモスカータ（moschata））、トマト（リコペルシコン（Lycopersicon）、例えばエスクレンツム（esculentum））、葉、例えばアルファルファ（メディカゴ（Medicago）、例えばサチバ（sativa））、キャベツ（例えばブラシッカ・オレラセア（Brassica oleracea））、エンダイブ（シトレウム（Cichoreum）、例えばエンディビア（endivia））、ニラネギ（アリウム（Allium）、例えばポルルム（porrum））、レタス（ラクツカ（Lactuca）、例えばサチバ）、ホウレンソウ（スピナシア（Spinacia）、例えばオレラセアエ）、タバコ（ニコチアナ（Nicotiana）、例えばタバクム（tabacum））、根、例えばクズウコン（マランタ（(Maranta）、例えばアルンジナセア（arundinacea））、ビート（ベータ（Beta）、例えばブルガリス（vulgaris））、ニンジン（ダウクス（Daucus）、例えばカロータ（carota）、キャッサバ（マニホト（Manihot）、例えばエスクレンタ（esculenta））、カブ（ブラシッカ、例えばラパ（rapa））、ラディッシュ（ラプハヌス（Raphanus）、例えばサチブス）、ヤムイモ（ディオスコレア（Dioscorea）、例えばエスクレンタ）、サツマイモ（イポモエア・バタタス（Ipomoea batatas））、および種子、例えばインゲンマメ（ファセオルス（Phaseolus）、例えばブルガリス）、エンドウマメ（ピスム（Pisum）、例えばサチブム（sativum））、ダイズ（グリシン（Glycin）、例えばマックス（max））、コムギ（トリチクム（Triticum）、例えばアエスチブム（aestivum））、オオムギ（ホルデウム（Hordeum）、例えばブルガレ（vulgare））、トウモロコシ（ゼア（Zea）、例えばマイス（mays））、コメ（オリザ（Oryza）、例えばサチバ）、ナタネ（ブラシッカ・ナプス（Brassica napus））、アワ（パニクム（(Panicum）L.）、ヒマワリ（ヘリアンツス・アンヌス（Helianthus annus））、エンバク（アベナ・サチバ（Avena sativa））、塊茎、例えばカブキャベツ（ブラシッカ、例えばオレラセアエ）、ジャガイモ（ソラヌム（Solanum）、例えばツベロスム（tuberosum））など。
ある特徴では、本発明の核酸およびポリペプチドは、任意の植物または種子で発現されるか、またはそれらに挿入される。本発明のトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明のトランスジェニックな単子葉植物の例は、牧草類、例えばメドウグラス（ブルーグラス、Poa）、飼い葉用牧草、例えばフェスチュカ（festuca）、ロリウム（lolium）、温帯産牧草類、例えばアグロスチス（Agrostis）、および穀類、例えばコムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガム、およびトウモロコシである。本発明のトランスジェニックな双子葉植物の例は、タバコ、豆類、例えばルピナス、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメおよびダイズ、並びに十字架植物（ブラシッカ科）、例えばカリフラワー、アブラナおよび近縁のモデル植物のアラビドプシス・タリアナである。したがって、本発明のトランスジェニック植物および種子には広範囲の植物が含まれる。前記には以下の属に由来する種が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラグス（Asparagus）、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシッカ、シトルス、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルタムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、クエウルビタ（Cucurbita）、ダウクス（Daucus）、エラエイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴシッピウム（Gossypium）、ヘリアンタス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒポシアムス（Hyoscyamus）、ラクチュカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピヌス（Lupinus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホト（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ（Nicotiana）、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パンニセツム（Pannisetum）、ペルセア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラヌム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ビシア（Vicia）、ビチス（Vitis）、ビグナ（Vigna）、およびゼア（Zea）。
また別の実施態様では、本発明の核酸は、線維細胞を含む植物（ワタ、カポックの木（カポック（Kapok）、セイバ・ペンタンドラ（Ceiba pentandra））、デザートウィロウ、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ローゼル、ジュート、サイザルアバカ（sisal abaca）、およびアマで発現される。また別の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物は、ゴシップ種の任意のメンバーを含むゴッシピウム属のメンバー（例えば、G.アルボレウム（arboreum）、G.ヘルバセウム（herbaceum）、G.バルバデンス（barbadense）、およびG.ヒルスツム（hirsutum）を含む）であり得る。
また別の植物を非植物発現系と同様に本発明の実施のために用いることができる。植物種の選択は、主として植物またはその部分の使用目的および当該植物種の形質転換の容易さによって決定される。
フィターゼコードDNA配列を含む発現構築物を標的植物に導入するために、いくつかの技術が利用可能である。極めて多様な高等植物種を形質転換する技術がよく知られており、技術文献および学術文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477；米国特許5,750,870号。そのような技術にはまた以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：カルシウム／ポリエチレングリコールを用いるプロトプラストの形質転換法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション、または（被覆）粒子ボンバードメント（Potrykus, 1990）。これらのいわゆる直接的DNA形質転換法の他に、以下のベクターを必要とする形質転換系が広く利用可能である：例えばウイルスベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来）および細菌ベクター（例えばアグロバクテリウム属由来）（Potrykus, 1990）。選別および／またはスクリーニングの後で、形質転換されたプロトプラスト、細胞または植物部分を当分野で公知の方法を用いて全植物に再生することができる（Horsch et al. 1985）。形質転換および／または再生技術の選択は本発明については重要ではない。
本発明の核酸および発現構築物は任意の手段によって植物細胞に導入できる。本発明の実施におけるまた別の特徴では、ポリヌクレオチド、例えば対象のヌクレオチド構築物の関係で“導入”という用語は、当該ポリヌクレオチドが植物細胞の内部にアクセスできるような態様でポリヌクレオチドを植物に提供する手段を意図する。2つ以上のポリヌクレオチドが導入される場合、これらのポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド構築物の部分として、または別々のヌクレオチド構築物としてアッセンブリングされ、同じまたは別個の形質転換ベクターに配置され得る。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象として、別々の形質転換事象として、または、例えば植物での育種プロトコルの部分として関心のある宿主細胞に導入され得る。本発明の方法は、1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを植物に導入する具体的な方法には左右されず、ポリヌクレオチドが植物の少なくとも1つの細胞の内部にアクセスするという点だけに左右される。ポリヌクレオチドを植物に導入する方法は当分野で公知であり、前記方法には一過性形質転換方法、安定的形質転換方法およびウイルス仲介方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
“一過性形質転換”を本発明の実施に用いることができ、ポリヌクレオチドに関するいくつかの特徴では、一過性形質転換は、ポリヌクレオチドが植物に導入され、植物のゲノムには組み込まれないことを意味する。植物に導入されるヌクレオチドに関して“安定的に導入する”または“安定的に導入された”という用語は本発明の実施で用いることができ、いくつかの特徴では、導入されたポリヌクレオチドが植物ゲノムに安定的に取り込まれ、したがって植物が当該ポリヌクレオチドにより安定的に形質転換されることを意図する。
植物に導入されるポリヌクレオチドに関して“安定的形質転換”または“安定的形質転換される”という用語は本発明の実施で用いることができ、いくつかの特徴では、ポリヌクレオチド（例えば本明細書に記載のヌクレオチド構築物）が植物に導入され、植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって、より具体的には何代もの連続した世代の子孫によって受け継がれ得ることが意図される。所望の植物のゲノムへの導入は、当該酵素が内因性の転写または翻訳制御エレメントによって調節されるものであり得る。単子葉植物および双子葉植物の両方についての形質転換技術が当分野では周知である。
本発明の核酸を用いて、本質的に任意の植物に所望の属性を付与することができる。ある実施態様では、本発明の酵素は、当該酵素が所望されるまではその基質と接触しないような態様で発現させることができる。例えば、本発明の酵素は植物細胞の小胞体に誘導されそこで保持され得る。細胞の小胞体内での酵素の保持は、酵素がその基質と接触することを妨げるであろう。続いて酵素および基質は、細胞内構造を破壊することができる任意の手段（例えばすり潰し、製粉、加熱など）によって接触させることができる。例えば、WO 98/11235、WO 2003/18766およびWO 2005/096704を参照されたい（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
トランスジーンが首尾よく組み込まれた植物細胞または組織を識別するために、選別可能なマーカーを遺伝子構築物に付加することができる。前記は、植物細胞への遺伝子の取り込みおよび発現の成功が稀な事象であるために（標的組織または細胞の数パーセントで発生する）必要なことであり得る。選別可能なマーカーは、通常は植物にとって有毒である薬剤（例えば抗生物質または除草剤）に対して耐性を提供するタンパク質をコードする。選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞だけが、適切な抗生物質または除草剤を含む培地で増殖させたときに生存するであろう。形質転換で日常的に用いられる選別マーカーには以下が含まれる：nptll遺伝子（前記はカナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与する）（Messing & Vierra. Gene 19: 259-268, 1982；Bevan et. al., Nature 304:184-187, 1983）、bar遺伝子（前記は除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与する）（White et. al., Nucl. Acids Res 18: 1062, 1990；Spencer et. al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631, 1990）、hph遺伝子（前記は抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する）（Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931）、dhfr遺伝子（前記はメトトレキセートに対する耐性を付与する）（Bourouis et. al., EMBO J. 2(7): 1099-1104, 1983）、EPSPS遺伝子（前記はグリホセートに対する耐性を付与する）（米国特許4,940,935号および5,188,642号）。
あるいは、トランスジェニック植物物質は陽性選別系、例えばマンノース-6-ホスフェートイソメラーゼ遺伝子を利用する系によって識別することができる。前記遺伝子はマンノース代謝能力を提供する（米国特許5,767,378号および5,994,629号）。
ある特徴では、トランスジェニック植物または種子の作製は、本発明の配列および場合によってマーカー遺伝子を標的発現構築物（例えばプラスミド）に取り込む工程を、プロモーターおよびターミネーターを適切に配置する工程とともに含む。前記は、適切な方法により改変遺伝子を植物に伝達する工程を含むことができる。本発明の配列の1つまたは2つ以上を、昆虫、病気、干ばつに対する耐性、収量増加、穀物の栄養的品質の改善、エタノール収量の向上などを付与する配列と結合させることができる。
例えば、構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を用いて、植物細胞のゲノムDNAに直接導入するか、または構築物は、弾道学的方法（例えばDNA粒子ボンバードメント）を用いて植物組織に直接導入してもよい。例えば以下を参照されたい：Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203；Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30；Klein (1987) Nature 327:70-73；Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69（前記はトランスジーンをコムギに導入するための粒子ボンバードメントの使用を考察する）；およびAdam（1997；上掲書）（前記は植物細胞にYACを導入するための粒子ボンバードメントの使用についてである）。Rinehart（1997；上掲書）は、トランスジェニックなワタの植物を作製するために粒子ボンバードメントを用いた。粒子を加速するための装置は米国特許5,015,580号で考察されており、さらにBioRad (Biolistics) PDS-2000粒子加速装置は市販されている。例えば以下もまた参照されたい：米国特許5,608,148号（John）および米国特許5, 681,730号（Ellis）（前記は裸子植物の粒子仲介形質転換について記載している）。
ある特徴では、プロトプラストを固定し、核酸（例えば発現構築物）を注入することができる。プロトプラストから植物を再生することは穀類では容易ではないが、豆類では、プロトプラスト誘導カルスから体細胞性胚形成を用いて植物の再生が可能である。遺伝子銃技術を用いて系統的に編成された組織を裸のDNAで形質転換することができる。前記技術では、DNAはタングステンのミクロ発射体で被覆され、細胞の1/100のサイズで発射される。前記によってDNAは細胞または小器官の深奥に運ばれる。続いて、通常的には体細胞性胚形成によって形質転換組織の再生を誘導する。この技術はいくつかの穀物種（トウモロコシおよびコメを含む）で成功した。
核酸、例えば発現構築物はまた、組換えウイルスによって植物細胞に導入することができる。植物細胞は、ウイルスベクター、例えばタバコモザイクウイルス誘導ベクターを用いて形質転換できる（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）。以下を参照されたい：Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants,” Mol. Biotechnol. 5:209-221。
あるいは、核酸（例えば発現構築物）は適切なT-DNAフランキング領域と結合させ、通常のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクターに導入できる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のビルレンス機能は、細胞が前記細菌に感染すると構築物および近傍のマーカーの植物細胞DNAへの挿入を誘導する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介形質転換技術（二元性ベクターのディスアーミングおよび使用を含む）学術文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496-498；Fraley, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983；Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed.（Springerlag, Berlin 1995）。A.ツメファシエンス細胞中のDNAは、Ti（腫瘍誘導）プラスミドとして知られる別の構造物と同様に細菌染色体中に含まれる。Tiプラスミドは、感染過程で植物細胞に伝達されるT-DNA（長さが約20kb）と称されるDNA鎖、および感染プロセスを誘導する一連のvir（ビルレンス）遺伝子を含む。A.ツメファシエンスは創傷を介してのみ植物に感染できる。植物の根または茎が傷ついたとき、前記はある種の化学シグナルを発し、そのシグナルに応答して、A.ツメファシエンスのvir遺伝子は活性化され、Tiプラスミドから植物染色体へのT-DNAの伝達に必要な一連の事象を誘導する。続いてT-DNAは創傷から植物細胞に侵入する。1つの推測は、T-DNAは植物DNAが複製されるまでまたは転写されるまで待機し、続いてそれ自体を露出した植物DNAに挿入するというものである。A.ツメファシエンスをトランスジーンベクターとして使用するために、T-DNAの境界領域およびvir遺伝子をそのままにしてT-DNAの腫瘍誘導部分を除去する必要がある。続いてトランスジーンをT-DNA境界領域間に挿入する（トランスジーンは植物細胞に伝達され、植物染色体に組み込まれる）。
本発明は、本発明の核酸を用いて、重要な植物を含む単子葉植物の形質転換を提供する（以下を参照されたい：Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205218）。さらにまた、例えば以下を参照されたい：Horsch, Science (1984) 233:496；Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803；Thykjaer (1997)上掲書；Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:11351148（前記はゲノムDNAへのT-DNAの挿入を考察する）。さらにまた、米国特許5,712,135号（D’Halluin）を参照されたい（前記は、穀類または他の単子葉植物の細胞で機能を有する遺伝子を含むDNAの安定的な組込みプロセスを記載している）。
ある特徴では、第三の工程は、取り込んだ標的遺伝子を次の世代に伝達することができる全植物の選別および再生を含む。そのような再生技術は、組織培養増殖培地でのある種の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には所望のヌクレオチド配列とともに導入されたバイオサイドおよび／または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物再生は以下に記載されている：Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985。再生はまた、植物カルス、外植片、器官またはその部分から達成できる。そのような再生技術は一般的に以下に記載されている：Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486。トランスジェニック組織（例えば未熟な胚）から全植物を得るために、栄養物およびホルモンを含む一連の培地の管理環境条件下（組織内容として知られているプロセス）でそれらを増殖させることができる。いったん全植物が生成され、種子を生じたら、子孫の評価を開始する。
ある特徴では、発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後で、前記を有性交配によって他の植物に導入することができる。交配する種に応じて、多数の標準的な育種技術を用いることができる。例えば以下を参照されたい：Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981)；Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis., 1983；Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford, 1987；Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY, 1986；およびWricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin, 1986。
ある特徴では、本発明の核酸のトランスジェニック発現は表現型の変化をもたらすので、本発明の組換え核酸を含む植物は最終生成物を得るために第二の植物と有性交配に付すことができる。したがって、本発明の種子は、本発明の2つのトランスジェニック植物間の交配から、または本発明の植物と別の植物との間の交配から得ることができる。所望の効果（例えば本発明のポリペプチドの発現が開花態様の変異した植物をもたらす）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えばフィターゼ）を発現するときに強化され得る。所望の効果は標準的な手段によって更なる植物世代に伝えることができる。
双子葉植物については、二元性ベクター系を用いることができる（Hoekema et al., 1983；EP0120516, Schilperoort et al.）。例えば、アグロバクテリウム株を用いることができる（前記はビルレンス遺伝子を含むvirプラスミドおよび伝達されるべき遺伝子構築物を含む適合プラスミドを含む）。このベクターは大腸菌およびアグロバクテリウムで複製でき、さらに二元性ベクターBin19（Bevan, 1984）から誘導されている（Bin19は本発明に無関係である細部に改変が存在する）。本実施例で用いられる前記二元性ベクターは、T-DNAの左境界と右境界配列との間にカナマイシン耐性をコードするそっくり同じNPTII遺伝子（Bevan, 1984）および必要な遺伝子構築物のクローニング用のマルチクローニング部位を含む。
単子葉作物の形質転換および再生は任意の方法または標準的手順を用いて実施できる。単子葉植物は形質転換が容易で、繁殖力をもつトランスジェニック植物を形質転換細胞から再生することができる。また別の特徴では、単子葉植物はアグロバクテリウムの形質転換によって形質転換できる。
ある特徴では、選別マーカーとしてヒグロマイシン耐性をコードする細菌のhph遺伝子を用いて、トランスジェニックなイネを得ることができる（hph遺伝子はエレクトロポレーションによって導入できる）。ある特徴では、トランスジェニックなトウモロコシ植物は、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のbar遺伝子をトウモロコシ懸濁培養の胚形成性細胞に微粒子ボンバードメントにより導入することによって入手できる（bar遺伝子はアセチルタランスフェラーゼ（除草剤のホスフィノスリシンを不活化する酵素）をコードする）。ある特徴では、遺伝物質は、単子葉作物（例えばコムギおよびオオムギ）の糊粉プロトプラストに導入できる。ある特徴では、コムギの植物は、胚形成性懸濁培養を樹立するために成長し密に詰まった結節状の胚形成性カルス組織のみを選別することによって胚形成性懸濁培養から再生される。ある特徴では、これら作物の形質転換系を組み合わせることによって、本発明の単子葉植物への応用が可能になる。これらの方法およびその他の方法もまた、双子葉植物の形質転換および再生に応用できる。
本発明の実施では、フィターゼ構築物の発現は、植物ポリメラーゼによる当該遺伝子の転写、mRNAの翻訳など組換えDNA技術分野の業者にとって公知のような詳細な事柄を含む。本発明のいくつかの具体例の実施に関するそのような詳細な事柄は本明細書で考察される。フィターゼの発現を引き起こすことが判明または発見されている調節配列を本発明で用いることができる。用いる調節配列の選択は、関心のある標的作物および／または標的器官に左右され得る。そのような調節配列は植物または植物ウイルスから入手できるが、それらはまた化学的に合成してもよい。そのような調節配列は植物での転写の誘導で活性を示すプロモーターであり、植物またはその部分での使用に応じて構成的または成長段階もしくは組織特異的である。これらのプロモーターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：構成的発現を示すプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター（Guilley et al., 1982）、葉特異的発現のためのプロモーター、例えばリブロースビホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター（Coruzzi et al., 1984）、根特異的発現のためのプロモーター、例えばグルタミンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Tingey et al., 1987）、種子特異的発現のためのプロモーター、例えばブラシッカ・ナプス（Brassica napus）のクルシフェリンAプロモーター（Ryan et al., 1989）、塊茎特異的発現のためのプロモーター、例えばジャガイモのクラス-Iパパチンプロモーター（Koster-Topfer et al., 1989; Wenzler et al., 1989）または果実特異的発現のためのプロモーター、例えばトマトのポリガラクツロナーゼ（PG）プロモーター（Bird et al., 1988）。
他の調節配列（例えばターミネーター配列およびポリアデニル化シグナル）を本発明の実施に用いることができる。それらには植物でそのような調節配列として機能する任意の配列が含まれ、その選択は当業者の技術レベル内にある。そのような配列の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3′フランキング領域である（(Bevan、上掲書）。調節配列にはまた、エンハンサー配列（例えばCaMVの35Sプロモーターで見出されるもの）、およびmRNA安定化配列（例えばアルファルファモザイクウイルス（AIMV）RNA4のリーダー配列（Brederode et al., 1980）、または同様な態様で機能する他の任意の配列が含まれ得る。
いくつかの実施態様では、本発明のフィターゼは、発現されたタンパク質の安定性を許容する環境で発現される。本発明では細胞区画（例えばサイトゾル、小胞体、空胞、タンパク質粒、細胞周辺腔）を選択して、フィターゼの生物物理学的パラメーターに応じてそのような安定的環境を作り出すことができる。そのようなパラメーターには、最適pH、プロテアーゼに対する感受性または所望される区画のモル濃度に対する感受性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、本発明のフィターゼは細胞質で発現される。いくつかの実施態様では、細胞質での発現を達成するために、発現される酵素は、分泌シグナルペプチドまたは他のいずれの標的誘導配列も含むべきではない。葉緑体およびミトコンドリアでの発現のために、発現される酵素はこれらの小器官への取り入れのために特定のいわゆる輸送ペプチドを含むべきである。前記を実施するために、関心のある酵素に結合させることができるターゲッティング配列は公知である（Smeekens et al., 1990；van den Broeck et al., 1985；Wolter et al., 1988）。酵素の活性が空胞で所望される場合は、分泌シグナルペプチドが、これらの空胞へ酵素を誘導する特異的なターゲッティング配列と同様に存在する必要がある（Tague et al., 1990）。種子中のタンパク質粒についても同じことが言える。関心のある酵素が細胞内の所望の場所でその作用を発揮できるように、当該酵素をコードするDNA配列を改変するべきである。
いくつかの実施態様では、フィターゼの細胞外発現を達成するために、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列を利用する。宿主の植物種にとって同種（固有）であるシグナル配列が好ましいが、異種シグナル配列（すなわち他の植物種または微生物に起源を有するもの）も同様に用いることができる。そのようなシグナル配列は当業者にとって公知である。本発明の関係で用いることができる適切なシグナル配列は以下に開示されている：Blobel et al., 1979；Von Heijne, 1986；Garcia et al., 1987；Sijmons et al., 1990；Ng et al., 1994；およびPowers et al., 1996。
いくつかの実施態様では、当業者に公知の方法を用い、本発明のDNA構築物の全ての部分（プロモーター、調節配列、分泌配列、安定化配列、ターゲッティング配列またはターミネーター配列）が、所望の場合には改変されて、それらの制御特徴に影響を与える。本発明により得られるフィターゼを含む植物を用いて、さらに高いレベルのフィターゼを含む植物または植物器官を入手できる。例えば、ソモクローナル（somoclonal）変型技術の使用によって、または交配育種技術によってそのような植物または植物器官を入手することが可能である。そのような技術は当業者には周知である。
ある特徴では、本発明は、フィターゼおよび他の分子のための高度に効率的な過剰発現系を達成する方法（およびそれによる生成物）を提供する。ある特徴では、本発明は、トリコデルマ（Trichoderma）でフィターゼおよびpH2.5の酸性ホスファターゼのための高度に効率的な過剰発現系を達成する方法（およびそれによる生成物）を提供する。この系は、動物飼料工業で特に有用な酵素組成物をもたらす。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献にあり、および／または当業者にも公知である。具体的な非限定例では、そのような公開された文献にはEP0659215 (W0 9403612 A1) （Nevalainen et al.）が含まれるが、ただしこれらの参考文献は、本発明の分子のこの応用については教示しない。
いくつかの実施態様では、本発明はin vivo再組合せを用いる。前記は、細菌では“RecA-依存”現象であり得る、包括的には“組換え”と称される“分子内”プロセスにその主眼がある。本発明は、宿主細胞の組み換えプロセスを当てにして配列を組み換えさらに再組合せを達成するか、または還元的プロセスを仲介する細胞の能力を当てにして欠失により細胞内の擬似反復配列の複雑さを低下させることができる。“還元的再組合せ”のこのプロセスは、“分子内”RecA-依存プロセスによって生じる。
したがって、本発明の別の特徴では、変種ポリヌクレオチドは還元的再組合せプロセスによって作製できる。本方法は、連続配列（本来のコード配列）を含む構築物の作製、適切なベクターへのそれらの挿入、およびその後に続くそれらの適切な宿主細胞への導入を必要とする。個々の分子実体の再組合せは、相同性領域を有する構築物中の連続配列間におけるまたは擬似反復ユニット間における総当たりプロセスによって生じる。再組合せプロセスは組換えを生じるか、および／または複雑度および反復配列の程度を減少させ、さらに新規な分子種の生成をもたらす。種々の処理を適用して、再組合せ速度を速めることができる。前記には、紫外線またはDNA損傷化学物質による処理、および／または“遺伝的不安定性”レベルの強化を示す宿主細胞株の使用が含まれよう。したがって、再組合せプロセスは、相同組換えまたは擬似反復配列のそれら自身の進化を誘導する天然の特性を必要とし得る。
本発明は、反復または“擬似反復”配列を用いることができる。これらの配列は遺伝的不安定性で役割を果たすことができる。本発明では、“擬似反復配列”は本来のユニット構造に限定されない反復配列である。擬似反復ユニットは、構築物中の配列アレイとして、すなわち類似する配列の連続ユニットとして提示され得る。いったん連結されると、連続した配列の間の結合部は本質的に見分けることはできず、生じた構築物の擬似反復性は分子レベルで連続性になる。生成される構築物の複雑度を低下させるために細胞が果たす欠失プロセスは擬似反復配列間で働く。擬似反復ユニットは、スリップ事象が発生し得るときには実際上は無制限の鋳型レパートリーを提供する。したがって擬似反復配列を含む構築物は、擬似反復ユニット内の実質的に任意の場所で欠失（場合によって挿入）事象が発生し得るほど十分な分子融通性を効率的に提供する。
いくつかの特徴では、擬似反復配列が、全てが同じ方向で（例えば頭尾またはその逆）連結されるとき、細胞は個々のユニットを見分けることができない。結果として、還元プロセスは配列全体で発生し得る。対照的に、例えばユニットが頭尾ではなく頭頭で提示されるとき、前記倒置は隣接ユニットの終点の輪郭を正確に示し、結果的に欠失形成は別個のユニットの損失を助長するであろう。したがって本発明のある特徴では配列は同じ方向で存在する。擬似反復配列のランダムな方向は再組合せ効率の低下を生じ、一方、一定方向の配列は最も高い効率を提供するであろう。しかしながら、同じ方向の連続配列の数の低下は効率を低下させるが、それでもなお新規分子の効果的な回収のために十分な融通性が提供され得る。構築物を同じ方向の擬似反復配列を用いて作製しより高い効率を可能にすることができる。
配列は、以下を含む多様な任意の方法を用いて頭尾方向でアッセンブリングさせることができる：
（a）ポリ-Aヘッドおよびポリ-Tテールを含むプライマー（一本鎖として作製されたとき、前記は方向性を提供する）を利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製（したがってRnaseHで容易に除去できる）することにより達成される。
（b）固有の制限切断部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、固有配列一式、並びに反復合成および連結工程が要求されるであろう。
（c）プライマーの内部数塩基をチオール化し、さらにエキソヌクレアーゼを用いて適切なテールを有する分子を生成することができる。
いくつかの特徴では、再組合せされた配列の回収はRIが低下したクローニングベクターの同定を必要とする。続いて再組合せされたコード配列を増幅によって回収することができる。生成物を再クローニングして発現させる。RIが低下したクローニングベクターの回収は以下によって実施することができる：
1）構築物の複雑度が低下したときにのみ安定的に維持されるベクターの使用。
2）物理的方法による短縮ベクターの物理的回収。この場合には、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離方法およびアガロースゲルでの、または標準的な方法を使用する低分子量カットオフによるカラムサイズ分画を用いて回収されるであろう。
3）挿入物のサイズが低下したときに選別することができる分断遺伝子を含むベクターの回収。
4）発現ベクターおよび適切な選別を用いる直接選別技術の使用。
関連生物から得られたコード配列（例えば遺伝子）を用いることができ、それらはは高度な相同性を示し、極めて多様なタンパク質生成物をコードし得る。このような配列タイプは、擬似リピートとして本発明で特に有用である。下記で考察する例示的プロトコルはほぼ同一の原型コード配列（擬似リピート）の再組合せを示しているが、しかしながら本方法はそのようなほぼ同一のリピートに限定されない。
いったん形成されたら、構築物は公表されているプロトコルにしたがってアガロースゲルでサイズ分画し（または分画せずに）、クローニングベクターに挿入し、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。続いて細胞を増殖させ、“還元的再組合せ” を起こさせる。所望する場合は、還元的再組合せプロセスの速度はDNA損傷の導入によって速めることができる。RIの低下が“分子内メカニズム”により反復配列間の欠失形成によって仲介されるか、または“分子間メカニズム”により組換え様事象によって仲介されるかは重要ではない。最終的な結果は分子の再組合せによる全ての可能な組合せを得ることである。
ある特徴では、本発明の方法はシャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングし、結合あるいは相互作用するか、または特定の反応（例えばフィターゼの加水分解の触媒反応）を触媒する能力を有するシャッフルされた個々のライブラリーメンバーを同定するさらに別の工程を含む。
ある特徴では、そのようなライブラリーから同定されたポリペプチドを治療、診断、研究および関連する目的（例えば触媒、水溶液の浸透圧を高めるための溶質）に用いることができ、および／または1つまたは2つ以上の更なるシャッフリングおよび／または選別サイクルに付すことができる。
別の特徴では、組換えもしくは再組合せ前またはそれらの間に、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の方法によって生成されたポリペプチドを、原型ポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する薬剤またはプロセスに付すことができる。そのような変異の導入は生成されるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれらからコードされるポリペプチドの多様性を高めるであろう。変異導入を促進する薬剤またはプロセスには以下が含まれる得る（ただしこれらに限定されない）：(+)-CC-1065または合成アナローグ、例えば(+)-CC-1065-(N3-アデニン)（Sun and Hurley, 1992）；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化-4’-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物（例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992)）；またはDNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化-アミノビフェニル付加物（さらにまた例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992), pp.751-758）；三価クロム、三価クロム塩、DNA複製を阻害することができる多環式芳香族炭化水素（“PAH”）DNA付加物、例えば7-ブロモメチル-ベンゾ[a]アントラセン（“BMA”）、トリス（2,3-ジブロモプロピル）ホスフェート（“トリス-BP”）、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン（“DBCP”）、2-ブロモアクロレイン（2BA）、ベンゾ[a]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド（“BPDE”）、白金(II)ハロゲン塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]-キノリン（“N-ヒドロキシ-IQ”）およびN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-f]-ピリジン（“N-ヒドロキシ-PhIP”）。PCR増幅を遅くするかまたは停止させるための例示的手段は、紫外線(+)-CC-1065および(+)-CC-1065-(N3-アデニン)から成る。特に包含される手段は（ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプール由来のDNA付加物を含む）DNA付加物またはポリヌクレオチドであり、前記は、更なる処理の前にポリヌクレオチドを含む溶液を加熱することを含むプロセスによって遊離または除去することができる。
別の特徴では、本発明は、生物学的活性を有する組換えタンパク質を製造する方法を意図し、前記方法はハイブリッドまたは再組合せされたポリヌクレオチドの生成を提供する本発明の条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含むサンプルを処理することによって実施される。
本発明はまた、点変異をポリヌクレオチドに導入して、全範囲の単一アミノ酸置換が各アミノ酸の位置で出現する一組の子孫ポリペプチドを作製するために専有コドンプライマー（縮退N,N,N配列を含む）の使用を提供する（遺伝子部位飽和変異導入（GSSM））。使用されるオリゴは、連続的に第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列および場合によって第二の相同な配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物には、N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。
ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型の原型コドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型の少なくとも2つの原型コドンを全範囲のコドン置換に付すために、少なくとも2つの縮退N,N,G/Tカセットが同じオリゴまたは別個のオリゴで用いられる。したがって、2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴ内に含ませ、2つ以上の位置でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は連続していてもよいし、または1つもしくは2つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に有用なオリゴを単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の組合せまたは並べ換えを導入することができる。
ある特徴では、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)n配列）を含むオリゴを用いて、2つまたは3つ以上の連続するアミノ酸の位置で同時に変異を導入することが可能である。
別の特徴では、本発明は、N,N,G/T配列よりも少ない縮退を有する縮退カセットの使用を提供する。例えばいくつかの事例では、ただ1つのNを含む縮退トリプレットを（1つのオリゴで）使用することが所望されることがある。この場合、前記Nはトリプレットの第一、第二または第三位に存在し得る。他の任意の塩基（その任意の組合せおよび並べ替えを含む）をトリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。あるいは、いくつかの事例では、縮退N,N,Nトリプレット配列またはN,N,G/Cトリプレット配列の使用が所望されることがある。
しかしながら、本発明で開示するように縮退トリプレット（例えばN,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列）を使用することはいくつかの理由で有利であることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、ポリペプチド中の各々および全てのアミノ酸の位置で可能なアミノ酸の全範囲（合計20アミノ酸について）の置換が系統的かつ比較的容易に得られる手段を提供する。したがって、100アミノ酸のポリペプチドについて、本発明は系統的にかつ比較的容易に2000個の別個の種（すなわち各位置に付き20の可能なアミノ酸X 100個のアミノ酸の位置）を作製する方法を提供する。縮退N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20の可能なアミノ酸をコードする32個の配列が提供されることは理解されよう。したがって、1つのそのようなオリゴを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入において非縮退オリゴを使用した場合、反応容器に付きただ1個の子孫ポリペプチド生成物しか得られない。
本発明はまた非縮退オリゴの使用を提供する。場合によって、前記オリゴは開示した縮退プライマーと一緒に用いることができる。いくつかの状況では、対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を作製するためには、非縮退オリゴを用いることが有利であることは理解されよう。これによって、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異および終止コドンを生成させる点変異並びにポリペプチドフラグメントの対応する発現をもたらす手段が提供される。
したがってある特徴では、飽和変異導入の各反応容器は、20アミノ酸の全てが、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に対応する特定の１つのアミノ酸の位置で提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。飽和変異導入の各反応容器から生成された32倍の縮退子孫ポリペプチドはクローン増幅に付すことができ（例えば発現ベクターを用いて適切な大腸菌宿主でクローニングできる）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。（親のポリペプチドと比較したとき）個々の子孫ポリペプチドが好ましい特性変化を示すことがスクリーニングによって同定されたら、前記の配列を決定して、前記配列に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
本明細書に開示した遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）を用いて親のポリペプチド中の各々および全てのアミノ酸の位置に変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変異が2つ以上のアミノ酸の位置で同定され得ることは理解されよう。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは部分が組み合わされた1つまたは2つ以上の新規な子孫分子を作製することができる。例えば、あるポリペプチド中の3つのアミノ酸の位置の各々で2つの特定のアミノ酸の変異が同定された場合、前記入れ替えは各位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、合計3ｘ3ｘ3、または27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないものを含む。
さらに別の特徴では、スクリーニングと併せて、位置飽和変異導入をシャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の変異導入プロセスと一緒に用いることができる。本発明は任意の突然変異導入プロセスの使用を提供する。前記方法には反復態様で用いられる飽和変異導入が含まれる。ある具体例では、任意の変異導入プロセスがスクリーニングと併用して反復使用される。
したがって、非限定的な具体例では、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、また別の変異導入プロセスと組み合わされた遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）によって誘導され得る。前記別の変異導入プロセスは例えば、ハイブリッドポリヌクレオチドを組換えおよび還元的再組合せによって生成することができるように2つまたは3つ以上の関連ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入するプロセスである。
遺伝子の配列全体に変異を導入すること以外にも、変異導入を用いてポリヌクレオチド中の任意の数の塩基の各々を置換することができる。この場合、変異を導入される塩基の数は、15から100,000のいずれかである。したがって、分子の全ての位置に変異を導入する代わりに、全ての塩基または所定の数の塩基（合計で15から100,000になるサブセットであり得る）に変異を導入することができる。ポリヌクレオチド配列の各々の位置または位置群に変異を導入するために、別々のヌクレオチドを用いることができる。変異を導入される3つの位置から成る群はコドンであってもよい。前記変異は、変異原プライマー（異種カセットを含み、変異原カセットとも称される）を用いて導入することができる。例示的カセットは1つから500の塩基を有することができる。そのような異種カセットの各ヌクレオチドの位置はN、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、またはEで、ここでEはA、C、GまたはTではない任意の塩基である（Eはデザイナーオリゴと称することができる）。
一般的な意味では、飽和変異導入は、変異を導入される所定のポリヌクレオチド配列（この場合変異を導入される配列は、長さが約15から100,000塩基であり得る）中の完全な一組の変異原カセット（この場合各カセットは長さが約1−500塩基であり得る）に変異を導入することを含む。したがって、変異群（1から100変異に及ぶ）が変異を導入される各カセットに導入される。1回の飽和変異導入の実施中に、1つのカセットに導入される変異群は、第二のカセットに導入される第二の変異群とは異なっていても同じであってもよい。そのような群の例は、欠失、付加、特定コドン群および特定のヌクレオチドカセット群である。
変異を導入される所定配列には完全な遺伝子、経路、cDNA、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー/トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーターまたは任意のポリヌクレオチド機能群が含まれる。一般的には、この目的のための“所定配列”は、15塩基のポリヌクレオチド配列および15塩基から15,000塩基の長さのポリヌクレオチド配列の任意のポリヌクレオチドであり得る（本発明は具体的には15から15,000の間の全ての整数を指定する）。コドン群の選択で考慮しなければならないことには、縮退変異原カセットによってコードされるアミノ酸のタイプが含まれる。
ある特徴では、変異原カセットに導入することができる変異群に関して、本発明は特に縮退コドン置換およびそれによってコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。前記は縮退オリゴを用いて提供され、前記オリゴは各位置で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18、19および20アミノ酸をコードする。
また別の特徴では、本発明の核酸はDNA（cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む）を含む。前記DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合はコード鎖でも非コード鎖（アンチセンス鎖）でもよい。また別には、本発明の核酸はRNAを含むことができる。
下記でさらに詳細に考察するように、本発明の単離核酸配列を用いて本発明のポリペプチドを調製できる。
したがって、本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列である。本発明の核酸配列は、さらに別のコード配列（例えばリーダー配列またはプロプロテイン配列）または非コード配列（例えばイントロンまたはコード配列の5’および／または3’ 非コード配列）を含むことができる。したがって、本明細書で用いられるように、“ポリペプチドコードするポリヌクレオチド”という用語は、ポリペプチドのコード配列だけを含むポリヌクレオチドと同様に、さらに別のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。
あるいは、本発明の核酸配列を通常的技術、例えば位置特異的変異導入または他の当業者が周知の技術を用いて変異させ、本発明のポリヌクレオチドにサイレント変異を導入することができる。本明細書で用いられるように、“サイレント変異”には例えば、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸が変化しない変異が含まれる。そのような変異は、宿主生物にしばしば存在するコドンまたはコドン対を導入することによって、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞によって生成されるポリペプチドレベルを増加させるために所望されることがある。
本発明はまた、本発明のポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切端をもたらすヌクレオチド変異を有するポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチド変異は、例えば位置特異的変異導入、化学的ランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失および他の組換えDNA技術のような技術を用いて導入できる。
必要な時には、プローブが相補性配列と特異的にハイブリダイズできる条件を決定することができる。前記条件は、相補性配列を含まないコントロール配列と同様に、相補性配列が含まれることが判明しているサンプルの相補性配列をプローブと接触させることによって決定される。ハイブリダイゼーション条件、例えばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度、またはハイブリダイゼーション温度を変化させて、プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズできる条件を認定することができる。
サンプルが、当該核酸が単離された生物を含むならば、プローブの特異的ハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを検出可能な薬剤、例えば放射性同位元素、蛍光染料または検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素で標識することによって検出できる。
サンプル中の相補性核酸の存在を検出するために標識プローブを用いる多くの方法は当業者にとって周知である。これらの方法には、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション方法およびドットブロットが含まれる。これらの方法の各々のプロトコルは以下で提供される：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
あるいは、2つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも1つは、核酸サンプルに存在するいずれかの相補性配列と特異的にハイブリダイズできる）を増幅反応で用いて、サンプルが本発明の核酸配列を含む生物（例えば本発明の核酸が単離された生物）を含むか否かを決定できる。典型的にはプローブはオリゴヌクレオチドを含む。ある特徴では、増幅反応はPCR反応を含む。PCRプロトコルは上掲書（Ausubel and Sambrook）に記載されている。あるいは、増幅はリガーゼ連鎖反応、3SR、または鎖置換反応を含むことができる（以下を参照されたい：Barany, F., “The Ligase Chain Reaction in a PCR World,” PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991；E. Fahy et al., “Selfsustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991；およびWalker G.T. et al., “Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992。そのような方法では、サンプル中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、得られた任意の増幅生成物を検出する。増幅生成物は、反応生成物でゲル電気泳動を実施し、インターカレーター（例えば臭化エチジウム）でゲルを染色することによって検出できる。あるいは、1つまたは2つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル泳動後に放射性増幅生成物をオートラジオグラフィーで検出してもよい。
本発明の配列の末端近くの配列から誘導したプローブをクロモソーム=ウォーキング法で用いて、上記に示した核酸の近傍に位置するゲノム配列を含むクローンを同定することができる。そのような方法は、宿主生物由来のさらに別のタンパク質をコードする遺伝子の単離を可能にする。
本発明の核酸配列をプローブとして用いて、関連核酸を同定および単離することができる。いくつかの特徴では、関連核酸は、本発明の核酸が単離された生物以外の生物に由来するcDNAまたはゲノムDNAであり得る。例えば、他の生物は関連生物であり得る。そのような方法では、プローブが関連配列と特異的にハイブリダイズできる条件下で核酸サンプルを前記プローブと接触させる。続いて、プローブと関連生物由来の核酸とのハイブリダイゼーションが上記に記載した方法のいずれかを用いて検出される。
核酸のハイブリダイゼーション反応では、特定のストリンジェンシーレベルを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変動し得る。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC/AT含量）、および核酸のハイブリダイズ領域の核酸のタイプ（例えばRNA/DNA）を、ハイブリダイゼーション条件の選択で考慮することができる。さらに別に考慮されるべきことは、核酸の一方が例えばフィルターに固定されているか否かである。
ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー、中等度ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下で実施することができる。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定された変性核酸を含むポリマーメンブレンは、先ず初めに0.9MのNaCl、50mMのNaH2PO4（pH7.0）、5.0mMのNa2EDTA、0.5%SDS、10Xのデンハルト溶液および0.5mg/mLのポリリボアデニル酸から成る溶液中で45℃、30分プレハイブリダイズされる。続いて、約2 X 107cpm（比活性4−9 X 108cpm/μg）の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液に添加する。12から16時間インキュベートした後、前記メンブレンを0.5%のSDSを含む、1XのSET（150mMのNaCl、20mMのトリス-塩酸（pH7.8）、1mMのNa2EDTA）中で30分、室温で洗浄し、続いて前記オリゴヌクレオチドプローブのTm−10℃で新しい1XのSETで30分洗浄する。続いて前記メンブレンでオートラジオグラフィー用フィルムを感光させハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
検出可能なプローブとハイブリダイズする核酸（例えばcDNAまたはゲノムDNA）を同定するために用いられるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーレベルを変動させることによって、プローブに対して種々のレベルの相同性を有する核酸を同定および単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変動させることができる。融解温度（Tm）は、（所定のイオン強度およびpHの下で）標的配列の50％が完全に相補性のプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのTmに等しいかまたはそれより約5℃低くなるように選択される。プローブの融解温度は以下の等式を用いて計算できる。長さが14から70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度（Tm）は下記式を用いて計算される：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を用いて計算できる：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（0.63％ホルムアミド）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。プレハイブリダイゼーションは、6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性フラグメント化サケ精子DNA、または6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性フラグメント化サケ精子DNA、50％ホルムアミド中で実施することができる。SSCおよびデンハルト溶液のための組成は例えば上掲書（Sambrook et al.）に挙げられている。
ハイブリダイゼーションは、検出可能なプローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前にそれを変性させる。前記プローブが、それと相補的または相同な配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズできるように十分な時間前記ハイブリダイゼーション溶液とフィルターを接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより15−25℃下で実施できる。より短いプローブの場合（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）、ハイブリダイゼーションはTmより5−10℃下で実施できる。典型的には、6XのSSC中でのハイブリダイゼーションの場、ハイブリダイゼーションは約68℃で実施される。通常では、50％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは約42℃で実施される。前述のハイブリダイゼーションのいずれも高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションであると考えられる。
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄して非特異的に結合した検出可能なプローブを一切除去することができる。フィルターの洗浄に用いられるストリンジェンシーはまた、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）および核酸のタイプ（例えばRNA/DNA）に応じて変動し得る。ストリンジェンシーがだんだんと高くなる洗浄条件の例は以下のとおりである：2XのSSC、0.1%のSDS、室温で15分（低ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5%のSDS、室温で30分から1時間（中等度ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5%のSDS、ハイブリダイゼーション温度から68℃の間で15から30分（高ストリンジェンシー）；および0.15MのNaCl、72℃で15分（超高ストリンジェンシー）。最後の低ストリンジェンシー洗浄は、0.1XのSSCで室温で実施することができる。上記の例は、フィルターの洗浄で用いることができる1組の条件の単なる例示である。種々のストリンジェンシーの洗浄のためのレシピが多数存在することは当業者には知られていよう。他のいくつかの例は下記で提供される。
プローブとハイブリダイズした核酸はオートラジオグラフィーまたは他の通常的な技術によって同定できる。
上記の方法は、プローブ配列に対して相同性レベルが低い核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が低い核酸を得るために、ストリンジェンシーが低い条件を用いることができる。例えば、約1MのNa+濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2XのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃より上で“中等度”の条件、50℃未満で“低度”の条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む緩衝液（例えば6XのSSC）中で42℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を50%から0%まで5%ずつ減少させ、プローブに対して相同性レベルの低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後でフィルターを6XのSSC、0.5％SDSにより50℃で洗浄することができる。これらの条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低度”の条件と考えられる。“中等度の”ハイブリダイゼーション条件の具体的な条件は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
例えば、前述の方法を用いて、配列番号：1に示す核酸配列、前記と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400または500塩基を含む前記のフラグメントに対して少なくとも約99%、少なくとも約98%、少なくとも約97%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、または少なくとも約80%の相同性を有する配列、および前述の配列のいずれかと相補的な配列を有する核酸を単離することができる。相同性はアラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、相同なポリヌクレオチドは、本明細書に記載したコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子変種であるコード配列を有することができる。そのような対立遺伝子変種は、配列番号：1に示す核酸配列またはその相補性配列と比較したとき1つまたは2つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る。
さらにまた、上記の方法を用いて、配列番号：2に示す配列を有するポリペプチド、前記と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150のアミノ酸を含む前記のフラグメントに対して、配列アラインメントアルゴリズム（例えば規定値パラメーターを用いるFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム）を用いたとき、少なくとも約99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%または少なくとも70%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
本発明の別の特徴は、配列番号:1に示す配列、前記と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150アミノ酸を含む前記のフラグメントを含む単離または精製ポリペプチドである。上記で考察したように、そのようなポリペプチドは、コードされるポリペプチドの発現を適切な宿主細胞で駆動することができる配列に前記コード配列が機能的に連結されるように、前記ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入することによって入手できる。例えば、前記発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むことができる。ベクターはまた、発現を増幅させるために適切な配列を含むことができる。
細菌でのポリペプチドまたはそのフラグメントの発現に適したプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。菌類プロモーターには∀因子プロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTR、およびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
哺乳動物発現ベクターはまた、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5’フランキング非翻訳配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
真核細胞でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させるためのベクターはまた発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作動性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。その例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
さらにまた典型的には、発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子が含まれる。大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、およびS.セレビシアエのTRP1遺伝子が含まれる。
少なくとも1つの微生物に由来するDNAから関心のある標的DNAを選択的に単離するために用いられるプローブDNAは、既知の活性をもつ酵素のためのDNAの完全長コード領域配列または部分的なコード領域配列であり得る。最初のDNAライブラリーは、指定の酵素活性を有する酵素をコードするDNA配列の少なくとも一部分を含むプローブ混合物を用いて探査することができる。これらのプローブまたはプローブライブラリーは一本鎖であり得る。さらにプローブで探査される微生物のDNAは一本鎖型に変換できる。適切なプローブは、スクリーニングされるべき指定の酵素活性と類似または同一の活性を有する酵素をコードするDNAから誘導されたプローブである。
前記プローブは少なくとも約10塩基または少なくとも15塩基であり得る。ある特徴では、完全なコード領域をプローブとして用いることができる。標的DNAが、少なくとも1つのDNAプローブの使用によって選択的に単離されるハイブリダイゼーション条件が設計され、少なくとも約50%の配列同一性、より具体的には少なくとも約70%の配列同一性を提供するハイブリダイゼーションストリンジェンシーが提供されるであろう。
プローブDNAは特異的結合対（すなわちリガンド）の一方のパートナーで“標識”され、前記対の他方のパートナーは固相マトリックスに結合され、標的供給源から標的の分離を容易にできる。リガンドおよび特異的結合パートナーは以下からそのどちらの順序でも選択できる：（1）抗原またはハプテンおよび抗体またはその特異的結合フラグメント；（2）ビオチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；（3）糖および前記に特異的なレクチン；（4）酵素およびその阻害物質；（5）アポ酵素およびコファクター；（6）相補性ホモポリマーオリゴヌクレオチド；および（7）ホルモンおよびそのレセプター。固相は以下から選択できる：（1）ガラスまたはポリマー表面；（2）ポリマービーズの充填カラム；および（3）磁性または常磁性粒子。
適切なDNA配列は多様な方法によってベクターに挿入できる。一般的には、DNA配列は、挿入物およびベクターの適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化の後でベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑端を連結してもよい。多様なクローニング技術が以下に開示されている：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。そのような方法および他の方法は当業者の技術範囲内と思われる。
ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。他のベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュウロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび擬似狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞および真核細胞宿主で使用される多様なクローニングおよび発現ベクターは以下に記載されている：Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989。
使用できる細菌ベクターには特に、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174 pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK2328およびpCM7の遺伝的成分を含む市販のプラスミドが含まれる。真核細胞ベクターには特に、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。
宿主細胞は当業者に周知のいずれの宿主細胞でもよい。前記には、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞または植物細胞が含まれる。適切な宿主の代表的な例として、以下を挙げることができる：細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス、ストレプトミセスおよびスタヒロコッカス属内の多様な種、菌類細胞、例えばアスペルギルス、酵母、例えばピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセスの任意の種（ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベを含む）、昆虫細胞、例えばドロソフィラS2およびスポドプテラSf9、動物細胞、例えばCHO、COSまたはボウズメラノーマ、並びにアデノウイルス。適切な宿主の選択は当業者の技量の範囲内である。
ベクターは宿主細胞に任意の多様な技術を用いて導入できる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはTi仲介遺伝子伝達が含まれる。特別な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーション（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986）が含まれる。
適切な場合には、プロモーターの活性化、形質転換体の選別、または本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養培地で操作した宿主細胞を培養できる。適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖に続いて、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに細胞を更なる期間培養して所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成させることができる。
典型的には細胞を遠心により採集し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現のために用いた微生物細胞は都合のよい任意の方法によって破壊できる。前記方法には、反復凍結融解、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用が含まれる。そのような方法は当業者には周知である。発現ポリペプチドまたはそのフラグメントは、以下を含む方法によって組換え細胞培養から回収および精製できる：硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー。ポリペプチドの立体構造の完成時に必要に応じてタンパク質の折りたたみ工程を用いることができる。所望の場合は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程のために利用できる。
多様な哺乳動物細胞培養系もまた組換えタンパク質の発現に利用できる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株（Gluzmanが記載（Cell, 23:175, 1981））、および適合ベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞株、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHKが含まれる。
宿主細胞中の構築物を通常的態様で用いて、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を製造することができる。組換え体の生成方法で用いられる宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞によって産生されるポリペプチドはグリコシル化される（またはグリコシル化されない）。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても含まなくてもよい。組換えタンパク質発現に関する更なる詳細は当業者には入手可能である。例えば、以下の文献は、多様な生物におけるタンパク質発現について当業者に豊富な手引きを提供する：Protein Expression: A Practical Approach (Practical Approach Series by S. J. Higgins (Editor), B. D. Hames (Editor) (July 1999) Oxford University Press; ISBN: 0199636249。
あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成装置により合成によって製造することができる。他の特徴では、ポリペプチドのフラグメントまたは部分を利用し、ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを生成することができる。すなわち、フラグメントは完全長ポリペプチドの生成のための中間体として利用することができる。
当業者には理解されるところであるが、本発明の核酸配列は多様な生物での発現のために最適化できる。ある特徴では、本発明の配列は、関心のある生物、例えば菌類（例えばS.セレビシアエ）または細菌（例えば大腸菌）のコドン使用頻度について最適化される。コドン使用頻度のために核酸配列を最適化するということは、個々のアミノ酸をコードするためにある生物が優先する個々のコドンを選択することであることは当分野ではよく理解されている。例えば以下を参照されたい：Transfer RNA in Protein Synthesis by Dolph L. Hatfield, Byeong J. Lee, Robert M. Pirtle (Editor) (July 1992) CRC Press; ISBN: 0849356989。したがって、本発明はまた、ある生物のコドン使用頻度に適応させた本発明の核酸を含む。
本発明の核酸配列の最適化発現はまた、コードされるタンパク質の発現を増加させる核酸の定方向またはランダム変異導入を意味する。本発明の核酸の変異導入は直接的にまたは間接的に発現タンパク質の収量増加を提供することができる。非限定的に例示すれば、本明細書に記載する変異導入技術を利用して、核酸の5'非翻訳領域、3’非翻訳領域、またはコード領域の変異を引き起こすことができる（前記の変異はRNAまたはタンパク質レベルでの安定性の増加をもたらし、それによってタンパク質収量の増加をもたらすことができる）。
本発明のポリペプチドの1つを生成するために、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いる無細胞翻訳系もまた利用できる。いくつかの特徴では、DNA構築物は、in vitro転写反応を実施する前に線状化できる。続いて転写mRNAを適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギ網状赤血球抽出物）とともにインキュベートし、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する。
本発明はまた本発明のポリペプチドの変種に関する。“変種”という用語には、これらポリペプチドの誘導体またはアナローグが含まれる。具体的には、変種は、本発明のポリペプチドおよび前記と実質的に同一の配列とは、1つまたは2つ以上の置換、付加、欠失、融合および切端（前記は任意の組合せで存在し得る）によってアミノ酸配列が異なり得る。
変種は天然に存在するかまたはin vitroで作製できる。具体的には、そのような変種は、遺伝子操作技術、例えば位置特異的変異導入、ランダムな化学的変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失方法および標準的クローニング技術を用いて作製することができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、アナローグまたは誘導体は化学的合成または改変方法を用いて作製してもよい。
変種を作製する他の方法もまた当業者にはよく知られている。これら方法には、天然の単離体から入手した核酸配列を改変して、工業的および研究的利用でそれらの価値を高める特徴をもつポリペプチドをコードする核酸を作製する方法が含まれる。そのような方法では、天然の単離体から入手した配列に対して1つまたは2つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が作製されその特徴が決定される。典型的には、これらのヌクレオチドの相違は、天然の単離体由来の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸の変化をもたらす。
例えば、変種は変異性PCRを用いて作製できる。変異性PCRでは、DNAポリメラーゼのコピー能力が低い条件下（例えばPCR生成物の全長にわたって高率の点変異が得られる条件下）でPCRが実施される。変異性PCRは以下に記載されている：Leung, D.W., et al., Technique, 1:11-15, 1989；およびCaldwell, R. C. and Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33, 1992。簡単に記せば、そのような方法では、変異を導入される核酸は、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、およびPCRの全長にわたって高率の点変異を生じるために適切な濃度のdNTPと混合される。例えば反応は、20フィコモルの変異を導入される核酸、30ピコモルの各PCRプライマー、反応緩衝液（以下を含む：50 mMの KCl、10 mM Tris HCl (pH 8.3)および0.01% ゼラチン、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2 mM dGTP、0.2 mM dATP、1mM dCTPおよびdTTP）を用いて実施できる。PCRは、94℃で1分、45℃で1分および72℃で1分の30サイクルで実施できる。しかしながら、これらのパラメーターは適切に変動させるのが適切であろう。変異が導入された核酸を適切なベクターでクローニングし、変異導入核酸によってコードされたポリペプチドの活性を評価する。
変種はまた、関心がある任意のDNAクローンに位置特異的変異を発生させるためにオリゴヌクレオチド指定変異導入を用いて作製できる。オリゴヌクレオチド変異導入は以下に記載されている：Reidhaar-Olson, J.F. & Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57, 1988。簡単に記せば、そのような方法では、DNAクローンに導入されるべき1つまたは2つ以上の変異を保持する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、変異を導入すべきDNAクローンに前記を挿入する。変異が導入されたDNAを含むクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を判定する。
変種を作製するまた別の方法はアッセンブリPCRである。アッセンブリPCRは、小DNAフラグメントの混合物からPCR生成物のアッセンブリングを必要とする。多数の様々なPCR反応が同じバイアル中で平行して発生し、ある反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリPCRは、係属中の特許出願08/677,112（1996年7月9日出願、発明の名称：Method of “DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process”）に記載されている。
変種を作製するさらに別の方法はセクシュアルPCR変異導入である。セクシュアル変異導入では、配列相同性によるDNA分子のランダムなフラグメント化の結果として、相違するが高度に関連するDNA配列をもつDNA分子間でin vitro相同組換えが強制され、続いてPCR反応でプライマーの伸長により交差が固定される。セクシュアルPCR変異導入は以下に記載されている：Stemmer, W.P., PNAS, USA, 91:10747-10751, 1994。簡単に記せば、そのような方法では、組換えられるべき複数の核酸をDNaseで消化して平均サイズが50−200ヌクレオチドのフラグメントを生成する。所望サイズのフラグメントを精製しPCR混合物に再懸濁する。核酸フラグメント間での組換えを促進する条件下でPCRを実施する。例えば、PCRは、0.2 mMの各dNTP、2.2 mM MgCl2、50 mM KCL、10 mM Tris HCl（pH 9.0）および0.1% Triton X-100の溶液に精製フラグメントを10-30ng/μLの濃度で再懸濁することによって実施される。100μLの反応混合物に2.5単位のTaqポリメラーゼを加え、以下のようにPCRを実施する：94℃で60秒、94℃で30秒、50−55℃で30秒、72℃で30秒（30−45回）および72℃で5分。しかしながら、これらのパラメーターは適切に変動できることは理解されよう。いくつかの特徴では、複数のオリゴヌクレオチドがPCR反応に含まれ得る。他の特徴では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントを最初のPCR反応セットで用い、Taqポリメラーゼをその後のPCR反応セットで用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を判定する。
変種はまたin vivo変異導入により作製できる。いくつかの特徴では、関心がある配列を細菌株（例えば大腸菌株）で増殖させることによって、関心がある配列にランダム変異が導入される。前記細菌株は1つまたは2つ以上のDNA修復経路に変異を保有する。そのような“ミューテーター”株は野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の1つでDNAを増幅させることによって、最終的にDNA内にランダム変異が発生するであろう。in vivo変異導入の使用に適切なミューテーター株は、PCT公開公報WO 91/16427（1991年10月31日PCT公開、発明の名称：“Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations”）に記載されている。
変種はまたカセット変異導入によって作製できる。カセット変異導入では、二本鎖DNA領域の小領域が、天然の配列と異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置換される。このオリゴヌクレオチドはしばしば完全にまたは部分的にランダム化された配列を含む。
再帰的アンサンブル変異導入もまた変種作製に用いることができる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型が関連する変異体の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列が相違する）を作製するために開発されたタンパク質操作（タンパク質の変異導入）用アルゴリズムである。この方法はフィードバックメカニズムを用いて総当たりカセット変異導入の連続的繰り返しを制御する。再帰的アンサンブル変異導入は以下に記載されている：Arkin, A.P. and Youvan, D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815, 1992。
いくつかの特徴では、変種はエクスポネンンシャルアンサンブル変異導入を用いて作製される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は、高い割合の固有で機能的な変異体を含む総当り組合せライブラリーを生成する方法である。前記変異導入では、残基の小グループが並行して任意抽出され、機能的タンパク質を生じるアミノ酸がそれぞれ変更された位置で同定される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Delagrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552。ランダムで位置特異的変異導入は例えば以下に記載されている：Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。
いくつかの特徴では変種はシャッフリングの方法によって作製される。この方法では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が一緒に融合され、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が生成される。前記は以下に記載されている：係属中の米国特許出願08/677,112（1996年7月9日出願、発明の名称：“Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process”）および係属中の米国特許出願08/651,568（1996年5月22日出願、発明の名称：“Combinatorial Enzyme Development”）。
本発明のポリペプチドの変種は、本発明の配列のポリペプチドの1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（例えば保存アミノ酸残基）で置換されれた変種であり得る。さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、そうでないものでもよい。
保存的置換は、同様な特徴を有する別のアミノ酸によってポリペプチド内のあるアミノ酸が置換されるものである。保存的置換として典型的に観察されるものは以下の置換である：脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのスレオニンによる置換またはその逆；酸性残基（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばアスパラギンおよびグルタミン）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばリジンおよびアルギニン）の別の塩基性残基による交換；および芳香族残基（例えばフェニルアラニン、チロシン）の別の芳香族残基による置換。
他の変種は、本発明のポリペプチドの1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変種である。
さらに他の変種は、前記ポリペプチドが別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を延長させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。
さらに別の変種は、また別のアミノ酸が前記ポリペプチドに融合されているものである。前記また別のアミノ酸は、例えばリーダー配列、分泌配列、プロプロテイン配列または前記ポリペプチドの精製、濃縮または安定化を促進する配列である。いくつかの特徴では、誘導体およびアナローグは本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持し、さらにプロプロテインを含むことができる。したがって、プロプロテイン部分が切断されることによって、前記フラグメント、誘導体またはアナローグが活性化され活性なポリペプチド生成することができる。
宿主細胞における高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化
本発明は、コドン使用頻度を改変するためにフィターゼコード核酸を改変する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、フィターゼをコードする核酸のコドンを改変して宿主におけるその発現を増加または減少させる方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞におけるその発現を高めるために改変されたフィターゼをコードする核酸、そのように改変されたフィターゼ酵素および改変フィターゼ酵素を製造する方法を提供する。前記方法は、“非優先”または“低優先”コドンをフィターゼコード核酸中で同定し、さらにこれら非優先もしくは低優先コドンの1つまたは2つ以上を、前記コドンと同じアミノ酸をコードする“優先コドン”で置き換えることを含み、核酸内の少なくとも1つの非優先または低優先コドンが同じアミノ酸をコードする優先コドンによって置き換えられいる。優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである。
本発明の核酸、発現カセットおよびベクターの発現のための宿主細胞には細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。したがって、本発明はこれら全ての細胞でコドン使用頻度を最適化する方法、コドン改変核酸およびコドン改変核酸によって生成されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、グラム陰性細菌（例えば大腸菌およびシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens））；グラム陽性細菌（例えばラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、枯草菌）が含まれる。例示的宿主細胞にはまた、真核生物、例えば種々の酵母、例えばサッカロミセス種（サッカロミセス・セレビシアエを含む）、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリスおよびクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲル、並びに哺乳動物細胞および細胞株、並びに昆虫細胞および細胞株が含まれる。したがって、本発明はまたこれらの生物および種での発現のために最適化された核酸およびポリペプチドを含む。
例えば、細菌細胞から単離されたフィターゼをコードする核酸のコドンは、フィターゼが由来した細菌とは異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞で前記核酸が最適に発現できるように改変される。コドンを最適化する方法は当分野で周知で、例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,795,737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253。さらにまた以下を参照されたい：Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系におけるコドンの最適化を記載）；Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24（酵母におけるコドンの最適化を記載）；Feng (2000) Biochemistry 39:15339-15409（大腸菌におけるコドンの最適化を記載）；Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264（大腸菌における分泌に影響するコドン使用頻度の最適化を記載）。
非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセットもしくはベクター、またはトランスフェクトされたもしくは形質転換された細胞を含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。前記トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の核酸を含む例えばヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、乳牛、ラットおよびマウスであり得る。これらの動物は、例えばフィターゼ活性を調べるin vivoモデルとして、またはフィターゼ活性の調節物質のin vivoスクリーニングのモデルとして用いることができる。非ヒトトランスジェニック動物で発現されるべきポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、または組織特異的、成長特異的もしくは誘導性調節因子の制御下にあるように設計することができる。非ヒトトランスジェニック動物は当分野で公知の任意の方法を用いて設計および作製することができる。例えば以下を参照されたい：US Patent No. 6,211,428；6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571（形質転換細胞および卵並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよび乳牛の作製および使用について記載されている）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157（トランスジェニック酪農動物のミルク中の組換えタンパク質の製造について記載）；Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461（トランスジェニックヤギの作製を示す）。米国特許第6,211,428号は、DNA配列を含む核酸構築物をその脳で発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製および使用について記載している。米国特許第5,387,742号は、クローン化組換えまたは合成DNA配列の受精マウス卵への注入、前記注入卵の偽妊娠雌への移植および、アルツハイマー病関連タンパク質をその細胞で発現するトランスジェニックマウスの妊娠期間満了までの発育について記載している。米国特許第6,187,992号は、そのゲノムがアミロイド前駆体（APP）をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスの作製および使用を記載している。
“ノックアウト動物”もまた本発明の方法の実施に用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明のトランスジェニックまたは改変動物は、フィターゼを発現しないように、またはフィターゼを発現できないように操作された“ノックアウト動物”、例えば“ノックアウトマウス”を含む。
別の特徴では、本発明のフィターゼをコードする異種配列（例えば配列番号：2の個々に列挙した配列改変）を含む非ヒトトランスジェニック動物が提供される。本発明のトランスジェニック動物を作製するために多様な方法を用いることができる。概略すれば、3とおりのそのような方法を用いることができる。そのような方法の1つでは、前核期の胚（“1細胞胚”）を雌から採集し、前記胚にトランスジーンをマイクロインジェクトする。この場合、トランスジーンは、得られる成熟動物の生殖細胞および体細胞の両方の染色体に組み込まれるであろう。別のそのような方法では、胚性幹細胞が単離され、トランスジーンは、エレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクションまたはマイクロインジェクションによってその中に取り込まれ、続いて前記幹細胞は胚に再導入される。前記胚において前記幹細胞はコロニーを形成し、生殖細胞系列の生成に寄与する。哺乳動物種のマイクロインジェクションの方法は米国特許4,873,191号に記載されている。
さらに別の例示的方法では、トランスジーンを含むレトロウイルスを胚性細胞に感染させ、それによって当該胚の生殖細胞の染色体にトランスジーンを組み込ませる。トランスジェニックにするべき動物が鳥類であるときは、一般的に鳥類の受精卵は卵管内での最初の20時間に細胞分割が終わるので、受精卵の前核へのマイクロインジェクションは前核への接近不能のために困難である。したがって、上記で概略したトランスジェニック動物を作製する方法のうちで、例えば米国特許5,162,215号に記載されているように、鳥類の種の場合についてはレトロウイルス感染が好ましい。しかしながら、マイクロインジェクションを鳥類種で用いようとする場合は、Loveらが公表した方法（Biotechnol. 12, Jan. 1994）を用いることができる。前記によれば、その前に排卵された卵の産卵後約2時間半後に屠殺した雌鳥から胚を入手し、ジャーミナルディスクの細胞質にトランスジーンをマイクロインジェクトし、この胚を成熟するまで宿主の卵殻内で培養する。トランスジェニックにするべき動物がウシまたはブタであるときは、卵子の不透明さのためにマイクロインジェクションが妨げられ、それによって伝統的な位相差顕微鏡による核の識別が困難になる。この問題を克服するために、より良好な可視化のために卵子を最初に遠心して前核を分離することができる。
ある特徴では、本発明の“非ヒト動物”にはウシ、ブタ、ヒツジおよび鳥類動物（例えば乳牛、ブタ、ヒツジ、ニワトリ）が含まれる。本発明の“非ヒトトランスジェニック動物”は、非ヒト動物の生殖細胞系列にトランスジーンを導入することによって作製される。種々の発育期の胚の標的細胞を用いてトランスジーンを導入できる。胚の標的細胞の発育期に応じて種々の方法が用いられる。接合子がマイクロインジェクションの最良の標的である。遺伝子伝達のための標的としての接合子の使用は、注入されたDNAがほとんどの事例で最初の分割の前に宿主の遺伝子に取り込まれるという点で大きな利点を提供する（Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985）。結果として、非ヒトトランスジェニック動物の全細胞が取り込まれたトランスジーンを保持する。生殖細胞の50%が当該トランスジーンを保有するので、このことはまた一般的にその子孫へのトランスジーンの効率的な伝達として示されるであろう。
ある特徴では、“トランスジェニック”という用語は、外因性の遺伝物質をその全細胞で含む動物を指すために用いられる。“トランスジェニック”動物は、生殖に用いられる細胞内に外因性遺伝物質を含む2つのキメラ動物を交配することによって作製できる。得られる子孫の25%がトランスジェニック、すなわち前記外因性遺伝物質をそれらの全細胞の両対立遺伝子に含む動物で、得られる動物の50%が一方の対立遺伝子内に前記外因性遺伝物質を含み、さらに25%が外因性遺伝物質を含まないであろう。
ある特徴では、マイクロインジェクション方法を本発明の実施に用いる。トランスジーンを消化し、例えば電気泳動により任意のベクターから精製する。ある特徴では、トランスジーンは機能的に結合したプロモーターを含む。前記プロモーターは、転写に必要な細胞性タンパク質と相互作用し、最終的に構成的発現をもたらす。これに関して有用なプロモーターにはサイトメガロウイルス（CMV）、モロニー白血病ウイルス（MLV）およびヘルペスウイルスに由来するものが含まれ、さらにメタロチオネイン、骨格アクチン、P-エノルピルベートカルボキシラーゼ（PEPCK）、ホスホグリセレート（PGK）、DHFRおよびチミジンキナーゼをコードする遺伝子に由来するものが同様に含まれる。ウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）の長い末端繰返し（LTR）もまた用いることができる。トランスジェニックにするべき動物が鳥類であるとき、好ましいプロモーターには、ニワトリのβ-グロビン遺伝子、ニワトリのリゾチーム遺伝子、およびニワトリの白血病ウイルスのプロモーターが含まれ得る。胚性幹細胞のプラスミドトランスフェクションで有用な構築物は、当分野で周知のさらに別の調節エレメント、例えば転写を促進するエンハンサーエレメント、スプライスアクセプター、終了およびポリアデニル化シグナル、並びに翻訳を可能にするリボソーム結合部位を含むであろう。
レトロウイルス感染もまた、上記に述べたように非ヒト動物へのトランスジーン導入に用いることができる。非ヒト発育胚をin vitroで胚盤胞期にまで培養する。この時期に、卵割球はレトロウイルス感染の標的であり得る（Jaenich, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264, 1976）。卵割球の効率的な感染は、酵素処理で透明帯を除去することによって達成される（Hogan, et al. (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。トランスジーンの導入に用いられるウイルスベクター系は典型的には、トランスジーンを保持する複製欠損レトロウイルスである（Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6927-6931, 1985；Van der Putten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152, 1985）。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することによって容易にかつ効率的に実施される（Van der Putten, 上掲書；Stewart, et al., EMBO J. 6: 383388, 1987）。あるいは、感染はより後期に実施してもよい。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔に注入する（D. Jahner et al., Nature 298: 623628, 1982）。創始細胞の大半はトランスジーンについてはモザイクであろう。なぜならば、取り込みは非ヒトトランスジェニック動物を形成した細胞のサブセットでのみ生じるからである。さらにまた、創始細胞は、ゲノム内の種々の位置にレトロウイルスによるトランスジーン挿入を含み得る（前記は一般的には子孫で分離していくであろう）。さらにまた、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖細胞系列にトランスジーンを導入することもまた可能である（ただし効率は低い）（D. Jahner et al. 上掲書）。
トランスジーン導入のための第三の標的細胞タイプは胚性幹細胞（ES）である。ES細胞はin vitroで培養し胚と融合させた着床前の胚から得られる（M. J. Evans et al., Nature 292:154-156, 1981；M. O. Bradley et al., Nature 309:255-258, 1984；Gossler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:90659069, 1986；およびRobertson et al., Nature 322:445-448, 1986）。トランスジーンは、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介形質導入によってES細胞に効率的に導入できる。そのような形質転換ES細胞をその後非ヒト動物由来の胚盤胞と合体させることができる。その後、ES細胞は胚を形成し、さらに生じたキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（概説として以下を参照されたい：Jaenisch, R., Science 240:1468-1474, 1988）。
ある特徴では、“形質転換された”とは、その中に（またはその先祖の中に）組換え核酸技術の手段によって異種核酸分子が導入された細胞を意味する。“異種”は、別の種に由来するか、またはその本来の形態もしくは細胞で主として発現される形態から改変されている核酸配列を意味する。
ある特徴では、“トランスジーン”は、巧みな操作により細胞に挿入され、当該細胞から発生した生物のゲノムの一部分になった（すなわち安定的に組み込まれたか、または安定な染色体外エレメントとなった）DNA片を指す。そのようなトランスジーンには、当該トランスジェニック生物にとって部分的にまたは完全に異種である（すなわち外来性である）遺伝子が含まれ得るが、また当該生物の内因性遺伝子と相同な遺伝子であってもよい。この定義に含まれるものは、DNAに転写され続いてゲノムに取り込まれるRNA配列を提供することによって作出されるトランスジーンである。本発明のトランスジーンには、フィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列が含まれ、さらに非ヒトトランスジェニック動物で発現され得るポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で用いられる“トランスジェニック”という用語はさらにまた、初期胚または受精卵のin vitro操作によって、または特異的な遺伝子ノックアウトを誘導する任意のトランスジェニック技術によってそのゲノムが変異した任意の生物を含む。本明細書で用いられる“遺伝子ノックアウト”は、当業者に周知の任意のトランスジェニック技術によって達成された完全な機能消失を伴う、in vivoでの遺伝子の標的誘導破壊を意味する。ある特徴では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、相同組換えによって機能を喪失させるべき遺伝子への標的誘導挿入によって標的遺伝子が機能を喪失した動物である。
ある特徴では、“トランスジェニック”という用語には当業者によく知られた任意のトランスジェニック技術が含まれる。前記技術は、導入されたトランスジーンを保持する生物、または内因性遺伝子が機能を喪失もしくは“ノックアウト”させられた生物を作製することができる。
本発明の実施で用いることができるトランスジーンは、フィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含むDNA配列である。ある特徴では、配列番号：1に示す配列を有するポリヌクレオチドまたは配列番号：2に示す配列を有するポリペプチドをコードする配列が、本明細書が当該用語を定義するトランスジーンである。適切な場合には、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮退のために核酸配列が異なるDNA配列もまた、切端形、対立遺伝子変種、および種間ホモローグの場合のように本明細書で用いることができる。
ある特徴では、胚のマイクロインジェクション後、トランスフェクトした胚性幹細胞のコロニー形成後、またはトランスジーンを含むレトロウイルスによる感染後に（本明細書の別の個所で強調したニワトリ種での本発明の実施の場合を除いて）、当該胚は偽妊娠雌の卵管に移植される。得られた子孫をトランスジーンの取り込みについて、トランスジーン特異的プローブを用い血液または組織サンプルのサザンブロット分析によって試験する。これに関してはPCRが特に有用である。陽性子孫（G0）を交配して子孫（G1）を産出する。G1は組織サンプルのノーザンブロット分析によってトランスジーン発現について調べる。
ある特徴では、前記方法は、約15%、約20%までの、または約20%、約50%もしくは前記を越える、トランスジェニック動物のリンの取り込み増加および／またはトランスジェニック動物の排泄物中の汚染物質量減少を含む。
ある特徴では、本発明の実施で使用が意図される動物は、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ鳥類種）を含む一般的に家畜とみなされる動物、および食物の加工に有用な動物、すなわち鳥類、例えば肉用および産卵用ニワトリ並びにシチメンチョウ、ヒツジ、例えばラム、ウシ、例えば肉牛および乳牛、魚類および豚である。
ある特徴では、これらの動物は、そのような動物がその生殖細胞の染色体に組み込まれた異種DNA配列、または当該動物にとって通常は内因性である1つまたは2つ以上のさらに別のDNA配列（本明細書では包括的に“トランスジーン”と称する）を有していた場合に、“トランスジェニック”であると称される。トランスジェニック動物（その子孫を含む）にはまたその体細胞の染色体に当該トランスジーンが偶発的に組み込まれているであろう。
スクリーニングの方法論および“オンライン”モニター装置
本発明の方法を実施するとき、多様な装置および方法論を本発明のポリペプチドおよび核酸と併せて用いて、例えばフィターゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングし、活性の潜在的調節物質（例えば活性化物質または阻害物質）として化合物をスクリーニングし、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸についてスクリーニングすることなどが可能である。
固定酵素固相：
フィターゼ酵素、そのフラグメント並びに前記酵素およびフラグメントをコードする核酸は固相に固定できる。前記は、フィターゼを工業的プロセスで使用するときにしばしば経済的で効率的である。例えば、フィターゼ酵素（またはその活性フラグメント）の混合物またはカクテル（前記は特異的な化学反応で用いることができる）を固相に結合させ、プロセスバットに浸すことができる。酵素反応が発生し得る。続いて、反復使用のために固相をバットから固相に結合させた酵素ともに取り出すことができる。本発明のある実施態様では、本発明の単離核酸は固相に固定される。本発明の別の実施態様では、固相は、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極および前記の任意の組合せの群から選択される。
例えば、本発明で有用な固相にはゲルが含まれる。ゲルのいくつかの例には、セファロース、ゼラチン、グルタルアルデヒド、キトサン-処理グルタルアルデヒド、アルブミン-グルタルアルデヒド、キトサン-キサンタン、トーヨーパールゲル（ポリマーゲル）、アルギネート、アルギネート-ポリリジン、カラジーナン、アガロース、グリオキシルアガロース、磁性アガロース、デキストラン-アガロース、ポリ(カルバモイルスルフォネート)ヒドロゲル、BSA-PEGヒドロゲル、リン酸化ポリビニルアルコール（PVA）、モノアミノエチル-N-アミノエチル（MANA）、アミノ、または前記の任意の組合せが含まれる。
本発明で有用な別の固相は樹脂またはポリマーである。樹脂またはポリマーのいくつかの例には、セルロース、アクリルアミド、ナイロン、レーヨン、ポリエステル、陰イオン交換樹脂、AMBERLITETM XAD-7、AMBERLITETM XAD-8、AMBERLITETM IRA-94、AMBERLITETM IRC-50、ポリビニル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、または前記の任意の組み合わせが含まれる。本発明で有用な別のタイプの固相はセラミックである。いくつかの例には、無孔性セラミック、有孔性セラミック、SiO2、Al2O3が含まれる。本発明で有用な別のタイプの固相はガラスである。いくつかの例には、無孔性ガラス、有孔性ガラス、アミノプロピルガラス、または前記の任意の組み合わせが含まれる。使用できる別のタイプの固相は微小電極である。一例はポリエチレンイミン被覆磁鉄鉱である。グラファイト粒子を固相として用いてもよい。固相の別の例は細胞、例えば赤血球である。
固定方法：
酵素もしくはそのフラグメントまたは核酸を固相に固定するために、当業者に公知の多数の方法が存在する。そのような方法のいくつかの例には、例えば静電滴生成、電気化学的手段、吸着、共有結合、架橋、化学反応もしくはプロセス、被包化、捕捉、アルギン酸カルシウム、ポリ(2-ヒドロキシメタクリレート)によるものが含まれる。同様な方法が以下に記載されている：Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Edited by S. P. Colowick and N. O. Kaplan. Volume 136；およびImmobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Edited by G. F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Edited by J. M. Walker。
キャピラリーアレイ：
キャピラリーアレイ、例えばGIGAMATRIXTM（Diversa Corporation, San Diego, CA）を本発明の方法で用いることができる。本発明の核酸またはポリペプチドをアレイ（キャピラリーアレイを含む）に固定するか、またはアレイに塗布できる。アレイを用いて組成物（例えば小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドと結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターできる。キャピラリーアレイはサンプルの保持およびスクリーニングのためのまた別の系を提供する。例えば、サンプルのスクリーニング装置は、隣接するキャピラリーの列の中に形成された複数のキャピラリーを含むことができ、各キャピラリーはサンプル保持のために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を含む。この装置はさらに、アレイ中の隣接するキャピラリーの間に配置された間隙物質および前記間隙物質内に形成された1つまたは2つ以上の参照用認証物を含む。サンプルのスクリーニング用キャピラリー（キャピラリーはキャプラリーアレイの中で一緒に束ねられるように作られている）は、サンプル保持のために管腔を仕切る第一の壁および、サンプルを励起するために管腔に提供される励起エネルギーのフィルタリングのためのフィルター物質で形成された第二の壁を含む。
ポリペプチドまたは核酸（例えばリガンド）を、キャピラリーアレイの1本のキャピラリーの少なくとも一部分の第一の成分に導入することができる。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、第一の成分を保持するために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を含むことができる。気泡を第一の成分の後ろのキャピラリーに導入することができる。第二の成分をキャピラリーに導入することができ、この場合第二の成分は前記気泡によって第一の成分と分離される。関心があるサンプルを検出可能な粒子で標識した第一の液体としてキャピラリーアレイの1本のキャピラリーに導入できる。この場合、キャピラリーアレイの各キャピラリーは第一の液体および検出可能な粒子を保持するために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を含み、さらに前記少なくとも1つの壁は検出可能な粒子を前記少なくとも1つの壁に結合させるために結合物質で被覆される。この方法はさらに、キャピラリー管から第一の液体を除去する工程（この場合、結合した検出可能な粒子はキャピラリー内に維持される）およびキャピラリー管に第二の液体を導入する工程を含むことができる。
キャピラリーアレイは、管腔を仕切る少なくとも1つの外壁を含む、複数の個々のキャピラリーを含むことができる。キャピラリーの前記外壁は融合した1つまたは2つ以上の壁であってもよい。同様に壁は管腔を仕切ることができ、前記管腔は、液体もしくはサンプルの保持のための管腔を前記壁が形成できるかぎり円筒形、方形、六角形または他の任意の幾何学的形状である。キャピラリーアレイのキャピラリーは、互いに近接した状態で一緒に保持され、平坦な構造物を形成することができる。キャピラリーは、溶融（例えばキャピラリーがガラスで製造されている場合）、接着剤による接着、縛るかまたは隣同士を留め金で固定することによって一緒に束ねることができる。キャピラリーアレイは、任意の数の個々のキャピラリー、例えば100から4,000,000本の範囲のキャピラリーで形成できる。キャピラリーアレイは、約100,000本またはそれ以上の個々のキャピラリーを一緒に束ねてマイクロタイタープレートを形成することができる。
アレイまたは“バイオチップ”：
本発明の核酸またはポリペプチドはアレイに固定または塗布することができる。アレイを用いて、組成物（例えば小分子、抗体、核酸など）ライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドと結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。例えば本発明のある特徴では、モニターされるパラメーターはフィターゼ遺伝子の転写物の発現である。細胞の1つもしくは2つ以上または全ての転写物が、細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって測定することができ、また細胞の代表的な核酸または細胞の転写物と相補的な核酸はアレイまたは“バイオチップ”上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップ上の核酸“アレイ”を用いることによって、細胞の転写物のいくつかまたは全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイはまた、本発明の方法によって新規に操作された株の遺伝子型の決定に用いることができる。“ポリペプチドアレイ”はまた、複数のタンパク質の同時定量に用いることができる。
また別の特徴では、本発明の“アレイ”または“マイクロアレイ” または“バイオチップ”または“チップ”は、本発明の核酸および／またはポリペプチドまたはペプチドの他に複数の標的エレメントを含む。各標的エレメントは、土台表面の所定の領域に固定された、所定量の1つまたは2つ以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸を含むことができる（以下でさらに詳細に考察される）。
本発明は、公知の任意の“アレイ”（“マイクロアレイ” または“核酸アレイ”または“ポリペプチドアレイ”または“抗体アレイ”または“バイオチップ”とも称される）またはその変型を用いて実施することができる。アレイは一般的には複数の“スポット”または“標的エレメント”である。各標的エレメントは所定量の1つまたは2つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドを含み、それらはサンプル分子（例えばmRNA転写物）と特異的に結合させるために土台表面の所定領域に固定される。
本発明の方法を実施するとき、任意の公知のアレイおよび／またはアレイの製造および使用方法の全体もしくは部分またはその変型を取り入れることができる。それらは例えば以下に記載されているようなものである：米国特許第6,277,628号；第6,277,489号；第6,261,776号；第6,258,606号；第6,054,270号；第6.048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,965,452号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,830,645号；第5,770,456号；第5,632,957号；第5,556,752号；第5,143,854号；第5,807,522号；第5,800,992号；第5,744,305号；第5,700,637号；第5,556,752号；第5,434,049号。さらにまた例えば以下を参照されたい：WO99/5173；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958。さらにまた例えば以下を参照されたい：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetis Supp. 21:25-32。さらにまた以下を参照されたい：米国特許出願公開広報第20010018642号；同第20010019827号；同第20010016322号；同第20010014449号；同第20010014448号；同第20010012537号；同第20010008765号。
ポリペプチドおよびペプチド
本発明は、配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、さらに表4、5、6、7、9に列挙した変異の少なくとも1つまたはその任意の組合せを含む、単離、合成または組換えポリペプチドを提供する。本発明はさらに、配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、さらに表4、5、6、7、9に列挙した変異の少なくとも1つまたはその任意の組合せを含むポリペプチドをコードする、単離、合成または組換え核酸を提供する。参照のために、合成により生成された“親”の配列番号：2は以下のとおりである：
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1 5 10 15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
20 25 30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
35 40 45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
50 55 60
Lys Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gly His Tyr Trp Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys
85 90 95
Cys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp
100 105 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
115 120 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
130 135 140
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145 150 155 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
165 170 175
Phe Thr Gly His Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
180 185 190
Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu
195 200 205
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
210 215 220
Asp Cys Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225 230 235 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
245 250 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
260 265 270
Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His
290 295 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305 310 315 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
340 345 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
355 360 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
370 375 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385 390 395 400
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
405 410 415
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
420 425 430
実施例1に記載するように、GeneReassemblyTMライブラリー構築のために選択した遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)-生成配列改変を示す親フィターゼ配列番号：2（例えば配列番号：1によってコードされる）の配列は図4に示されている。実施例2に記載するように、親フィターゼ配列番号：2（例えば配列番号：1によってコードされる）はさらに、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)配列改変、位置特異的変異導入(SDM)およびTMCAライブラリー構築に付された。
ある特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドはフィターゼ活性を有する。また別の特徴では、それらはまた、例えば標識プローブ、抗原、寛容誘導原、モチーフ、フィターゼ活性部位として有用であり得る。
また別の特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドは合成ポリペプチドであるか、または組換え生成ポリペプチドである。ペプチドおよびタンパク質はin vitroまたはin vivoで組換えによる発現できる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当分野で公知の任意の方法を用いて作製および単離できる。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当分野で周知の化学的方法を用いてその全体または部分を合成できる。例えば以下を参照されたい：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA。例えば、ペプチド合成は多様な固相技術を用いて実施でき（例えば以下を参照されたい：Roberge (1995) Science 269:202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13）、さらに自動化合成は、例えばABI 431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を製造業者の提供する指示に従って用いることにより実施できる。
本発明の酵素およびポリヌクレオチドは単離形として提供するか、または均質に精製できる。本発明のフィターゼポリペプチドは、いくつかの標準的な方法のいずれかを用いて入手できる。例えば、フィターゼポリペプチドは、標準的な組換え発現系（本明細書に記載）で製造するか、化学的に合成するか（ただし小さなフィターゼペプチドフラグメントにある程度限定される）、またはそれらを天然に発現する生物から精製できる。有用な組換え発現方法は、哺乳動物宿主、細菌宿主および植物宿主を含む。
また別の特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドは“アミノ酸”または“アミノ酸配列”を含み、それらは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を含むか、あるいは、前記の、および天然に存在する分子または合成分子のいずれかのフラグメント、部分またはサブユニットである。
また別の特徴では、本発明の“組換え”ポリペプチドまたはタンパク質には、組換えDNA技術によって生成された、例えば所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性DNA構築物によって形質転換した細胞から生成されたポリペプチドまたはタンパク質が含まれる（該当する）。本発明の“合成”核酸（オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチドまたはタンパク質には、化学的合成（本明細書で詳細に記載）によって生成したものが含まれる。また別の特徴では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドイソステアーを含み、20個の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の改変アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によって、または化学的修飾技術（当業界で周知である）によって改変することができる。改変はポリペプチドの任意の場所（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含む）で生じ得る。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同程度または種々の程度で存在し得ることは理解されよう。さらにまた、あるポリペプチドが、例えば以下の多くのタイプの改変を有することもできる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合環状化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストール化、酸化、ポリエチレングリコール化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA仲介付加。
また別の特徴では、“合成”ポリペプチドまたはタンパク質は化学的合成によって生成されるものである。固相ペプチド化学合成方法もまた本発明のポリペプチドまたはフラグメントの合成に用いられる。そのような方法は、1960年代初期より当分野で公知であり（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（さらにまた以下を参照されたい：Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12）、さらに最近、市販の実験室用ペプチド設計および合成キットで用いられている（Cambridge Research Biochemicals）。
そのような市販の実験用キットは、一般的にH. M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998, 1984）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（それらの全てが1枚のプレートにつながっている）の先端に合成ペプチドを提供する。そのような系を利用するとき、ロッドまたはピンをもつプレートはひっくり返されて、対応するウェルまたは溶液溜めをもつ第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたは溶液溜めは、前記ピンまたはロッドの先端に適切なアミノ酸を付着または固定させるための溶液を含む。そのような工程（すなわちひっくり返し、ロッドおよびピンの先端を適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸が所望のペプチドに成長する。さらにまた、多数のFMocペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントのアッセンブリはアプライドバイオシステム社（Applied Biosystems, Inc.）のModel 431A自動ペプチド合成装置を用いて実施できる。そのような装置によって、直接合成、または他の公知の技術により結合させることができる一連のフラグメントの合成により本発明のペプチドに容易に近づくことができる。
また別の特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドはグリコシル化される。グリコシル化は、化学的にまたは細胞の生合成メカニズムにより翻訳後に付加されるか（この場合は公知のグリコシル化モチーフ（当該配列にとって天然であり得る）の使用を含む）、またはペプチドとして付加されるか、または配列をコードする核酸に付加され得る。グリコシル化は、O-結合でもN-結合でもまたはその組合せでもよい。
また別の特徴では、上記に定義される本発明のペプチドおよびポリペプチドは、部分的または完全な“模倣体”および“ペプチド模倣体”型を含む。ある特徴では、“模倣体”および“ペプチド模倣体”という用語は合成された化学的物質を意味し、前記物質は本発明のポリペプチドと実質的に同じ構造的および／または機能的特徴を有する。模倣体は、完全に合成の非天然アミノ酸アナローグで構成されるか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸アナローグのキメラ分子であってもよい。模倣体はまた、任意の量の天然の保存的アミノ酸置換を、そのような置換が模倣体の構造および／または活性を実質的に変化させないかぎり取り入れることができる。保存的変種である本発明のポリペプチドに関しては、日常的な実験によって、模倣体が本発明の範囲内であるか否か、すなわちその構造および／または機能が実質的に変化していないことが決定されるであろう。したがって、ある特徴では、模倣体組成物は、それがフィターゼ活性を有するならば本発明の範囲内である。
また別の特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記に定義したように配列番号：2に特定の改変を含み、さらにまた活性（例えば酵素活性）を改変し得る（または改変し得ない）保存的置換を含む配列を有する。また別の特徴では、保存的置換は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を同様な特徴をもつ別のアミノ酸によって置換するものである。また別の特徴では、保存的置換は以下の置換である：脂肪族アミノ酸（例えばAla、Val、LeuおよびIle）の別の脂肪族アミノ酸による置換；SerのThrによる置換またはその逆；酸性残基（例えばAspおよびGlu）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばAsnおよびGln）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばLysおよびArg）の別の塩基性残基による交換；および芳香族残基（例えばPhe、Tyr）の別の芳香族残基による置換。
発明のポリペプチド模倣体組成物は任意の組合せの非天然成分を含むことができる。また別の特徴では、本発明の模倣体組成物は以下の3つの構造基の1つまたは全てを含む：a）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）以外の残基結合基；b）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；c）二次構造模倣を誘導する（すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造などを誘導または安定化させる）残基。例えば本発明のポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されるとき模倣体と特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基性マレイミド、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）によって結合され得る。通常のアミド結合（“ペプチド結合”）の代用となることができる結合基には例えば以下が含まれる：ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステル（例えば以下を参照されたい：Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY）。
本発明のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全てまたはいくつかの非天然の残基が含まれることによって模倣体と特徴付けられる。非天然残基は学術文献および特許文献に詳しく記載されている。天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な非天然組成物のいくつかおよび基準は以下で述べる。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば以下によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフチルアラニン；D-またはL-フェニルグリシン；D-またはL-2チエネイルアラニン；D-またはL-１、-2,3-、または4-ピレネイルアラニン；D-またはL-3チエネイルアラニン；D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；およびD-またはL-アルキルアラニン（前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、iso-ブチル、sec-イソチル、iso-ペンチルまたは非酸性アミノ酸で置換できるがまた置換されてなくてもよい）。非天然アミノ酸の芳香環には、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸スレオニンによって置換することにより生成できる。カルボキシル側鎖基（例えばアスパルチルまたはグルタミル）はまた、カルボジイミド（R’-N-C-N-R’）、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソールペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に改変することができる。アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基もまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギン残基およびグルタミン残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジンおよびアルギニンの他に）アミノ酸オルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸または(グアニジノ)アルキル-酢酸（アルキルは上記で定義されたとおり）による置換によって生成することができる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギンまたはグルタミンを置換することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基は、対応するアスパラギン酸またはグルタミン酸残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニン残基を例えば1つまたは2つ以上の通常の試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオンまたはニンヒドリンを含む）と、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体はチロシン残基を例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を例えばアルファ-ハロアセテート（例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）および対応するアミンと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成することによって達成できる。システイン残基模倣体はまた、システイン残基を例えばブロモ-トリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ水銀ベンゾエート；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによって生成することができる。リジン模倣体は、リジン残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることによって（さらにアミノ末端残基を変化させることによって）生成することができる。リジンおよび他のアルファ-アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロ-ベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、およびグキオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成することができる。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-または4-メチルプロリンまたは3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体はヒスチジルを例えばジエチルプロカーボネートまたはパラ-ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；またはC-末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
残基、例えば本発明のポリペプチドのアミノ酸はまた、反対のキラリティーをもつアミノ酸(またはペプチド模倣体残基)によって置換することができる。したがって、L型構造で天然に存在するいずれのアミノ酸（前記化学物質の構造に応じてRまたはSとも呼ぶことができる）も、同じ化学構造型であるが反対のキラリティーのアミノ酸またはペプチド模倣体（D-アミノ酸と称されるが、またR-またはS-型とも称される）で置換することができる。
本発明はまた本発明のポリペプチドを、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング、例えばリン酸化、アセチル化など）または化学的改変技術のどちらかによって改変する方法、および生成された改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のいずれの場所でも生じる得る。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同じ程度または種々の程度でいくつかの部位で存在することができることは理解されよう。さらにまたあるポリペプチドが多くのタイプの改変を含むことも可能である。改変には以下が含まれる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質または脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびタンパク質へのトランスファーRNA仲介アミノ酸付加、例えばアルギニル化。例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12, 1983。
固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチドまたはフラグメントの合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初期より当業界で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計および合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998, 1984）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（これらは全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。前記のような系を利用するときは、ロッドまたはピンを含むプレートはさかさまにされ、対応するウェルまたは液溜めの第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたは液溜めは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に付着または固定させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMocペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントのアッセンブリはアプライドバイオシステムズ社のモデル431A（商標）自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成または一連のフラグメント（前記フラグメントは他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
ある特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記で定義した配列番号：2に対し特定の改変および“実質的に同一”のアミノ酸配列を含む配列を有する。前記実質的に同一のアミノ酸配列とは、すなわち1つまたは2つ以上の保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入によって相違する配列であり、特にそのような置換が分子の活性部位ではない部位で生じる場合で、さらに当該ポリペプチドがその機能的特性を本質的に保持することを条件とする。ある特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記で定義した配列番号：2に対し特定の改変および保存的アミノ酸置換を含む配列を有する。前記保存的置換は、1つのアミノ酸で同じ種類の別のアミノ酸を置換、例えば1つの疎水性アミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）で別のものを置換、1つの極性アミノ酸で別のものを置換（例えばアルギニンでリジンを置換、グルタミン酸でアスパラギン酸を置換、またはグルタミンでアスパラギンを置換）する置換である。ある特徴では、1つまたは2つ以上のアミノ酸を例えば本発明のフィターゼポリペプチドから欠失させて、その生物学的活性を顕著に変化させることなく、あるいは、その生物学的活性を意図的に顕著に変化させて当該ポリペプチドの構造の改変をもたらすことができる。例えば、フィターゼの生物学的活性に必要なあるいは必要でない、アミノ-またはカルボキシル-末端のアミノ酸を除去するか、および／または付加することができる。本発明の改変ポリペプチド配列は、多数の方法によってフィターゼの生物学的活性についてアッセイすることができる。前記方法は、改変ポリペプチド配列をフィターゼ基質と接触させる工程、および改変ポリペプチドがアッセイ中の特異的基質の量を減少させるか、または機能的フィターゼポリペプチドと基質との酵素反応の生物性産物を増加させるかを決定する工程を含む。
本発明の別の特徴は、配列番号：2と約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い配列同一性を有し、さらに上記で考察した（示した）ように具体的に列挙した配列改変の１つを有するポリペプチドを含む。
本発明のこれらアミノ酸配列変種は予め定めた多様性の性質を特徴とすることができる。この性質は、天然に存在する形態（例えばフィターゼ配列の対立遺伝子変種または種間変種）と本発明の変種を区別する特色である。ある特徴では、本発明の変種は、天然に存在するアナローグと質的に同じ生物学的活性を示す。あるいはまた、改変された特徴を有する変種を選択することができる。ある特徴では、アミノ酸配列の多様性を導入する位置または領域は予め定められるが、変異それ自体は予め定める必要はない。例えば、ある位置の変異の成果を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異導入を実施し、発現されたフィターゼ変種を所望活性の最適な組合せについてスクリーニングできる。既知の配列を有するDNAの予め定めた位置で置換変異を作製するための技術は周知で、本明細書に考察するように、前記は、例えばM13プライマー変異導入およびPCR変異導入である。変異体のスクリーニングは、例えばフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機リン酸への触媒アッセイまたはフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）の加水分解アッセイを用いて実施できる。また別の特徴では、アミノ酸置換はただ1つの残基であってもよい。挿入は約1から20アミノ酸の規模であるが、ただしそれよりも相当に大きな挿入も実施できる。欠失は、約1から約20、30、40、50、60、70残基またはそれより大きい範囲でもよい。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入またはその任意の組合せを用いることができる。一般的には、これらの変更は、分子の変化を最小限にするために数アミノ酸で実施される。しかしながら、より大きな変更もある種の環境では受け入れられ得る。
本発明のポリペプチドは、生化学的濃縮または精製方法による入手できる。潜在的に均質なポリペプチドまたはフラグメントの配列は、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動、および／またはマイクロシークェンシングによって決定できる。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドのフラグメントまたは変種を同定するアッセイである。本発明のポリペプチドを用いて生化学的反応を触媒し、前記フラグメントまたは変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持していることを示すことができる。
変種のフラグメントが本発明のポリペプチドの酵素活性を保持しているか否かを決定する例示的アッセイは以下の工程を含む：ポリペプチドフラグメントまたは変種を、前記ポリペプチドフラグメントまたは変種が機能できる条件下で基質分子と接触させる工程、および基質レベルの低下またはポリペプチドと基質との間の反応の特異的な反応生成物レベルの増加のどちらかを検出する工程。
本発明のポリペプチドを用いて生化学的反応を触媒することができる。本発明のある特徴にしたがえば、本発明のポリペプチドをフィターゼとして利用するプロセスが提供される。
本発明は、シグナル配列（いわゆるシグナルペプチド（SP）またはリーダーペプチド）をもたないか、または改変もしくは異種シグナル配列をもつフィターゼを提供する。本発明のポリペプチドはまた、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）をもたないか、または改変もしくは異種プレプロドメインおよび／または触媒ドメインを有する。
本発明のポリペプチドに取り込まれた改変または異種SP、プレプロドメインおよび／またはCDは、融合タンパク質の部分、例えばキメラタンパク質の異種ドメインとして存在してもよく、または化学的結合剤によって付加されてもよい。例えば、本発明の酵素は、ベクター（例えばpPICシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA））中で異種SPおよび／またはプレプロを含むことができる。
さらにまた、本発明のポリペプチドはさらに異種配列を含むことができ、前記異種配列は、他のフィターゼ由来配列または非フィターゼ由来または完全に合成配列である。したがってある特徴では、本発明の核酸は、内因性、改変または異種であるシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）および異種配列（すなわち、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）に天然には付随しない配列）をコードする配列を含む。異種配列は、SP、プレプロドメインおよび／またはCDコード配列の3’末端、5’末端および／または両末端に存在することができる。
“プレプロ”ドメイン配列およびシグナル配列を同定する方法は当分野で周知であり、例えば以下を参照されたい：Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136。例えばプレプロ配列を同定するために、細胞外間隙からタンパク質を精製し、N-末端タンパク質配列を決定し、未加工型と比較する。多様なシグナル配列認識方法が当業者には公知である。例えば、ある特徴では、本発明のポリペプチドとともに使用されるシグナル配列は、SignalPと称される方法によって同定される。SignalPは、シグナルペプチドおよびそれらの切断部位の両方を認識する合体ニューラルネットワークを利用する。例えば以下を参照されたい：Nielsen (1997) "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites" Protein Engineering 10:1-6。
本発明は、ポリペプチド骨格の構造、二次または三次構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）が改変されたフィターゼ酵素を提供する。ある特徴では、荷電または疎水性が改変されている。ある特徴では、側鎖の嵩が改変されている。保存性が少ない置換を選択することによって、機能または免疫学的同一性における実質的な変化が生じる。例えば、変異領域内のポリペプチド骨格の構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）；当該分子の荷電または疎水性部位（前記は活性部位であり得る）；または側鎖に対しより顕著な影響を及ぼす置換を実施することができる。本発明は以下のように本発明のポリペプチドに置換を提供する：（a）親水性残基（例えばセリンまたはスレオニン）が疎水性残基（例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニン）によって置換される；（b）システインまたはプロリンが任意の他の残基によって置換される；（c）電気的に陽性の側鎖をもつ残基（例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン）が電気的に陰性の残基（例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）によって置換される；または（d）嵩張る側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が側鎖をもたない残基（例えばグリシン）によって置換される。変種は質的に同じ生物学的活性（すなわちフィターゼ酵素活性）を示すことができるが、ただし変種は要請にしたがってフィターゼの特徴を改変するように選択できる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、エピトープもしくは精製タグ、シグナル配列または他の融合配列などを含む。ある特徴では、本発明のフィターゼは任意抽出ペプチドと融合させて融合ポリペプチドを形成することができる。本明細書の“融合”または“機能的に連結”とは、任意抽出ペプチドおよびフィターゼが、フィターゼ活性の安定性の破壊を最小限にする態様で一緒に連結されることを意味する。融合ポリペプチド（または融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、さらに別の成分（多数のループの多数のペプチドを含む）を同様に含むことができる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、キメラポリペプチド（例えば異種SP、炭水化物結合モジュール、フィターゼ酵素触媒ドメイン、リンカーおよび／または非フィターゼ触媒ドメインを含む）である。本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えばハイブリッドフィターゼ酵素）をコードすることができるキメラポリペプチドを生成する手段を提供する。ある特徴では、原型ポリヌクレオチドは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。本発明の方法は、細胞性プロセスを利用することによって新規なハイブリッドポリペプチドを生成する。前記プロセスは、生成されるハイブリッドポリヌクレオチドが生物学的に活性な原型ポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードできるように、原型ポリヌクレオチドの配列を組み込む。例えば、原型ポリヌクレオチドは種々の微生物に由来する特定の酵素をコードすることができる。ある生物または変種に由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、例えば特定の環境条件下で（例えば高塩濃度で）効率的に機能できる。異なる生物または変種に由来する第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、異なる環境条件下で（例えば超高温下で）効率的に機能することができる。第一および第二の原型ポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、原型ポリヌクレオチドによってコードされる両方の酵素の特徴を示す酵素をコードすることができる。したがって、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素の各々によって共有される条件下で（例えば高塩濃度および超高温下で）効率的に機能することができる。
したがって、本発明のこの方法から生成されるハイブリッドポリペプチドは、原型酵素では提示されない特殊な酵素活性を示すことができる。例えば、フィターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの組換えおよび／または還元的再組合せに続いて、生成されたハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを、特殊化された酵素活性（例えばヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、ホスホリラーゼなど）（原型酵素の各々から得られる活性）についてスクリーニングすることができる。したがって、ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、ハイブリッドポリペプチドを原型親ポリペプチドと区別する化学的機能性（例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHまたは塩濃度）を確認することができる。
本発明の方法から生成されたハイブリッドポリペプチドは、原型酵素では提示されない特殊化された酵素活性を示すことができる。例えば、ヒドロラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドの組換えおよび／または還元的再組合せに続いて、生成されたハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを、原型酵素の各々から得られる特殊化されたヒドロラーゼ活性（すなわち、当該ヒドロラーゼが働く結合のタイプおよび当該ヒドロラーゼが機能する温度）についてスクリーニングすることができる。したがって例えばフィターゼをスクリーニングして、ハイブリッドポリペプチドを原型ポリペプチドと区別する化学的機能性、例えばハイブリッドポリペプチドが機能する（a）アミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；（b）エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；（c）アセタール、すなわちグリコシダーゼ、および例えば温度、pHまたは塩濃度を確認することができる。
ある特徴では、本発明は、以下の工程によって、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを生成し、そのようなポリペプチドを強化された活性についてスクリーニングする方法に関する：
（1）機能できるように連結された少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび機能できるように連結された第二のポリヌクレオチド（前記少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドは部分的な配列同一性を有する少なくとも1つの領域を共有する）を適切な宿主細胞に導入する工程；
（2）機能できるように連結されたハイブリッドポリペプチドを生じる配列再編成を促進する条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程；
（3）前記ハイブリッドポリペプチドによってコードされるハイブリッドを発現させる工程；
（4）生物学的活性の強化の同定を促進する条件下で前記ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする工程；および
（5）前記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する工程。
多様な酵素活性についてスクリーニングする方法は当業者に公知であり、本明細書を通して考察されている。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離するときにそのような方法を用いることができる。
ある特徴では、本発明は、熱による酵素活性の不活化に対して強化された耐性を示し、さらに長期の保存期間中にそのフィターゼ活性を維持する、フィターゼ活性を有する安定化水性液体処方物の製造方法（およびその製造物）を提供する。前記液体処方物は、安定化剤として尿素および／またはポリオール（例えばソルビトールおよびグリセロール）を添加する手段によって安定化される。さらにまた提供されるものは、そのような安定化水性液体処方物の使用により達成される、単胃動物用の飼料調製物およびその製造方法である。このアプローチに関する更なる詳細は刊行文献にあり、当業者にも知られている。特に非限定的な具体例として、そのような一般的に入手できる文献には以下が含まれるEP0626010（WO9316175A1）（Barendse et al.）。ただし前記公開文献は本出願の刷新的分子に関して教示していない。
抗体および抗体依存スクリーニング方法
本発明は、本発明のフィターゼと特異的に結合する単離、合成または組換え抗体を提供する。これら抗体を用いて、本発明のフィターゼまたは関連ポリペプチドを単離、同定または定量することができる。これらの抗体を用いて、本発明の酵素の活性を阻害することができる。これらの抗体を用いて、本発明のポリペプチドと関連するポリペプチド、例えば関連フィターゼ酵素を単離できる。
本発明の抗体は、抗原またはエピトープと特異的に結合する、1つのまたは複数の免疫グロブリン遺伝子から誘導される、前記遺伝子にならって作製される、または前記遺伝子によって実質的にコードされるペプチドもしくはポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことができる。例えば以下を参照されたい：Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)；Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273；Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。抗体という用語は、抗原結合能力を保持する抗原結合部分、すなわち“抗原結合部位”（例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、前記には以下が含まれる：（i）Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインから成る1価フラグメント；（ii）F(ab’)2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメント；（iii）VHおよびCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の単腕のVLおよびVHから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、前記はVHドメインから成る；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）。一本鎖抗体もまた“抗体”という用語に含まれる。
抗体は、免疫沈澱、染色（例えばFACS）または免疫親和性カラムなどで利用することができる。所望の場合は、免疫に続いてポリペプチドまたは核酸を単離し、増幅またはクローニングおよび本発明のアレイへのポリペプチドの固定によって、特異的抗原をコードする核酸配列を生成することができる。あるいはまた、本発明の方法を用いて、改変されるべき細胞によって生成される抗体の構造を改変することができる。例えば、抗体の親和性を増加または低下させることができる。さらにまた、抗体を生成または改変する能力は、本発明の方法によって細胞を操作した表現型であってもよい。
免疫方法、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）の生成および単離方法は当業者に公知であり、学術文献および特許文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Coligan, CURRENT PROTocOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991)；Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”)；Goding, MONocLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986)；Kohler (1975) Nature 256:495；Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York。抗体はまた、動物を用いる伝統的なin vivo方法に加えて、例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを用いてin vitroで生成することができる。例えば以下を参照されたい：Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70；Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45。
本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成できる。生成された抗体を免疫親和性クロマトグラフィー工程で用いて、ポリペプチドを単離または精製するか、またはポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定できる。そのような工程では、タンパク質調製物（例えば抽出物）または生物学的サンプルを本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合できる抗体と接触させる。
免疫親和性工程では、抗体を固相（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に結合させる。タンパク質調製物を当該抗体が本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合する条件下で接触させる。非特異的に結合したタンパク質の除去のために洗浄した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
生物学的サンプル中のタンパク質の当該抗体と結合する能力を、当業者に周知の多様な方法のいずれかを用いて決定することができる。例えば、結合は、検出可能な標識（例えば蛍光薬剤、酵素標識または放射性同位元素）で抗体を標識することにより決定できる。あるいは、抗体とサンプルとの結合は、そのような検出可能な標識を有する二次抗体を用いて検出してもよい、具体的なアッセイには、ELISAアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射能免疫アッセイおよびウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチドに対して生成されるポリクローナル抗体は、前記ポリペプチドの動物への直接注射またはポリペプチドを動物（例えば非ヒト）に投与することによって入手できる。そのようにして入手した抗体は前記ポリペプチド自体と結合するであろう。この態様では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえ、完全な天然のポリペプチドと結合できる抗体の生成に用いることができる。続いてそのような抗体を用いて、当該ポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製のためには、持続的細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。これらの例には、ハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば以下を参照されたい：Cole (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）。
単鎖抗体の生成について記載された技術（例えば米国特許4,946,778号を参照されたい）は、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体の生成に応用できる。あるいは、トランスジェニックマウスを用いて、これらのポリペプチドまたはそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
他の生物およびサンプル由来の類似ポリペプチドのスクリーニングに、本発明のポリペプチドに対して生成された抗体を用いることができる。そのような技術では、当該生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、前記抗体と特異的に結合するポリペプチドを検出する。上記に記載した任意の方法を用いて抗体の結合を検出できる。
キット
本発明は、組成物（例えば、本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド（例えばフィターゼ）および／または抗体）を含むキットを提供する。このキットはまた、本明細書に記載した、本発明の方法論および工業的使用を教示する指示物を含むことができる。
本発明のポリペプチドはまた、本発明の酵素ポリペプチドまたはフラグメントと特異的に結合する抗体の生成に用いることができる。生成された抗体を免疫親和性クロマトグラフィー工程で用いて、前記ポリペプチドを単離または精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。そのような工程では、タンパク質調製物（例えば抽出物）または生物学的サンプルを、配列番号：2のポリペプチド、前記と実質的に同一の配列または前述の配列のフラグメントの1つと特異的に結合できる抗体と接触させる。
免疫親和性工程では、抗体を固相（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に結合させる。抗体が配列番号：2のポリペプチド、前記と実質的に同一の配列またはそのフラグメントの1つと特異的に結合する条件下で、タンパク質調製物を抗体と接触させる。非特異的結合タンパク質の除去のための洗浄後、特異的結合ポリペプチドを溶出させる。
単離したポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、その変種および変異体を、本発明の酵素と比較して生物学的活性の特徴の保持について、例えばフィターゼの酵素的活性を検出するアッセイ（Food Chemicals Codex, 4th Ed.）で測定できる。そのような酵素には、フィターゼの切端型および変種（例えば配列番号：2に示すポリペプチド配列の欠失および挿入変種）が含まれる。これらフィターゼは耐熱性を有する。すなわち、前記フィターゼは70℃で30分処理後に約90%および75℃で30分処理後に約50%の残留比活性を有する。本発明のフィターゼの耐熱性は飼料添加物として前記酵素を使用する際に有利である。なぜならば、飼料を高温で固形化、顆粒化またはペレット化できるからである。
例えばある特徴では、本発明は、食用のペレット化酵素デリバリーマトリックスおよび例えば栄養補助物として動物にフィターゼをデリバリーするために前記を使用する方法を提供する。前記酵素デリバリーマトリックスは、水性媒体（例えば動物の消化液）中でフィターゼ酵素（例えば配列番号：2のアミノ酸配列または前記の連続する少なくとも30アミノ酸を有するもの）を容易に放出する。本発明の酵素デリバリーマトリックスは、以下のような成分から選択される顆粒状食用担体から調製される：油の搾りかすの穀粒、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りコムギなど（前記はその中に含まれている組換え酵素を水性媒体中に容易に分散させる）。使用時に、前記食用ペレット化酵素デリバリーマトリックスを動物に投与し、動物にフィターゼをデリバリーする。適切な穀粒系基質は、任意の適切な穀粒、例えばコムギ、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、アルファルファ、オオムギなどを含むか、または前記に由来する。例示的な穀粒系基質はトウモロコシ系基質である。前記基質は穀粒の任意の適切な部分、例えば穀物胚芽（動物飼料の使用が承認されている）、例えばトウモロコシ胚芽（湿式または乾式製粉プロセスで得られる）に由来する。穀物胚芽は使用済み胚芽を含むことができる。使用済み胚芽は、例えば加圧またはヘキサンもしくは他の溶媒による抽出によって油が除去された穀物胚芽である。あるいは、穀物胚芽はエクスペラーで抽出される（すなわち油は加圧によって除去されている）。
本発明の酵素デリバリーマトリックスは、別個の多数の粒子形、ペレットまたは顆粒である。“顆粒”とは、例えばペレット化、押出しまたは同様なコンパクト化によって圧縮またはコンパクト化されてマトリックスから水が除去された粒子を意味する。粒子のそのような圧縮またはコンパクト化はまた粒子の粒子内凝集を促進する。例えば、顆粒はペレットミル中で穀粒系基質をペレット化することによって調製できる。そのようにして調製したペレットは、動物飼料でアジュバントとして使用するために適切な顆粒サイズにすり潰すかまたは粉砕される。マトリックス自体は動物飼料での使用が承認されているので、前記を酵素デリバリーのための動物飼料の希釈材として用いることができる。
酵素デリバリーマトリックスは、約4から約400メッシュ（USS）または約8から約80メッシュ、または約14から約20メッシュの範囲の顆粒サイズを有する顆粒形である。穀物胚芽が溶媒抽出による搾りかすである場合、ペレット化装置内で滑沢剤（例えばトウモロコシ油）の使用が要求され得るが、胚芽がエクスペラー抽出される場合はそのような滑沢剤は不要である。本発明の他の特徴では、マトリックスは、他の圧縮またはコンパクト化プロセス、例えばダイから穀粒系基質の押出しおよび適切な顆粒サイズへの押出し物のすり潰しによって調製される。
酵素デリバリーマトリックスはさらに、マトリックス顆粒の凝集を強化するために凝集剤として多糖類成分を含むことができる。前記凝集剤は追加のヒドロキシル基を提供すると考えられる（ヒドロキシル基はマトリックス顆粒内で穀粒タンパク質間の結合を強化する）。さらにまた、前記追加のヒドロキシル基は、タンパク質とデンプンおよび他のタンパク質との水素結合を強化することによってそのように機能すると考えられる。凝集剤は、酵素デリバリーマトリックスの顆粒の凝集を強化するために適切な任意の量で存在できる。適切な凝集剤には、1つまたは2つ以上のデキストリン、マルトデキストリン、デンプン（例えばトウモロコシデンプン）、小麦粉、セルローシクス、ヘミセルローシクスなどが含まれる。例えば、マトリックス中の穀物胚芽および凝集剤のパーセンテージ（酵素を含まない）は、ひき割りトウモロコシ胚芽78重量%およびトウモロコシデンプン20重量%である。
本発明の酵素放出マトリックスは生物分解性素材から作られるので、マトリックスは例えばカビの発生による腐敗を受けやすい。そのようなカビの発生を予防または抑制するために、マトリックスは、カビ阻害物質例えばプロピオン酸塩を含むことができ、前記は酵素放出マトリックスのカビ発生を抑制するために十分な任意の量で存在することができ、したがって冷蔵庫を必要としない安定な処方物としてデリバリーマトリックスが提供される。
ある特徴では、本発明の酵素デリバリーマトリックスおよび方法に含まれるフィターゼ酵素は、本明細書に記載するように耐熱性フィターゼで、したがって上昇温度および／または水蒸気をペレット化酵素デリバリーマトリックスの調製に利用することがある製造時にフィターゼの不活化に耐性を示す。本発明の酵素デリバリーマトリックスを含む飼料の消化中に、水性消化液は活性酵素を放出するであろう。他のタイプの耐熱性酵素および耐熱性栄養補助物もまた、任意のタイプの水性条件下での放出のためにデリバリーマトリックスに取り入れることができる。
多くの種々の目的のために、本発明の酵素マトリックス粒子にコーティングを適用することができる。前記目的は、例えば動物飼料への風味または栄養補助物の添加、動物飼料補助物および酵素の胃の条件下での放出を遅らせることなどである。あるいは、コーティングは、機能的な目的、例えばマトリックス粒子から酵素をゆっくり放出することまたは酵素放出条件の制御を所望するときはいつでも適用できる。コーティング物質の組成は、それが感受性を示す因子（例えば熱、酸もしくは塩基、酵素または他の化学物質）によって選択的に崩壊するようなものであり得る。あるいは、異なるそのような崩壊因子に感受性を示す2つまたは3つ以上のコーティングを連続的にマトリックス粒子に適用してもよい。
本発明はまた酵素放出マトリックスの製造プロセスを目的とする。本発明にしたがえば、本プロセスは、酵素放出マトリックスとしての使用に適した粒子サイズを有する別々の多数の穀粒系基質粒子の提供を含み、ここで前記粒子は本発明のフィターゼ酵素を含む。本プロセスは、酵素放出マトリックスの粒子をコンパクト化または圧縮して顆粒にする工程を含むことができ、前記工程はペレット化によって達成できる。カビの阻害物質および凝集剤を使用するときは、それらは任意の適切な時期に添加でき、穀粒系基質のペレット化の前に所望の割合で穀粒系基質と混合できる。ペレットミル飼料中の水分含有量は最終製品の水分含有量に対して上記に示した範囲であるか、または約14%から15%、または約10%から20%であり得る。水分はフィードストックに酵素の水性調節物の形で添加し、フィードストックをこの水分含有量にすることができる。ペレットミル中の温度を水蒸気で約82℃にすることができる。ペレットミルは、フィードストックに十分な成果を付与してペレットを提供することができる任意の条件下で稼働させることができる。ペレット形成プロセス自体は、酵素含有組成物から水を除去するために費用効率の高いプロセスである。
ある特徴では、ペレットミルを4.6cm x 5.1cm（1.8インチx 2インチ）のダイで82℃、45.4kg（100ポンド）/分の圧で操作してペレットを提供する。続いてペレットミル破砕装置でペレットを砕き、8メッシュスクリーンは通過するが20メッシュスクリーン上に保持され得る粒子サイズを有する多数の別々の粒子を提供する。
本明細書に記載した耐熱性フィターゼは高い至適温度を有することができ、さらに高い熱抵抗性または耐熱性を有することができる。したがって、本発明のフィターゼは、通常は最適を越えると考えられる温度で酵素反応を進行させることができる。本発明のフィターゼはまた高温に曝露した後で酵素反応を進行させることができる。（耐熱性とは、以前に高温に曝露された後で（当該高温が酵素活性を不活化または低下させることができるとしても）、野生型フィターゼが活性を示す温度で酵素活性を維持する能力である。上記の耐熱性の定義もまた参照されたい）。配列番号：2のフィターゼの特徴と異なる（至適pH、至適温度、熱耐性、溶媒に対する安定性、比活性、基質に対する親和性、分泌能力、翻訳速度、転写制御などに関して）フィターゼの調製で、本発明のフィターゼをコードする遺伝子を用いることができる（例えば本明細書で記載したGSSMおよび／またはTMCA技術を用いて）。さらにまた、本明細書に記載した方法によって調製した変種フィターゼのスクリーニングのために、本発明のポリヌクレオチドを用いて所望の活性（例えば改善または改変された熱安定性または耐熱性）を有するものを決定できる。例えば、米国特許5,830,732号は、フィターゼの耐熱性を決定するスクリーニングアッセイを記載している。
そのようなスクリーニングアッセイのin vitroの例はフィターゼ活性の検出のための以下のアッセイである。フィターゼ活性は、150μLの酵素調製物を600μLの2mMフィチン酸ナトリウム（1mMのCaCl2を補充した100mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5）と37℃で30分インキュベートすることによって測定できる。インキュベーション後、750μLの5%トリクロロ酢酸を添加することにより反応を停止させる。遊離したホスフェートは、1500μLのカラー試薬（5.5%の硫酸中の1.5%モリブデン酸アンモニウムの4体積および2.7%の硫酸第一鉄の1体積；Shimizu, 1992）を添加した後で、ホスフェート標準物に対して分光光度法的に700nmで測定された。酵素活性1単位は、アッセイ条件下で1分間に1ピコモルのPiを遊離させるために必要な酵素量と定義される。比活性は、タンパク質1mg当たりの酵素活性の単位数で表すことができる。本発明の酵素は、フィテートのイノシトールおよび遊離ホスフェートへの加水分解に関する酵素活性を有する。
ある特徴では、本発明はフィテートを加水分解する方法を提供し、前記方法は、フィテートを本明細書に開示する新規なフィターゼ分子（例えば特異的改変を有する配列番号：2のタンパク質）と接触させる工程を含む。したがって、本発明は、フィチン酸複合体からミネラルを遊離させながらフィテートのイノシトールおよび遊離ホスフェートへの加水分解を触媒する方法を提供する。本方法は、フィテート基質を本発明の酵素の分解有効量と接触させる工程を含む。“分解有効”量という用語は、酵素と接触させなかったフィテートと比較したとき、フィテートの少なくとも50%の分解に必要な酵素量を意味する。フィテートの80%が分解され得る。
別の特徴では、本発明は、フィテートのホスホ-モノ-エステル結合を加水分解する方法を提供する。本方法は、有効量の本発明のフィターゼ分子を投与して、イノシトールおよび遊離ホスフェートを生成する工程を含む。ある特徴では、“有効”量は、酵素と接触させなかったフィテートと比較したとき、ホスホ-モノ-エステルの少なくとも50%の加水分解に必要な酵素量を意味する。ある特徴では、前記結合の少なくとも80%が加水分解される。
具体的な特徴では、所望の場合、フィテート分子および／または基質供給源の他の分子における化学的変化（例えば加水分解）を達成するために、本フィターゼ分子は他の試薬（例えば他の触媒）と一緒に用いることができる。この特徴にしたがえば、フィターゼ分子および追加される試薬は互いを阻害しないであろう。フィターゼ分子および追加される試薬は全体として累積的効果を有することができるか、あるいはフィターゼ分子および追加される試薬は全体として相乗的効果を有することができる。
基質フィテート分子の対応する供給源には、食品、潜在的食品、食品の副産物（in vitro副産物およびin vivo副産物の両方、例えばex vivo反応生成物および動物の糞便生成物）、食品の前駆物質、およびフィテートの他の任意の物質原が含まれる。
非限定的な特徴では、組換えフィターゼは微生物によって消費され、消費時に活性を保持することができる。別の具体例では、トランスジェニックなアプローチを利用して、組換えフィターゼの発現を、例えば制御的態様で達成できる。（時期特異的および組織特異的態様でトランスジェニック分子の発現の制御のための方法が利用可能である）。
ある特徴では、原材料（例えばトランスジェニック植物原または組換え原核細胞宿主）中のフィターゼ活性を消費時に増加させることができる。この活性の増加は、例えばプロフォームの前駆フィターゼ分子からより成熟した形態の顕著に活性が高い酵素への変換時に生じ得る。この場合、前記変換は例えばフィターゼ供給原の摂取および消化からもたらされ得る。フィテート基質の加水分解は、フィターゼとフィテートの接触に際して任意の時期に発生し得る。例えばこれは、基質または酵素のどちらか一方のまたはその両方の摂取の前または摂取の後で、または摂取の前後の両時点で発生し得る。さらにまた、フィターゼ基質は（フィターゼの他に）、1つまたは2つ以上の追加の試薬（例えば別の酵素）と接触させることができることは理解されよう（前記追加の試薬はまた直接適用するか、またはその原材料から精製した後で適用できる）。
フィターゼ原材料は、例えば、フィターゼ供給原およびフィテート供給源のどちらか一方または両方をin vitroまたはin vivoですり潰すかまたは噛み砕くときに、フィテート原材料に直接接触させ得ることは理解されよう。あるいは、フィターゼ酵素をフィテート基質と接触させる前に、フィターゼ酵素を原材料から精製するか、またはフィテート基質を原材料から精製するか、またはフィターゼ酵素およびフィテート基質の両方を原材料から精製してもよい。精製試薬および未精製試薬を組み合せて（酵素または基質またはその両方を含む）使用できることは理解されよう。
2つ以上の原材料をフィターゼ活性の供給源として使用できることは理解されよう。前記は、原材料から時間を決めて試薬の放出を達成する1つの方法として有用である。この場合、種々の試薬の原材料からの放出は、例えば摂取された原材料がin vivoで消化されるとき、または原材料がin vitro適用時に処理されるときに弁別的に生じる。フィターゼ活性を有する2つ以上の原材料の使用もまた、例えば種々の適用処理工程中のある範囲の条件および遭遇の可能性があるその変動下において（例えばある範囲のpH値、温度、塩濃度、および時間間隔）、フィターゼ活性を得るために有用である。1つまたは2つ以上の形態またはアイソマーのフィターゼおよび／またはフィテートおよび／または他の物質が例示として挙げられる種々の試薬を得るために、種々の原材料を使用することもまた有用である。
ただ1つの原材料、例えばトランスジェニック植物片（またはその植物部分）はフィターゼおよびフィテートの両方の原材料であり、さらに、酵素および基質は前記ただ1つの原材料内で弁別的に区画化され（例えば分泌されるかまたは分泌されない）、弁別的に発現され、および／または種々の植物部分または器官または組織で、あるいは同じ植物部分または器官または組織内の細胞内区画で種々の濃度を有し得ることは理解されよう。それらの中に含まれるフィターゼ分子の精製は、1つまたは2つ以上の所望の植物部分または器官または組織または細胞内区画を単離および／またはさらに加工する工程を含む。
ある特徴では、本発明は、酵素量が増強された種子を用いてin vivoおよび／またはin vitro反応を触媒する方法を提供する。本方法は、トランスジェニック非野生型種子を例えばすり潰した形態で反応混合物に添加し、種子中の酵素が反応速度を高めることを可能にする工程を含む。反応混合物に種子を直接添加することによって、本方法は、高価で煩雑な酵素の抽出および精製に対する解決を提供する。十分な酵素の提供を欠く生物に、酵素量が増強された1つまたは2つ以上の植物種（例えばトランスジェニック植物種）由来の種子の形で酵素を投与する、処理方法もまた提供される。本アプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である。特に非限定的な例として、例えば公開文献には以下が含まれる：米国特許5,543,576号 (Van Ooijen et al.) および米国特許5,714,474号 (Van Ooijen et al.)（ただしこれらの参考文献は本出願のこの分子について教示していないが、その代わりに菌類フィターゼの使用を教示している）。
ある特徴では、本フィターゼ分子は、組換え消化系の生活型（または細菌もしくは植物群）の作製および前記組換え消化系の生活型の動物への投与に有用である。投与は、場合によって、単独でまたは他の酵素および／または他の生活型（消化系として酵素活性を提供できる）と一緒に実施できる。この場合、前記他の酵素および前記生活型は組換え型または他のものであり得る。例えば、投与はキシラン分解細菌と一緒に実施してもよい。
ある特徴では、本発明は、トウモロコシまたはソルガムに存在するフィチンを実質的に分解できる量で1つまたは2つ以上のフィチン分解酵素を含む酵素調製物の存在下で、二酸化硫黄を含む温水中でトウモロコシまたはソルガム穀粒を浸漬する方法を提供する。前記酵素調製物は、フィターゼおよび／または酸性ホスファターゼおよび場合によって他の植物素材分解酵素を含むことができる。浸漬時間は12から18時間であり得る。浸漬は中間製粉工程によって中断され、浸漬時間を短縮できる。ある特徴では、トウモロコシまたはソルガム穀粒は、1つまたは2つ以上のフィチン分解酵素、例えばフィターゼおよび酸性ホスファターゼを含む酵素調製物の存在下で二酸化硫黄を含む温水中で浸漬され、フィチン酸およびフィチン酸の塩を除去または大きく減少させる。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあり、当業者にも公知である（例えば、米国特許4,914,029（Caransa et al.）およびEP 0321004（Vaara et al.））。
ある特徴では、本発明は、フィターゼ分子をパン用ドー（生地）に添加する工程を含む、所望の物理的特性（例えばべたべたせず弾力性がある）を有するパン用ドーおよび優れた品質（例えば比体積）をもつパン製品を得る方法を提供する。ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、その後で成形し天火焼きされる製造中のパン用ドー調製物に添加される。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP03076529（Hara et al.））。
ある特徴では、本発明は改善されたダイズ食品を製造する方法を提供する。ダイズを本発明のフィターゼ分子と混合してダイズからフィチン酸を除去し、それによって消費生物にとって必須の微量栄養物の供給およびタンパク質の消化性が改善されたダイズ食品を提供する。ある特徴では、フィチン酸含有量を減少させるために、ダイズ乳の製造時に本発明のフィターゼ分子をダイズに添加するか、ダイズと接触させる。非限定的な具体例では、適用プロセスは、加熱下でダイズ乳を酵素と一緒に攪拌するか、または固定化酵素を用いて攪拌容器内で混合型反応を実施することによって促進することができる。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP59166049（Kamikubo et al.））。
ある特徴では、本発明は、飲料水用混合製品または液体形の動物飼料を製造する方法を提供し、前記方法は、ミネラル混合物およびビタミン混合物並びにまた本発明の新規なフィターゼ分子を使用する工程を含む。ある特徴では、重要なミネラル／ビタミンの沈殿および破壊のリスクをいっさい伴わずに消費生物にとって必要な栄養物の同時添加および構成が達成され、一方で同時に飼料中のフィチン結合ホスフェートの最適利用が達成される。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばEP0772978（Bendixen et al.））。
本発明のフィターゼ分子はまた、菌および／または穀粒および／または他の植物による他のアルコールおよび非アルコール飲用食品の製造に用いることができることは理解されよう。これらの飲用食品には、酒、ワイン、混合アルコール飲料（例えばワインクーラー、他のアルコール性コーヒー（例えばアイリッシュコーヒー）など）、ビール、擬似ビール、ジュース、抽出物、ホモジネートおよびピューレが含まれる。ある特徴では、本明細書に開示するフィターゼ分子を用いて、そのような飲用食品の製造に有用な菌および／または穀粒および／または他の植物のトランスジェニック型を作製する。別の特徴では、そのような飲用食品の製造プロセスでおよび最終含有物として、本明細書に開示するフィターゼ分子が追加の成分として用いられる。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である。
ある特徴では、本発明は、フィチンの量が減少しイノシトールの含有量が増加した清酒を得る方法を提供する。そのような酒は、直接的または心理的作用により、肝疾患および他の疾患における予防的作用を示すことができる。ある特徴では、酒は原料として高いフィターゼ活性を有する米麹菌を増殖させることによって米麹から製造される。本発明のフィターゼ分子を用いて活性が強化された有用な菌（例えばトランスジェニックな菌）を作製するか、または本発明のフィターゼ分子を麹菌の作用を増強させるために外因的に添加することができる。前記株を蒸した米に添加し、通常的な方法によって麹を製造する。ある具体例では、調製麹を用い、完全米を二段階で調製し、さらに15℃の定常的酒造温度で酒を製造して、フィチンの量が減少しイノシトールの含有量が増加した目的の清酒を得る。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP06153896（Saga et al.）およびJP06070749（Soga et al.））。
ある特徴では、本発明は、胃液または腸液によって消化されずに、摂取カルシウムを含むミネラルの吸収を促進することができる吸収促進剤を低コストで得る方法を提供する。ある特徴では、前記ミネラル吸収促進剤は活性成分としてフィチン酸の部分的加水分解物を含む。フィチン酸の部分的加水分解物は、フィチン酸またはその塩を本発明の新規なフィターゼ分子を用いて加水分解することによって製造できる。フィターゼ分子による処理は、単独でまたは併用処理で発生し（最終的作用を阻害または増強し）、続いてある範囲内の加水分解を阻害して一部のリン酸ラジカルを遊離させない。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP04270296（Hoshino））。
ある特徴では、本発明は、累積的または相乗的フィターゼ活性を有する酵素組成物を製造する方法（およびそれによる生成物）を提供する。前記組成物は、本発明の新規なフィターゼ分子および併用処理に有用な組成物を完成させる1つまたは2つ以上の追加の試薬を含む。ある特徴では、本発明の併用処理は、種々の位置特異性（すなわち1-、2-、3-、4-、5-および6-フィターゼ）を有する少なくとも2つのフィターゼを含む。種々の位置特異性をもつフィターゼを組み合わせることによって、累積的または相乗的作用が得られる。そのような組合せフィターゼを含む食品および飼料または食品および飼料添加物のような組成物もまた、それらの調製プロセスと同様に本発明に包含される。このアプローチに関する更なる詳細は公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばWO30681（Ohmann et al.））。
ある特徴では、本発明の併用処理は、pH2.5でフィテート加水分解活性を有する酸性ホスファターゼを、約0.1：1.0から10：1、または約0.5：1.0から5：1、または約0.8：1.0から3：1、または約0.8：1.0から2：1のpH2.5：5.0の活性プロフィルに一致する低い割合で用いることによって達成される。本酵素組成物は、熱処理を通じてフィテート加水分解でより高い相乗作用を示すことができる。本酵素組成物は、食品（飲用並びに固形食品、飼料および飼い葉製品）を処理してフィテート加水分解を改善するために有用である。このアプローチに関する更なる詳細または変更プロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えば米国特許5,554,399号（Vanderbeke et al.）および米国特許5,443,979号（Vanderbeke et al.）；前記は菌類（特にアスペルギルス）のフィターゼの使用を教示する）。
別の特徴では、本発明は、本発明の新規なフィテート作用性酵素を多糖類に作用する1つまたは2つ以上の追加の酵素と一緒に含む組成物を製造する方法（およびそれによる生成物）を提供する。そのような多糖類は以下から成る群から選択できる：アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコジュダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコゲン、アミロペクチン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、パスツラン、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、および少なくとも1つのアルドース、ケトースを含む多糖類、以下から成る群から選択される酸またはアミン：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、ガルロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガロース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸。
ある特徴では、本発明は、相乗的フィテート加水分解活性を有する組成物を製造する方法（およびそれによる生成物）を提供する。前記組成物は、本発明の1つまたは2つ以上の新規なフィターゼ分子、セルラーゼ（キシラナーゼもまた含むことができる）、場合によってプロテアーゼ、および場合によって1つまたは2つ以上の追加の試薬を含む。また別の特徴では、そのような組合せ処理は、食品、木材製品（例えば紙製品）の処理で、並びに洗浄溶液および固形物として有用である。
ある特徴では、本発明のフィターゼはセルロース成分との併用で有用である。多くのセルロース分解細菌のセルラーゼは組織化されて、セルロソームと称される別個の多酵素複合体を形成する。この多重セルロソームサブユニットは多数の機能的ドメインを含み、それらは相互におよびセルロース系基質と相互作用する。これらのサブユニットの1つは、別個の新しい種類の非触媒性骨格ポリペプチドを含み、前記は多様なセルラーゼおよびキシラナーゼサブユニットを選択的に統合して凝集複合体を形成する。セルロースハイブリッドおよびセルロソームドメインのキメラ構築物の知的応用は、セルロース系バイオマスのよりよい使用を可能にし、さらに研究、医薬および工業分野で広範囲な新しい応用を提供できる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは（単独であれ併用処理であれ）、紙パルプ工業において伝統的に使用される環境に有害な化学物質の使用の削減が所望されるバイオパルプ製造およびバイオ漂泊分野で有用である。汚水処理はまた別の膨大な応用分野を提示する（本分野では、生物学的酵素が、脱色だけでなく潜在的に有害な物質の有用なバイオプロダクトへの生物変換においても有効であることが示されている）。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、生物の消化系の処理で（単独であれ併用処理であれ）少なくとも1つの酵素活性を提供できる生活型の生成に有用である。特に関連する処理されるべき生物には非反芻動物が含まれる（ただし反芻動物もまたそのような処理で利益を受けることができる）。特に、このアプローチは、単独でまたは他の生物学的分子（例えばキシラナーゼ）と併用して実施し、多数の生物学的分子を発現する組換え宿主を生成できることは理解されよう。さらにまた、本発明のフィターゼ分子および／または本発明のフィターゼ分子を発現する組換え宿主の投与は、単独でまたは他の生物学的分子、および／または消化系で酵素活性を提供できる生活型と併用して実施できることも理解されよう（この場合、前記他の酵素および前記生活型は組換え型であってもそうでなくてもよい）。例えば、投与はキシラン分解細菌と併用して実施できる。
例えば、多くの生物がフィテート以外のヘミセルロースも適切に消化できない。ヘミセルロースまたはキシランは植物素材の主要な成分（35%）である。反芻動物については食物性キシランの約50%が分解されるが、非反芻動物およびヒトの下部消化管では極めて少量のキシランしか消化されない。第一胃では、主要なキシラン分解種は、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）およびバクテロイデス・ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）である。ヒトの結腸では、バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）およびバクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）亜種“a”は主要なキシラン分解細菌である。キシランは化学的に複雑であり、それらの分解には多数の酵素が必要である。腸管細菌によるこれらの酵素の発現は種間で大いに変動する。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスは細胞外でキシラナーゼを生成するが、バクテロイデス種は細胞結合性キシラナーゼ活性を有する。腸管細菌由来のキシラン分解酵素の生化学的特徴の決定はまだ完全には実施されていない。キシロシダーゼ遺伝子がB.フィブリソルベンスからクローニングされた。B.フィブリソルベンスからクローニングしたキシラナーゼ遺伝子を用いたDNAハイブリダイゼーションのデータによって、この遺伝子は他のB.フィブリソルベンスに存在し得ることが示された。バクテロイデス・ルミニコラからクローニングしたキシラナーゼをバクテロイデス・フラギリスおよびバクテロイデス・ユニフォルミス（B. uniformis）にトランスフェクトし、高発現させた。バクテロイデス・オバツスのアラビノシダーゼおよびキシロシダーゼ遺伝子がクローニングされた。両活性は新規な二機能性単一酵素によって触媒されるようである。
ある特徴では、本発明のフィターゼは以下について有用である：1）適切な宿主（例えばバクテロイデス・フラギリスまたはバクテロイデス・ユニフォルミス）への伝達；2）生成組換え宿主での適切な発現の達成；および前記組換え宿主の生物への投与による処理生物のフィテート分解能の改善。遺伝学および生化学分野における持続的研究によって、消化管レベルにおける消化の操作に関する知識および洞察並びに結腸における線維消化の更なる理解が提供されるであろう。
本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である。例えば、本発明は以下に記載の方法を取り入れることができる：米国特許5,624,678号（Bedford et al.）、米国特許5,683,911号（Bodie et al.）、米国特許5,720,971号（Beauchemin et al.）、米国特許5,759,840号（Sung et al.）、米国特許5,770,012号（Cooper）、米国特許5,786,316号（Baeck et al.）、米国特許5,817,500号（Hansen et al.）。
本発明は、フィターゼ活性が追加された調製物を得るために本発明のフィターゼ分子を開示の試薬に添加できることを教示する。ある特徴では、試薬および追加されたフィターゼは互いに阻害し合わないであろう。ある特徴では、試薬および追加されたフィターゼ分子は全体的な累積作用を有することができる。ある特徴では、試薬および追加されたフィターゼ分子は全体的な相乗作用を有することができる。
ある特徴では、本発明は、ヒドロキシル化ビタミンD3誘導体を含む飼料組成物を動物に投与することによる、フィテートのリンの利用の強化並びに動物（特に家禽）の脛骨における軟骨形成不全の治療および予防のための方法（およびそれによる生成物）を提供する。ビタミンD3誘導体は、フィテートのリンの利用を強化するために、カルシウムおよびリンレベルを低下させた飼料で動物に投与することができる。したがって、ビタミンD3誘導体は、フィテートのリンの利用をさらに強化するために、本発明の新規なフィターゼ分子と一緒に投与することができる。本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えば、米国特許5,516,525号（Edwards et al.）、米国特許5,366,736号（Edwards et al.）、米国特許5,316,770号（Edwards et al.））。
ある特徴では、本発明は、以下のフィチンを含む食品を得る方法（およびそれによる生成物）を提供する：1）動物の体内で容易に吸収され、イノシトールの形で利用されるフィチン；2）糞便中のリンを減少させることができるフィチン；および3）したがって環境汚染の改善に有用なフィチン。前記食品は、フィチン含有穀粒、乳酸生成微生物および本発明の新規なフィターゼ分子の混合物を含む。ある特徴では、前記食品は、フィチン含有穀粒（例えば米ぬか）を有効な微生物群（好酸性特性を有し、乳酸を生成し、酪酸を生成せず、病原性をもたない）およびフィターゼを混ぜ合わせることによって製造される。有効な微生物群の例には例えば以下が含まれる：アクチノミセスの群に属するストレプトミセスsp.（アメリカ菌培養収積所ATCC3004）およびラクトバシルスの群に属するラクトバシルスsp.（Lactobacillus sp.）（IFO3070）。
有効な微生物群の例示的な添加量は穀粒材料に対して菌体重量で0.2wt%である。ある特徴では、フィターゼの添加量は、穀粒材料におけるフィターゼを基準にして1−2wt%である。本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP08205785（Akahori et al.））。
ある特徴では、本発明は、植物タンパク質の溶解性を改善する方法を提供する。より具体的には、本発明は、植物タンパク質供給源中のタンパク質を可溶化する方法に関し、前記方法は、植物タンパク質供給源を1つまたは2つ以上の本発明のフィターゼ酵素の有効量で処理する工程、および植物タンパク質供給源を1つまたは2つ以上のタンパク分解酵素の有効量で処理する工程を含む。別の特徴では、本発明は、本発明のフィターゼおよび1つまたは2つ以上のタンパク分解酵素を含む動物飼料添加物を提供する。本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばEP 0756457（WO 9528850 A1）（Nielsen and Knap））。
ある特徴では、本発明は、植物タンパク質調製物を製造する方法を提供する。本方法は、植物タンパク質供給源材料を2から6の範囲のpHで水に分散させる工程およびその中に本発明のフィターゼ分子を混合する工程を含む。可溶性タンパク質を含む酸性抽出物を分離し乾燥させて、所望の特徴を有する固形タンパク質を得る。1つまたは2つ以上のプロテアーゼもまた、当該タンパク質の特徴の改善に用いることができる。本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えば米国特許3,966,971号）。
ある特徴では、本発明は、3つの試薬、フィターゼ、サポニンおよびキトサンを堆肥に添加することによって、土壌および／または堆肥中の不活性なリンを活性化して窒素化合物の利用率を改善し、さらに病原菌の増殖を抑制する方法（およびそれによる生成物）を提供する。
ある特徴では、本発明は以下の添加によって堆肥を処理する工程を含む：1）培地中にフィターゼ含有微生物（例えば本発明の新規なフィターゼ分子を過剰発現する組換え宿主）を、例えば100mL/100kg含水堆肥で添加する；2）あるいはまた、フィターゼ含有植物供給原（例えばコムギ糠）を例えば0.2から1kg/100kg含水堆肥で添加する；3）サポニン含有供給源（例えばピート、マグワートおよびユッカ植物）を例えば0.5から3.0kg/kgで添加する；4）キトサン含有材料（例えばエビ、カニなどの粉末化した殻）を例えば100から300g/kg含水堆肥で添加する。
ある特徴では、組換え体供給源、3つの試薬、フィターゼ、サポニンおよびキトサンが用いられる。本アプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは公開文献に記載されてあるか、および／または当業者に公知である（例えばJP07277865（Toya Taisuke））。
いくつかの事例では、本発明のフィターゼ配列を局所的に（例えば個々の組織または細胞タイプ内で）デリバーまたは発現することは有利であり得る。例えば、動物の消化管内でのフィターゼまたは消化酵素の局所的発現は、例えばフィテートおよびリンのそれぞれ消化および摂取を促進するであろう。前記核酸配列は、例えば唾液腺、組織および細胞、および／または消化管に並ぶ上皮細胞に直接的にデリバーしてもよい。そのようなデリバリー方法は当分野で公知であり、エレクトロポレーション、ウイルスベクターおよびDNA直接取り込みが含まれる。フィターゼ活性を有する任意のポリペプチド（例えば本サブセクション6.3.18に具体的に記載したものおよび本発明の他のセクションに記載したもの）を本発明の方法で利用することができる。
例えば、本発明の核酸構築物は、宿主組織内の標的細胞への取り込みに適した形態の核酸分子を含むであろう。前記核酸は裸のDNAまたはRNA分子の形態であり得る（この場合、前記分子は1つまたは2つ以上の構造遺伝子、1つまたは2つ以上の調節遺伝子、アンチセンス鎖、三重体を形成できる鎖などを含むことができる）。一般的には、核酸構築物は、適切な調節領域の転写および翻訳制御下で少なくとも1つの構造遺伝子を含むであろう。より通常的には、本発明の核酸構築物は、トランスフェクション効率を改善するためにデリバリーベヒクル内に取り込まれた核酸を含むであろう（この場合、デリバリーベヒクルは、乾燥親水性賦形剤を含むより大きな粒子内に分散されているであろう）。
そのようなデリバリーベヒクルは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスを含む。前記ウイルスは自己複製を防止するために不活化されているが、ただし標的細胞に結合して標的宿主細胞の細胞質に遺伝物質をデリバーし、構造遺伝子または他の遺伝子（粒子内に既に取り込まれている）の発現を促進する天然のウイルスの能力は維持される。遺伝子伝達の仲介に適切なレトロウイルスベクターは以下に記載されている：Kahn et al. (1992) Circ. Res. 71:1508-1517。適切なアデノウイルス遺伝子デリバリーは以下に記載されている：Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434。レトロウイルスおよびアデノウイルスの両デリバリー系は以下に記載されている：Friedman (1989) Science 244:1275-1281。
第二のタイプの核酸デリバリーベヒクルはリポソームトランスフェクション小胞を含み、陰イオンおよび陽イオンリポソーム構築物が含まれる。陰イオンリポソームの使用は、核酸がリポソーム内に捕捉されることを必要とする。陽イオンリポソームは核酸の捕捉を必要とせず、むしろ単純な核酸およびリポソームの混合によって形成することができる。陽イオンリポソームは、陰性荷電の核酸分子（DNAおよびRNAの両方を含む）と強力に結合し複合体を形成する。前記複合体は多くの細胞型で相応なトランスフェクション効率を提供する。以下を参照されたい：Farhood et al. (1992) Biochem. Biophys. Acta. 1111:239-246。リポソーム小胞を形成するための例示的物質はリポフェクチンであり、前記は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびジオレイルオキシプロピル-トリエチルアンモニウム（DOTMA）の等モル混合物を含む。前記は以下に記載されている：Felgner and Ringold (1989) Nature 337:387-388。
さらにまた、これら2つのタイプのデリバリー系を結合させることができる。例えばKahnら（上掲書）は、レトロウイルスベクターを陽イオンDEAE-デキストラン小胞と結合させて形質転換効率をさらに強化できることを教示している。さらにまた、核タンパク質をウイルスおよび／またはリポソームデリバリー小胞に取り込んでトランスフェクション効率をさらに高めることも可能である（以下を参照されたい：Kaneda et al. (1989) Science 243:375-378）。
別の特徴では、唯一の活性成分として1つの酵素を含むか、または1つまたは2つ以上の他の薬剤および／または複数の酵素を一緒に含む消化補助剤が提供される。家畜および家畜化動物の消化補助剤での酵素および他の薬剤の使用は、動物の健康および平均余命を改善するだけでなく、家畜の健康および家畜の食物生産性の増加を助ける。
本発明はまた、家畜にデリバーされる多数のミネラル（例えば無機リン）、酵素、成長因子、医薬および他の薬剤を大量に補充した家畜用飼料（例えばある種の家禽飼料）に用いることができる。これらの補充物は、例えばカロリーおよび穀物中に存在する天然の栄養物を放逐する。無機リンサプリメントおよび他のサプリメント（例えば微量の鉱物塩、成長因子、酵素、抗生物質）を飼料そのものから削減または除去することによって、飼料はより多くの栄養物およびエネルギーを保持することができる。したがって、残りの飼料はより多くの使用可能なエネルギーを含むであろう。例えば、穀粒-オイルシードひき割り飼料はおおむね飼料１kg当たり約3,200kcalの代謝性エネルギーを含み、鉱物塩は代謝性エネルギーを供給しない。不要な鉱物塩の除去および穀物による置き換えは、したがって飼料中の使用可能エネルギーを増加させる。したがって、本発明は一般的に用いられるフィターゼ含有飼料とは区別される。例えば、ある特徴では、生物の胃腸管による消化に耐性を示す生物適合性材料が用いられる。
多くの生物（例えば家禽または鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、カモ、アヒル、オウム、クジャク、ダチョウ、キジ、ウズラ、ハト、エミュ、キーウィ、アビ、オカメインコ、コッカトゥ、カナリア、ペンギン、フラミンゴおよびハトを含む）では、消化管は砂嚢を含む。砂嚢は、堅い生物適合性物質（例えば小石および貝の殻）を保存しこれを利用して、種子または鳥類が消費する他の飼料の消化に役立てる。この一般的な生物ファミリーの典型的な消化管は、そ嚢と称される袋を有する食道を含む。そ嚢で食物は短時間保存される。そ嚢から食物は真の胃（または前胃）に移動し、そこで塩酸およびペプシンが消化プロセスを開始する。次に食物は砂嚢に移動する。砂嚢は卵形で強力な筋肉をもつ厚い壁で囲まれる。砂嚢の主な機能は食物粒子をすり潰しまたは破砕することである（少量の微細な砂利または砂を嚥下する鳥によって助成されるプロセス）。砂嚢から食物は十二指腸に移動する。鳥類の小腸は哺乳動物と類似する。小腸と大腸の結合部に長さが約10.2−15.2cm（約4−6インチ）の2つの盲嚢（または盲腸）が存在する。大腸は短く、ほとんど直腸（長さは約7.6−10.2cm（3−4インチ））から成る。直腸は内容物を総排泄腔に出し、糞便は肛門から排泄される。
砂嚢で消費（あるいは導入）および提示される硬質の生物適合性物質は、多様な酵素性物質、化学物質、治療薬および抗生物質のデリバリーのための有用な仲介物を提供する。これらの硬質の物質は数時間から数日の寿命を有し一定時間後送り出される。したがって、本発明は、有用な消化剤または治療剤のデリバリーのための、被覆した、液体を浸み込ませた（例えば液体を浸み込ませたマトリックスまたは膜）改変食養生補助物を提供する。そのような食養生補助物は、砂嚢内の消化を助けるために、典型的には生物によって摂取された物質（例えば小石または砂）を含む。本発明は、生物の消化補助物として有用な薬剤、または治療剤もしくは医薬または化学物質のデリバリーのための物質をその上に被覆した、またはその中に浸み込ませた生物適合性物質を提供する。
ある特徴では、本発明は、消化を補助する薬剤の放出のために設計された生物適合性組成物を有する食養生補助物を提供する。前記生物適合性組成物は、経口消費および生物の消化管（例えば砂嚢）での放出のために設計される。“生物適合性”とは、宿主生物（例えば鳥）との接触に際して、当該物質が、物質の拒否をもたらすかまたは物質を機能喪失させるに足る有害な応答を引き起こさないことを意味する。そのような機能喪失は、例えば浸み込ませた薬剤の宿主生物への拡散を制限する物質周囲の線維性構造物の形成、または毒性または感染のために当該生物で死亡率又は罹病率の増加をもたらす物質の形成によって発生し得る。生物適合性物質は生物非分解性であっても生物分解性であってもよい。ある特徴では、生物適合性組成物は分解または胃腸管による消化に耐性を示す。別の特徴では、生物適合性組成物は砂利または小石の堅牢性を有する。
本発明で有用な生物非分解性物質は食養生薬剤の結合または注入が可能なものである。非限定的なそのような生物非分解性物質には、例えば熱可塑性物質、例えばアクリル、モダクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンおよびポリビニリデンフッ化物が含まれる。エラストマーもまた有用な物質であり、前記には例えば、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン（例えばシリコーン系またはシリコーン含有シリカ）が含まれる。本発明は複数のそのような物質を含むことができる生物適合性組成物を提供し、前記は例えば、混合されるかまたは重層されて混合物、コポリマーまたはその組合せを形成できる。
ある特徴では、“生物分解性”物質は、組成物がin vivoで腐食または分解してより小さな化学物質種を形成することを意味する。分解は、例えば酵素的、化学的または物理的プロセスによって発生し得る。本発明の使用を意図される適切な生物分解性物質には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリレートなど。そのような物質は、混合されるかまたは重層されて混合物、コポリマーまたはその組合せを形成できる。
ある特徴では、多数の種々の本発明の生物適合性物質が動物に投与され、連続的に接種され、または別の態様で同じ動物に同時にまたは様々な組合せ（例えばある物質に続いて別の物質を投与）で提供され得る。さらにまた、本発明の生物適合性物質は消化管をゆっくりと通過させるために設計できる。例えば、大きいまたは脂肪性の物質は消化管をよりゆっくりと移動する傾向があり、したがって消化管の急速な通過を妨げる大きいサイズの生物適合性物質を用いることができる。そのような大きい物質は生物非分解性および生物分解性物質の組合せであり得る。例えば、小さな生物非分解性物質を本発明の生物分解性物質によって包み、その結果、一定の期間にわたって生物非分解性部分が消化管を通過することを可能にしながら、生物分解性部分が分解していくであろう。さらにまた、任意の数の香料を本発明の生物適合性物質に提供して消費を促進できることは理解されよう。
任意の数の薬剤を単独でまたは他の薬剤と一緒に用いて、本発明の生物適合性物質を被覆できる。前記薬剤には、例えばポリペプチド（例えば酵素、抗体、サイトカインまたは小分子治療薬）および抗生物質が含まれる。有用な個々の薬剤の例は下記の表1および2に列挙されている。細胞を本発明の生物適合性物質で包みこんで、酵素または治療薬をデリバーするために用いることもまた意図される。例えば、多孔性物質であって、細胞が出入りして増殖するために十分大きな孔を有し、これらの多孔性物質が消化管に取り込まれ得るように前記多孔性物質を設計することができる。例えば、本発明の生物適合性物質は、複数の細胞型の支持を提供する複数の微生物叢環境を含むことができる（例えば種々の多孔度、pHなど）。前記細胞は、特定の医薬、酵素または化学物質を生物にデリバーするために遺伝子操作することができる。細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
ある種の薬剤は、一定の条件下で（例えばあるpHで、活性化剤の存在下で）活性になるかまたは不活化状態で設計することができる。さらにまた、本発明の組成物でプロ酵素を用いることは有利であり得る。例えば、プロ酵素はプロテアーゼによって活性化できる（例えば消化管に存在する唾液プロテアーゼ、または前記は人工的に生物の消化管に導入される）。本発明の生物適合性組成物によってデリバーされる薬剤は、生物によって摂取されるか或いはデリバーされ得る活性化剤の添加によって活性化または不活化されることが意図される。消化管中の薬剤を制御するまた別のメカニズムは、適切な消化性区画内で活性化される環境に鋭敏な薬剤である。例えば、ある薬剤は低いpHで不活化されるが、中性pHでは活性である得る。したがって、前記薬剤は胃内では不活性であるが腸管内では活性であろう。或いは、前記薬剤は、微生物特異的因子（例えば腸内に存在する微生物）の存在に応答して活性になることができる。
ある特徴では、本発明の潜在的利益には例えば以下が含まれる：（1）毎日の飼料または穀物からミネラルサプリメント（例えば無機リンサプリメント）、酵素または動物（魚を含む）用治療薬の要求を減少させるかまたは排除することが可能になり、それによって飼料中に存在するカロリーおよび栄養物の量が増す；および（2）家畜および非家畜動物（例えば家禽、ブタ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコ科の動物が含まれる）の健康および成長が増進される。
本発明のフィターゼに加えて、多数の酵素を本発明の方法および組成物で用いることができる。これらの酵素には、消費される食物の適切な消化または適切な代謝、化学物質、プロドラッグもしくは他の薬剤、または消化管を介して当該動物へデリバーされる化合物の活性化または誘導のために必要な酵素が含まれる。デリバーされるかまたは本発明の組成物に取り込むことができる酵素の例には、例えば以下から成る群から選択される飼料強化酵素が含まれる：α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド- 1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼおよびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクテートリアーゼ、およびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、および脂質分解性酵素、例えばリパーゼ、フィターゼおよびクチナーゼ。配列番号：2に示すアミノ酸配列を有するフィターゼ以外のフィターゼも本発明の方法および組成物で用いることができる。
ある特徴では、本発明の組成物（例えば食養生補助物）で用いられる酵素は、熱安定性であり耐熱性であり、フィテートの酵素的加水分解を触媒するフィターゼ酵素である。すなわち前記酵素は、50℃を越える温度に短時間（すなわち5から30秒）またはより長時間（例えば数分または数時間）曝露した後で再生するか活性を再度得ることができる。
“飼料”および“食物”は、それぞれ動物およびヒトによって食され、摂取され、消化されることを意図したまたは前記に適した、任意の天然のまたは人工の飲食物、食餌など、またはそのような食餌の成分を意味する。本明細書で用いられる“食養生補助物”は、例えば、治療剤又は消化剤を動物または生物に提供する薬剤を含む組成物を意味する。“食養生補助物”は、典型的には生物のカロリー摂取源ではなく、換言すれば食養生補助物は典型的には生物のエネルギー源ではなく、典型的な“飼料”または“食物”に加えて摂取される組成物である。
本発明の多様な特徴では、配列番号：2のアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも30の連続するアミノ酸を有する組換えフィターゼを含む飼料組成物およびフィターゼ含有食品が提供される。当業者には理解されるところであるが、そのような組成物は、ポリマー被覆添加物を含む（または含まない）ペレット形、顆粒形および噴霧乾燥を含む（ただしこれらに限定されない）、多数の方法で製造することができる。非限定的に例示すれば、飼料の製造を目的とする分野での教示には以下が含まれる：WO0070034 A1、WO0100042 A1、WO0104279 A1、WO0125411 A1、WO0125412 A1およびEP 1073342A。
任意の酵素を食養生補助物に取り入れることができるが、本明細書ではフィターゼを本発明の方法および組成物の具体例として言及する。本発明の食養生補助物は酵素（例えばフィターゼ）を含む。一般的には、フィターゼ組成物を含む食養生補助物は液状または乾燥している。
液体組成物は、（好ましくは高度に精製された形態の）酵素（例えばフィターゼ）以外の何物も含む必要がない。しかしながら通常は、安定化剤（例えばグリセロール、ソルビトールまたはモノプロピレングリコール）がまた含まれる。液体組成物はまた、他の添加物（例えば塩、糖、保存料、pH調整剤、タンパク質、フィテート（フィターゼ基質））を含む。典型的な液体組成物は水性または油性スラリーである。液体組成物は緩徐な放出のために生物適合性組成物に添加することができる。好ましくは、前記酵素は、生物適合性物質（例えば生物分解性または生物非分解性）であり、さらに例えば多孔性微小ビーズへの組換え細胞の添加を含む食養生補助物に添加される。
乾燥組成物は噴霧乾燥組成物であり得る。本事例では、組成物は乾燥形の酵素以外は何物も含む必要がない。しかしながら通常は、乾燥組成物はいわゆる粒状物であり、前記は容易に食物または飼料と混合され、より好ましくはプレミックスの成分を形成し得る。酵素粒状物の粒子サイズは好ましくは混合物の他の成分のサイズと匹敵する。これによって酵素を動物飼料に取り込む安全で簡便な手段が提供される。本発明の粒状物は生物適合性であり得るが、それらはまた生物非分解性である生物適合性粒状物であり得る。
酵素で被覆した本発明の凝集粒状物は高剪断ミキサーでの凝集技術を用いて調製できる。吸収粒状物は、担体物質のコアに酵素を吸収させるか、酵素によって被覆することによって調製される。ある特徴では、担体物質は、動物の砂嚢中の小石または砂の役割を促進する生物適合生物非分解性である。凝集技術で用いられる典型的な充填物質には塩、例えば硫酸二ナトリウムが含まれる。他の充填物はカオリン、タルク、ケイ酸マグネシウムアルミニウムおよびセルロース繊維である。場合によって、結合剤（例えばデキストリン）もまた凝集粒状物に含まれる。担体物質は任意の生物適合性物質であり得る。前記には生物分解性および生物非分解性物質（例えば石、小石、セラミック、種々のポリマー）が含まれる。ある特徴では、粒状物はコーティング混合物で被覆される。そのような混合物は、コーティング剤（例えば疎水性コーティング剤、例えば水素添加ヤシ油および牛脂）、所望の場合は他の添加物（例えば炭酸カルシウムまたはカオリン）を含む。
ある特徴では、食養生補助組成物（例えばフィターゼ食養生補助組成物）は、他の代用物（例えば着色剤、芳香化合物、安定化剤、ビタミン、ミネラル、他の飼料または食物強化酵素など）を含むことができる。ある特徴では、本発明の組成物に用いられる添加物は、1つまたは2つ以上の化合物（例えばビタミン、ミネラル、または飼料強化酵素および適切な担体および／または賦形剤）を含む。
ある特徴では、本発明の食養生補助組成物は、さらにまた有効量の1つまたは2つ以上の飼料強化酵素、特に以下から成る群から選択される飼料強化酵素を含む：α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、他のフィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド- 1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼおよびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクテートリアーゼ、およびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、および脂質分解性酵素、例えばリパーゼ、フィターゼおよびクチナーゼ。
本発明の動物の食養生補助物は、常用飼料の前にまたは常用飼料と同時に単胃動物に補充される。ある特徴では、本発明の食養生補助物は常用飼料と同時に単胃動物に補充される。別の特徴では、前記食養生補助物は粒状物または安定化液状物の形で常用飼料に添加される。
本発明の食養生補助物中の酵素の有効量は、約10から20,000、約10から15,000、約10から10,000、約100から5,000、または約100から約2,000FYT/kg食養生補助物である。
本発明のフィターゼの他の具体的な使用の非限定的な例は、ダイズの加工およびイノシトールまたはその誘導体の製造である。
本発明はまた、動物の糞便中のフィテートレベルを減少させる方法に関する。本方法では、動物は本発明のフィターゼの有効量を含む食養生補助物を与えられる。本出願の冒頭で述べたように、フィターゼの重要な作用はホスフェートによる環境汚染の軽減である。
別の特徴では、食養生補助物は磁性担体である。例えば、磁性担体（例えば多孔性磁性ビーズ）内に、その上にまたはその中に配分された酵素（例えばフィターゼ）を含む磁性担体を高フィテート領域全体に配分し、一定時間後に磁石によって収集することができる。そのような配分およびビーズの再収集は更なる汚染を減少させ、ビーズの再使用を可能にする。さらにまた、そのような磁性ビーズのin vivo使用は、例えばフィターゼ活性が実際に進行し得る消化管の一点に食養生補助物を局在させることを可能にする。例えば、動物が磁性担体を含む食養生補助物を消費した後で砂嚢に磁石を並置することによって、消化性酵素（例えばフィターゼ）を含む本発明の食養生補助物を動物の砂嚢に局在させることができる。磁石を一定時間後に除去して、食養生補助物の消化管通過を可能にすることができる。さらにまた、磁性担体は、屠殺後に当該動物から除去するためにまたは収集を促進するために適切である。
食養生補助物が多孔性粒子であるときは、典型的には、ゆっくりと放出することが所望される物質をそのような粒子に浸み込ませて徐放粒子が形成される。そのような徐放粒子は、放出させたい物質を多孔性粒子に浸み込ませるだけでなく、第一の分散相に所望の物質をまず初めに溶解させることによってもまた調製できる。この事例では、放出されるべき物質を第一の分散相にまず初めに溶解させる方法によって調製された徐放粒子もまた本発明の範囲内に包含される。多孔性の中空粒子に、例えば徐放物質（例えば医薬、農薬または酵素）を浸み込ませることができる。特に、酵素を浸み込ませた多孔性中空粒子が生物分解性ポリマーで製造されるときは、粒子それ自体は農薬または肥料として用いることができ、それらは環境に対して悪影響を及ぼさない。ある特徴では、多孔性粒子は磁性の性質を有する。
多孔性中空粒子を、バイオリアクターの支持体（特に酵素の支持体）として用いることができる。したがって、例えば酵素を被包化することによって、微細小胞（例えばリポソーム、前記から投与用量が数日、好ましくは約3から20日にわたって放出される）中の薬剤をゆっくりと放出する方法を利用して食養生補助物を調製することは有利である。あるいは、薬剤（例えば酵素）を徐放のために処方することができ、例えば徐放性ポリマーに取り込み、当該ポリマーから投与量の薬剤（例えば酵素）を、数日、例えば2から30日（動物の一生に及ぶことができる）にわたってゆっくりと放出させる。
ある特徴では、本発明のリポソームはリン脂質または他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散させた1重または多重薄層の水和液状結晶によって形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性で生理学的に許容可能な代謝性脂質を用いることができる。リポソーム中の本発明の組成物は、安定化剤、保存料、賦形剤などを当該薬剤の他に含むことができる。いくつかの例示的脂質はリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）（天然および合成）である。リポソームを形成する方法は当分野で公知である。例えば以下を参照されたい：Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33および以下参照。
さらにまた、食物または飼料調製物の製造時に（すなわちフィターゼが製造時にのみフィターゼ活性を示し、最終食品または飼料製品では活性を示さない）、本発明のフィターゼを使用することもまた本発明の範囲内である。本特徴は、例えばドー製造およびベーキングに関係する。したがって、フィターゼまたはフィターゼ発現組換え酵母を磁性担体内に、その上にまたはその中に浸み込ませ、前記をドーまたは食物媒体内に配分し、さらに磁石によって回収できる。
本発明の食養生補助物は、生物適合性（例えば生物分解性または生物非分解性）担体中で動物に単独で、または他の消化付加剤と一緒に投与できる。本発明の食養生補助物は、トップドレッシングとして、または動物飼料にそれらを直接混合することによりもしくは飼料とは別に提供することにより、または別個の経口投与により注射によりもしくは経皮手段により、または成長に関する他の食用化合物と一緒に容易に投与することができ、併用される化合物のそれぞれの割合は、個々の生物または強調される問題、および所望される応答の程度に左右される。いずれの事例でも投与される具体的な１回の食養生量は、投与される具体的な化合物、処置されるべき問題、対象動物の状態、および有効成分の活性を改変できる他の関連する事実または対象動物の応答にしたがって、当業者が周知するように調節できることは理解されよう。一般的には、当業者が周知するように、１日１回の用量または分割した1日分の投薬量を用いることができる。
動物飼料とは別に投与される場合、食養生補助物型は、当業者が周知するように、それらを非毒性の医薬的に許容できる食用担体と結合させ、即時放出または徐放処方物を生成することによって調製できる。そのような食用担体は固体でも液体でもよく、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、ショ糖、ダイズフレーク、ピーナツバター、オリーブオイル、ごま油およびプロピレングリコールである。固形担体が用いられる場合、化合物の投薬形は錠剤、カプセル、散剤、トローチまたはロゼンジまたは微細分散形としてのトップドレッシングであり得る。液状担体が用いられる場合、軟質ゼラチンカプセル、またはシロップもしくは液状懸濁物、エマルジョンまたは溶液が投薬形であり得る。投薬形はまた、補助薬、例えば保存料、安定化剤、湿潤もしくは乳化剤、溶液促進剤などを含むことができる。投薬形はまた他の治療に有用な物質を含むことができる。摂取されたときに酵素を放出させる粒状の食用担体を高温で製造するプロセスは、同時係属中の米国特許出願No.09/910,579（2001年7月20日出願）に記載されている。
また別の実施態様では、本発明の目覚ましい長所には以下が含まれ得る：1）活性成分が添加された生物適合性組成物の製造の容易さ；2）利用可能なポリマーの種類および／または活性成分に関する場合の融通性；3）より高い収量および添加効率；および4）活性を示す無傷の活性薬剤をin vivoで放出する持続性放出処方物の供給、したがって長期にわたって活性薬剤の制御放出を提供。ある実施態様では、長所は、生物の消化管（例えば砂嚢）内の薬剤の局所デリバリーによるものであり得る。ある特徴では、“〜中に含まれる”という語句は、長期間に及ぶ薬剤の制御放出に有用な組成物中に薬剤を処方する方法を指す。
本発明の持続放出または徐放組成物のまた別の実施態様では、有効量の薬剤（例えば酵素または抗生物質）が利用される。ある特徴では、持続放出または徐放は、薬剤が生物適合性物質から長期間にわたって薬剤が徐々に放出されることを指す。持続性放出は、連続性であっても不連続性であっても、または一元的であっても一元的でなくてもよく、さらに前記は、1つまたは2つ以上の生物分解性または生物非分解性組成物、薬剤付加、賦形剤の選択または他の改変を用いて達成できる。しかしながら、生物によって一度に消費される急速放出を提供する“迅速”放出生成物が所望されることがあることは理解されよう。さらに、“放出”は生物適合性担体から薬剤が放出されることを必ずしも意味しないこともまた理解されよう。むしろある特徴では、徐放は生物適合性組成物上に存在する薬剤の緩徐な活性化または持続的活性化を包含する。例えば、フィターゼは有効であるために生物適合性組成物から放出される必要はない。この特徴では、フィターゼは生物適合性組成物上に固定される。
動物飼料は、動物の食の要求を満たすために通常用いられる任意のタンパク質含有有機性食餌であり得る。そのようなタンパク質含有食餌の多くは、典型的には主としてトウモロコシ、ひき割りダイズ、またはひき割りダイズ/トウモロコシ混合物を含む。例えば、家禽に与えられる典型的な市販製品には、エッグメーカーコンプリート（Egg Maker Complete ）（Land O’Lakes AG Servicesの家禽飼料製品）およびカントリーゲームアンドターキーグローアー（Country Game and Turkey Grower）（Agwa社の製品）が含まれる（以下の文献もまた参照されたい：The Emu Farmer’s Handbook（Phillip Minnaar and Maria Minnaar））。これら市販製品のどちらも、本発明の食養生補助物および／または酵素フィターゼを取り入れて、前記組成物で要求される補充されるべきリン、亜鉛、マンガンおよび鉄の取り入れ量を軽減または排除できる典型的な動物飼料例である。
本発明は、新規な処方物並びに食養生補助物および添加物、並びにある種の規定食（例えばアトキンス（Atkins）食、菜食主義食、長寿食、絶対菜食主義食または地域食（例えば発展途上圏食））のための食事の補充方法を提供する。ある種の選択食（例えばアトキンス食、菜食主義食、長寿食、絶対菜食主義食または地域食（例えば発展途上圏食））に付随する食物はある種の食物カテゴリー（例えばタンパク質および脂肪、ダイズなど）に重きを置くか、または土着作物（例えば穀類、コメ、豆類など）を個体の栄養補給の実質的または唯一の貢献栄養物として当てにしている。これら穀類系作物の多くはフィチン酸のレベルが高い（3から10倍）。加工食物製品（例えばダイズタンパク質水解物および他のもの）は高いフィチン酸レベルを維持しているようであり、タンパク質供給源としてそれらを高栄養バー、散剤並びに他の食品または食品サプリメントおよび成分に添加することによって、これらを常食する個体が受けるフィチン酸負荷を増加させる。
骨低下の予防及び回復：
本発明は、サプリメントおよび添加物として用いられる新規な医薬および食養生処方物、並びに食養生補助物の製造方法を提供する。前記方法は以下の個体に対してフィターゼ（例えば本発明のフィターゼを含む任意のフィターゼ）を提供することを含む：骨低下の素因がある個体、骨低下を示す個体、およびある種の症状（例えば骨粗しょう症、悪液質）を有する個体および医学的処置を受けている個体（例えば化学療法、前記は必須の栄養物の適切な取り込みまたは利用を損ない得る）。本発明の方法および組成物は単独でまたは他のサプリメントまたは治療スケジュール（投薬などを含む）と一緒に用いることができる。本処方物、食養生補助物および食事補充方法は、他の食養生補助物または骨粗鬆症の治療もしくは予防用投薬（例えばビタミンD3および／またはカルシウムを用いる（前記は骨低下を予防することが立証された））とともに与えることができる。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）およびビタミンD3および／またはカルシウムを含む処方物を提供する。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む処方物を骨低下の予防のために提供する。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む処方物を骨低下の回復のために提供する。
本処方物は医薬組成物の形態であるか、または医薬の添加物であってもよい。前記のどちらも液体、固体、散剤、ローション、スプレー、またはエーロゾルであり得る。本発明の経口投与用医薬組成物および処方物は、当業者が周知の医薬的に許容できる担体を用い妥当で適切な用量で処方できる。そのような担体は、患者の摂取に適した、錠剤、ピル、散剤、糖衣丸、カプセル、液体、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などのユニット調剤形で医薬を処方することを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、所望の場合には適切な追加の化合物を添加した後で、場合によって生成された混合物をすり潰し、顆粒混合物を加工し、固体の賦形剤として処方して錠剤または糖衣丸のコアを得ることができる。適切な固体賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填材であり、例えば糖（ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む）；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；セルロース（例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；およびゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）；並びにタンパク質（例えばゼラチンおよびコラーゲン）が含まれる。崩壊剤または可溶化剤を添加することができ、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。
本発明は、本発明のフィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を水性懸濁物の製造に適した賦形剤との混合物として含む水性懸濁物を提供する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム並びに分散剤または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導した部分的エステルとの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビトールモノオレエート）またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導した部分的エステルとの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート）を含む。水性懸濁物はまた、1つまたは2つ以上の保存料（例えばエチルまたはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエート）、1つまたは2つ以上の着色剤、1つまたは2つ以上の香料、および1つまたは2つ以上の甘味剤（例えばショ糖、アスパルターム、またはサッカリン）を含むことができる。処方物は浸透圧について調節できる。
投薬スケジュールではまた、当分野で公知の薬物消長に関するパラメーター、すなわち活性薬剤の吸収速度、生体利用性、代謝、クリアランスなどが考慮される（例えば以下を参照されたい：Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617；Groning (1996) Pharmazie 51:337-341；Fotherby (1996) Contraception 54:59-69；Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144-1146；Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613；Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108；Remingtonの最新版、The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Lippincott Williams & Wilkins）。当業界の状況では、各患者の投薬スケジュール、活性薬剤および治療される疾患または症状を臨床医が決定できる。医薬として用いられる類似の組成物について提供された指針を、投薬スケジュール（すなわち用量スケジュールおよび投薬レベル）の決定のための手引きとして用いることができ、本発明の方法（例えば骨低下の回復または骨低下の予防）の実施は適切であり正しい。
身体トレーニングの補充：
本発明はまた新規な食養生補助物および添加物並びにそれらの使用方法を提供する。前記方法は、運動競技または他の激しい身体トレーニング（例えば兵士の訓練）を受けている個体にフィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を提供する工程を含む。運動競技用トレーニングおよび激越な活動は必須の栄養物を枯渇させ、食養生補充を必要とする。これらの食事および状態は、最適な栄養補給に必要な必須の微小栄養物、例えば金属（K、Ca、Fe、Zn、Mn、Se）およびイオン（PO4）を欠くという点で同じである。フィチン酸が豊富な食事はこの問題を悪化させ、さらに高フィチン酸食物を多く含む食事への自発的または経済的依存から生じる慢性および急性症状の両症状もまたもたらされ得る。
例えば、多様な低炭水化物食を続けた個体はしばしば筋肉（例えば脚筋）の痙攣に苦しめられる。これに対する典型的な助言は、更なるカリウム、カルシウムおよび他の栄養物を食事に添加することである。本発明は、食養生補充のための組成物、食養生補助物およびサプリメント並びに食養生補充のための方法を提供する（前記方法は、食事へのフィターゼ（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）補充を用いてマクロ栄養物および微小栄養物を総動員することにより損なわれた栄養補給を強化する）。
本発明のある特徴では、フィターゼの使用（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼの使用）は、食物およびサプリメントプロセスへの直接添加を適切にする易熱性またはpH安定性を示すように、および／またはヒトまたは動物の胃腸管で強化された安定性及び活性を示すように最適化される。
本発明はまた、食養生サプリメントおよび添加物並びにそれらを用いる方法を提供する。前記は、ミネラルの補充を受けている個体にフィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を提供する工程を含む。高フィチン酸含有物を含む食物を摂る人々へのミネラルの補充は実際には栄養物の利用性に関する問題を悪化させることがある。文献では、フィチン酸、カルシウムおよび亜鉛の複合体は、フィチン酸およびカルシウムの複合体よりもはるかに不溶性であると提唱されている。人々はしばしば多重ミネラルサプリメントを摂取する。高フィチン酸食物の存在下でミネラルサプリメントを組み合せるために工夫された試案へのフィターゼ添加は、これらのサプルメントをはるかに有効ならしめることができる。
また別の特徴では、本発明の組成物および方法（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）がサプリメントまたは添加物として以下で用いられる：
−特定の食物群の摂取を制限する体重減少プログラム、菜食主義食、長寿食、絶対菜食主義食（肉、ナス属野菜、パンなどの摂取を制限または排除する）およびナッツの摂取に焦点を当てる他の食事で；
−ミネラル摂取の低下に起因する生理学的症状を緩和するために、フィチン酸食物を多く含む低炭水化物食を摂る個体に固有のサプリメントで；
−規定食の摂取を介して性能の向上を希求する運動競技のトレーニングスケジュール（軍隊の訓練スケジュールを含む）で；
−食物群の摂取が妨げられているかまたは制限されている患者の個々の要請に合わせた病院食で；
−発展途上圏のマクロ栄養物が不足している穀類および豆類の食事で；
−学校給食プログラムで。
本発明はまた、本発明の組成物（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）およびこれらの食事に本発明の組成物または方法を取り入れることに関する指示を含むキットを提供する。本キットは任意のパーッケージ、標識、製品挿入物などを含むことができる。
ある特徴では、本発明は天然のフィターゼまたは本発明の最適化フィターゼを提供する。前記は、製造のため、加工のためまたはヒトもしくは動物系（例えば消化管）の通過のために処方されるかまたは最適化される（例えば配列が最適化される）。前記フィターゼはまた別の処方物を用いて最適化することができる。
あるいは、本発明のフィターゼまたは任意のフィターゼを、例えば定方向進化、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、、エクスポネンシャルアンサンブル、位置特異的変異導入、連結再アッセンブリ、GSSMTMおよび前記の任意の組み合わせを用いて、フィターゼ酵素の配列を操作することによって最適化し、加工時、摂取時およびヒトの消化管内で活性を維持することができる。
本組成物（例えば任意のフィターゼ酵素または本発明のフィターゼ酵素を含む食養生処方物）は、食養生有効性を提供する多数の手段によってデリバーすることができる。例えば、本発明は、組成物（例えば任意のフィターゼ酵素または本発明のフィターゼ酵素を含む食養生処方物または添加物）および以下の使用を含む方法を提供する：
−包装された食物サプリメント（例えば噛み砕くことができる錠剤または高栄養バー）として；
−摂取前に水和させて利用できる凍結乾燥製品として；
−食養生製品（例えば加工ダイズ製品）と一緒に包装されるか、またはダイズタンパク水解物と他の加工部分（食物加工工業に成分として販売される完全食物に由来する）との処方物として販売される；
−市販の焼き商品として；
−朝食シリアルへのふりかけ；
−スプレー投与処方物（例えば鼻用スプレー）として；
−土着作物（例えば穀類および豆類）で発現されるトランスジェニック生成物として（例えば微生物（例えば細菌）のトランスジェニック生成物として）；
−トランスジェニック生物（例えば微生物）として；（例えば、ヒトまたは動物は、摂取または注入後に組換えフィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を生成できる細菌または他の微生物を消化管に投与される）。
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、栄養強化性、栄養適合性を銘打つか、あるいは栄養物の性能を強化する能力および栄養不足に付随する多様な症状を緩和する能力を特記することができる。
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、フィテートの抗栄養作用を緩和するために利用することができる（フィテートは重要な食餌性ミネラル（例えば亜鉛、銅、鉄、マグネシウム、錫およびカルシウム）をキレートする）。したがって、本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、摂取食物中の金属結合酵素およびタンパク質の沈殿を防ぐために食養生サプリメントとして用いられる。ある特徴では、本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、ヒトの食事（特に豆類および穀類が豊富な食事）中のフィテートの抗栄養作用を緩和するために、ミネラルの生体利用性を高めるために用いられる。ある特徴では、本発明の食養生サプリメント中のフィターゼは、フィテートからオルトホスフェートを部分的または完全に加水分解して除去する反応を触媒する（フィテートの完全な加水分解によって１分子のイノシトールおよび６分子の無機リン酸が生成される）。
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、ヒトおよび多数の動物（家禽および魚を含む）の食餌に応用できる。例えば本発明のフィターゼ含有食養生サプリメント製品および食養生サプリメントの方法を市場の重要な種（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、実験室用げっ歯類（ラット、マウス、ハムスターおよびアレチネズミ）、毛皮動物（例えばミンクおよびキツネ）および動物園の動物（例えばサルおよびヒヒ）とともにペット動物（例えばネコおよびイヌ）で実施できる。市場で重要な典型的な鳥類の種には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、キジ、エミュ、ダチョウ、アビ、キーウィ、ハト、オウム、オカメインコ、コッカトゥ、カナリア、ペンギン、フラミンゴおよびウズラが含まれる。商業的に飼育される魚、例えばマスもまた本明細書に開示する食養生補助物により利益を得るであろう。利益を得ることができる他の魚には、例えば特に水族館または養殖環境の魚（例えば熱帯魚）、金魚および他の観賞用のコイ、ナマズ、マス、サケ、サメ、エイ、カレイ、シタビラメ、ティラピア、メダカ、グッピー、モーリー、プラティフィッシュ、メカジキ、ゼブラフィッシュおよびドジョウが含まれる。
本発明のフィテート含有生成物および方法はまた、組織培養および／または細胞培養で用いられる多様な寒天、ゲル、媒体および溶液で用いられる。一定しないダイズ水解物は、組織培養および／または細胞培養で用いるときに遭遇する問題であり得る。ある特徴では、細胞培養収量の増加および成果の一定性のために、本発明のフィターゼ含有生成物および方法が細胞培養媒体添加物としてまたは処理として用いられる。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を含む細胞培養用水解物を提供する。
ある特徴では、一定した生成物を提供するために、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）バイオマーカーを用いることによって、フィターゼを含む細胞培養用水解物、サプリメントまたは他の添加物を製造する方法を提供する。例えば、本方法は、水解物、サプリメントまたは他の添加物のバッチでいくつかのフィターゼ分子を“スコア付けする”または“マークを付す”工程を含み、続いて水解物、サプリメントまたは他の添加物のバッチを混合して一定のバイオマーカーパターンを達成する工程を含む。ある特徴では、各バッチの培養性能をミニバイオリアクターで測定し、さらに各バイオマーカーおよびバッチの性能の相関性を調べる。ある特徴では、混合を実施して、一定したまたは平均より優れた高性能製品を製造する。ある特徴では、チオレドキシン（TRX）を添加して、ジスルフィド結合によって引き起こされる二次構造を除去することにより多くのタンパク質の生物利用性を高める。ある特徴では、プロテアーゼがまた本発明の水解物、サプリメントまたは添加物に添加される。プロテアーゼは “スコアを付す”かまたは他のバイオマーカーにより品質を管理して（上記に考察したフィターゼのように）、混合プロセスを管理する。
ある特徴では、本発明は、フィターゼを穀粒に添加して一定の生成物を提供する方法を提供する。前記方法は、本発明の水解物、サプリメントまたは添加物について上記に記載したプロセスと類似する、バイオマーカーによる“スコア付け”または品質管理プロセスを用いることによって達成される。
戦闘員効率および士気を向上させる酵素強化食：
ある特徴では、本発明は、戦闘員効率および士気の向上のための酵素強化食のために、新規な食養生サプリメントおよび添加物並びにフィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む食養生サプリメントのための方法を提供する。ある特徴では、本発明のこれらの食養生サプリメント組成物はin situで作動し、食物の廃棄が制限されているときに安定で容易に利用できかつ所望の形式でエネルギー、スタミナおよび士気を高める。
ある特徴では、本発明のこれらの食養生サプリメント組成物および方法は、栄養物の効率的デリバリーおよび関連する兵士の健康、士気および作戦上の有効性を含む軍隊の作戦遂行におけるチャレンジに重点を置く。本発明は、ヒトの腸で効率的に機能するために最適化された酵素を提供する。これらの酵素は、栄養充足の長時間維持および個々の満足度と同様に栄養物の抽出およびエネルギーの生成を強化することができる。
フィターゼに加えて、他の酵素、例えばアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼを用いて、本発明の食養生サプリメント組成物および方法が実施される。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）および別の酵素（例えばアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはその組合せ）を含む、処方物、食物サプリメント、食物、自給式食事、携帯口糧ユニット（Ready-to-Eat unit（MRE））、飲料、水和剤などを提供する。食物とともに摂取されるとき、これらの酵素は、重要な栄養物、例えばリン、必須金属およびイオン、アミノ酸および糖の遊離を増大させることが示された。さらにまたこれらの酵素の同時摂取は、植物由来セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンの脱ポリマー化によって胃腸管の運動および吸収を高める。この報告書は、戦闘員用の栄養物の利用強化を提供するためにこれら酵素を軍隊食へのサプリメントとして開発することを提案する。
ある特徴では、本発明の食物サプリメントは、通常は抗栄養性の植物由来フィテートから必須のホスフェートを遊離させて食物のエネルギー収量および骨のCaPO4沈着を高める。ある特徴では、フィターゼおよび他の潜在的サプリメント酵素は、消化管pHおよび内因性プロテアーゼ活性に耐性を有する。
ある特徴では、本発明は、訓練、戦闘または任意の高ストレス状況下で戦闘員に供される軍隊食（または任意の食事（一般消費者の食事および食事補充製品を含む））の栄養価、消化性、およびエネルギー含有量を顕著に改善するために、糧食、飲料、食物、MRE、水和剤などのための酵素サプリメントを提供する。本サプリメントは、使用および個々人の輸送（MRE、水和剤などに含まれるかまたは前記と一緒に）が容易であるように処方することができる。ある特徴では、本酵素サプリメントは、食物の外観、味および／または堅牢性を損なわないであろう。ある特徴では、本製品は戦闘員の健康を改善し、スタミナを向上させるであろう。
また別の特徴では、本酵素サプリメントは多数の方法でデリバーされ食養生有効性を提供する。例えば、本発明は、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）およびいくつかの特徴ではまた別の酵素を以下の形態で提供する：
−包装された食物または飲料サプリメント、例えばMRE、糧食、サーバイバルキット、水和剤、咀嚼性錠剤または高栄養バー；
−摂取前に水和して利用できる凍結乾燥生成物（例えば散剤）として；
−食養生製品、食物、飲料（例えば加工ダイズ製品）、またはダイズタンパク質水解物と食品加工工業へ成分として販売される完全食物の他の加工部分との処方物と一緒に包装されて；
−焼き製品として；
−シリアルへのふりかけ；
−処方物、例えば錠剤、ゲルタブ、カプセル、スプレーなど。
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、摂取した食事からカロリー並びにマクロ栄養物および微小栄養物を急速に放出する栄養補充を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、ストレスの多い状況下（例えば激越な活動および不連続な倒錯期を含む）で個体にエネルギーおよび身体強度を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、ヒトの消化管で効果的に働き、その一方で所望の環境（例えば軍事的設定）下での安定性、保存性および輸送性を維持するように最適化および処方された酵素を提供する。
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、風味性、不溶解性、咀嚼性および個々人による輸送効率の向上した製品の処方を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、さらに他の成分（例えばカリウム、グルコース、CaCl2）を含む。前記処方物中のCaCl2は放出されたホスフェートと結合し、続いて骨沈着および骨重量増加を強化する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、さらに他の酵素処方物、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、へミセルラーゼをタンパク質、セルロースおよびヘミセルロース消化のためにそれぞれ含む。これらの酵素はタンパク質およびデンプンの利用可能性を改善し、さらに鉄が豊富な多くの食物からの鉄の吸収を増加させる。
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、さらに植物材料に由来する食物を加水分解する酵素を含む（前記植物材料は、アミノ酸ポリマー、タンパク質と同様にグルコースおよびキシロース系ポリマー、セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンが豊富である）。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、食物中のポリマー物質の加水分解を促進する。すなわち、前記は、ポリマーからモノマーへの（例えば多糖類から単糖類への、またはタンパク質からアミノ酸成分への）完全な消化を促進する。したがって、この特徴では、本発明の組成物および方法は、食物、飲料または糧食がその完全なカロリー価および栄養価を示すことを可能にする。ある特徴では、酵素の補充は、安定した酵素（例えば多様なヒドロラーゼ、セルラーゼ、へミセルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼおよび他の酵素）の使用を含む。ある特徴では、本発明の組成物および方法で用いられる酵素は、周辺の消化管の条件に耐性を示すことができる（すなわち低pHおよび消化管のプロテアーゼの存在下での安定性）。
フィターゼの工業的利用
上記に記載したものの他に、本発明は、フィターゼの工業的利用（本発明の新規なフィターゼの利用を含む）を提供する。
環境中のホスフェート汚染の軽減：
ある特徴では、本発明は、廃棄物または堆肥に添加して“環境中” のフィチン酸を変換するためのフィターゼ（本発明のフィターゼを含む）組成物を提供する。ある特徴では、前記は、汚染の軽減および栄養物の利用性の向上という目的に適う。本発明はまた、フィターゼを土壌、天然もしくは人工の水の集塊（例えば湖、池、下肥溜めなど）、都市下水、任意の下水排出液などに添加するための組成物および方法を提供する。上記で述べたように、本発明は、廃棄物または下水（例えば動物の排出物）中のフィターゼレベルを削減する組成物および方法を提供する（ここで動物は有効量のフィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を含む食養生補助物を与えられている）。したがって、本発明の組成物および方法は、フィチン酸を分解することによって汚染を軽減するいずれの適用でも用いることができる。
農業および植物育成への応用：
ある特徴では、本発明は、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物、および農業経営への応用または他の植物育成への応用のための方法を提供する（例えば肥料または植物（例えば家庭用植物）のための植物用食物添加物（例えばMIRACLEGROWTM）にフィターゼを添加する）。農業経営への応用のために本発明の組成物および方法を利用する場合、ユーザーには組織的農業者が含まれる。本発明の組成物および方法を用いて、任意のリン欠乏土壌または特定の作物もしくは利用のためにリンの補充が必要な土壌にフィターゼを添加することができる。リンの放出は植物の生長を促進するので、本発明の組成物および方法を用い、藻類または植物素材を含むいずれのものにもフィターゼを添加することができる。
製品：
本発明は、1つまたは2つ以上の本発明のフィターゼを含む多様な製品を提供する。例えばある特徴では、本発明は、化粧品への応用のために（例えば植物生成物を含むシャンプー、ローションまたは石鹸）、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物および方法を提供する。
ある特徴では、本発明は、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物およびフィターゼを固定する方法を提供する。ある特徴では、固定されたフィターゼは、制御放出機構として機能する。例えば、ある特徴では、本発明は、土壌（例えば粘土）への適用のために、例えば家庭用植物などにフィターゼの制御放出（時間的放出）処方物を提供する。ある特徴では、フィターゼはビーズ（例えばポリソーブビーズ）に固定される。これらのビーズは、例えば農業植物または家庭用植物のために土壌にデリバーできる。別の特徴では、本発明のフィターゼの制御放出（時間的放出）処方物は、食養生サプリメントおよび添加物で用いられる。
バイオ燃料およびバイオマス変換：
本発明は、本発明の1つまたは2つ以上のフィターゼの使用を含む燃料（例えばバイオ燃料）を製造する方法を提供する。前記方法は、本発明の1つまたは2つ以上のフィターゼを含む燃料（例えばバイオ燃料）を提供する工程を含む。本発明は、本発明の1つまたは2つ以上のフィターゼの使用を含む、バイオマス変換のための方法を提供する。
ある特徴では、本発明は、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物、および発酵またはアルコール製造（例えばエタノール製造）プロセスでフィターゼを用いる方法を提供する。例えば、本発明の組成物および方法を用いて、石油系製品の使用に対して有効で持続可能な代替物または付加物、例えばバイオエタノールおよびガソリンの混合物を提供できる。
本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学反応サイクルに加わるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。さらにまた、フィターゼ（例えば本発明の酵素）および1つまたは2つ以上のデンプン分解酵素（例えばアミラーゼまたはグルコアミラーゼ）の混合物はデンプンのエタノール生成を改善する。本発明は、これらの重要な新しい“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする酵素の発見およびもっとも効果的な実施のための方法を提供する。
バイオマス変換およびクリーンなバイオ燃料の製造：
本発明は、ポリペプチド（酵素（本発明のフィターゼ）および抗体を含む）を提供し、さらにバイオマスまたはリグノセルロース系物質（例えばセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含む任意の組成物）を、飼料、食物および化学物質の他に、燃料（例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオプロパノール、バイオメタノール、バイオディーゼル）に加工するための方法を提供する。例えばある特徴では、本発明の酵素は、バイオマス（リグノセルロース系物質、穀粒またはオイルシード）中の消化不能のフィチン酸（フィテート）を分解して、消化性のリンを遊離させ、したがってある特徴では、本発明のフィターゼを用いてバイオマスを処理または前処理する。
したがって、本発明の組成物および方法をバイオ燃料の製造および／または加工に用いて、例えば、石油系製品の使用に対して有効で持続可能な代替物または付加物を提供できる。例えば、本発明の組成物および方法を酵素混合物とともに用いて、バイオ燃料、例えばバイオメタノール、バイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオディーゼルなどを製造できる（前記はディーゼル燃料、ガソリン、ケロシンなどに添加できる）。本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学反応サイクルに加わるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。ある特徴では、変換のための酵素および方法は、バイオマスの効率的な処理のために、多糖類、セルロース系および／またはヘミセルロース系ポリマーの代謝可能な（例えば発酵可能な）炭素部分への脱ポリマー化と併せて、酵素アンサンブルで用いられる。本発明は、これらの重要な新しい“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする酵素の発見およびもっとも効果的な実施のための方法を提供する。
本発明の組成物および方法を用いて、石油系製品の使用に対して有効で持続可能な代替物または付加物（例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオプロパノール、バイオメタノール、および／またはバイオディーゼルおよびガソリンの混合物として）を提供できる。本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学反応サイクルに加わるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。本発明は、これらの重要な新しい“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする酵素の発見およびもっとも効果的な実施のための方法を提供する。
本発明は、材料、例えばバイオマス材料（例えばセロオリゴ糖、アラビノキシル化オリゴマー、リグニン、リグノセルロース、キシラン、グルカン、セルロースおよび／または発酵可能な糖を含む組成物）を処理するための方法、本発明の酵素および酵素混合物（または“カクテル”）を提供する。前記は、例えば組成物を本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと処理する工程を含み、ここで場合によって、前記材料は、農業作物（例えばコムギ、オオムギ、ジャガイモ、スイッチグラス、ポプラ材）に由来するか、食物または飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄産物である。さらに場合によって植物残留物は、茎、葉、外皮、さや、トウモロコシもしくはトウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、トウモロコシの線維、干し草、わら（例えば稲わら、麦わら）、サトウキビのバガス、テンサイパルプ、かんきつ類の皮、木材、木材削り屑、木材チップ、木材パルプ、パルプ廃棄物、木材廃棄物、木材カンナ屑およびおが屑、建築および／または解体廃棄物およびゴミ（例えば木材、木材削り屑およびおが屑）である。さらに場合によって、紙廃棄物は、廃棄または使用済みコピー用紙、コンピュータのプリンター用紙、帳面、便せん、タイプ用紙、新聞、雑誌、厚紙、紙製包装材およびリサイクル紙を含む。さらにまた、都市廃棄物、例えば市中の固形廃棄物の紙部分、市中の木材廃棄物および市中の植物廃棄物および糖、デンプンおよび／またはセルロースを含む他の物質も一緒に用いることができる。また別の実施態様では、材料（例えばバイオマス材料）の処理は、バイオアルコール、例えばバイオディーゼ、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノールを生じる。
或いは、本発明のポリペプチドはバイオマス植物材料またはフィードストックそれ自体で発現させることができる。
本発明の方法はまた、変換リグノセルロース系材料（本発明の酵素によって処理）を採取し、前記を発酵によっておよび／または化学的合成によって燃料（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル）に生成する工程を含む。ある特徴では、生成された糖を発酵させるか、および／または非発酵性生成物をガス化させる。
本発明の方法はまた、藻類、植物性バージンオイル、植物性廃油、動物脂肪および獣脂（例えば牛脂、豚脂、および黄色グリース）、または下水を本発明の酵素を用いて変換し、前記を発酵によっておよび／または化学的合成または変換によって、燃料（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル）に生成する工程を含む。
本発明の酵素（本発明の組換え酵素を生成し、いくつかの特徴では前記を分泌する生物、例えば微生物（例えば菌類、酵母または細菌）を含む）は、任意のバイオマス変換プロセスの任意のステージ、例えば任意の1つの工程またはいくつかの工程で用いられるかまたは含まれるか／組み入れられるか、または以下のバイオマス変換プロセスの全ての工程もしくはそれら方法の全てに、またはこれらのバイオ燃料代替物の全てに含まれ得る：
−直接燃焼：は直接の熱による物質の燃焼であり、前記はもっとも単純なバイオマス技術であり、バイオマスが身近に存在する場合は非常に経済的である。
−熱分解：は酸素の非存在下での熱によるバイオマスの熱分解である。ある特徴では、バイオマスを約427℃から760℃（華氏約800度から1400度）の温度に熱するが、燃焼促進に酸素は導入されず気体、燃料油および炭を生じる。
−ガス化：バイオマスを用いて加熱または嫌気性消化によりメタンを生成できる。合成ガス（一酸化炭素および水素の混合物）はバイオマスから誘導できる。
−ゴミ投棄場ガス：ゴミ投棄場ガスはゴミ投棄場に埋められたゴミの分解（嫌気性消化）によって発生する。有機廃棄物が分解するとき、前記は約50％のメタン（天然ガスの主成分）から成るガスを生じる。
−嫌気性消化：は有機物質をメタン（天然ガスの主成分）および二酸化炭素の混合物に変換する。ある特徴では、バイオマス（例えば排水（下水）、動物の排泄物または食物処理廃棄物）を水と混合し、空気の非存在下で消化生物タンクに加える。
−発酵：
−アルコール発酵：燃料アルコールは、セルース系物質および／またはデンプンを糖に変換し、糖をアルコール発酵させ、続いてアルコール水混合物を蒸留によって分離することにより生成される。フィードストック（例えば専用作物（例えばトウモロコシ、ダイズ、オオムギ、ジャガイモ、スイッチグラス、ミスカンサス（Miscanthus）、ポプラ材）、農業残留物および廃棄物（例えば稲わら、トウモロコシ茎葉、麦わら、サトウキビバガス、稲もみ殻、、トウモロコシ線維、テンサイパルプ、かんきつ類パルプおよびかんきつ類外皮）、森林廃棄物（例えば硬木および軟木削り屑、木材処理から生じる硬木および軟木残留物、木材のカンナ屑およびおが屑）、都市廃棄物（例えば市中の固形廃棄物の紙部分、市中の木材廃棄物および市中の植物廃棄物）、木材廃棄物（製材所廃棄物、パルプミル廃棄物、建築廃棄物、解体廃棄物、木材カンナ屑およびおが屑）、および紙廃棄物または糖、デンプンおよび／またはセルロースを含む他の物質）を糖に、続いて酵母を用いる発酵によってアルコールに変換できる。或いは、糖を含む材料を直接発酵によってアルコールに変換できる。
−トランスエステル化：油をバイオディーゼルに変換する例示的反応はトランスエステル化と称される。トランスエステル化プロセスでは、アルコール（メタノールのような）が植物油、動物の脂肪またはリサイクルグリースに含まれるトリグリセリドと反応して、脂肪酸アルキルエステル（バイオディーゼル）およびグリセリンを生成する。前記反応は、熱および強い塩基触媒（例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を要求する。
−バイオディーゼル：バイオディーゼルは、植物油、動物脂肪またはリサイクルグリースから生成された脂肪酸アルキルエステルの混合物である。バイオディーゼルはその精製形で乗り物の燃料として用いることができるが、通常はディーゼル駆動乗物か排出される粒状物、一酸化炭素、炭化水素および大気汚染物質のレベルを低下させるために石油ディーゼル添加物として用いられる。
−加水分解：本発明の酵素を用いて触媒される、化合物、例えばバイオマス（例えばリグノセルロース系物質）の加水分解が含まれる。
−コジェネレーション：コジェネレーションは、ただ1つの燃料および設備を用いて2つ以上のエネルギー形態を同時に発生させることである。ある特徴では、バイオマスによるコジェネレーションは、コジェネレーションが熱と電気の両方を発生させるのでバイオマス単独のエネルギー生成よりも潜在的成長を有する。
ある特徴では、本発明のポリペプチドを他の酵素（例えばヒドロラーゼまたはセルロース分解活性を有する酵素（例えばグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、マンナナーゼおよび／または他の酵素））と一緒に用いて、燃料、例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル）を、任意の有機物質、例えばバイオマス、例えば植物および動物に由来する組成物（任意の農業作物または他の再生可能なフィードストック、農業残留物または動物の廃棄物、都市の有機成分および工業廃棄物、または建築もしくは解体廃棄物またはゴミ、または微生物（例えば藻類または酵母）が含まれる）から製造することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系バイオマスを燃料（例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル））に変換するためのプロセスで用いられるか、或いはまた、本発明のポリペプチドは、バイオ材料を燃料（例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル））として用いることができるように、それらバイオ材料を加水分解または消化するためのプロセスで、またはバイオマスの燃料への変換をより容易にするためのプロセスで用いられる。
また別の特徴では、本発明のポリペプチド（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）は、アルコール（エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパノール、メタノールのような）を、植物油、動物脂肪またはリサイクルグリースに含まれるトリグリセリドと反応させ、脂肪酸アルキルエステル（バイオディーゼル）およびグリセリンを生成するトランスエステル化プロセスのためのプロセスで用いられる。ある特徴では、バイオディーゼルはダイズ油またはリサイクル料理油から生成される。動物の脂肪、他の植物油、および他のリサイクル油もまた、それらのコストおよび利用可能性に応じてバイオディーゼルの生成に用いることができる。別の特徴では、全種類の脂肪および油の混合物が本発明のバイオディーゼルの生成に用いられる。
本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）はまたグリセリン精製に用いることができる。グリセリン副生成物は未反応触媒および酸で中和される石鹸を含む。水およびアルコールが除去され、50%から80%の粗グリセリンを生じる。残余の夾雑物には未反応脂肪および油が含まれ、それらは本発明のポリペプチドを用いて処理することができる。本発明の大量のバイオディーゼル植物では、グリセリンはさらに、製薬および化粧品工業用に99%またはそれ以上の純度に精製することができる。
本発明のポリペプチド（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）を用いて生成される燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル）を、燃料酸素付加物とともに用いて燃焼特性を改善できる。酸素付加は完全な燃焼をもたらし、それによって一酸化炭素の放出が軽減される。これは、石油燃料をバイオ燃料（例えば本発明の燃料）で代替するもう1つの環境上の利点である。本発明の組成物および／または方法を用いて生成されるバイオ燃料をガソリンと混合してE10ブレンド（約5%から10%のエタノールおよび約90%から95%のガソリン）を生成できるが、より高い濃度（例えばE85）またはその純粋形で用いることもできる。本発明の組成物および／または方法を用いて生成されるバイオ燃料を石油ディーゼルと混合して、B20ブレンド（20%バイオディーゼルおよび80%石油ディーゼル）を生成することができるが、B100（純粋バイオディーゼル）までの他のブレンドレベルを用いることもできる。
本発明はまた、バイオマス（例えば植物由来供給源、例えばリグノセルロース系バイオマス）を含む組成物から、バイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼル）を製造するために、本発明の酵素を用いるプロセスを提供する。バイオマス材料は、農業作物（例えば食物もしくは飼料製造の副産物として）、または廃棄物として（リグノセルロース系廃棄物、例えば植物残留物、廃棄紙、または建築および／または解体廃棄物またはゴミを含む）入手できる。本発明のポリペプチドによる処理に適した植物供給原または植物残留物の例には、ケルプ、藻類、穀粒、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、わら、サトウキビ、サトウキビバガス、草（例えばインディアングラス（例えばソルガストルム・ヌータンス（Sorghastrum nutans））；またはスイッチグラス（例えばパニクム（Panicum）種、例えばパニクム・ヴィルガツム（P. virgatum））などとともに木材、木材チップ、木材パルプおよびおが屑が含まれる。本発明のポリペプチドによる処理に適した紙廃棄物の例には、廃棄されたコピー用紙、コンピュータのプリンター用紙、帳面、便せん、タイプ用紙などとともに新聞、雑誌、厚紙、紙製包装材が含まれる。建築および解体廃棄物およびゴミの例には木材、木材スクラップ、木材削り屑およびおが屑が含まれる。
ある実施態様では、本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）および本発明の方法を、バイオマスからエタノール、メタノール、ブタノール、プロパノールおよび／またはディーゼルを製造するより伝統的な手段と一緒に用いることができる（前記手段は、例えばリグノセルロース系材料を強酸の希釈溶液および金属塩を含むリアクターで乾燥リグノセルロース系材料を触媒に付すことによってリグノセルロース系材料を加水分解する工程を含む方法で、この方法によって活性化エネルギーまたはセルロースの加水分解温度が低下し、より高い糖収量を得ることができる；例えば米国特許6,660,506号および6,423,145号を参照されたい）。
本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）の使用を取り入れることができるまた別の例示的方法は、任意のリグノセルロース系材料を含むバイオマス（例えばヘミセルロース、セルロースおよびリグニンを含む）または加水分解できる任意の他の多糖類を含むバイオマスを、セルロースからグルコースへの主要な脱ポリマー化を生じることなくヘミセルロースの予備的脱ポリマー化を達成するために選択した温度および圧力下にて水性媒体中で第一ステージの加水分解工程に前記材料を付すことによって加水分解する工程を含む。この工程は、水性液相が不溶の単糖類（ヘミセルロースの脱ポリマー化から生じる）を含み、固相がセルロースおよびリグニンを含むスラリーを生じる。第二ステージの加水分解工程は、セルロースの少なくとも主要な部分が脱ポリマー化される条件を含み、そのような工程はセルロースの脱ポリマー化された不溶／可溶化生成物を含む水性液相を生じる（例えば米国特許5,536,325号を参照されたい）。本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）はこの例示的プロセスの任意のステージで添加することができる。
本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）の使用を取り入れることができるまた別の例示的方法は、約0.4%から2%の強酸を含む希酸加水分解の1つまたは2つ以上のステージによってリグノセルロース含有バイオマス材料を処理する工程；および酸加水分解バイオマス材料の未反応のリグノセルロース系固体成分をアルカリ性脱リグニン化によって処理して生物分解性熱可塑性物質および誘導体を生成する工程を含む（例えば米国特許6,409,841号を参照されたい）。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意のステージで添加することができる。
本発明の酵素（本発明の酵素混合物または“カクテル”を含む）の使用を取り入れることができるまた別の例示的方法は、予備加水分解リアクターでリグノセルロース系材料を予備加水分解する工程；固体のリグノセルロース系材料に酸性液を添加して、混合物を形成する工程；前記混合物を反応温度に加熱する工程；リグノセルロース系材料を分断化するために十分な時間反応温度を維持して、リグノセルロース系材料のリグニンの少なくとも約20%を含む可溶化部分およびセルロースを含む固体分画を得る工程；固体分画中のセルロースが酵素消化にいっそう馴染みやすい反応温度または反応温度近くで固体分画から可溶化部分を取り出す工程；および可溶化部分を回収する工程を含む（例えば米国特許5,705,369号を参照されたい）。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意のステージで添加することができる。
本発明は、本発明の酵素および方法を用いることによって生成された燃料級アルコールと混合した液体炭化水素を土台にした自動車燃料組成物（例えば火花添加自動車用）を生成する方法を提供する。ある特徴では、本発明の酵素を使用することにより製造された燃料は、例えば液化石炭ガス-または液化天然ガス-エタノール混合物を含む。ある特徴では、コソルベントはバイオマス由来2-メチルテトラヒドロフラン（MTHE）である。例えば米国特許6,712,866号を参照されたい。
ある特徴では、リグノセルロースの酵素的分解のための（例えばリグノセルロース系材料からバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼルを含む）を生成するための）本発明の方法はまた、バイオマス材料の超音波処理の使用を含むことができる（例えば米国特許6,333,181号を参照されたい）。
別の特徴では、セルロース系基質からバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼルを含む）を製造するための本発明の方法は、セルロース系基質、本発明の酵素および発酵因子を含むスラリーの形状の反応混合物を（例えば反応容器、例えば半連続的固体供給バイオリアクターにて）提供する工程を含み、前記反応混合物を発酵反応の開始および維持に十分な条件下で反応させる（例えば米国特許出願20060014260に記載されているとおり）。ある特徴では、実験または理論的計算によって最適な材料供給頻度を決定できる。ある特徴では、セルロース系基質および酵素の追加量は、最適化材料供給頻度にしたがってある間隔で反応容器に提供される。
本発明のバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼルを含む）を製造するある例示的プロセスは、米国特許出願公開公報20050069998号；20020164730号に記載され、ある特徴では以下のステージを含む：リグノセルロース系バイオマスをすり潰し（例えば15−30mmのサイズに）、得られた生成物をリアクター内で1から10分間蒸気破裂前処理に付し（例えば190−230℃の温度で）、前処理材料をサイクロンまたは関連する製造業製品で収集し、さらに液体および固体分画をフィルタープレスでろ過することにより分離し、固体分画を発酵デポジットに導入し、本発明の1つまたは2つ以上の酵素（例えばセルラーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼ酵素（例えばクエン酸緩衝液（pH4.8）に溶解させる）を添加する。
本発明の酵素を用いて、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノールを含む本発明のバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオディーゼルを含む）を製造する別の例示的プロセスは、少なくともヘミセルロースおよびセルロースを含むリグノセルロース系フィードストックを含む出発材料を前処理する工程を含む。ある特徴では、出発材料は、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、コムギ、テンサイもしくはサトウキビ、または成分または廃棄物、または食物もしくは飼料製造の副生成物を含む。出発材料（“フィードストック”）は、植物の線維構造を破壊してヘミセルロースおよびセルロースの少なくとも部分的加水分解を達成する条件下で反応させる。破壊条件は、例えば出発材料を180℃から270℃の平均温度で約5秒から60分の間pH0.5から2.5に付すか、または220℃から270℃の温度で約5秒から120秒の間pH0.5から2.5に付すか、または同等なものに付す工程を含むことができる。前記工程は、酵素（例えば本発明のセルラーゼ酵素）によって消化されるために接近性が向上したフィードストックを生じる（米国特許6,090,595号）。
リグノセルロース系材料の加水分解で本発明の酵素を用いる例示的条件には、約30℃から48℃の温度および／または約4.0から6.0のpHでの反応が含まれる。他の例示的条件には、約30℃から60℃の温度および約4.0から8.0のpHが含まれる。
バイオマスの燃料への変換およびエタノールの製造では、例えばPCT出願WO0043496およびWO8100857に記載されているように、グルカナーゼ（またはセルラーゼ）、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、キサンタナーゼおよび／またはグリコシダーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼを用いることができる。グルカナーゼ（またはセルラーゼ）、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、キサンタナーゼおよび／またはグリコシダーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼをフィターゼ（本発明のフィターゼ）と一緒に用いて、発酵性糖および燃料エタノールに変換できるグルカン含有バイオマスを製造できる。アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコイソメラーゼ、アルファ-グルコシダーゼなどをフィターゼ（本発明のフィターゼ）と一緒に用いて、デンプンを発酵性糖またはエタノールに変換できる。PCT出願WO2005/096804を参照されたい。
蒸留粕乾燥穀粒プロセッシング：
別の特徴では、“蒸留粕乾燥溶解性物質（DDS）”、“蒸留粕乾燥穀粒（DDS）”、“蒸留粕濃縮溶解性物質（CDS）”、“蒸留粕湿潤穀粒（DWG）”、および“溶解性物質を含む蒸留粕乾燥穀粒（DDGS）”を処理／加工するために本発明の酵素を用いることができる。
蒸留粕乾燥穀粒は蒸留プロセスの穀類副産物であり、溶解性物質を含むことができる。これらのプロセスは、例えば飼料に適用するために（例えば家禽、ウシ、ブタおよび他の家畜用）乾燥下ですり潰された植物副産物を含むことができる。したがって、本発明の酵素は、穀粒（例えば穀物）（前記は任意の蒸留プロセスの副産物である）を処理／加工するために用いることができる。前記蒸留プロセスには、穀粒の任意の供給源、例えば蒸留酒製造業者から得られる伝統的な供給源また別にはエタノール製造プラント（工場、製粉所など）から得られるものを用いるプロセスが含まれる。本発明の酵素は蒸留酒製造業者から得られる乾燥マッシュを処理／加工するために用いることができる。このマッシュを続いて多様な目的のために、例えば家畜（特に反芻動物）の飼い葉として用いることができ、したがって本発明は、家畜（例えば反芻動物）用の飼い葉のプロセッシングのための方法および本発明のフィターゼを含む酵素処理飼い葉を提供する。
本発明のフィターゼを単独でまたは他の酵素と一緒に用いて、“蒸留粕乾燥溶解性物質（DDS）”、“蒸留粕乾燥穀粒（DDS）”、“蒸留粕濃縮溶解性物質（CDS）”、“蒸留粕湿潤穀粒（DWG）”、および“溶解性物質を含む蒸留粕乾燥穀粒（DDGS）”を処理することができる。例えば、本発明のフィターゼを図10に示すようにアルコール製造プロセスの任意の工程で用いることができる。本発明のフィターゼを用いて、任意のバイオ燃料または潜在的バイオ燃料中のリン（“蒸留粕乾燥溶解性物質（DDS）”、“蒸留粕乾燥穀粒（DDS）”、“蒸留粕濃縮溶解性物質（CDS）”、“蒸留粕湿潤穀粒（DWG）”、および“溶解性物質を含む蒸留粕乾燥穀粒（DDGS）”中で見出されるリンを含む）の生体利用性を高めることができる（例えば以下を参照されたい：C. Martinez Amezcua, 2004 Poultry Science 83:971-976）。
酒精または飲用アルコール製造：
本発明のフィターゼはまた、（バイオ燃料製造のためのバイオマスプロセッシングでの使用に加えて）アルコール製造（“酒精”の場合のアルコール、例えばビールまたはウィスキー製造）のために蒸留酒製造業者の乾燥穀粒のプロセッシングで用いることができる。本発明のフィターゼは、エタノールプラントで、例えば穀粒（例えばトウモロコシ）のプロセッシングのために用いることができる。蒸留酒製造業者の乾燥穀粒は、まず初めに穀粒（例えばトウモロコシ）を粗い粒子にすり潰してさらに熱湯に添加することによって生成できる。冷却後、酵母を添加し、混合物を数日間から１週間発酵させる。発酵後に残留する固形物が蒸留酒製造業者の穀粒である。本発明のフィターゼはこのプロセスの任意の工程で用いることができる。
処方物：
本発明は、フィターゼは（例えば本明細書で記載したもの）を含む新規な処方物およびフィターゼ（本発明の新規なフィターゼを含む処方物を含む）のために処方物を提供する。本発明のフィターゼは、単独でまたはフィターゼの混合物もしくはフィターゼおよび他の酵素（例えばキシラナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、またはレドックス酵素、例えばラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼまたはレダクターゼ）の混合物として用いるか、または処方できる。それらは、固体形で（例えば散剤、凍結乾燥調製物、顆粒、錠剤、バー、結晶、カプセル、ピル、ペレット）または液体形で（例えば水溶液、エーロゾル、ゲル、ペースト、スラリー、水性／オイルエマルジョン、クリーム、カプセル）または小胞もしくはミセル懸濁物で用いるか、または処方できる。本発明の処方物は、以下の成分のいずれかまたは組合せを含むことができる：ポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセロール、糖、例えばショ糖、ソルビトール、トレハロース、グルコース、フラクトース、マルトース、マンノース、ゲル化剤、例えばグアーゴム、カラギーナン、アルギネート、デキストラン、セルロース誘導体、ペクチン、塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、脂肪酸および脂肪酸誘導体の塩、金属のキレート物質、例えばEDTA、EGTA、クエン酸ナトリウム、抗菌剤、例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体、パラベン、ソルベート、ベンゾエート、酵素（例えばプロテアーゼ）の影響を阻止するさらに別の調節化合物、増量タンパク質、例えばBSA、コムギ水解物、ボレート化合物、アミノ酸またはペプチド、適切なpHまたは温度調節化合物、乳化剤、例えば非イオン性および／またはイオン性洗剤、レドックス剤、例えばシスチン／システイン、グルタチオン、酸化グルタチオン、還元剤または抗酸化剤化合物、例えばアスコルビン酸、ロウ、または油、または分散剤。架橋またはタンパク質改変、例えばPEG化、脂肪酸修飾、グリコシル化もまた酵素の安定性の改善のために用いることができる。
代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、新規な表現型を有する新規な細胞株を開発するために、当該細胞の遺伝的組成の改変による全細胞進化または全細胞操作を必要とし、この場合、遺伝的組成は当該細胞に本発明の核酸を付加することによって改変される。新規な表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターが、当該細胞で“リアルタイム”または“オンライン”時間枠でモニターされる。ある特徴では、複数の細胞（例えば細胞培養）が“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。ある特徴では、複数の代謝パラメーターが“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。
代謝フラックス解析（MFA）は公知の生化学フレームワークを基準にしている。線形独立代謝行列を、質量変換の法則および細胞内代謝物に関する擬似定常状態仮説（pseudo-steady state hypothsis, PSSH）により構築する。本発明の方法を実施するとき、以下を含む代謝ネットワークが構築される：
−全経路の基質、生成物および中間代謝物の実体、
−当該経路の代謝物を相互変換する化学反応の全ての実体、当該経路の反応の化学量論、−当該反応を触媒する全ての酵素の実体、酵素反応動力学、
−経路成分間の調節性相互作用、例えばアロステリズム相互作用、酵素-酵素相互作用など、
−酵素の細胞内区画化または他の任意の分子超越酵素機構、および
−代謝物、酵素もしくはエフェクター分子の任意の濃度勾配の存在またはそれらの移動に対する拡散障壁。
いったんある株について代謝ネットワークが構築されたら、行列概念による数学的提示を導入し、オンラインメタボロームデータが利用可能な場合には細胞内代謝フラックスを概算できる。
代謝表現型は細胞内の全代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境的条件、遺伝的調節、発育状態および遺伝子型などに対応する経路利用の変化に依存する。本発明の方法のある特徴では、オンラインMFA計算後に、細胞の動的対応、それらの表現型および他の特性が、経路の利用を究明することによって解析される。例えば、酵母の発酵中にグルコース供給が増加し酸素が減少したら、呼吸経路の利用は減少および／または停止し、発酵経路の利用が優越するであろう。細胞培養の生理学的状態の制御は前記経路の解析後に可能になるであろう。本発明の方法は、基質の供給、温度、誘発物質の利用などがどのように変化するかを決定することによって、発酵を如何に操作し細胞の生理学的状態が所望の方向に進むように制御すべきかを決定するために役立ち得る。本発明の方法を実施するとき、MFAの結果はまた、代謝の操作または遺伝子シャッフリングなどの実験およびプロトコルの設計のために、トランスクリプトームおよびプロテオームデータと比較することができる。
本発明の方法を実施するとき、任意の改変表現型または新規な表現型（細胞内の新規なまたは改善された特徴を含む）を付与および検出することができる。代謝または成長の任意の局面がモニターされ得る。
mRNA転写物の発現のモニタリング：
本発明のある特徴では、操作される表現型は、mRNA転写物の発現の増加もしくは減少または細胞の新規な転写物の生成を含む。mRNA転写物またはメッセージは当分野で公知の任意の方法（例えばノーザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどを含む）によって検出および定量できる。定量的増幅反応には例えば定量的PCRが含まれ、前記には、例えば定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（またはRT-PCR）、定量的リアルタイムRT-PCR、または“リアルタイム動力学的RT-PCR”（例えば以下を参照されたい：Kreuzer (2001) Br J Haematol 114:313-318；Xis (2001) Transplantation 72:907-914）が含まれる。
本発明のある特徴では、操作される表現型は相同な遺伝子の発現をノックアウトすることによって創出される。遺伝子のコード配列または1つもしくは2つ以上の転写制御エレメント（例えばプロモーターまたはエンハンサー）をノックアウトできる。したがって、転写物の発現を完全に除去するかまたは単に低下させることができる。
本発明のある特徴では、相同な遺伝子の発現の増加を含む。これは、負の制御エレメント（cis-またはtrans-で作用する転写調節エレメントを含む）のノックアウトまたは正の制御エレメントの変異導入によって達成できる。
下記で詳細に考察するように、細胞の1つもしくは2つ以上または全ての転写物は、細胞の転写物または細胞の転写物に対して代表的なもしくは前記と相補的な核酸を含むサンプルを、アレイに固定した核酸とハイブリダイズさせることによって測定できる。
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニタリング：
本発明のある特徴では、操作される表現型は、ポリペプチドの発現の増加もしくは減少または細胞の新規なポリペプチドの生成を含む。ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸は、当分野で公知の任意の方法によって検出および定量できる。前記方法には、例えば核磁気共鳴（NMR）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質の放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばSDS-PAGE）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類（FACS）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外分光光度法、ラマン分光光度法、GC-MS、並びにLC-エレクトロスプレーおよびキャップ-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分析法などが含まれる。新規な生物活性はまた、米国特許6,057,103号に記載された方法またはその変法を用いてスクリーニングできる。さらにまた、下記で詳細に考察するように、タンパク質アレイを用いて細胞の1つもしくは2つ以上または全てのポリペプチドを測定できる。
タンパク質形成性アミノ酸の生合成特異的な分別13C-標識は、13C-均質標識および非標識炭素供給化合物をバイオ反応ネットワークに補給することによってモニターできる。得られた標識パターンの解析によって、ネットワークトポロジーの包括的特徴決定およびアミノ酸の代謝フラックス比の決定の両方が可能になる（例えば以下を参照された：Szyperski (1999) Metab Eng 1:189-197）。
本発明の具体的実施態様をいくつか以下に例示する。
（１）（a）（i）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列であって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、前記核酸配列を含む単離、合成または組換え核酸；
（ii）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、前記ポリヌクレオチドを含む、前記核酸配列を含む単離、合成または組換え核酸；または
（iii）（i）または（ii）の核酸であって、配列同一性が、配列比較アルゴリズムを用いる解析によってまたは目視精査によって決定され、さらに場合によって前記配列比較アルゴリズムがBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションが規定値に設定される、前記核酸；
（b）少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SまたはY79Wである、（a）の核酸；
（c）ポリペプチドがさらにC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RまたはT349Yの少なくとも1つの変異を含む、（b）の核酸；
（d）フィターゼ活性を有するが、同種シグナル配列、プロプロテイン配列を欠くポリペプチドをコードする、またはプロモーター配列を欠く（a）、（b）または（c）の核酸；
（e）さらに異種核酸配列を含む、（a）、（b）、（c）または（d）の核酸；
（f）異種核酸配列が、異種シグナル配列、タグ、エピトープまたはプロモーター配列をコードする、（e）の核酸；
（g）異種核酸配列が、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン、または植物の小胞体もしくはエンドメンブレン系を標的とするN-末端および／またはC-末端伸長部を含むかまたは前記から成る異種シグナル配列をコードするか、または前記異種配列が制限部位をコードする、（e）または（f）の核酸；
（h）プロモーター配列が、構成的または誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーター、または植物特異的プロモーター、またはトウモロコシ特異的プロモーターを含むかまたは前記から成る、（f）の核酸；
（i）（a）から（h）のいずれかの核酸であって、フィターゼ活性が、飼料、食品もしくは飲料、または穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、ドー、果実もしくは野菜を含む飼料、食品もしくは飲料中のフィテートの加水分解の触媒作用；または微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞または植物細胞中のフィテートの加水分解の触媒作用を含むか、またはフィターゼ活性が、フィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機リン酸への触媒作用、またはフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）の加水分解を含む、前記核酸；
（j）（a）から（i）のいずれかの核酸であって、フィターゼ活性が熱安定性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い温度範囲を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、前記核酸；
（k）（a）から（j）のいずれかの核酸であって、フィターゼ活性が耐熱性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する、前記核酸；
（l）（a）から（k）のいずれかの核酸であって、フィターゼポリペプチドが約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0または前記より低い酸性pHで耐熱性または耐熱活性を有するか、または前記フィターゼポリペプチドが約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5または前記より高いpHで耐熱性または耐熱活性を有する、前記核酸；または
（m）（a）から（n）のいずれかの核酸配列と完全に相補的な核酸。
（２） （a）（1）に記載の核酸を含む、発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクターまたは
（b）（1）に記載の核酸を含む、発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクターであって、
（i）前記発現カセット、クローニングベヒクル、またはベクターが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体であるか、
（ii）（i）のウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含むか、または、
（iii）前記発現カセット、クローニングベクターまたはベクターが、細菌人工染色体（BAC）、バクテリオファージP1誘導ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）または哺乳動物人工染色体（MAC）である、
前記発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクター。
（３） （a）（２）に記載の発現カセット、ベクターもしくはクローニングベヒクル、または（1）に記載の核酸を含む、形質転換細胞または単離宿主細胞；
（b）（２）に記載の発現カセット、ベクターもしくはクローニングベヒクル、または（１）に記載の核酸を含む宿主細胞であって、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である、前記宿主細胞；
（c）（２）に記載の発現カセット、ベクターもしくはクローニングベヒクル、または（１）に記載の核酸を含む宿主細胞であって、エスケリキア（Escherichia）、バシルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、サルモネラ（Salmonella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトコッカス（Lactococcus）、およびスタヒロコッカス（Staphylococcus）属内の任意の種の細菌細胞、アスペルギルス（Aspergillus）属内の任意の菌類細胞、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）またはシュワンニオミセス（Schwanniomyces）属内の任意の酵母細胞、または大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、前記宿主細胞。
（４） （i）（１）に記載の核酸または（２）に記載の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターもしくはクローニングベクターを含む、非ヒトトランスジェニック動物；または
（ii）マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタまたは乳牛である、（i）の非ヒトトランスジェニック動物。
（５） （１）に記載の核酸または（２）に記載の発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターもしくはクローニングベクターを含む、トランスジェニック植物または種子であって、
場合によって前記植物は、トウモロコシの植物、ジャガイモの植物、トマトの植物、コムギの植物、オイルシードの植物、ナタネの植物、ダイズの植物、もしくはタバコの植物、または動物もしくは反芻動物用の飼い葉および／または飼料植物であり、
さらに場合によって、前記植物は飼い葉であるかまたは飼い葉を含み、または飼料植物は干し草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年草、ソルガム、スーダングラス、ベルトグラスまたはビュッフェルグラスであるか、または前記種子はトウモロコシの種子、コムギの穀粒、オイルシード、ナタネ、ダイズの種子、ヤシの実、ヒマワリの種子、ゴマの種子、ピーナツまたは落花生の種子、アルファルファの種子、ワタの種子、ベニバナの種子、ソルガムの種子、エンバクの穀粒、ライムギの種子、アワの種子、オオムギの種子、コメの穀粒、エンドウマメの種子またはタバコの種子であり、
さらに場合によって、前記植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、エンドウマメ、インゲンマメ、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはサトウダイコンである、前記トランスジェニック植物または種子。
（６） アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、（１）に記載の配列に対してアンチセンスであり、さらに表4、5、6、7、9に列挙された少なくとも1つの変異またはその任意の組み合わせをコードする核酸を含み、場合によって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが、約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100または約50から150塩基である、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
（７）
（a）（i）（１）に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列含む、単離、合成または組換えフィターゼポリペプチド；
（ii）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列含み、前記アミノ酸配列が表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、単離、合成または組換えフィターゼポリペプチド；または
（iii）（i）または（ii）のポリペプチドであって、配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる解析によってまたは目視精査によって決定される、前記ポリペプチド；
（b）（a）のポリペプチドであって、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SまたはY79Wである、前記ポリペプチド；または
（c）（b）のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがさらにC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RまたはT349Yの少なくとも1つの変異を含む、前記ポリペプチド；
（d）フィターゼ活性を有するが、シグナル配列またはプロプロテイン配列を欠く、（a）、（b）または（c）のポリペプチド；
（e）フィターゼ活性を有し、さらに異種配列を含む、（a）、（b）、（c）または（d）のポリペプチド；
（f）（e）のポリペプチドであって、前記異種アミノ酸配列が、異種シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種配列が識別ペプチドを含む、前記ポリペプチド；
（g）（e）または（f）のポリペプチドであって、前記異種シグナル配列が、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン、または植物の小胞体もしくはエンドメンブレン系を標的とするN-末端および／またはC-末端伸長部を含むかもしくは前記から成るか、または前記異種アミノ酸配列が酵素標的部位を含むかもしくは前記から成る、前記ポリペプチド；
（h）（a）から（g）のいずれかのポリペプチドであって、フィターゼ活性が、飼料、食品もしくは飲料、または穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、ドー、果実もしくは野菜を含む飼料、食品もしくは飲料中のフィテートの加水分解の触媒作用；または微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞または植物細胞中のフィテートの加水分解の触媒作用を含むか、またはフィターゼ活性が、フィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機リン酸への触媒作用、またはフィテート（ミオ-イノシトール-ヘキサホスフェート）の加水分解を含む、前記ポリペプチド；
（i）（i）前記ポリペプチドがグリコシル化されるかまたは前記ポリペプチドが少なくとも1つのグリコシル化部位を含む（a）から（h）のいずれかのポリペプチド、
（ii）グリコシル化がN-結合グリコシル化またはO-結合グリコシル化である（i）のポリペプチド、
（iii）酵母細胞で発現後にグリコシル化される（i）または（ii）のポリペプチド、または、
（iv）酵母細胞がP.パストリスまたはS.ポンべである、（iii）のポリペプチド；
（j）（a）から（i）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が熱安定性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い温度範囲を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、前記ポリペプチド；
（k）（a）から（j）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が耐熱性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃ から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃または前記より高い範囲の温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する、前記ポリペプチド；
（l）（a）から（k）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が、約37℃で約100から約1000単位/mgタンパク質、約500から約750単位/mgタンパク質、約500から約1200単位/mgタンパク質、または約750から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含む、前記ポリペプチド；
（m）（a）から（l）のいずれかのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0または前記より低い（より酸性の）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持するか、または前記ポリペプチドが、約pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5または前記より高い（より塩基性の）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持する、前記ポリペプチド；または
（n）（a）から（m）のいずれかのポリペプチドであって、（i）前記ポリペプチドがさらにシグナル配列（リーダー配列またはリーダーペプチド）と前記酵素との間に追加のアミノ酸残基を含む、前記ポリペプチド。
（８）（７）に記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物であって、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物/処方物、固体、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲル；または医薬処方物、食品または飼料またはそのサプリメントを含む、前記タンパク質調製物。
（９）（i）（７）に記載のポリペプチドおよび第二のドメインを含むヘテロダイマー、または、
（ii）第二のドメインがポリペプチドであり、さらに前記ヘテロダイマーが融合タンパク質であり、および／または前記第二のドメインがエピトープまたはタグである、（i）のヘテロダイマー。
（１０）（i）（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、固定化ポリペプチド、または、
（ii）細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、散剤、凝集物、表面、または多孔性構造物上にまたは前記の内部に固定化された、固定化ポリペプチド。
（１１）（i）（a）（１）に記載の核酸を提供する工程；および（b）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成する工程を含む、組換えポリペプチドを生成する方法；
（ii）（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを生成する工程をさらに含む、（i）の方法；または
（iii）宿主細胞が、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞、アスペルギルス属内の任意の菌類細胞、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス、アスペルギルス・ニゲル、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベである、（ii）の方法。
（１２）（i）（a）（７）に記載のポリペプチドまたは（１）に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）イノシトール-ヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および、
（c）（a）のポリペプチドを（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-ヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程、を含む、
イノシトール-ヘキサホスフェートをイノシトールおよび無機ホスフェートに加水分解する方法；
（ii）前記条件が、約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の温度を含む、（i）の方法；または
（iii）組成物がフィチン酸を含む、（i）または（ii）の方法。
（１３）以下の工程を含む油を脱ガムする方法：（a）（７）項7に記載のポリペプチドまたは（１）に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）油を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドおよび（b）の油を、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させ、それによって油を脱ガムする工程。
（１４）（i）（a）植物、植物部分または植物細胞を（１）に記載の核酸で形質転換する工程；
（b）前記植物、植物部分または植物細胞をフィターゼ酵素が発現される条件下で培養する工程；および、
（c）前記植物、植物部分または植物細胞を、動物用飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントに適した組成物に変換するか、または前記培養した植物、植物部分または植物細胞を動物飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントに添加して、それによって動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントを製造する工程、を含む、
動物の飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメント製造する方法；
（ii）ポリヌクレオチドが発現ベクターに含まれ、さらに場合によって前記ベクターが植物細胞で核酸を発現することができる発現制御配列を含む、（i）の方法；
（iii）動物が単胃動物であり、さらに場合によって前記動物が反芻動物である、（ii）の方法；
（iv）動物用飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントがデリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉の形である、（i）から（iii）のいずれかの方法；
（v）フィターゼ酵素がグリコシル化されるか、または前記フィターゼ酵素がグリコシル化されてペレット化条件で耐熱性または熱安定性を提供する（i）から（iv）のいずれかの方法；または
（vi）デリバリーマトリックスが穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によってペレットが水蒸気の適用を含む条件下で製造され、場合によってペレットが約5分間80℃を超える温度の適用を含む条件下で製造され、さらに場合によってペレットが、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む、（iv）または（v）の方法。
（１５）（i）（a）食用担体および（７）に記載のポリペプチドを含む食用デリバリーマトリックスを製造する工程（ここで、前記マトリックスは、水性媒体中に置かれたとき容易に分散してフィターゼ酵素を放出する）；および、
（b）前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物またはヒトに投与する工程、を含む、フィターゼ酵素サプリメントを動物またはヒトにデリバリーする方法；
（ii）食用デリバリーマトリックスが顆粒状食用担体を含む、（i）の方法；
（iii）食用デリバリーマトリックスが、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スラリー、懸濁物、スプレーまたは散剤の形であるか、またはインプラントとして存在する、（i）または（ii）の方法；
（iv）食用担体が、穀物胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズおよびひき割りコムギから成る群から選択される担体を含む、（i）、（ii）または（iii）の方法；または
（v）食用担体が油の搾りかすである穀物胚芽を含む、（i）から（iv）の方法。
（１６）（i）（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、動物またはヒト用食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化されるか、または前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント；または、
（iii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤、スラリー、懸濁物または液体形で製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される（i）または（ii）の食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント。
（１７）
（i）（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によってフィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；または
（iii）ペレットを含むかもしくはペレットの形状で製造されるか、またはペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤または液体形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形として製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）または（ii）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス。
（１８）（i）顆粒状の食用または吸収性担体および（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、食用または吸収性ペレット；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化され、および／または前記ポリペプチドが耐熱性または熱安定性であるフィターゼ活性を有する、（i）の食用または吸収性ペレット；または
（iii）、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤もしくは液体、スラリーまたは懸濁形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）または（ii）の食用または吸収性ペレット。
（１９）（i）（７）7に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、ひき割りダイズ、または、
（ii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、スラリー、懸濁物または液体形として製造される、（i）のひき割りダイズ。
（２０）以下の工程を含む、トウモロコシおよびソルガムの実の処理方法：（a）（７）に記載のポリペプチド提供する工程；（b）トウモロコシ浸漬液またはソルガム浸漬液を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドおよび（b）の組成物を、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させる工程。
（２１）（i）（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む、医薬または食養生処方物；
（ii）前記ポリペプチドがグリコシル化され、および／またはフィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の医薬または食養生処方物；
（iii）前記医薬または食養生処方物が、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤、ローションまたは液体形として処方または製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、またはインプラントとして製造される、（i）または（ii）の医薬または食養生処方物；または
（iv）顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）から（iii）のいずれかの医薬または食養生処方物。
（２２）（a）（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマー、および
（b）表2に示す任意の製品または表1に列挙する組成物のいずれか、
を含む組成物であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記組成物。
（２３）骨粗しょう症を緩和する（その進行を遅らせるか、治療または予防する）方法であって、その必要がある個体に（７）に記載のポリペプチドまたは（９）に記載のヘテロダイマーを含む組成物の有効な量（用量）を投与する工程を含み、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記骨粗しょう症を緩和する方法。
（２４）（A）（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程、および（b）前記ポリペプチドをコードする配列中の1つまたは2つ以上のアミノ酸をアルギニン、ヒスチジン、プロリン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはチロシンで置き換える工程を含む、フィターゼの胃での不安定性を増加させる方法、または、
（B）ポリペプチドが
（i）配列番号：2を含むポリペプチドである、または
（ii）（７）に記載のポリペプチドを含むポリペプチドである、
（A）の方法。
（２５）以下の工程を含む、酵素の少なくとも2つの異なる特性を改変するための方法：
（a）酵素活性を有するポリペプチドを提供する工程；
（b）（a）のポリペプチドから変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドに1つの単一アミノ酸変化を有する）；
（c）（b）の変種を2つの異なる特性についてスクリーニングする工程；
（d）所望される（c）の変種を選別し、各選別変種で単一アミノ酸変化を同定する工程；
（e）（d）の選別した単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種を作製する工程；
（f）（e）の変種を2つの改変特性についてスクリーニングする工程；および
（g）2つの改変特性を有する所望される（f）の変種を選別する工程。
（２６）以下の工程を含む、酵素の少なくとも2つの異なる特性を改変する方法：
（a）酵素活性を有するポリペプチドを提供する工程；
（b）（a）のポリペプチドから変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドに単一アミノ酸変化を有する）；
（c）（b）の変種を1つの改変特性についてスクリーニングする工程；
（d）（b）の変種を別の改変特性についてスクリーニングする工程；
（e）（c）および（d）の所望される変種を選別し、各選別変種の単一のアミノ酸変化を同定する工程；
（f）（c）および（d）の選別した単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種を作製する工程；
（g）（f）の変種を2つの改変特性についてスクリーニングする工程；および
（h）2つの改変特性を有する（g）の所望される変種を選別する工程。
（２７）以下の工程を含む、フィターゼの耐熱性から胃での安定性を切り離す方法：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；
（b）（a）のポリペプチドから変種フィターゼを作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドに単一アミノ酸変化を有する）；
（c）（b）の変種フィターゼを改変された胃での安定性および改変された耐熱性についてスクリーニングする工程；
（d）所望の胃での安定性および耐熱性を有する（c）の変種を選別し、各選別変種の単一のアミノ酸変化を同定する工程；
（e）（d）の選別した単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種フィターゼを作製する工程；
（f）（e）の変種を改変された胃での安定性および改変された耐熱性についてスクリーニングする工程；および
（g）所望の胃での安定性および耐熱性を有する（f）の変種を選別する工程。
（２８）以下の工程を含む、フィターゼの耐熱性から胃安定性を切り離す方法：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；
（b）（a）のポリペプチドからフィターゼ変種を作製する工程（ここで各変種は（a）のポリペプチドに単一アミノ酸変化を有する）；
（c）（b）の変種フィターゼを改変胃安定性についてスクリーニングする工程；
（d）（b）の変種フィターゼを改変耐熱性についてスクリーニングする工程；
（e）所望の胃安定性または耐熱性を有する（c）および（d）の変種を選別し、各選別変種の単一アミノ酸変化を同定する工程；
（f）（c）および（d）の選別単一アミノ酸変化の種々の組合せを含む新規な変種フィターゼを作製する工程；
（g）（f）の変種を改変胃安定性および改変耐熱性についてスクリーニングする工程；および
（h）所望の胃安定性および耐熱性を有する（g）の変種を選別する工程。
（２９）変種作製方法がGSSM進化、ジーンリアッセンブリー（GeneReassembly）進化および／またはTMCA進化による、（25）、（26）、（27）、または（28）に記載の方法。
（３０）（a）のフィターゼが配号：2である、（27）または（28）に記載の方法。
（３１）単一アミノ酸置換が、表4、5、6、7、9に列挙された変異のいずれかまたはその任意の組合せである、（27）または（28）に記載の方法。
（３２）単一アミノ酸置換が、（a）A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79S、Y79Wのいずれかもしくはその組合せ、または（a）およびC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163R、T349Yの少なくとも1つまたはその組合せである、（27）または（28）に記載の方法。
（３３）以下から成る群から選択される核酸を含む、単離、合成または組換え核酸：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列を含み、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、前記核酸配列を含む核酸；
（b）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、前記ポリヌクレオチド；
（c）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列であって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択される、前記核酸配列を含む核酸；
（d）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択される、前記ポリヌクレオチド；
（e）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号：1と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有する核酸配列を含み、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択され、さらに、前記ポリペプチドがC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RおよびT349Yから成る群から選択される少なくとも1つの変異
さらに含む、核酸；および
（f）配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択され、さらに、前記ポリペプチドがC226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RおよびT349Yから成る群から選択される少なくとも1つの変異をさらに含む、前記ポリヌクレオチド。
（３４）以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離、合成または組換えポリペプチド：
（a）フィターゼ活性を有し、かつ配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離、合成または組換えポリペプチドであって、表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含む、前記ポリペプチド；
（b）フィターゼ活性を有し、かつ配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離、合成または組換えポリペプチドであって、表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A48L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択される、前記ポリペプチド；および
（c）フィターゼ活性を有し、かつ配列番号：2と少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%または前記を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離、合成または組換えポリペプチドであって、表4、5、6、7、9に列挙される少なくとも1つの変異またはその任意の組合せを含み、前記少なくとも1つの変異が、A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、 G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79SおよびY79Wから成る群から選択され、さらに、C226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163RおよびT349Yから成る群から選択される少なくとも1つの変異をさらに含む、前記ポリペプチド。
（３５）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27、配列番号：29、配列番号：31、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37および配列番号：39から成る群から選択される核酸を含む、単離、合成、または組換え核酸。
（３６）フィターゼ活性を有する、配列番号：24、配列番号：26、配列番号：28、配列番号：30、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、配列番号：38および配列番号：40から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離、合成、または組換えポリペプチド。
（３７）フィターゼがグリコシル化される、（35）に記載の単離、合成、または組換え核酸。
（３８）フィターゼがグリコシル化される、（36）に記載の単離、合成、または組換えポリペプチド。
（３９）（a）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む、発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクター；または
（b）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む、発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクターであって、
（i）前記発現カセット、クローニングベヒクルまたはベクターが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体であるか、
（ii）（i）のウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含むか、または、
（iii）前記発現カセット、クローニングベクターまたはベクターが、細菌人工染色体（BAC）、バクテリオファージP1誘導ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）または哺乳動物人工染色体（MAC）である、前記発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクター。
（４０）（a）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む形質転換細胞または単離宿主細胞；
（b）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む宿主細胞であって、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である、前記宿主細胞；または
（c）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む宿主細胞であって、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞、アスペルギルス属内の任意の菌類細胞、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス、アスペルギルス・ニゲル、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベである、前記宿主細胞。
（４１）（i）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含む非ヒトトランスジェニック動物；または
（ii）マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタまたは乳牛である、（i）の非ヒトトランスジェニック動物。
（４２）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を含むトランスジェニック種子であって、
場合によって前記植物は、トウモロコシの植物、ジャガイモの植物、トマトの植物、コムギの植物、オイルシードの植物、ナタネの植物、ダイズの植物、もしくはタバコの植物、または動物もしくは反芻動物用の飼い葉および／または飼料植物であり、
さらに場合によって、前記植物は飼い葉であるかまたは飼い葉を含み、または飼料植物は干し草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年草、ソルガム、スーダングラス、ベルトグラスまたはビュッフェルグラスであるか、または前記種子はトウモロコシの種子、コムギの穀粒、オイルシード、ナタネ、ダイズの種子、ヤシの実、ヒマワリの種子、ゴマの種子、ピーナツまたは落花生の種子、アルファルファの種子、ワタの種子、ベニバナの種子、ソルガムの種子、エンバクの穀粒、ライムギの種子、アワの種子、オオムギの種子、コメの穀粒、エンドウマメの種子またはタバコの種子であり、
さらに場合によって、前記植物は、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、エンドウマメ、インゲンマメ、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはサトウダイコンである、前記トランスジェニック植物または種子。
（４３）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物であって、前記タンパク質調製物が、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物/処方物、固体、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲル；または医薬処方物、食品または飼料またはそのサプリメントを含む、前記タンパク質調製物。
（４４）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドおよび第二のドメインを含むヘテロダイマー；または、
（ii）第二のドメインがポリペプチドであり、さらに前記ヘテロダイマーが融合タンパク質であり、および／または前記第二のドメインがエピトープまたはタグである、（i）のヘテロダイマー。
（４５）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む固定化ポリペプチド、または、
（ii）細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、散剤、凝集物、表面、または多孔性構造物上にまたは前記の内部に固定化された、固定化ポリペプチド。
（４６）（i）（a）（33）、（35）または（37）に記載の核酸を提供する工程；および（b）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成する工程を含む、組換えポリペプチドを生成する方法；
（ii）（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを生成する工程をさらに含む、（i）の方法；または
（iii）宿主細胞が、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞、アスペルギルス属内の任意の菌類細胞、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス、アスペルギルス・ニゲル、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベである、（ii）の方法。
（４７）（i）（a）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）イノシトール-ヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドを（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-ヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程を含む、イノシトール-ヘキサホスフェートをイノシトールおよび無機ホスフェートに加水分解する方法；
（ii）前記条件が、約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の温度を含む、（i）の方法；または
（iii）前記組成物がフィチン酸を含む、（i）または（ii）の方法。
（４８）以下の工程を含む油を脱ガムする方法：（a）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）油を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドおよび（b）の油を、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させ、それによって油を脱ガムする工程。
（４９）（i）（a）植物、植物部分または植物細胞を（33）、（35）または（37）に記載のポリヌクレオチドで形質転換する工程；（b）前記植物、植物部分または植物細胞をフィターゼ酵素が発現される条件下で培養する工程；および（c）前記植物、植物部分または植物細胞を、動物用飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントに適した組成物に変換するか、または前記培養した植物、植物部分または植物細胞を動物飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントに添加して、それによって動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントを製造する工程を含む、動物飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメント製造する方法；
（ii）ポリヌクレオチドが発現ベクターに含まれ、さらに場合によって前記ベクターが植物細胞で核酸を発現することができる発現制御配列を含む、（i）の方法；
（iii）動物が単胃動物であり、さらに場合によって前記動物が反芻動物である、（ii）の方法；
（iv）動物用飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントがデリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉の形である、（i）から（iii）のいずれかの方法；
（v）フィターゼ酵素がグリコシル化されるか、または前記フィターゼ酵素がグリコシル化されてペレット化条件で耐熱性または熱安定性を提供する（i）から（iv）のいずれかの方法；または
（vi）デリバリーマトリックスが、穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によってペレットが水蒸気の適用を含む条件下で製造され、場合によってペレットが約5分間80℃を超える温度の適用を含む条件下で製造され、さらに場合によってペレットが、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む、（iv）または（v）の方法。
（５０）（i）（a）食用担体および（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む食用デリバリーマトリックスを製造する工程（ここで、前記マトリックスは、水性媒体中に置かれたとき容易に分散してフィターゼ酵素を放出する）；および（b）前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物またはヒトに投与する工程を含む、フィターゼ酵素サプリメントを動物またはヒトにデリバリーする方法；
（ii）食用デリバリーマトリックスが顆粒状食用担体を含む、（i）の方法；
（iii）食用デリバリーマトリックスが、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スラリー、懸濁物、スプレーまたは散剤の形であるか、またはインプラントとして存在する、（i）または（ii）の方法；
（iv）食用担体が、穀物胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズおよびひき割りコムギから成る群から選択される担体を含む、（i）、（ii）または（iii）の方法；または
（v）食用担体が油の搾りかすである穀物胚芽を含む、（i）から（iv）の方法。
（５１）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む、食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化されるか、または前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント；または
（iii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤、スラリー、懸濁物または液体形で製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される（i）または（ii）の食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント。
（５２）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む、食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によってフィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；または（iii）ペレットを含むかもしくはペレットの形状で製造されるか、またはペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤または液体形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形として製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）または（ii）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス。
（５３）（i）顆粒状の食用または吸収性担体および（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む、食用または吸収性ペレット；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化され、および／または前記ポリペプチドが耐熱性または熱安定性であるフィターゼ活性を有する、（i）の食用または吸収性ペレット；または（iii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤もしくは液体、スラリーまたは懸濁形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）または（ii）の食用または吸収性ペレット。
（５４）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む、ひき割りダイズ；または（ii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、散剤、スラリー、懸濁物または液体形として製造される、（i）のひき割りダイズ。
（５５）以下の工程を含む、トウモロコシおよびソルガムの実の処理方法：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチド提供する工程（ここで前記ポリペプチドは（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む）；（b）トウモロコシ浸漬液またはソルガム浸漬液を含む組成物を提供する工程；および（c）（a）のポリペプチドおよび（b）の組成物を、前記ポリペプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断できる条件下で接触させる工程。
（５６）（i）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む、医薬または食養生処方物；
（ii）ポリペプチドがグリコシル化され、および／またはフィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、（i）の医薬または食養生処方物；
（iii）前記医薬または食養生処方物が、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤、ローションまたは液体形として処方または製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、またはインプラントとして製造される、（i）または（ii）の医薬または食養生処方物；または、
（iv）顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、（i）から（iii）のいずれかの医薬または食養生処方物。
（５７）（a）（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドおよび（b）表2に示す任意の製品または表1に列挙する組成物のいずれかを含む組成物であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記組成物。
（５８）骨粗しょう症を緩和する（その進行を遅らせるか、治療または予防する）方法であって、前記方法がその必要がある個体に（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドを含む組成物の有効な量（用量）を投与する工程を含み、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記骨粗しょう症を緩和する方法。
（５９）胃で不安定でかつ耐熱性であるフィターゼであって、刺激胃液（SGF）で10分未満、8分未満、6分未満、4分未満、または2分未満で完全に分解され、さらに、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、または約80℃から約86℃の範囲の温度に暴露後に活性を保持する、前記フィターゼ。
（６０）刺激胃液（SGF）で4分未満に完全に分解し、さらに約80℃から約86℃の範囲の温度に暴露後活性を保持する、（59）に記載のフィターゼ。
（６１）（7）、（34）、（36）または（38）に記載のポリペプチドである、（59）または（60）に記載のフィターゼ。
（６２）以下の方法によって製造されるフィターゼ：
（i）（a）（1）、（33）、（35）または（37）に記載の核酸を提供し；さらに（b）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成することを含む方法；
（ii）（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを生成する、（i）の方法；または
（iii）宿主細胞が、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞、アスペルギルス属内の任意の菌類細胞、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス、アスペルギルス・ニゲル、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベである、（ii）の方法。
以下の実施例は例証を目的とするが、本発明を限定しようとするものではない。実施例に記載した方法は、本発明のある種の特徴を実施するために用いることができる方法の典型的なものであるが、当業者の公知の他の方法もまた用いることができる。
本発明の例示的フィターゼ活性の特徴の決定
本実施例は、本発明のポリペプチド（親フィターゼ配列番号：2の配列改変（いわゆる“進化”フィターゼ）である）のフィターゼ活性の特徴の決定および例示的フィターゼアッセイについて述べる。本フィターゼ活性アッセイを用いて、あるポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるべき十分な活性を有するか否かを決定することができる。
本発明のGSSM-改変核酸配列を発現させることによって本発明のポリペプチドを生成した後、この“進化”フィターゼポリペプチド（本実験の単一残基変異の例示的な種）を精製し、続いて種々の温度で30分間熱処理した（pH7.0、0.01% Tween）。熱処理工程後に、このサンプル（20μL）を蛍光基質（180μL）、4mMのDiFMUPを用いてpH5.5でアッセイした。この速度を対応する無処理サンプルの各々の速度と比較した。結果は図1に示されている。
別の実験では、“混ぜ合わせ”単一変異を含む本発明の“進化”フィターゼ（すなわち多重変異を含むフィターゼ）をLBCARB100TM（LBcarb 100）で一晩30℃にて増殖させた。各培養の100μLを72℃から100℃のサーモサイクラーで熱処理した。この熱処理培養の20μLを180μLの4mMのDiFMUPとpH5.5で混合した。図2に要約したように、この速度を対応する無処理サンプルの各々の速度と比較した。図3に示した表は、図2のグラフを作成するために用いたデータ（小数第二位で四捨五入）をグラフで要約している。
サンプル1から21は、図5の表に示すように、親の配列番号：2の“混ぜ合わせ”単一変異と一致する。“進化”フィターゼ番号10はGSSMによって導入されたのではない配列残基改変（配列番号：2に対して）を有し、この変異は偶発的チャンスによって導入され、本発明のこの例示的フィターゼの熱安定性に対して全く相関性をもたない可能性があるか、または相関性をもつ可能性があることは留意されたい。さらにまた、**の印を有する例示的フィターゼ19、20および21はC-末端ヒスチジン（6xHis）タグ（-RSHHHHHH）を有することに留意されたい。図5は、本明細書に詳細に記載したように、親配列番号：2に対し多重残基改変を有する例示的フィターゼを示す。図6は、本明細書に詳細に記載したように、親配列番号：2に対し単一残基改変を有する例示的フィターゼを示す。
図7は、蛍光基質、4-メチルウンベリフェリルホスフェート（MeUMB-ホスフェート、その構造もまた示されている）を用いる、本発明の例示的フィターゼアッセイを模式的に示している：（i）72℃でpH4.5および80℃で生理学的pH（pH7.4）にて20分フィターゼを熱チャレンジし、さらに（ii）残留活性を37℃でpH4.5にて試験する：
−高pHおよび低pHの両方の残留活性を測定する、
−熱処理に続いて野生型に対し残留活性を計算する。
図8は、蛍光基質MeUMB-ホスフェートがまた用いられる、本発明の別の例示的フィターゼアッセイを模式的に示している：（i）86℃でpH5.5にて30分フィターゼを熱チャレンジし、さらに（ii）残留活性を37℃でpH4.5にて試験する：
−6X変種コントロールに対して残留活性を測定する、
−最高の変種を選別するためにヒットを選別し、より高いストリンジェンシーで再アッセイする。
本アッセイを用いて、GSSM変種（配列番号：1の変種）がコードするポリペプチドのフィターゼ活性についてアッセイすることによってそれら変種ライブラリーをスクリーニングした。図9は、このライブラリーのスクリーニングプロトコル（図8に記載されている）を模式的に示している（スクリーニングしたライブラリーサイズは24,576変種である）。
耐熱性が増加し胃不安定性が増加したフィターゼの開発
本実施例は、本発明のポリペプチドのフィターゼ活性の進歩および特徴の決定について述べる。前記は親フィターゼ配列番号：2の更なる配列改変である（“進化”フィターゼ）。ここに記載する進化フィターゼは、植物での発現および広大な面積での産業化について最適化されている。本フィターゼは、親フィターゼ（配列番号：2、配列番号：1によってコードされる）と比較して高いかまたは等価の耐熱性を有し、in vitroでの胃安定性が低下している（胃不安定性が増加している）。
鋳型選択：
選択したGSSM骨格は耐熱性およびSGF分解の証拠の両方を有している。評価は、13の耐熱性フィターゼ分子（上記実施例1および下記表3に記載）のSGF特性の試験により開始した。精製フィターゼのSGFデータは、全ての耐熱性変種（耐熱性親フィターゼの単一部位変異N159V（配列番号：2-N159V）を含む）が非常に安定であることを示している（前記は2時間にわたって最小限の低下を示す）。
これまでの実験／文献は、大腸菌フィターゼappA遺伝子（K12株由来、GenBankアクセッション番号M58708）は親フィターゼ（配列番号：2）よりもSGF分解に対してより感受性が高いことを示唆している。SGF安定性の現象を理解するために、appAと親フィターゼ（配列番号：2）との間の5つの中間変種をSGF不安定性について精査した。前記のデータは、耐熱性とSGF不安定性との間の強い相関性を示唆した（図11Aおよび11B）。より重要なことには、親フィターゼ（配列番号：2）と1つのアミノ酸が異なるappA-7Xは、SGFで10分インキュベーション後に親フィターゼ（配列番号：2）と比較して〜10％以上の活性低下を示した。この新しいデータは、配列番号：2におけるある単一変異による変化はSGF耐性における変化に影響を与え得ること、およびより重要なことには、SGFアッセイで親フィターゼ（配列番号：2）と区別し得ることを示唆している。この新規な証拠によりappA-7XをSGF進化の基準コントロールとして選択し、配列番号：2を進化のためのGSSM骨格として選択した。
タンパク質精製は特徴決定プロセスの不可欠の部分であるので、配列番号：2をhis-タグ（配列番号：2-HIS）および非his-タグ（配列番号：2）分子の両方として評価した。SGFアッセイは、親フィターゼ（配列番号：2）の精製his-タグおよび精製非his-タグ型の両方について実施した。SGFアッセイは2つの異なるペプシン用量（0.15mg/mLおよび0.75mg/mL）を用いて実施した。残留活性は種々のタイムポイント（7.5、15、30、60、90および120分）で決定した。2つの型の間でSGFプロフィルに顕著な差異はなかった（図12）。
配列番号：2および配列番号：2-N159Vから配列番号：2-6Xまでの変種の精製フィターゼ分画を0.75mg/mLおよび0.15mg/mLのペプシン用量でSGF安定性について試験した（データは示されていない）。種々のタイムポイント（7.5、15、30、60、90および120分）における残留活性を決定した。両用量において、変種フィターゼ間でSGF安定性について顕著な差異は観察されなかった。配列番号：2は両用量でSGFにおける安定性が最も低かった。
SDS-PAGE解析によるSGFアッセイ：表3に列挙した全変種をSDS-PAGEによってSGF安定性について試験した（データは示されていない）。SDS-PAGEゲルを装置（Simply BlueTM SafeStain）を用いて染色した。SGFアッセイでは、配列番号：2は60分を超えるタイムコースで変成したが、配列番号：2-N159Vおよび他の変種は2時間を越える時間で顕著な変成を示さなかった。
N-グリコシル化の除去：
これまでの実験は、N-グリコシル化がSGF安定性を改善する可能性があることを示唆している。したがって、SFG安定性を低下させるために、飽和定方向変異導入（SDM）を実施して、親の配列番号：2の分子から2つのN-グリコシル化部位を除去した。第一のN-グリコシル化認識部位は、161位のアスパラギン（N）または163位のスレオニン（T）を任意の他のアミノ酸に変更することによって除去できる。第二のN-グリコシル化認識部位は339位のNまたは341位のTを同じプロセスにより変更することによって除去できる。
SDMは、所望のコドン変化を有するプライマーを構築し、続いてこのプライマーおよび鋳型（親の配列）によるPCRを利用して所望のコドン変化を含む新規な鋳型を作製することによって実施した。SDMの間に、N-グリコシル化認識に必要な4つの残基（161、163、339および341位）の各々で可能な他の19の全てのアミノ酸に置換した。4つの部位で配列番号：2ともっとも類似する特徴（比活性、耐熱性およびpHプロフィル）を示す変異を組み合せて、N-グリコシル化認識部位を一切もたない変種を作製した。親フィターゼ（配列番号：2）の特性を保存する上位4つの変異はN161K、T163R、N339EおよびT341Dであった。これらの変異を、同じ分子の両方のN-グリコシル化認識部位を除去する態様で組み合せた（表4）。
表4：N-グリコシル化マイナス変種
4つのグリコシル化マイナス変種を構築し、ピキア・パストリスで発現させ、特徴を決定した。配列番号：2のグリコシル化マイナス変種（GLY1−GLY4）および配列番号：2の2つのコントロールの耐熱性（半減期）を10分間のタイムコースにわたって80℃で熱処理することによって決定した。ピキア発現配列番号：2およびN-グリコシル化マイナス変種（変種GLY1−GLY4）はほぼ同じ耐熱性を有している。しかしながら、配列番号：2（ピキア・パストリスで発現）は、大腸菌で発現させた同じ遺伝子（配列番号：2-HIS）よりも耐熱性がはるかに強かった。指標のグリコシル化マイナス変種、GLY3変種は、配列番号：2と同じ耐熱性、pHプロフィルおよび比活性を有していた（図13）。この耐熱性データは驚くべきことで、以前の実験から得られた仮説は、グリコシル化は耐熱性を改善することを示唆していた。したがって、グリコシル化マイナス変種は耐熱性を低下させると予想された。予想したとおり大腸菌およびピキア・パストリス発現の配列番号：2との間で耐熱性に顕著な差異が存在した。しかしながら、グリコシル化がその因子でないならば、耐熱性の相違は、2つの発現宿主の異なるタンパク質折り畳み環境（ピキアの細胞内タンパク質折り畳み、大腸菌の周辺質タンパク質折り畳み）に起因せしめることができる。
このプロジェクトの後の方ではT163RおよびN339E変異が一番上のSGF不安定性変種に取り入れられた（下記のTMCASM Evolution参照）。
精製したピキア発現配列番号：2と同様に、グリコシル化マイナス変種（GLY1−GLY4変種）のフィターゼ活性およびpHプロフィルをpH2、2.5、3、4、5および6で37℃にてフィテートを用いて決定した。データ（提示されていない）は、グリコシル化マイナス変種（GLY1−GLY4）は配列番号：2と類似する活性およびpHプロフィルを有することを示している。
配列番号：2のSGF GSSM SM スクリーニング
配列番号：2-HISをGSSM鋳型として選択した。GSSMSM（遺伝子部位飽和変異導入、Gene Site Saturation MutagenesisSM）進化を実施した（例えば米国特許6,171,820号を参照されたい）。
高処理アッセイの開発：
配列番号：2および配列番号：2-6Xの培養を384ウェルのマイクロプレートで増殖させ、自動化ロボットアッセイ様式でSGF安定性について試験した。プレートを65℃で30分熱処理して細胞を溶解させた。続いて培養を未処理コントロールプレートとSGF処理プレートとに分割した。タイムポイントを10、20、30および40分に設定した（図14）。自動化アッセイから得た親フィターゼ（全細胞溶解物）のSGFプロフィルは、精製SFGのベンチスケールアッセイと同一であった。
高処理アッセイの結果：
完全な親配列（配列番号：2、ただし開始コドンを除く）、432コドンを変異させ、大腸菌で発現させ（下記で考察）、開発したフィターゼSGF高処理アッセイを用いてSGF分解改善についてスクリーニングした。132の新規な変異が、69の別個の残基位置でSGF不安定性について確認された（表5）。少なくとも8つの単一変異が、10分間での完全なタンパク質分解のSGF要件を満たした。しかしながら、これらの変異の大半が親フィターゼ耐熱性特性に4℃以上及ばない。ただ1つの変異体、Q247Hが親フィターゼよりもわずかに高いかまたは等しい耐熱性を有し、SGFで10分以内に完全な分解を示した。
GSSMスクリーニングから選別した変異体のSGF活性の低下は20分のタイムコース実験で、ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート（DiFMUP）、50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）、0.75mg/mLのペプシンを用いて決定された（図15）。これらのSGF変異の特徴は、完全な分解速度は3つのカテゴリーに分類されることを示した：迅速（2分未満）、中等度（〜10−15分）および遅い（20分以上）（遅いSGF変異体は、親フィターゼ（配列番号：2）よりわずかな改善を示した）。これらのデータは、このアッセイはフィターゼ崩壊の決定のためにより感受性が高い方法であることを示唆している。すなわちSDS-PAGEゲルでは20％の残留活性ではフィターゼバンドは検出できない（データは提示されていない）。
SGF変異体は以下の2つの方法によって耐熱性について試験された：a）65℃で30分の熱処理およびb）50−70℃の温度勾配で30分。この耐熱性のデータは、これらSGF変異体の大半が、I427T変種およびQ247H変種を除き4℃以上低下することを示唆した。この耐熱性欠如を迅速に克服するために、以下のファストトラックストラテジーを開発した：いくつかの非常に有望なSGF変異をより耐熱性のフィターゼ骨格（上記実施例1由来）に取り込み、耐熱性が獲得できるか否かを試験した（ファストトラックストラテジーの表題の項で詳細に記載）。
全ての変異を比較し、上位48をフィット値FTによって並べた（耐熱性%−SGF%＝FT）（表6）。この上位の単一部位変異を、テーラードマルチサイトコンビナトリアルアッセンブリ（Tailored Multi-Site Combinatorial AssemblySM；TMCASM）局面での組合せのために考慮した（下記参照）。
これらのデータを基にすると、親フィターゼ（配列番号：2）分子で変化させたとき、SGF不安定性の改善について他のものより好ましい一定のアミノ酸置換および残基位置が存在した（図16）。図16では、アミノ酸記号の下の数字は、この分子が原型タンパク質に何回出現するかを示している。例えば、48位の残基、スレオニンは9つの他のアミノ酸に変化させることができた（FYWMHKVIL）。もっとも頻繁にSGF不安定性を増加させた3つのアミノ酸付加はロイシン（14回）、プロリン（12回）およびヒスチジン（12回）であった。さらに別の例として、原型タンパク質に存在するアルギニン（配列番号：2では22回）は、別のアミノ酸で決して置換できなかった（置換した場合、SGF不安定性の増加を伴うことが観察された）。しかしながら、原型タンパク質の別のアミノ酸（7回）のためにアルギニンを代用したとき、各事例でSGF不安定性が増加した。このSGF GSSMデータは、SGF変異のためのホットスポットがフィターゼ分子内に存在することを示唆した（図17）。もっとも大きな一連の変異（連続して7つ）が残基145−151で生じる。さらにまた一続きの3つの残基が変異し得る3つのセットが存在した。SGF不安定性を助けるアミノ酸置換のために幾つかのアミノ酸残基が有望であり、もっとも際立ったものがT48であった。前記は9つの異なるアミノ酸によって置換された（F、Y、W、M、H、K、V、IおよびL）。48位および79位のためにHが最良の変異で、TMCAライブラリーの候補として選択した。
表5：GSSMスクリーンから発見したSGF分解が改善されたヒットの変種名称および変種
顕著な数のGSSM変種がSGF要件を満たしたが（10分後の迅速分解は10%未満）、耐熱性特性に関しては不足であった（65℃で30分の熱処理後の生存は75%未満）。分解が中等度および遅い変異体は耐熱性要件を満たしたが、SGF要件は満たさなかった。このGSSMスクリーンから得た唯一の変種56（Q247H）がSGFおよび耐熱性特性の両方を満たした。
表6：上位SGF変異体ランキング
（132の変異体の全てをランク付けして比較し、SGFスクリーンから得られた最良の変異体を決定した。上位49のSGF変異体を並べ、6つの別個のコントロール（親フィターゼ−配列番号：2）と比較した。それらの耐熱性特性（65℃での%生存 HT%）およびSGF不安定性（SGF生存、SGF%）により変種をランク付けした。随意フィット値｛（FV）＝（65℃のHT%）−（SGF%）｝を確立し、より高いFVをもつ変種（橙色で強調）がTMCA技術を用いた更なる進化のために検討された。）
上位3つの変種のうち2つ（Q246WおよびQ247H）が親フィターゼ（配列番号：2）と類似の耐熱特性および顕著なSGF不安定性の改善を示した。三次元モデリングを用いた観察によれば、W246はタンパク質の表面下に埋もれることが予想され、このタンパク質をより大きなトリプトファン側鎖に適合させる必要がある（以前はグルタミン周囲の密に詰まった環境にあった）。さらにまた、トリプトファン残基には側鎖酸素が存在しないので、G255の主鎖窒素とともにQ246側鎖のエプシロン酸素との間の水素結合の消失にもタンパク質を適合させねばならない。構造解析はまた、H247の主鎖は埋没するであろうが、イミジゾール側鎖は表面にシュノーケルのように突き出るでだろうということを示した。グルタミンからヒスチジンへの変更は比較的保存的であるが、この変更は、低pHでプロトン化のために利用できる新規な接近可能な表面基をこの領域に生じる。このプロトン化は局所的な水素結合ネットワークを確実に変化させ、局所的なタンパク質構造をこの領域で破壊しこのタンパク質を酸およびペプシンによる分解により感受性にする酸性スイッチとして潜在的に作用するであろう。
ファストトラックストラテジー
リードSGF不安定性変種（Q247Hを除く）で失われた耐熱性特性を克服するために、ファストトラックストラテジーを開始して、所望の両方の特性（SGFおよび熱耐性）を有するフィターゼ分子を設計した。より初期の進化作業（上記実施例1参照）由来の耐熱性フィターゼ（配列番号：2-N159V、配列番号：2-6Xおよび配列番号：2-9X）を、2ラウンドの位置特異的変異導入（SDM）のための骨格として選択した。
1回目のSDMは、単一SGF変異（T291V、A236TまたはL157P）の各々を3つの耐熱性骨格の各々に下記の表に示すように取り込んだ（表7）。
表7：SDMラウンドI変種
この1回目のSDMのデータは、SGF不安定性の改善は配列番号：2-N159V骨格から作製された変種に対して達成されたことを示唆した。しかしながら、これらSGF変異はまた、耐熱性特性を目標以下に低下させた。他の2つの耐熱性骨格（配列番号：2-6Xおよび配列番号：2-9X）の変種はSGF分解において最小限の改善しか示さなかった。さらにまた、より多くの変異を配列番号：2-N159V骨格に付加することにより耐熱性の目標以下に耐熱性が低下することが観察された。
2つまでのSGF変異（T291Vおよび／またはL192F）を配列番号：2-6Xおよび配列番号：2-9Xに取り込むことによって、他の2つの耐熱性変種にさらに多くのSGF変異を付加する2回目のSDMを実施した（配列番号：2-6Xおよび配列番号：2-9Xは両方ともA236T変異を有するかまたは有しない）（下記表8参照）。
表8：SDMラウンドII変種
このSDMの結果は1つの変種（変種O）をもたらした。この変種は、親フィターゼ（配列番号：2）よりわずかに改善された耐熱性およびSGFで10分未満での完全な分解を示す。例えば、種々のSGFペプシン投与量（0.3、0.2、0.1、0.05、0.025および0mg/mLペプシン）を用いたT-0およびT-10タイムポイントで、SDS-PAGEゲル（Simply BlueTM SafeStainで染色）は、変種Oは10分以内に0.3mg/mLおよび0.2mg/mLペプシンで完全に分解することを示した。SDS-PAGEゲルで再度実施した20分SGFタイムコース（0.3mg/mLペプシン）は、配列番号：2-HISは20分後に分解しないが、変種Oは約7.5分で完全に分解することを示した。
変種Oおよび配列番号：2-HISのSGF安定性は種々のペプシン用量で決定された（0.3、0.2、0.1、0.05、0.025および0.0mg/mLペプシン）（図18）。図18では、ベンチマークとして、配列番号：2-HSについて0.3mg/mLのペプシン用量がグラフに示されている。この用量応答実験は、ペプシンが完全な分解のために必要であること、および分解は単に酸性処理の関数ではないことを示した（図18）。
変種Oおよび配列番号：2-HISの半減期を75℃で決定した（図19）。2つの異なる緩衝液（100mMのクエン酸塩（pH5.5）および100mMのTris緩衝液（pH7.2））中の精製親フィターゼ（配列番号：2-HIS）およびフィターゼ変種（変種O）を75℃で45分まで（T-0、5、10、15、20、30、45分）熱処理した。この熱処理サンプルの10μLを100μLの100μM DiFMUP 50mMクエン酸塩（pH5.5）中で活性についてアッセイした。活性をT-0活性と比較した。変種OはSGFおよび熱耐性要件を満たしたが、比活性は所望よりも低かった（図19）。比活性の低下は、より初期の進化実験（実施例）から得た以前の情報（配列番号：2-6X骨格は親フィターゼ（配列番号：2）の比活性の2/3しかないことを示した）から予想された。
変種Oの欠陥を克服するためTMCAストラテジーを最大にし、本アプローチでは、親フィターゼ（配列番号：2-HIS）を鋳型として用い、比活性を維持した耐熱性変異をSGF変異と混ぜ合わせた。
TMCA SM 進化
耐熱性がSGF特性と同様に所望される変種を選別するために、高処理アッセイを改変して熱処理工程を取り入れた。テーラードマルチサイトコンビナトリアルアッセンブリ（TMCA）技術（PCT公開公報WO09/018449参照）を用いて、2つのライブラリーを作製した。TMCA進化は、多数の部位に多様な変異の種々の組合せを有する多数の子孫ポリヌクレオチドを生成するための方法を含む。本方法は、部分的には少なくとも1つまたは2つ以上の以下の工程を組み合せることによって実施することができる：
（“第一の”または“鋳型”）ポリヌクレオチドの配列情報を入手する工程：例えば、第一のまたは鋳型配列は、野生型でも（例えば配列番号：2-N159V）、変異（例えば下記で考察する“D164R鋳型”）配列でもよい。配列情報は、完全なポリヌクレオチド（例えば遺伝子またはオープンリーディングフレーム）であっても、または対象の部分領域（例えば結合、結合特異性、触媒作用または基質特異性のための部位をコードする配列）であってもよい。
第一のまたは鋳型ポリヌクレオチド配列の全長で対象の3つまたは4つ以上の変異を同定する工程：例えば、変異は、第一または鋳型配列内の3、4、5、6、8、10、12、20またはそれ以上の位置に存在し得る。この位置は、絶対的な位置によってまたは周囲の残基または相同性の関係によって決定することができる。フィターゼポリペプチドのTMCAのために、酵素性能の改善をもたらした上位のSGFおよび熱耐性アミノ酸変化を対象の変異として取り入れた。変異の位置とどちらかの側でフランキングする配列は既知であり得る。各変異位置は2つまたは3つ以上の変異を、例えば異なるアミノ酸について含むことができる。そのような変異は、遺伝子部位飽和変異導入(商標)（GSSMSM）技術を用いて同定できる(前記技術は本明細書および米国特許6,171,820号および6,764,835号に記載されている)。
対象の変異を含むプライマー（例えば合成オリゴヌクレオチド）を提供する工程：ある実施態様では、プライマーは対象の各変異に対して提供される。したがって、対象の3つの変異を有する第一または鋳型ポリヌクレオチドは、該当位置で3つのプライマーを利用することができる。プライマーはまた縮退位置を含むプライマープールとして提供され、それにより対象の変異は、一続きの任意のヌクレオチドまたは天然に存在するアミノ酸または当該一続きのサブセットであり得る。例えば、脂肪族アミノ酸残基のための変異を優先するプライマープールを提供することができる。
プライマーはフォワードまたはリバースプライマーとして調製できる、あるいは、プライマーは少なくとも1つのフォワードプライマーおよび少なくとも1つのリバースプライマーとして調製できる。変異の位置が接近しているとき、2つ以上の位置に変異を含むか、または複数の位置に異なる変異の組合せを含むプライマーを用いるのが便利であり得る。
鋳型配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程：第一または鋳型ポリヌクレオチドは環状でも、スーパーコイルでもよく、例えばクローニング、配列決定または発現用プラスミドまたはベクターであり得る。ポリヌクレオチドは一本鎖（“ssDNA”）でもまたは二本鎖（“dsDNA”）でもよい。例えば、TCMA方法では、スーパーコイル（“sc”）のdsDNA鋳型は95℃で1分の加熱工程に付される（以下を参照されたい：Levy, 2000, Nucleic Acid Res 28(12):e57(i-vii)）。
反応混合物の鋳型ポリヌクレオチドにプライマーを添加する工程：プライマーおよび鋳型ポリヌクレオチドを、前記プライマーが前記鋳型ポリヌクレオチドとアニールできる条件下で一緒にする。TMCAプロトコルのある実施態様では、プライマーはただ1つの反応混合物中のポリヌクレオチドに添加されるが、多重反応に添加してもよい。
ポリメラーゼ伸長反応を実施する工程：伸長生成物（例えば“子孫”または“改変伸長ポリヌクレオチド”として）を通常の手段によって増幅することができる。前記生成物は、長さ、配列、所望の核酸特性について解析するか、またはポリペプチドとして発現させることができる。他の解析方法には、in-situハイブリダイゼーション、配列スクリーニングまたは発現スクリーニングが含まれる。前記解析は、所望の特性のために1回または2回以上のスクリーニングおよび選別工程を含むことができる。
前記生成物で細胞（または他の発現系、例えば無細胞系）を形質転換することができる。無細胞系は、DNA複製、修復、組換え、転写に関連する酵素または翻訳のための酵素を含むことができる。例示的宿主には細菌、酵母、植物および動物細胞並びに細胞株が含まれ、前記には大腸菌、シュードモナス・フルオレセンス、ピキア・パストリス、アスペルギルス・ニゲルが含まれる。例えば、大腸菌のXL1-BlueまたはStb12株を宿主として用いてもよい。
本発明の方法を同じプライマーまたは異なるプライマーとともに種々の反応条件下で用いて、種々の組合せの変異または種々の変異数を有する生成物の生成を促進できる。
上記に記載の例示的方法を実施することによって、本プロトコルはまた、このTMCA進化によって生成される1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを提供する（続いて前記ポリヌクレオチドを所望の特性についてスクリーニングまたは選別することができる）。1つまたは2つ以上の子孫ポリヌクレオチドをポリペプチドとして発現させ、場合によって所望の特性についてスクリーニングまたは選別してもよい。したがって、TMCA進化プロトコルのこの実施態様は、ポリヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド並びにそのようなポリペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチドのプールを提供する。TMCA進化プロトコルのこの実施態様は、さらに所望の活性を有する1つまたは2つ以上のポリペプチドをコードする1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを得るために当該ライブラリーをスクリーニングまたは選別することによるライブラリーのスクリーニングを提供する。
PCT公開公報WO2009/018449に記載されたTMCA進化プロトコルの別の実施態様は、複数の改変ポリヌクレオチドを生成する方法を含む。そのような方法は一般的に以下の工程を含む：（a）少なくとも3つのプライマーをただ1つの反応混合物中の二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに添加する工程（ここで前記少なくとも3つのプライマーはオーバーラップせず、前記少なくとも3つのプライマーの各々は他のプライマーとは異なる少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つのプライマーは当該鋳型のマイナス鎖とアニールできるフォワードプライマーであり、さらに少なくとも1つのプライマーは当該鋳型のプラス鎖とアニールできるリバースプライマーである）；および（b）前記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に付して、前記少なくとも3つのプライマーから複数の伸長改変ポリヌクレオチドを得る工程。
PCT公開公報WO2009/018449に記載されたTMCA進化プロトコルのまた別の実施態様は、リガーゼで処理されていない複数の伸長生成物で細胞を形質転換する方法を含む。本発明の別の実施態様では、複数の伸長改変ポリヌクレオチドが細胞から回収される。別の実施態様では、回収した前記複数の伸長改変ポリヌクレオチドは、例えば前記複数の伸長改変ポリヌクレオチドの少なくとも1つを発現させ、それらから発現されたポリペプチドを解析することによって解析される。別の実施態様では、対象の変異を含む前記複数の伸長改変ポリヌクレオチドが選別される。
TMCA進化プロトコルの別の実施態様では、鋳型ポリヌクレオチドに関する配列情報が得られ、鋳型ポリヌクレオチドに沿って対象の3つまたは4つ以上の変異を同定することができる。別の実施態様では、複数の伸長改変生成物で細胞を形質転換する前に、ポリメラーゼ伸長によって得られた生成物を解析することができる。
TMCA進化プロトコルのある実施態様では、ポリメラーゼ伸長によって得られた生成物は、酵素、例えば制限酵素（例えばDpnI制限酵素）で処理され、それによって鋳型ポリヌクレオチド配列が破壊される。前記処理生成物で細胞（例えば大腸菌細胞）を形質転換できる。
TMCA進化プロトコルのある実施態様では、少なくとも2つ、または少なくとも3つ、または少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つ、または少なくとも7つ、または少なくとも8つ、または少なくとも9つ、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、またはそれ以上のプライマーを用いることができる。ある実施態様では、各プライマーはただ1つの点変異を含む。別の実施態様では、2つのフォワードまたは2つのリバースプライマーは、当該鋳型ポリヌクレオチドの同じ位置に異なる変異を含む。別の実施態様では、少なくとも1つのプライマーは、当該鋳型ポリヌクレオチドの異なる位置に少なくとも2つの変異を含む。さらに別の実施態様では、少なくとも1つのプライマーは異なる位置に少なくとも2つの変異を含み、さらに少なくとも2つのフォワードまたは2つのリバースプライマーは当該鋳型ポリヌクレオチドの同じ位置に異なる変異を含む。
TMCA進化プロトコルのある実施態様では、フォワードプライマーはフォワードグループに分類され、リバースプライマーはリバースグループに分類され、フォワードグループのプライマーおよびリバースグループのプライマーは、互いに独立して、鋳型ポリヌクレオチドにおける位置とは無関係に対応するグループで等しい濃度となるように標準化され、さらに標準化した後で等しい量のフォワードおよびリバースプライマーが反応に添加される。この標準化方法では、いくつかの位置の組合せに偏向が生じ得る。この偏向は、例えば多数のプライマーを含むある位置に比較してただ1つのプライマーしか含まないある位置のプライマー濃度が相対的に低いために生じ得る。“位置偏向”は、そのフォワードまたはリバースプライマーグループ内で他の複数の位置と比較してある単一位置へのプライマーの取り込みについて強い優先性を示すポリヌクレオチドが生じることを指す。これによって、そのフォワードまたはリバースプライマーグループ内で、ある単一プライマー位置に高率の変異が生じるが、別の位置では変異率が低い改変ポリヌクレオチドの組合せが生じ得る。TMCAの目標が、鋳型に可能なあらゆる変異の組合せを含む子孫ポリヌクレオチドを生成することである場合は、前記の偏向は好ましくない。この偏向は、例えばプライマーを等しくされるべき各位置でのプールとして標準化することによって修正することができる。
TMCA進化プロトコルのある実施態様では、プライマー正規化は、鋳型ポリヌクレオチドにおけるプライマーの位置にしたがって以下のようにプライマーを多数のグループに編成することによって実施される：鋳型上の同じ選択領域をカバーするプライマーは1つのグループに存在し；各グループ内の分類プライマーを等しい濃度になるように正規化し；あるグループ内のフォワードプライマーを1つのフォワードグループにプールして、各グループのフォワードプライマー間で等しくなるように濃度を正規化し；あるグループ内のリバースプライマーを1つのリバースグループにプールして、各グループのリバースプライマー間で等しくなるように濃度を正規化し；さらに等量のプールしたフォワードおよびリバースプライマーを反応に添加する。位置組合せについて偏向は認められなかった。
TMCA進化プロトコルのある実施態様では、縮退プライマー（各々が縮退位置を含む）のセットが提供される（ここで対象の変異は縮退位置における一連の異なるヌクレオチドである）。別の実施態様では、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも1つのコドンに対応する少なくとも1つの縮退コドンおよび、鋳型ポリヌクレオチド配列の当該コドンに隣接する配列と相同な少なくとも1つの隣接配列を含む縮退プライマーのセットが提供される。別の実施態様では、前記縮退コドンはN,N,Nであり、20の天然に存在するアミノ酸のいずれかをコードする。
PCT公開公報WO2009/018449に記載されたTMCA進化プロトコルの別の実施態様は、関心のある変異を含む複数の改変ポリヌクレオチドを生成する方法を含む。そのような方法は一般的に以下の工程を含む：（a）少なくとも2つのプライマーをただ1つの反応混合物中の二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに添加する工程（ここで前記少なくとも2つのプライマーはオーバーラップせず、前記少なくとも2つのプライマーの各々は他のプライマーとは異なる少なくとも1つの変異を含み、少なくとも1つのプライマーは当該鋳型のマイナス鎖とアニールできるフォワードプライマーであり、さらに少なくとも1つのプライマーは当該鋳型のプラス鎖とアニールできるリバースプライマーである）；および（b）前記反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に付して、前記少なくとも2つのプライマーから複数の伸長改変ポリヌクレオチドを得る工程；（c）前記複数の伸長改変ポリヌクレオチドを酵素で処理し、それによって鋳型ポリヌクレオチドを破壊する工程；（d）リガーゼ処理を施していない、処理した前記伸長改変ポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程（e）細胞から複数の伸長改変ポリヌクレオチドを回収する工程；および（f）関心のある変異を含む複数の伸長改変ポリヌクレオチドを選別する工程。
TMCA技術を用いて、小ライブラリー（ライブラリーA）を迅速な作業時間およびプロセスの単純化のために作製した（5つまでのSGF変異および2つまでの耐熱性変異を含む96の異なる変種（表9参照））。ライブラリーAは、ただ1種の鋳型（配列番号：2-N159V）および下記表10に列挙したオリゴを用いた。要求されるSGF特性を有し非常に耐熱性の変種を作製する潜在能力を高めるために、第二のより広範なライブラリー（ライブラリーB）もまたTMCA技術を用いて作製した（7つまでのSGF変異および5つまでの耐熱変異を含む4096の異なる変種（表9を参照されたい））。ライブラリーBは、2つの鋳型（配列番号：2-N159Vおよび“D164R鋳型”を2つの別々のTMCA反応で用いた。各反応は表11に列挙したオリゴを使用し、2つのサブライブラリーを生じた。“D164R鋳型”はライブラリーAで生成され、D164R変異を取り込んだ配列番号：2-N159V骨格から成っていた。両ライブラリーをpQE60ベクター（Qiagen, Valencia, CA）で増幅させ、続いて宿主PHY635（下記に記載）を形質転換して初期および二次フィターゼ活性を確認した。
合計8つの有望な耐熱性SGF不安定性ヒットがライブラリーをスクリーニングすることによって見出された。5つの耐熱性（親フィターゼ（配列番号：2）よりも〜5℃高いTm、表13）SGF不安定性変種が小ライブラリーで見出された（変種AA−EE、表12）。より大きなTMCAライブラリーは10の候補を作出したが、わずかに3候補が変種AA−EEよりも強く耐熱性であった（変種FF−HH（表13）は親フィターゼ（配列番号：2）よりも〜7.5℃高いTmを有していた）。特徴決定スクリーニングのため、最良の単一部位SGF変異（変種56）とともにこれらの変種を（全てをグリコシル化型またはグリコシル化マイナス型として）ピキア・パストリスで発現させた（グリコシル化マイナス型は2つの変異（T163RおよびN339E）を含み、それらはN-グリコシル化除去実験に由来する（上記を参照されたい））。
SGF処理時のSGF不安定フィターゼ変種の残留活性を決定した（図20）。精製親フィターゼ（配列番号：2）、変種56および変種AA−HHをSGF（pH1.2）、ペプシン（10U/μgフィターゼ）により10.0分のタイムコースで処理した。フィターゼの安定性はDiFMUPでの活性によって決定した。SGF不安定フィターゼ変種の比活性を配列番号：2のフィターゼと比較した（図21）。精製親フィターゼ（配列番号：2）および指標フィターゼ変種をフィテートでの活性について試験した。精製タンパク質を4mMフィテート、100mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で37℃にてアッセイした。グリコシル化および非グリコシル化ピキア発現指標変種間でSGFおよび熱耐性特性において顕著な変化は全く存在しなかった（図20および21）。以前の実験は、グリコシル化変種はより強い耐熱性を有しSGFに対してより耐性であると予測したが、我々のデータはそうではないことを示唆した。
さらにまた、グリコシル化変種、グリコシル化マイナス変種および親フィターゼ（配列番号：2）のpHプロフィルを、37℃でpH2、2.5、3、4、5および6でフィテートにおけるフィターゼ活性について作成した。アッセイした全てのフィターゼが同様なpHプロフィルを示した（データは提示されていない）。
表9：TMCA進化のために選択した変異
（TMCA技術を利用し、配列番号:2-N159Vを骨格として用いて耐熱性変異およびSGF変異を混ぜ合わせた。）
表10：ライブラリーAで用いたオリゴ
表11：ライブラリーAで用いたオリゴ
変種AAは配列番号：28（配列番号：27によってコードされる）、変種BBは配列番号：32（配列番号：31によってコードされる）、変種CCは配列番号：34（配列番号：33によってコードされる）、変種DDは配列番号：36（配列番号：35によってコードされる）、 変種EEは配列番号：38（配列番号：37によってコードされる）、変種FFは配列番号：24（配列番号：23によってコードされる）、変種GGは配列番号：26（配列番号：25によってコードされる）、変種HHは配列番号：40（配列番号：39によってコードされる）、変種56は配列番号：30（配列番号：29によってコードされる）である。しかしながら、配列番号：23、25、27、29、31、33、35、37および39は、天然のシグナル配列をコードする核酸を含まず、配列番号：24、26、28、30、32、34、36、38および40は天然のシグナル配列のアミノ酸（配列番号：2のアミノ酸1−22）を含まないことに留意されたい。開始メチオニン配列（ATG）が参照配列の各々に付加される。これらの変種の点変異の位置（例えば表12に列挙されている）は、あたかも天然のシグナル配列が存在するかのように数えられる。
表13：配列番号：2およびリードSGF候補の溶解温度（Tm）
（精製親フィターゼ（配列番号：2）および9つの指標フィターゼ候補をピキア・パストリスで発現させ、精製して100mMのクエン酸塩（pH5.5）で透析し、さらにApplied Thermodynamics N-DSCIIを用いTmについて試験した。）
動物試験のための上位4変種の選択
9つのタイムポイント（0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0および10分）におけるSGF SDS-PAGE解析（フィターゼ1μg当たりペプシン用量10Uを使用）のために、本特徴決定データ（データは提示されていない）を基にして4変種を大規模発酵用に選択し、動物試験で用いた。この4つの選択指標変種は5分以内に完全なタンパク質分解を示した。
選択リード変種：
変種56（配列番号：30、配列番号：29によりコードされる）は原型親フィターゼ（配列番号：2）分子に最も近い変種で、1つのSGF変異および2つのグリコシル化マイナス変異を有する。
変種AA（配列番号：28、配列番号：27によりコードされる）は、2つのSGF変異、2つの耐熱性変異および2つのグリコシル化マイナス変異を有する。
変種FF（配列番号：24、配列番号：23によりコードされる）は、3つのSGF変異、4つの耐熱性変異および2つのグリコシル化マイナス変異を有する。
変種GG（配列番号：26、配列番号：25によりコードされる）は、3つのSGF変異、5つの耐熱性変異、2つのグリコシル化マイナス変異を有する。
リード候補の発酵：
リード変種（変種56、変種AA、変種FFおよび変種GG）を動物試験のために選択し、30L発酵にスケールアップし、少なくとも5gの各タンパク質を得た。活性およびブラッドフォードタンパク質解析を基準にして、各変種について16g以上のタンパク質が生成された。
回収サンプルを凍結乾燥させ、続いて再懸濁し、熱処理して潜在的微生物の増殖を廃し、続いて再度凍結乾燥させた。これらのサンプル（表14）を動物試験に用いた。この4つの選択変種とともに、他のSGF不安定性変種（表12）の小サンプル（15−50mg）をベンチスケールでの評価に用いた。
表14：動物試験およびベンチスケール評価に用いたサンプルの明細
（活性アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイの両アッセイを用いて凍結乾燥生成物を定量した。）
方法
増殖、誘導および精製
大腸菌によるフィターゼ発現（2Lスケール）：
全てのフィターゼ変種（グリコシル化試験のものを除く）を大腸菌、PHY635株（phy-株；P1ファージ形質導入により大腸菌CU1867株（ATCC47092；appA欠損）を作製することによって作出）で発現させた。出発培養のフィターゼ変種を5mLのLBcarb100中で37℃にて約18時間増殖させた。前記出発培養の一晩培養を2LのLBcarb100に接種し、この培養のOD600が約0.5に達したときに1mMのIPTGで誘導した。24時間の誘導の後で、培養を20分間遠心（Sorvall RC 5CPlus Centrifuge；SLC-4000ローター、7000RPM；9220 RCF）してペレットを形成することによって前記培養を採集した。細胞を50mMのTris（pH8.0）に再懸濁し、微量流体化装置（Microfluidics Model 11OL）により細胞溶解させた。細胞屑を除去するために、全細胞溶解物を30分間遠心した（Sorvall RC 5CPlus；F13S-14X50ローター、12500RPM；25642 RCF）。清澄な細胞溶解物を無菌的フィルターに通し、AKTA FPLCによりHisTrap FF5mLカラムを通過させてフィターゼタンパク質を精製した。2Mのイミジゾール、50mMのTris（pH8.0）グラジエントによりフィターゼを溶出させた。活性については100uMのDiFMUP、100mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）により、タンパク質の純度についてはSDSゲル解析により分画を試験した。
ピキア・パストリスによるフィターゼ発現（1Lスケール）：
最終的リードフィターゼ変種（変種AA−HH並びに変種56のグリコシル化-プラスおよびグリコシル化-マイナス型）および配列番号：2のグリコシル化-マイナス型（変種GLY1−GLY4）をピキア・パストリス（X-33）で発現させた。出発培養のフィターゼ変種を10mLのBMGYzeo100中で30℃にて約18時間増殖させ（OD600は約15−20）、細胞をペレットにし、さらに10mLのMES*培養液（0.5％のMeOHを含む）中に再懸濁させた。この出発培養を1LのMES*培養液（0.5％のMeOHを含む）に接種し、30℃にて3−4日間インキュベートした（5mLのMeOHをタンパク質の誘導のために24時間毎に添加した）。分泌タンパク質を細胞塊から遠心（Sorvall RC 5CPlus Centrifuge；SLC-4000ローター、7000RPM；9220 RCF）によって分離し、分離装置（MiniKros Tangential Flow Separation Module；SpectrumLab M215-600-01P）を用いて濃縮および緩衝液交換（100mMの酢酸ナトリウム、pH5.5）を実施した。
純度を高めるために、AKTA FPLCによりHiTrapTM QFF5mLカラムを通過させた。1MのNaCl、100mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）グラジエントを用いてフィターゼを溶出させた。活性については100uMのDiFMUP、100mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）により、タンパク質の純度についてはSDSゲル解析により分画を試験した。
フィターゼの特徴
タンパク質の耐熱性：
示差スキャン熱量分析法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）：ピキア発現フィターゼ変種のタンパク質溶解温度（Tm）をApplied Thermodynamics N-DSCIIを用いて決定した。タンパク質サンプル（約1.0mg/mL）を100mMのクエン酸塩（pH5.5）で透析し、試験チャンバー（600uL）にロードし、コントロールサンプル（100mMのクエン酸塩（pH5.5）の600uL）と比較し、60℃から100℃までさらに100℃から60℃まで（タンパク質の再折り畳みを評価するため）スキャンした。
改変Tm測定：予備的な特徴決定時に全細胞溶解物および非精製タンパク質サンプルを評価してSGF不安定性フィターゼと親フィターゼ（配列番号：2）を比較するために迅速耐熱性測定ツールを開発した。タンパク質サンプルを96ウェルのPCRプレート上で一列に並べ、60から80℃までのグラジエントにわたってPCRマシーン上で30分間熱処理した。熱処理タンパク質サンプル（10μL）を蛍光基質（100uMのDiFMUP、50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5））と混合し、5分のタイムコースにわたって蛍光の変化を測定した（EX360nm/EM465nm）。50%の活性が残存する温度を親フィターゼ（配列番号：2）の性能（50%活性温度）と比較した。
SGFアッセイ（改変規模縮小）
多重ミニ反応（種々のタイムポイントで反応停止）を確立させて、フィターゼ分子のSGF不安定性を決定した。コントロールT-0参照として、プレクェンチSGF反応もまた実際の実験と同様に実施した。10μLのタンパク質サンプルをpH1.2の50μL SGF（2mg/mLのNaCl、7uL/mLの濃塩酸）中でペプシン（用量0.15、0.30および0.75mg/mL）とともにあるタイムコースにわたって37℃にてインキュベートした。反応を10μLの200mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH10.0）の添加により停止させた（この工程はT-0参照のためのタンパク質サンプルの添加前に実施した）。
SGF SDSゲル解析：前記SGF反応停止から20μLを取り出し、210uLのSDSサンプル緩衝液と混合し、10分間沸騰させて15μLをトリス-Gly SDS-PAGEゲルにロードした。180V、250mAを約1時間または完了までSDSサンプル泳動緩衝液に適用した。
SGF活性解析：前記SGF反応停止から10μLを取り出し、基質（190μLのDiFMUP（100uM）、50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5））と混合し、5分のタイムコースにわたって蛍光の変化を測定した（EX360nm/EM465nm）。
SGFアッセイ（米国局方24,2000を応用、擬似胃液、TS、米国処方集（Board of Trustees, Eds,; United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD, P. 2235））
37℃に予備加熱したSGFの950μL（2mg/mLのNaCl、HClでpH1.2に調整）中で5mg/mLのフィターゼの50μLを10Uペプシン/μg試験タンパク質とともに37℃にて10分間のタイムコースにわたってインキュベートした。タイムポイントは、50μLの反応物を取り出し、これを50μLの停止溶液（200mMの炭酸ナトリウム、pH10.0）と混合することによって達成した。タイムポイント（停止サンプル）は、アッセイが完了し解析の準備が整うまで氷上で保持した（SGFアッセイ（改変規模縮小）の項で概略したSGF SDSゲル解析およびSGF活性解析を順守した）。
フィターゼ比活性の解析
37℃に予備加熱した950μLのフィテート（4.0mM）、酢酸（100mM）（NaOHでpH4.5に調整）中でフィターゼサンプル（50μL）を相対的活性についてアッセイした。反応は、反応物50μLを取り出し、50μLの発色/停止溶液（20mMのモリブデン酸アンモニウム／5mMのバナジウム酸アンモニウム／10%硝酸溶液）と混合することによって停止させた。10分後に発色のタイムポイントを415nmで測定し、結果は時間に対してプロットした。反応速度をホスフェート標準物と比較し相対速度を決定した。
比活性は、タンパク質濃度を基準にして評価した相関関係を計算することによって決定した。タンパク質濃度は260nm/280nm解析によって決定した（1A OD280は0.93mg/mLに対応する）。二次比較は、指標フィターゼおよび親フィターゼ（配列番号：2）の活性関係を比較するために、SDSゲルに等しいフィターゼ活性をロードし、GelProゲルデンシトメトリー解析を用いてタンパク質バンドの濃さを定量することによって実施した。
フィターゼのpHプロフィル解析
より広い緩衝液性能（pH2−6）をもつように基質を改変した点を除いて、上記に規定した活性プロトコルと同じである。基質：4mMのフィテート、80mMのリンゴ酸、80mMのギ酸および80mMの酢酸ナトリウム（種々のpH（2、2.5、3、4、5および6pHユニット）に調整）。各変種について評価した相関関係を活性の最適条件（pH4であった）と比較した。
材料：
SGFアッセイ
ブタの胃の粘膜に由来するペプシン（Sigma P-6887）
HCl（Fisher UN1789）
塩化ナトリウム（Fisher S-271-1）
6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート（DiFMUP）（Invitrogen-D22068）
4−20%トリス-グリシンSDSPAGEゲル（Invitrogen EC60255BOX）
Novex トリス-グリシンSDSサンプル緩衝液（InvitrogenNovex LC2676）
Novex SDS泳動緩衝液（Invitrogen LC2675）
Simply BlueTM SafeStain（Invitrogen LC6065）
フィターゼ比活性解析
コメ由来12ナトリウムフィテート（Sigma P-3168）
メタバナジウム酸アンモニウム（Acros Organics 194910500）
モリブデン酸アンモニウム（Sigma A-7302）
リン酸カリウム（二塩基性）（Fisher P288-500）
70%硝酸（Sigma 380091）
25%アンモニウム溶液（Atlas Chemical AA-3060）
タンパク質精製
HisTrapTM FF5ｍL Ni-セファロースカラム（GE Healthcare 17-5255-01）
HisTrapTM QFF5ｍL 陰イオン交換カラム（GE Healthcare 17-5156-01）
イミジゾール（Sigma I-0125）
本明細書に提供したように、多数の実施態様をこれまで述べてきた。にもかかわらず、本明細書に開示した範囲および本質から逸脱することなく多様な改変を実施できることは理解されよう。したがって、他の実施態様も以下の特許請求の範囲内に包含される。

Claims (12)

  1. フィターゼ活性を有する変種ポリペプチドであって、配列番号２記載のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列に対する単一アミノ酸置換の組合せを有し、以下からなる群より選ばれる前記変種ポリペプチド：
    (a)配列番号２８（配列番号２７によってコードされる）の配列を有する変種AA；
    (b)配列番号３２（配列番号３１によってコードされる）の配列を有する変種BB;
    (c)配列番号３４（配列番号３３によってコードされる）の配列を有する変種CC;
    (d)配列番号３６（配列番号３５によってコードされる）の配列を有する変種DD;
    (e)配列番号３８（配列番号３７によってコードされる）の配列を有する変種EE;
    (f)配列番号２４（配列番号２３によってコードされる）の配列を有する変種FF;
    (g)配列番号２６（配列番号２５によってコードされる）の配列を有する変種GG;
    (h)配列番号４０（配列番号３９によってコードされる）の配列を有する変種HH;
    (i)配列番号３０（配列番号２９によってコードされる）の配列を有する変種56;
    (j)A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種A；
    (k)A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, A236TおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種B；
    (l)A47F, T136H, L157 P, N159V, C226D, V233Wおよびのアミノ酸置換を有する変種C；
    (m)A47F, T136H, L157P, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種G；
    (n)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, S236T Q275VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種H；
    (o)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種I；
    (p)A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233WおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種J；
    (q)A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種L；
    (r)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, Q275VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種M；
    (s)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種N；
    (t)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, Q275V, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種O；
    (u)A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, A236TおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種P；
    (v)A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, A236T, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種Q；
    (w)A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, A236T, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種R；
    (x)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, A236T, Q275VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種S；
    (y)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, A236T, Q275V, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種T；および、
    (z)A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, A236T, Q275V, T291VおよびT349Yのアミノ酸置換を有する変種U。
  2. 請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
  3. 請求項２記載の核酸を含む、発現カセット、ベクター、クローニングベヒクル、発現ベクターまたはクローニングベクター。
  4. 請求項２記載の核酸を含む、形質転換細胞または宿主細胞。
  5. 請求項１記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物であって、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物/処方物、固体、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲル；または医薬処方物、食品または飼料またはそのサプリメントを含む、前記タンパク質調製物。
  6. 請求項１記載のポリペプチドを含む、動物またはヒト用食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメントであって、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、散剤、スラリー、懸濁物または液体形で製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて製造されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって製造される、前記食品、飼料、食品サプリメントまたは飼料サプリメント。
  7. 細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、散剤、凝集物、表面、または多孔性構造物上にまたはそれらの内部に固定化された請求項１記載のポリペプチド。
  8. （a）請求項１記載のポリペプチドを提供する工程；
    （b）イノシトール-ヘキサホスフェートまたはフィチン酸を含む組成物を提供する工程；および、
    （c）（a）のポリペプチドを（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-ヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程、を含む、
    イノシトール-ヘキサホスフェートをイノシトールおよび無機ホスフェートに加水分解する方法。
  9. 請求項１記載のポリペプチドを含む動物飼料または食品、または飼料サプリメントもしくは食品サプリメントを製造する方法であって、前記動物用飼料または食品、または飼料もしくは食品サプリメントがデリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉の形であり、前記ペレットが水蒸気の適用を含む条件下で製造される、前記方法。
  10. 請求項１記載のポリペプチドを含む組成物。
  11. （Ａ）（ａ）請求項２に記載の核酸を提供する工程；および
    （ｂ）（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを生成する工程を含む、
    請求項１記載のポリペプチドを製造する方法；または、
    （Ｂ）（ｉ）宿主細胞が、エスケリキア、バシルス、ストレプトミセス、サルモネラ、シュードモナス、ラクトコッカス、およびスタヒロコッカス属内の任意の種の細菌細胞、大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バシルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス、
    （ii）宿主細胞が、アスペルギルス属内の菌類細胞またはアスペルギルス・ニゲル、または、
    （iii）宿主細胞が、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス属内の任意の酵母細胞、またはキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエ、またはシゾサッカロミセス・ポンベである、
    （Ａ）の方法。
  12. 請求項１記載のポリペプチドを発酵、エタノール産生またはアルコール産生に使用する方法であって、前記ポリペプチドがエタノール収量を増加させる、カルシウム塩およびマグネシウム塩を含むスラッジを加水分解する、またはフィチン酸およびフィチン酸の塩を大きく低下させるまたは除去する、前記方法。
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