CN102459303B - 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法 - Google Patents

肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102459303B
CN102459303B CN201080033132.4A CN201080033132A CN102459303B CN 102459303 B CN102459303 B CN 102459303B CN 201080033132 A CN201080033132 A CN 201080033132A CN 102459303 B CN102459303 B CN 102459303B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
sequence
phytase
present
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080033132.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102459303A (zh
Inventor
D·P·威纳
A·I·小索巴克
R·麦肯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
BASF Enzymes LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43126780&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102459303(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by BASF Enzymes LLC filed Critical BASF Enzymes LLC
Priority to CN201610323370.8A priority Critical patent/CN106011159A/zh
Publication of CN102459303A publication Critical patent/CN102459303A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102459303B publication Critical patent/CN102459303B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及肌醇六磷酸酶、编码它们的多核苷酸、本发明的多核苷酸和多肽的应用、以及这类多核苷酸和多肽的产生和分离。特别是，本发明提供了在高温条件下具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，和暴露于高温后保持活性的肌醇六磷酸酶。本发明进一步提供具有增加的胃不稳定性的肌醇六磷酸酶。本发明的肌醇六磷酸酶可被用在食品中以改善富肌醇六磷酸成分的喂养价值。本发明的肌醇六磷酸酶可被配制为例如帮助肌醇六磷酸消化的食物或饲料或补充物。

Description

肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
相关申请
本申请按照35U.S.C.§119(e)的规定要求享有2009年5月21日提交的美国临时申请序号(“USSN”)61/180,283的优先权。上述申请以其全部通过引用明确地并入本文，并用于所有目的。
参考通过EFS-WEB提交的序列表
本申请正通过USPTOEFS-WEB服务器电子提交，如在MPEP§1730II.B.2.(a)(A)所批准并阐明的，并且该电子提交包括电子提交的序列(SEQID)表。该序列表的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。序列表根据如下电子提交的.txt文件确定：
文件名 创建日期 大小(字节)
D1370_17WO_序列_表.txt 2010年5月20日 58,575字节
技术领域
本发明涉及肌醇六磷酸酶、编码它们的多核苷酸、本发明的多核苷酸和多肽的应用、以及这类多核苷酸和多肽的产生和分离。特别是，本发明提供了在高温条件下具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，和暴露于高温后保持活性的肌醇六磷酸酶。本发明进一步提供具有增大的胃不稳定性的肌醇六磷酸酶。本发明的肌醇六磷酸酶可被用在食品中以改善富含肌醇六磷酸的成分的喂养价值。本发明的肌醇六磷酸酶可被配制为例如帮助肌醇六磷酸消化的食物或饲料或补充物。本发明的食物和饲料可以是丸粒、液体、粉末等形式。在一个方面，本发明的肌醇六磷酸酶在粒化期间对热变性稳定；并且这减少肌醇六磷酸酶产品的成本，同时保持体内功效和在饲料中检测到活性。
发明背景
矿物质是所有生物体生长的必需元素。饮食矿物质可以来源于许多来源材料，包括植物。例如，由于植物种子含有与肌醇六磷酸分子的磷酸基团复合的离子，所以它们是矿物质的丰富来源。在一些情况下，这些与肌醇六磷酸结合的矿物质可满足一些种类的饲养生物体的饮食需求，如多胃反刍动物。因此，在一些情况下，反刍动物较少需要用无机磷酸和矿物质来进行饮食补充，这是因为瘤胃中的微生物产生了催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)转化成肌醇和无机磷酸的酶。在该过程中，已与肌醇六磷酸复合的矿物质被释放出来。然而，饲养生物体中的绝大多数种类不能有效地利用与肌醇六磷酸结合的矿物质。因此，例如，在单胃动物(如猪、鸟和鱼)的畜牧生产中，通常用矿物质和/或用改变了消费生物体的消化菌群环境的抗生素物质来补充饲料，从而提高生长速率。
如此，在许多应用中存在伴随有肌醇六磷酸的不充分水解的许多难以解决的问题，这些问题与营养、先体外后体内(离体)加工步骤、健康和医药、环境保护和资源管理有关。下面是这些问题的非限定性实例：
1)用无机矿物质进行饮食补充在成本上是昂贵的。
2)在许多先体外后体内(离体)应用中，未水解的肌醇六磷酸的存在是不期望的并且是成问题的(如通过引起不必要的淤渣的存在)。
3)通过增加耐抗生素的病原体的丰度，用抗生素进行饮食补充同样对人类和动物构成了医学威胁。
4)未吸收的粪便矿物质排放到环境中普遍地打破且损害了周围土壤、鱼类养殖水域和地面水的整个生态系统。
5)许多潜在食品中有价值的营养供给仍显著未被利用而被浪费。
因此，含肌醇六磷酸的食品需要用外源营养素和/或用肌醇六磷酸酶活性来源进行补充，以便改进它们被非常多种生物体消费后营养素供给的缺陷。
因此，对于在各种应用中实现肌醇六磷酸的高效且成本有效的水解的方法存在需求。尤其是，对于在商业应用上最优化肌醇六磷酸水解的方法存在需求。在一个特定方面，对于最优化改善用于人类和饲养动物消费的含肌醇六磷酸食品的营养供给的商业处理方法存在需求。
发明概述
本发明提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽、编码它们的多核苷酸、本发明的多核苷酸和多肽的应用、以及这类多核苷酸和多肽的产生和分离。一方面，本发明提供了在高温条件下具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，和暴露于高温后保持活性的肌醇六磷酸酶。本发明的肌醇六磷酸酶可被用在食品中以改善富含肌醇六磷酸的成分的喂养价值。本发明的肌醇六磷酸酶可被配制为例如帮助肌醇六磷酸消化的食物或饲料或补充物。本发明的食物和饲料可以是丸粒、片剂、丸剂、液体、粉末、喷雾剂等形式。在一个方面，本发明的肌醇六磷酸酶在粒化期间对热变性稳定；并且这减少肌醇六磷酸酶产品的成本，同时保持体内功效和在饲料中检测到活性。
概述：
本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含
(a)，(i)，核酸序列，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并与SEQIDNO：1具有至少95％、96％、97％、98％或99％或以上序列同一性，其中该多肽包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合；
(ii)，多核苷酸，其编码与SEQIDNO：2具有至少95％、96％、97％、98％或99％或以上序列同一性的多肽，其中该多肽包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合；或
a)，(i)，核酸序列，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并与SEQIDNO：1具有至少95％、96％、97％、98％或99％或以上序列同一性，其中该多肽包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合；
(ii)，多核苷酸，其编码与SEQIDNO：2具有至少95％、96％、97％、98％或99％或以上序列同一性的多肽，其中该多肽包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合；或
(iii)，(i)或(ii)的核酸序列，其中序列同一性通过带有序列比较算法的分析或目视检查确定，并且该序列比较算法任选地是BLAST2.2.2版本算法，其中过滤设置(filteringsetting)被设置为blastall-pblastp-d“nrpataa”-FF，所有其它选项被设置为缺省值；
(b)，(a)的核酸，其中至少一个突变是：A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79S或Y79W；
(c)，(b)的核酸，其中多肽进一步包含以下中的至少一个突变：C226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163R或T349Y；或(d)与其完全互补的序列。所有这些核酸是“本发明的核酸”，其编码“本发明的多肽”。
一方面，序列比较算法是BLAST2.2.2版本算法，其中过滤设置(filteringsetting)被设置为blastall-pblastp-d“nrpataa”-FF，所有其它选项被设置为缺省值。
一方面，本发明的核酸序列缺少编码信号序列、前蛋白序列(proproteinsequence)或启动子序列的同源核酸序列。另一方面，本发明的核酸序列进一步包含异源核酸序列，其中任选地异源核酸序列包含编码异源信号序列、标签、表位或启动子序列的序列或由其组成。另一方面，异源核酸序列编码这样的异源信号序列：其包含靶向内质网(ER)或内膜或靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N末端和/或C末端延伸，或由靶向内质网(ER)或内膜或靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N末端和/或C末端延伸组成；或者异源序列编码限制性位点。还有另一方面，异源启动子序列包含组成型或诱导型启动子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或玉米特异性启动子，或由组成型或诱导型启动子、或细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或玉米特异性启动子组成。
一方面，肌醇六磷酸酶活性包括：催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸(myo-inositol-hexaphosphate))成肌醇和无机磷酸(盐)；或，水解肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)。另一方面，肌醇六磷酸酶活性包括：催化在饲料、食品或饮料，或包含基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜的饲料、食品或饮料中的肌醇六磷酸的水解；或，催化在微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中的肌醇六磷酸的水解。
一方面，本发明的肌醇六磷酸酶是耐热性的，并且任选地在暴露于如下范围的温度后，多肽保持肌醇六磷酸酶活性：大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约37℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。一方面，本发明的肌醇六磷酸酶是热稳定的，并且任选地肌醇六磷酸酶在如下温度范围内保持活性：大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。
在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在如下酸性pH下是耐热的或热活性的：大约pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更低pH，或肌醇六磷酸酶在如下pH下是耐热的或热活性的：大约pH7、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5或更高pH。
本发明提供包含本发明核酸或其中已含有本发明核酸(其包括编码本发明多肽的核酸)的表达盒、载体、克隆运载体(cloningvehicle)、表达载体和克隆载体(cloningvector)，其中任选地，表达盒、克隆运载体或载体包括或者是病毒载体、质粒、噬菌体(phage)、噬菌粒(phagemid)、黏粒、F黏粒、细菌噬菌体(bacteriophage)或者人工染色体，病毒载体包括或是腺病毒载体、逆转录病毒载体或者腺相关病毒载体，或者表达盒、克隆运载体或载体包括或是细菌人工染色体(BAC)、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
本发明提供包含本发明核酸或其中已含有本发明核酸(其包括编码本发明多肽的核酸)或本发明的表达盒、载体、克隆运载体、表达载体或克隆载体的转化细胞、转导细胞、宿主细胞等，其中任选地，细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者植物细胞。
本发明提供包含本发明核酸或其中已含有本发明核酸(其包括编码本发明多肽的核酸)或本发明的表达盒、载体、克隆运载体、表达载体或克隆载体的转基因非人类动物，其中任选地，动物是小鼠、大鼠、山羊、兔、绵羊、猪或牛。
本发明提供包含本发明核酸或其中已含有本发明核酸(其包括编码本发明多肽的核酸)或本发明的表达盒、载体、克隆运载体、表达载体或克隆载体的转基因植物(包括植物部分，例如加工的部分或收获的部分，例如叶、茎、根或果实)或种子，其中任选地，所述植物是玉米植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、含油种子植物、油菜籽植物、大豆植物或烟草植物，并且任选地，所述种子是玉米种子、小麦粒、含油种子、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、花生或烟草植物种子。在可选的实施方式中，从本发明的种子或植物产生的植物或种子，或者本发明的植物或种子，可包括作物植物例如玉米、紫花苜蓿、向日葵、油菜、大豆、甘蔗、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松柏类植物，豆科作物如豌豆、豆和大豆，淀粉块茎/根如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、芦荟和甜菜等，或者植物可以是玉米植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、含油种子植物、油菜籽植物、大豆植物或烟草植物，或者用于动物或反刍动物的草料和/或饲料植物，或者植物可以是或包括草料或饲料植物，其为干草、玉米、粟米、大豆、小麦、荞麦、大麦、紫花苜蓿、黑麦、一年生窄叶杂草、高粱、苏丹草、丛草(veldtgrass)或绿毛蒺藜草；或者种子是玉米种子、小麦粒、含油种子、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、花生或花生种子、紫花苜蓿种子、棉花种子、红花种子、高粱种子、燕麦仁、黑麦种子、粟米种子、大麦种子、稻粒、豌豆种子或烟草植物种子，或者植物是玉米、紫花苜蓿、向日葵、油菜、大豆、甘蔗、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松柏类植物、豌豆、豆、大豆、马铃薯、甘薯、木薯、芋头、芦荟和甜菜。
本发明提供包含与本发明核酸反义的核酸并且编码表4、5、6、7、9所列的至少一个突变或其任意组合的反义寡核苷酸，其中任选地，所述反义寡核苷酸的长度在约10至50、约20至60、约30至70、约40至80、约60至100或约50至150个碱基之间。本发明也提供包含本发明的反义序列的核糖核酸酶(核酶)和/或iRNA(例如siRNA或miRNA)。
本发明提供抑制细胞内肌醇六磷酸酶信息的翻译的方法，包括对所述细胞施用本发明的反义寡核苷酸或者在所述细胞内表达本发明的反义寡核苷酸。
本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽，该多肽包含
(a)，(i)氨基酸序列，其由本发明的核酸编码；
(ii)，氨基酸序列，其与SEQIDNO：2具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中多肽包含表4、5、6、7、9所列的至少一个突变或其任意组合；或
(iii)，(i)或(ii)的多肽，其中序列同一性通过带有序列比较算法的分析或目视检查确定；
(b)，(a)的多肽，其中至少一个突变是：A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79S或Y79W；或
(c)，(b)的多肽，其中多肽进一步包含至少一个以下突变：C226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163R或T349Y。
一方面，肌醇六磷酸酶活性包括：催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸(myo-inositol-hexaphosphate))成肌醇和无机磷酸(盐)；或，水解肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)。另一方面，肌醇六磷酸酶活性包括：催化在饲料、食品或饮料，或包含基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜的饲料、食品或饮料中的肌醇六磷酸的水解；或，催化在微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中的肌醇六磷酸的水解。
本发明提供本发明的多肽，其含有肌醇六磷酸酶活性，该活性是耐热的，并且任选地在暴露于大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高范围的温度后，所述多肽保持肌醇六磷酸酶活性。在暴露于大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高范围的温度后，根据本发明的耐热多肽可保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性。在一些实施方式中，在大约pH3.0、大约pH3.5、大约pH4.0、大约pH4.5、大约pH5.0、大约pH5.5、大约pH6.0、大约pH6.5、大约pH7.0、大约pH7.5、大约pH8.0、大约pH8.5、大约pH9.0、大约pH9.5、大约pH10.0、大约pH10.5、大约pH11.0、大约pH11.5、大约pH12.0或更高的pH下，暴露于上述范围的温度后，根据本发明的耐热多肽保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性。
本发明提供本发明的多肽，其含有肌醇六磷酸酶活性，该活性是热稳定性的。例如，本发明的多肽可以是热稳定性的。在包括从大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度范围的条件下，根据本发明的热稳定性多肽可保持结合和/或酶促活性，例如肌醇六磷酸酶活性。在从大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃到大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高范围的温度中，根据本发明的热稳定性多肽可保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性。在一些实施方式中，在大约pH3.0、大约pH3.5、大约pH4.0、大约pH4.5、大约pH5.0、大约pH5.5、大约pH6.0、大约pH6.5、大约pH7.0、大约pH7.5、大约pH8.0、大约pH8.5、大约pH9.0、大约pH9.5、大约pH10.0、大约pH10.5、大约pH11.0、大约pH11.5、大约pH12.0或更高的pH下，在上述范围的温度下，根据本发明的热稳定性多肽保持活性，例如肌醇六磷酸酶活性。
本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽，该多肽包含本发明的氨基酸序列并(a)，缺少同源信号序列(前导肽)或前蛋白序列；(b)，缺少信号序列(前导肽)并进一步包括异源信号序列(前导肽)；(c)，(a)或(b)的氨基酸序列并进一步包括异源序列，其中任选地，异源序列包含异源信号序列或标签或表位，或由异源信号序列或标签或表位组成，或者异源序列包含鉴定肽。一方面，异源信号序列包含用于靶向内质网(ER)或内膜或靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N末端和/或C末端延伸，或由用于靶向内质网(ER)或内膜或靶向植物内质网(ER)或内膜系统的N末端和/或C末端延伸组成；或者异源氨基酸序列包含酶靶向位点，或由酶靶向位点组成。另一方面，本发明的多肽在信号序列(前导序列或前导肽)与酶之间进一步包含另外的氨基酸残基。
一方面，本发明的任何多肽的肌醇六磷酸酶活性包含(具有)这样的比活性：在大约37℃，在每毫克蛋白质大约100到大约1000单位的范围内；或者，每毫克蛋白质大约500到大约750单位；或者在37℃，在每毫克蛋白质大约500到大约1200单位的范围内；或者在37℃，在每毫克蛋白质大约750到大约1000单位的范围内。在一方面，在暴露于大约37℃的温度后，耐热肌醇六磷酸酶活性包括在每毫克蛋白质大约100到大约1000单位的范围内的比活性；或者热稳定肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质大约500到大约750单位的比活性；或者在37℃下，热稳定肌醇六磷酸酶活性包含在每毫克蛋白质大约500到大约1200单位的范围内的比活性；或者在37℃下，热稳定肌醇六磷酸酶活性包括在每毫克蛋白质大约750到大约1000单位的范围内的比活性。在一方面，在包含大约37℃的温度的条件下，热稳定性肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质大约100到大约1000单位的范围内的比活性；或者，热稳定性肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质大约500到大约750单位的比活性；或者，37℃下，热稳定性肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质大约500到大约1200单位的范围内的比活性；或者，在37℃下，热稳定性肌醇六磷酸酶活性包含每毫克蛋白质大约750到大约1000单位的范围内的比活性。
在一方面，本发明的多肽被糖基化或包含至少一个糖基化位点，其中任选地，糖基化是N-联糖基化或O-联糖基化，并且任选地，所述多肽在酵母中被表达后进行糖基化，所述酵母任选地为巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)。
在一方面，在包含大约pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更低(更酸性)pH条件下，多肽保持肌醇六磷酸酶活性。可选地，在包含大约pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10.0、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12、pH12.5或更高(更碱性)pH的条件下，本发明的多肽可保持肌醇六磷酸酶活性。
本发明提供了包含本发明的多肽的蛋白制备物，其中该蛋白制备物包括液体、浆、粉末、喷雾剂、悬液、冻干组合物/制剂、固体、凝胶锭、丸剂、植入物或凝胶；或其药物制剂、食品、饲料、食品补充物(foodsupplement)、饲料补充物(feedsupplement)、食品添加剂(foodadditive)、饲料添加剂(feedadditive)、营养补充物(nutritionalsupplement)或饮食补充物。
本发明提供了包含本发明的多肽的异源二聚体，并且在一方面，异源二聚体包含第二结构域，其中任选地，第二结构域是多肽，且所述异源二聚体是融合蛋白，并且任选地，第二结构域可以是表位或标签(tag)。
本发明提供包含本发明多肽的固定化多肽，其中固定化多肽可包含本发明的同源二聚体或异源二聚体，其中任选地，多肽被固定在细胞、囊泡、脂质体、薄膜、膜、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨丸粒、珠子、凝胶、板、阵列、毛细管、晶体、片剂、丸剂、胶囊、粉末、团聚体、表面或多孔结构上或内部。在一方面，本发明提供包含固定化多肽、或者本发明的核酸、或者它们的组合的阵列(例如微阵列)，其中多肽包括本发明的多肽或者本发明的异源二聚体。
本发明提供分离的、合成的或重组的抗体，其与本发明的多肽或与由本发明的核酸编码的多肽特异性结合，其中任选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明提供包含本发明抗体的杂交瘤。
本发明提供产生重组多肽的方法，包括如下步骤：(a)，提供核酸，其中所述核酸包含本发明的序列；和(b)，在允许多肽表达的条件下表达(a)的核酸，从而产生重组多肽，并且任选地该方法进一步包括用(a)的核酸转化宿主细胞，随后表达(a)的核酸，从而在转化的细胞中产生重组多肽。在可供选择的实施方式中，核酸在被转化到宿主细胞中前被可操作地连接于启动子。
本发明提供鉴定具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，该方法包括：(a)，提供本发明的多肽；(b)，提供肌醇六磷酸酶底物；和(c)，将(a)的多肽或其片段或变体与(b)的底物接触，并检测底物量的增加或反应产物量的减少，其中底物量的减少或反应产物量的增加检测到具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。
本发明提供鉴定肌醇六磷酸酶底物的方法，该方法包括：(a)，提供本发明的多肽；(b)，提供测试底物；和(c)，将(a)的多肽与(b)的测试底物接触，并检测底物量的增加或反应产物量的减少，其中底物量的减少或反应产物量的增加鉴定到所述测试底物为肌醇六磷酸酶底物。
本发明提供了确定化合物是否与多肽特异性结合的方法，包括：(a)，在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包含该核酸的载体，其中所述核酸包括本发明的序列；(b)，将所述多肽与所述测试化合物接触；和(c)，确定所述测试化合物是否与所述多肽特异性结合，从而确定所述化合物与所述多肽特异性结合。
本发明提供用于鉴定肌醇六磷酸酶活性的调节剂的方法，包括：(a)，提供本发明的肌醇六磷酸酶多肽；(b)，提供测试化合物；(c)，将(a)的多肽与(b)的测试化合物接触，并测量肌醇六磷酸酶的活性，其中在存在测试化合物的情况下测定的肌醇六磷酸酶活性相比于不存在测试化合物的情况下的活性的变化，提供确定该测试化合物调节肌醇六磷酸酶活性，其中任选地，肌醇六磷酸酶活性，通过提供肌醇六磷酸酶底物，并检测底物量的增加或反应产物量的降低来测量，并且任选地，与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比，存在测试化合物时底物量的降低或反应产物量的增加，鉴定测试化合物为肌醇六磷酸酶活性的激活剂，并且任选地，与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比，存在测试化合物时底物量的增加或反应产物量的降低，鉴定测试化合物为肌醇六磷酸酶活性的抑制剂。
本发明提供了水解肌醇-六磷酸为肌醇和无机磷酸的方法，包括：(a)，提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中多肽包括本发明的氨基酸序列，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)，提供包含肌醇六磷酸的组合物；和(c)，在其中所述多肽水解所述肌醇六磷酸以产生肌醇和无机磷酸的条件下，将(a)的多肽与(b)的组合物接触，其中任选地该条件包括大约37℃和大约70℃、大约50℃和大约80℃之间，或大约60℃和大约90℃之间的温度，并且任选地，该组合物包括肌醇六磷酸。
本发明提供了油脱胶(oildegumming)方法，包括：(a)，提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中多肽包括本发明的氨基酸序列，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)，提供包含植物油的组合物；和(c)，在其中所述多肽能够切割肌醇-无机磷酸键的条件下，将(a)的多肽与(b)的植物油接触，从而使植物油脱胶。
本发明提供了生产饲料或食品、或饲料或食品补充物、或食品或饲料添加剂、或营养补充物、或饮食补充物的方法，包括：(a)，用编码肌醇六磷酸酶多肽的多核苷酸转化植物、植物部分或植物细胞，其中肌醇六磷酸酶包括包含本发明的氨基酸序列的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)，在表达肌醇六磷酸酶的条件下培养植物、植物部分或植物细胞；和(c)，将植物、植物部分或植物细胞转变成适合于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物的组合物，或将所培养的植物、植物部分或植物细胞添加至食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物，从而产生食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物，其中任选地，所述多核苷酸被包括在表达载体中，并且任选地所述载体包含能够在植物细胞中表达核酸的表达调控序列，并且任选地食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物用于动物，并且任选地，其中所述动物是单胃动物，并且任选地所述动物是反刍动物，并且任选地食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物是输送基质、丸粒、片剂、凝胶、液体、喷雾剂、细粒(groundgrain)或粉末的形式。在一方面，肌醇六磷酸酶被糖基化以在粒化条件下提供耐热性或热稳定性，并且任选地，输送基质通过粒化包含谷物胚芽和肌醇六磷酸酶的混合物以产生颗粒而形成，并且任选地，丸粒在包含应用蒸汽的条件下制成，并且任选地，丸粒在包含应用超过80℃的温度大约5分钟的条件下制成，并且任选地，丸粒包含肌醇六磷酸酶，其含有每毫克酶至少350到大约900单位的比活性。
本发明提供了向动物或人输送肌醇六磷酸酶补充物的方法，所述方法包括：(a)，制备可食用的输送基质，其含有可食用的载体和肌醇六磷酸酶，其包括含有本发明的氨基酸序列的多肽，其中当置于水介质中时，基质容易地分散并释放肌醇六磷酸酶，和(b)，向动物或人施用所述可食用的酶输送基质，其中任选地，可食用的输送基质包括颗粒状的可食用载体，并且任选地可食用的输送基质是丸粒、片剂、凝胶、液体、喷雾剂或粉末的形式，并且任选地可食用的载体包括选自下列的载体：谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆皮、向日葵种子粉、玉米粉、大豆粉和小麦粉，并且任选地可食用的载体包括榨干油的谷物胚芽。
本发明提供用于动物或人的食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物，其包括本发明的多肽，或本发明的同源二聚体或异源二聚体；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。在一方面，食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充物或饮食补充物以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、喷雾剂、粉末、冻干制剂、药物制剂、液体形式、作为悬液或浆液制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
本发明提供可食用或可吸收的酶输送基质(多种基质)，其包括本发明的多肽，或本发明的同源二聚体或异源二聚体；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。在一方面，可食用的输运基质包括丸粒，或者可食用或可吸收的酶输送基质以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、喷雾剂、粉末、冻干制剂、药物制剂、液体形式、作为悬液或浆液制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
本发明提供可食用或可吸收的丸粒(多种丸粒)，其包含颗粒状可食用或可吸收的载体和本发明的多肽，或本发明的同源二聚体或异源二聚体；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的，并且任选地，丸粒以丸粒形式，或者作为丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、喷雾剂、粉末、冻干制剂、药物制剂、液体形式、作为悬液或浆液制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
本发明提供粉(多种粉)，例如大豆粉，其包括本发明的多肽，或本发明的同源二聚体或异源二聚体；其中任选地，所述粉例如大豆粉被以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、喷雾剂、粉末、冻干制剂或液体形式制造。
本发明提供了提高肌醇六磷酸酶多肽对动物消化系统中的酶灭活作用的耐受性的方法，该方法包括将包括本发明多肽的肌醇六磷酸酶多肽糖基化，从而提高肌醇六磷酸酶多肽对动物消化系统中的酶灭活作用的耐受性，并且任选地，糖基化是N-联糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶多肽的糖基化可以是细胞内编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸的体内表达的结果，并且任选地，细胞可以是真核细胞，并且任选地，真核细胞是真菌细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了加工玉米仁和高梁仁的方法，包括：(a)，提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中多肽包括本发明的多肽；(b)，提供包含玉米浸渍液(steepliquor)或高梁浸渍液的组合物；和(c)，在其中多肽可以切割肌醇-无机磷酸键的条件下使(a)的多肽和(b)的组合物接触。
本发明提供药物或饮食(膳食)制剂，其包含本发明的多肽或异源二聚体；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的；并且任选地，药物或饮食制剂以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、喷雾剂、粉末、洗剂或液体形式制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者作为植入物，或者以颗粒状形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
本发明提供这样的组合物，其包含本发明的多肽或异源二聚体的；和(b)表2中提出的任何产物或表1中列出的任何组合物；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。
本发明提供包含本发明多肽或异源二聚体的独立餐即食型单元(self-containedmealRead-to-eatunit，MRE)、饮品或保湿因子(水合剂，hydratingagent)；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。
本发明提供改善骨质疏松(减慢骨质疏松的进展、治疗骨质疏松或预防骨质疏松)的方法，包括向需要的个体施用有效量(剂量)的包含本发明多肽或异源二聚体的组合物；其中任选地，多肽被糖基化，并且任选地肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。
本发明提供增加肌醇六磷酸酶的胃不稳定性的方法，包括提供具有肌醇六磷酸酶活性并以精氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸替换编码多肽的序列中的一个或多个氨基酸的多肽。本发明进一步提供用于本方法的示例性肌醇六磷酸酶，例如，SEQIDNO：2或本发明的其他肌醇六磷酸酶，如在下面实施例2中详细描述的。
本发明提供改变酶的至少两种不同性质的方法，如在下面实施例2中详细描述的，该方法包括：(a)，提供具有酶活性的多肽；(b)，由(a)的多肽生成变体，其中各变体相对于(a)的多肽具有单个氨基酸变化；(c)，以两种不同的性质筛选(b)的变体；(d)，选择所需的(c)的变体，并确定各所选变体中的单个氨基酸变化；(e)，生成新变体，其包含(d)中所选的单个氨基酸变化的不同组合；(f)，以两种改变的性质筛选(e)的变体；和(g)，选择所需的(f)的具有两种改变性质的变体。本发明提供改变酶的至少两种不同性质的可供选择的方法，包括：(a)，提供具有酶活性的多肽；(b)，由(a)的多肽生成变体，其中各变体相对于(a)的多肽具有单个氨基酸变化；(c)，以一种改变的性质筛选(b)的变体；(d)，以另一种改变的性质筛选(b)的变体；(e)，选择所需的(c)和(d)的变体，并确定各所选变体中的单个氨基酸变化；(f)，生成新变体，其包含(c)和(d)中所选的单个氨基酸变化的不同组合；(g)，以两种改变的性质筛选(f)的变体；和(h)，选择所需的(g)的具有两种改变性质的变体。本发明进一步提供生成变体的示例性方法，例如，通过GSSM进化、GeneReassembly进化和/或TMCA进化。
本发明提供断开(decouple)肌醇六磷酸酶的胃稳定性与耐热性的联系的方法，如在下面实施例2中详细描述的，该方法包括：(a)，提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；(b)，由(a)的多肽生成变体肌醇六磷酸酶，其中各变体相对于(a)的多肽具有单个氨基酸变化；(c)，以改变的胃稳定性和改变的耐热性筛选(b)的变体肌醇六磷酸酶；(d)，选择(c)的具有所需胃稳定性和耐热性的变体，并确定各所选变体中的单个氨基酸变化；(e)，生成新变体肌醇六磷酸酶，其包含所选的(d)的单个氨基酸变化的不同组合；(f)，以改变的胃稳定性和改变的耐热性筛选(e)的变体；和(g)，选择(f)的具有所需胃稳定性和耐热性的变体。本发明提供断开肌醇六磷酸酶的胃稳定性与耐热性的联系的可供选择的方法，包括：(a)，提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；(b)，由(a)的多肽生成变体肌醇六磷酸酶，其中各变体相对于(a)的多肽具有单个氨基酸变化；(c)，以改变的胃稳定性筛选(b)的变体肌醇六磷酸酶；(d)，以改变的耐热性筛选(b)的变体肌醇六磷酸酶；(e)，选择(c)和(d)的具有所需胃稳定性或耐热性的变体，并确定各所选变体中的单个氨基酸变化；(f)，生成新变体肌醇六磷酸酶，其包含(c)和(d)中所选的单个氨基酸变化的不同组合；(g)，以改变的胃稳定性和改变的耐热性筛选(f)的变体；和(h)，选择(g)的具有所需胃稳定性和耐热性的变体。本发明进一步提供生成变体的示例性方法，例如，通过GSSM进化、GeneReassembly进化和/或TMCA进化。本发明提供用于本方法的示例性肌醇六磷酸酶，例如，SEQIDNO：2和本发明的其他肌醇六磷酸酶。本发明提供断开胃稳定性与耐热性的联系的示例性突变，例如，表4、5、6、7、9所列的突变或其任意组合。
本发明提供具有胃不稳定性和耐热性的肌醇六磷酸酶，如以下实施例所详述，其中肌醇六磷酸酶在10分钟以内、8分钟以内、6分钟以内、4分钟以内或2分钟以内在受激胃液(SGF)中完全降解，并且肌醇六磷酸酶在暴露于以下范围的温度后保持活性：大约75℃至大约85℃、大约85℃至大约90℃、大约90℃至大约95℃或大约80℃至大约86℃，例如，如在下面实施例2中详细描述的本发明的肌醇六磷酸酶。一方面，本发明的胃不稳定和耐热的肌醇六磷酸酶在4分钟以内在受激胃液(SGF)中完全降解，并且肌醇六磷酸酶在暴露于大约80℃至大约86℃范围的温度后保持活性。
本发明的一个或多个方面的细节在下面附图和说明书中阐述。本发明的其它特征、目的和优点将通过说明书和附图以及权利要求而清楚。
本文引述的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物均通过引用被明确引入，用于所有目的。
附图简述
下面的附图是本发明的各方面的例证性说明，而不意图限制权利要求书所包括的本发明的范围。
图1阐明纯化的、包括本发明的单个突变示例性序列的本发明多肽在不同温度热处理30分钟后的残留活性的总结；其中使用荧光底物分析肌醇六磷酸酶活性，并且将速率与每一相应的未处理的样品的速率进行比较；如在下面实施例1中详细描述的。
图2阐明纯化的、包括“混合的”单残基突变的本发明多肽(含有多个突变的肌醇六磷酸酶)在热循环仪(thermocycler)上热处理后的残留活性的总结；其中使用荧光底物分析肌醇六磷酸酶活性，并且将速率与每一相应的未处理的样品的速率进行比较；如在图1中总结的；如在下面实施例1中详细描述的。
图3图解总结了用来产生图1的图的数据；如在下面实施例1中详细描述的。
图4阐明亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2的序列和基因位点饱和诱变(GSSM)-产生的序列修饰，其选择用于GeneReassemblyTM文库构建；如下所详细描述的。
图5阐明对亲本SEQIDNO：2具有多个残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶；如本文详细描述的。
图6阐明对亲本SEQIDNO：2具有单一残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶；如本文详细描述的。
图7示意性阐明使用荧光底物4-甲基伞形酮磷酸(MeUMB-磷酸)进行的本发明的示例性肌醇六磷酸酶分析；如在下面实施例1中详细描述的。
图8示意性阐明使用荧光底物MeUMB-磷酸进行的本发明的示例性肌醇六磷酸酶分析；如在下面实施例1中详细描述的。
图9示意性描述示例性文库筛选的方案，如在图8中所述，如在下面实施例1中详细描述的。
图10阐明可合并使用本发明的肌醇六磷酸酶的示例性醇法。
图11A和11B阐明appA肌醇六磷酸酶(GenBank登录号M58708)、appA-SEQIDNO：2中间体和SEQIDNO：2的热稳定性和SGF不稳定性的总结，如在下面实施例2中详细描述的。
图12阐明通过亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的纯化的his-标签和非his-标签样本的SGF分析测定的his-标签对SGF稳定性的影响，如在下面实施例2中详细描述的。
图13阐明糖基化-负(glycosylation-minus)SEQIDNO：2变体(变体GLY1-GLY4)和两个SEQIDNO：2对照的耐热性，如在下面实施例2中详细描述的。
图14阐明SEQIDNO：2-HIS和SEQIDNO：2-6X变体的SGF稳定性，如在下面实施例2中详细描述的。
图15阐明由SEQIDNO：2的GSSM进化选择的突变体的SGF活性丧失，如在下面实施例2中详细描述的。
图16阐明不同氨基酸对SGF不稳定性的影响，如在下面实施例2中详细描述的。
图17阐明SGF突变热点，如在下面实施例2中详细描述的。
图18阐明SEQIDNO：2-HIS和变体O在不同胃蛋白酶剂量下的SGF不稳定性，如在下面实施例2中详细描述的。
图19阐明SEQIDNO：2-HIS和变体O的半衰期，如在下面实施例2中详细描述的。
图20阐明SGF不稳定的肌醇六磷酸酶变体的残留活性，如在下面实施例2中详细描述的。
图21阐明SGF标记变体肌醇六磷酸酶相对于SEQIDNO：2的比活性，如在下面实施例2中详细描述的。
在不同的附图中同样的标记符号表示同样的要素。
发明详述
本发明涉及肌醇六磷酸酶多肽，其具有或包含如上所述的对SEQIDNO：2的具体残基修饰，和编码它们的多肽，(例如包括对SEQIDNO：1的具体碱基对修饰，如上所述)，以及应用所述多核苷酸和多肽的方法。图6阐明具有对亲本SEQIDNO：2的单一残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶，而图5阐明具有对亲本SEQIDNO：2的多个残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶。
本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽可包括具有任何肌醇六磷酸酶活性的酶，例如能催化肌醇六磷酸降解的酶，例如催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)为肌醇和无机磷酸。本发明的肌醇六磷酸酶包括耐热和抗热的酶。
肌醇六磷酸酶和编码本发明的肌醇六磷酸酶的多核苷酸可用于大量的过程、方法和组合物中。例如，如上讨论的，肌醇六磷酸酶可用于动物饲料和饲料补充物以及用于处理以从环境或样品降解或除去过量的肌醇六磷酸。基于本文提供的教导，包括上面讨论的那些，其它应用对本领域技术人员而言是明显的。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶分子——单独或与其它试剂(包括但不限于酶，例如蛋白酶、淀粉酶等)组合——被用于加工食品，例如用于防止不期望的玉米渣(cornsludge)，和用于其它需要肌醇六磷酸水解的应用。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶分子被用于消除或减少未水解的肌醇六磷酸的存在，特别地当未水解的肌醇六磷酸导致先体外后体内方法——包括但不限于食品加工——有问题的结果时。在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶分子被用于如在EP0321004-B1(Vaara等)中所描述的方法，其包括在玉米和高梁粒加工中的步骤，因而将硬粒浸入水中以软化它们。在该过程中浸出的水溶性物质变为玉米浆的一部分，通过蒸发将其浓缩。玉米浆中未水解的肌醇六磷酸——主要为钙和镁的盐的形式——与磷结合，并沉积具有蛋白质和金属离子的不想要的淤渣。这种淤渣在玉米浆的蒸发、运输和储存中带来问题。本发明的肌醇六磷酸酶分子被用于水解这种淤渣。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶可提供比先前鉴定的肌醇六磷酸酶分子例如真菌来源的肌醇六磷酸酶分子明显优异的商业性能。在一方面，本发明的酶可以为大约4400U/mg蛋白质，或高于大约50到100U/mg蛋白质之间、或50到1000U/mg蛋白质之间、或100到4000U/mg蛋白质之间。
本发明还提供改变本发明的肌醇六磷酸酶的特性的方法，这通过诱变和其它方法来实现，如下面详细讨论的。
产生和操作核酸
本发明提供了编码本发明多肽和肌醇六磷酸酶的核酸。本发明还提供表达盒、载体例如表达载体或克隆载体、克隆运载体如病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、细菌噬菌体或者人工染色体，其可包含本发明的核酸或其中含有本发明的核酸。
本发明还包括使用本发明的核酸来发现新肌醇六磷酸酶序列的方法。也提供了用于修饰本发明核酸的方法，如通过合成的连接重装配、优化的定向进化系统和/或饱和诱变进行。
在一方面，本发明提供一类核酸，其为亲本SEQIDNO：1的合成产生的变体，其中这些本发明的核酸与“亲本”SEQIDNO：1具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且编码表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合。作为参考，亲本SEQIDNO：1为：
atgaaagcgatcttaatcccatttttatctcttctgattccgttaaccccgcaatctgca60
ttcgctcagagtgagccggagctgaagctggaaagtgtggtgattgtcagtcgtcatggt120
gtgcgtgctccaaccaaggccacgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggcca180
acctggccggtaaaactgggtgagctgacaccgcgcggtggtgagctaatcgcctatctc240
ggacattactggcgtcagcgtctggtagccgacggattgctgcctaaatgtggctgcccg300
cagtctggtcaggtcgcgattattgctgatgtcgacgagcgtacccgtaaaacaggcgaa360
gccttcgccgccgggctggcacctgactgtgcaataaccgtacatacccaggcagatacg420
tccagtcccgatccgttatttaatcctctaaaaactggcgtttgccaactggataacgcg480
aacgtgactgacgcgatcctcgagagggcaggagggtcaattgctgactttaccgggcat540
tatcaaacggcgtttcgcgaactggaacgggtgcttaattttccgcaatcaaacttgtgc600
cttaaacgtgagaaacaggacgaaagctgttcattaacgcaggcattaccatcggaactc660
aaggtgagcgccgactgtgtctcattaaccggtgcggtaagcctcgcatcaatgctgacg720
gagatatttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggggtggggaaggatcacc780
gattcacaccagtggaacaccttgctaagtttgcataacgcgcaatttgatttgctacaa840
cgcacgccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttattagatttgatcaagacagcg900
ttgacgccccatccaccgcaaaaacaggcgtatggtgtgacattacccacttcagtgctg960
tttatcgccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgcactggagctcaactgg1020
acgcttcccggtcagccggataacacgccgccaggtggtgaactggtgtttgaacgctgg1080
cgtcggctaagcgataacagccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttacag1140
cagatgcgtgataaaacgccgctgtcattaaatacgccgcccggagaggtgaaactgacc1200
ctggcaggatgtgaagagcgaaatgcgcagggcatgtgttcgttggcaggttttacgcaa1260
atcgtgaatgaagcacgcataccggcgtgcagtttgtaa1299
本发明的核酸可以通过以下方法制备、分离和/或操作，如cDNA文库的克隆和表达，信使或基因组DNA通过PCR的扩增等等。在实施本发明的方法中，同源基因可以通过操作模板核酸而被修饰，如本文描述的。本发明可以与任何本领域已知的方法或方案或装置一起实施，它们在科学和专利文献中被很好地描述。
一般技术
用于实施本发明的核酸，无论是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或者其杂交物，可以从多种来源分离、被遗传工程改造、被扩增和/或被重组表达/产生。从这些核酸产生的重组多肽可以是单独地被分离或克隆，并检测所需的活性。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
可选地，这些核酸可以通过熟知的化学合成技术在体外合成，如以下文献中描述的：Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25：3440-3444；Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利第4,458,066号。
操作核酸的技术，如亚克隆、标记探针(如，使用Klenow聚合酶标记随机引物、缺口翻译、扩增)、测序、杂交和类似技术在科学和专利文献中被很好地描述，参见例如Sambrook，ed.，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL(2NDED.)，Vols.1-3，ColdSpringHarborLaboratory，(1989)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，Ausubel，ed.JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork(1997)；LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY：HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES，PartI.TheoryandNucleicAcidPreparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
另一个获得和操作用于实施本发明方法的核酸的有用方法是从基因组样品中克隆，并且如果需要，筛选和再克隆从如基因组克隆或cDNA克隆中分离或扩增的插入片段。本发明方法中使用的核酸来源包括包含于下列的基因组或cDNA文库：如，哺乳动物人工染色体(MAC)，参见如美国专利第5,721,118；6,025,155号；人类人工染色体，参见如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见如Woon(1998)Genomics50：306-316；P1-来源的载体(PAC)，参见例如Kern(1997)Biotechniques23：120-124；黏粒、重组病毒、噬菌体或质粒。
在可选的方面，短语“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一种的片段，或者基因组来源的或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，它们可以是单链或双链的，并且可以代表正义链或反义链，还指肽核酸(PNA)或者天然或合成来源的任何DNA样或RNA样的物质，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNP)。该术语包括核酸，即寡核苷酸，含有天然核苷酸的已知类似物。该术语也包括具有合成骨架的核酸样结构，例如参见Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36：8692-8698；Samstag(1996)AntisenseNucleicAcidDrugDev6：153-156。
在一方面，本发明的重组多核苷酸包括与“骨架”核酸相邻的序列，所述序列在其天然环境中与该“骨架”核酸是不相邻的。在一方面，核酸表现为核酸“骨架分子”群体中约5％或更多数量的核酸插入片段。根据本发明的“骨架分子”包括核酸，如表达载体、自主复制核酸、病毒、整合核酸，以及用于维持或操纵目标核酸插入片段的其它载体或核酸。在一方面，富集的核酸表现为在重组骨架分子群体中具有15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多数量的核酸插入片段。
在一方面，编码本发明多肽的核酸与能指导翻译出的多肽或其片段的分泌的前导序列以适当的位置关系(相位，phase)进行装配。
本发明提供了融合蛋白和编码它们的核酸。本发明的多肽可以被融合到异源肽或多肽上，如N-末端鉴定肽，其给予了期望的特性，如增加的稳定性或简化的纯化特性。本发明的肽和多肽也可以作为融合蛋白被合成和表达，其中所述融合蛋白中连接有一个或多个额外的结构域，例如用于产生免疫原性更强的肽、以便更易于分离重组合成的肽、以便鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞，等等。有利于检测和纯化的结构域包括，例如金属螯合肽，如多组氨酸标签和组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定的金属上纯化，还包括蛋白A结构域，其允许在固定的免疫球蛋白上纯化，还包括在FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp，SeattleWA)中所使用的结构域。在纯化结构域和含有基序的肽或多肽之间包含可切割的连接子序列有助于纯化，这样的连接子序列例如Xa因子或肠激酶(Invitrogen，SanDiegoCA)。例如，表达载体可以包括编码表位的核酸序列，其连接到六个组氨酸残基上，接着连接有硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(例如参见Williams(1995)Biochemistry34：1787-1797；Dobeli(1998)ProteinExpr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基有助于检测和纯化，而肠激酶切割位点则提供了将表位与融合蛋白的剩余部分纯化分离开的手段。关于编码融合蛋白的载体的技术以及融合蛋白的应用在科学和专利文献中进行了充分的描述，例如参见Kroll(1993)DNACell.Biol.，12：441-53。
在一方面，术语“分离的”是指物质从其来源环境(如，天然环境，假如它是天然发生的)移取。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统中一些或所有共存物质中分离的同样的多核苷酸或多肽是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且它们仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。在一方面，术语″纯化的″不需要绝对的纯度；相反，它旨在作为相对的定义。从文库中获得的独立核酸已经常规地被纯化以得到电泳均一性。从这些克隆获得的序列不能直接地从文库或总人DNA中获得。本发明的纯化核酸已经从生物体中其余基因组DNA中被纯化至少104-106倍。在可选的方面，术语″纯化的″还包括已经从剩余基因组DNA或从文库中的其它序列或其它环境中被纯化的核酸，至少纯化一个数量级，或可选地，两个或三个数量级，或四个或五个数量级。
转录和翻译控制序列
本发明提供了可操作地连接到一个或多个表达(例如转录或翻译)控制序列上的本发明的核酸(例如DNA)序列，所述表达控制序列例如启动子或增强子，它们指导或调节RNA合成/表达。表达控制序列可以在表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。示例性的真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子以及小鼠金属硫蛋白I启动子。
适于在细菌中表达或过度表达多肽的启动子包括大肠杆菌(E.coli)lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子、λpL启动子、来自编码糖解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的操纵子的启动子和酸性磷酸酶启动子。真核细胞启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I启动子。也可以使用其它已知控制基因在原核细胞或真核细胞或它们的病毒中表达的启动子。
表达载体和克隆运载体
本发明提供表达系统，例如表达盒、载体、克隆运载体等，其包含本发明的核酸，例如编码本发明的肌醇六磷酸酶的序列，以表达和过度表达本发明多肽(和核酸，如反义核酸)。本发明的表达载体和克隆运载体可包括病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、细菌人工染色体、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和其它任何对特定目的宿主(如杆菌、曲霉菌(Aspergillus)和酵母)特异的载体。本发明的载体可包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列。大量适合的载体为本领域技术人员已知并可从商业渠道获得。示例性载体包括：细菌载体：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体(λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核载体：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。但是，可使用任何其它的质粒或其它的载体，只要它们在宿主中是可复制的并是有活力的。低拷贝数或高拷贝数载体可与本发明一起使用。
作为可被使用的表达载体的代表性实例，可以是上面提到的病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、细菌人工染色体、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和其它任何对特定目的宿主(如杆菌、曲霉菌和酵母)特异的载体。因此，例如，DNA可以被包含在表达多肽的多种表达载体的任一种中。这类载体包括包括染色体、非染色体和合成的DNA序列。大量的适当的载体是本领域普通技术人员已知的，并且是商业可获得的。作为实例提供下列的载体：细菌载体：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体、(λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核载体：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。但是，可使用任何其它的质粒或其它的载体，只要它们在宿主中是可复制的并是有活力的。低拷贝数或高拷贝数载体可与本发明一起使用。
用于本发明中的示例性的载体含有f-因子起点复制。大肠杆菌中的f-因子(或致育因子)是质粒，它在接合过程中实现其本身的高频转移和细菌染色体本身的低频转移。一个方面使用克隆载体，被称作“F黏粒”或细菌人工染色体(BAC)载体。这些衍生自能稳定地整合基因组DNA大片段的大肠杆菌f-因子。当与来自混合未培养的环境样品的DNA整合时，这使得其获得稳定“环境DNA文库”形式的大基因组片段成为可能。
用于本发明中的另一种类型的载体是黏粒载体。黏粒载体最初是设计用于克隆和繁殖基因组DNA大片段的。克隆进黏粒载体在“MolecularCloning：AlaboratoryManual”(Sambrook等人，1989)中有详细描述。
表达载体中的DNA序列可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)上，以指导RNA合成。特别指定的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择完全在本领域普通技术水平之内。表达载体也含有用于翻译起始的核糖体结合位点以及转录终止子。载体也可包括用于扩增表达的适当序列。可以从任何使用了CAT(氯霉素转移酶)载体或带有可选择标记的其它载体的期望基因来选择启动子区。另外，表达载体可含有一个或多个可选择标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型特征，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
在一方面，本发明的表达盒包含本发明的序列和能影响在宿主中与这些序列相容的结构基因(即编码蛋白质如本发明的肌醇六磷酸酶的序列)表达的核苷酸序列。表达盒至少包括与编码多肽的序列可操作地连接的启动子；并且任选地，可以与其它序列例如转录终止信号序列可操作地连接。也可以使用在实现表达方面必需的或有用的其它因子，例如增强子。在一方面，如在本文使用的，“可操作地连接(operablylinked)”是指DNA序列上游启动子的连接，以便启动子介导DNA序列的转录。因此，表达盒也包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体，以及类似物。在一方面，“载体”包括可以感染、转染、瞬时或永久地转导细胞的核酸。载体可以是裸核酸、或与蛋白或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白，和/或膜(例如细胞膜、病毒脂质包膜等等)。在一方面，载体包括但不限于复制子(例如RNA复制子、细菌噬菌体)，DNA片段可以连接到这些复制子上从而可被复制。在一方面，载体包括但不限于RNA、自主复制环状或线状DNA或RNA(例如质粒、病毒以及类似物，例如参见美国专利5,217,879)，并且包括表达质粒和非表达质粒。在重组微生物或细胞培养物被描述为“表达载体”的宿主的情况下，这包括染色体外环状和线状DNA，它们已经被整合到宿主染色体(一个或多个)中。在载体通过宿主细胞来维持的情况下，该载体或者可以作为自主结构在有丝分裂过程中被细胞稳定地复制，或者被整合进宿主的基因组中。
表达载体可以包括启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点、和转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。哺乳动物表达载体可以包括复制起点、任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、5’侧翼非转录序列。在一些方面，衍生于SV40剪接子和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录遗传元件。
在一方面，表达载体含有一个或多个选择性标记基因，使得可以对含有该载体的宿主细胞进行选择。这样的选择性标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或使得真核细胞培养物具有新霉素抗性的基因、使得大肠杆菌具有四环素或氨苄青霉素抗性的基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。启动子区可以从使用了氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标记的其它载体的任何期望的基因中选择出来。
用于在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可以含有增强子，以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件，一般长度为大约10到大约300bp，其作用于启动子，增强其转录。例子包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
DNA序列可以通过各种程序插入载体中。一般而言，在将插入片段和载体用合适的限制性内切酶消化后，DNA序列被连接到载体中期望的位置。可选择地，插入片段和载体的平末端可以被连接。在本领域已知多种克隆技术，例如在Ausubel和Sambrook中描述的。这样的程序和其它程序被认为在本领域技术人员的知识范围内。
载体可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，SV40的衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。例如Sambrook描述了在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体。
可以使用的具体细菌载体包括商业上可获得的质粒，其包括以下已知的克隆载体的遗传元件：pBR322(ATCC37017)、pKK223-3(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)、GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174pBluescriptIIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。具体真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，只要它可以在宿主细胞中复制和存活，可以使用任何其它载体。
宿主细胞和转化细胞
本发明还提供了含本发明核酸序列例如编码本发明肌醇六磷酸酶的序列的转化细胞，或包含本发明的表达盒、载体、克隆运载体、表达载体或克隆载体的转化细胞。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞，真核细胞如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包括大肠杆菌属(Escherichia)、杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳球菌属(Lactococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的任何种，包括埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。示例性的真菌细胞包括曲霉菌属(Aspergillus)的任何种，包括黑曲霉(Aspergillusniger)。示例性酵母细胞包括毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)的任何种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。示例性的昆虫细胞包括草地夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)的任何种，包括果蝇S2和草地夜蛾(Spodoptera)Sf9。示例性的昆虫细胞包括果蝇S2和草地夜蛾(Spodoptera)Sf9。示例性的酵母细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤细胞或任何小鼠或人细胞系。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。
载体可以使用各种技术引入宿主细胞中，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法(lipofection)或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology，(1986))。
在适当的情况下，工程化宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被转化和宿主株生长到合适的细胞密度之后，用合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)诱导所选择的启动子，并且细胞再培养一段时期，使得它们产生所需的多肽或其片段。
细胞可以通过离心收获，通过物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎，包括冻-融循环、超声波处理、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话，可以应用蛋白质重折叠步骤来完成多肽的构象。假如需要的话，在最终的纯化步骤中可以采用高效液相色谱(HPLC)。
宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产方法中所用的宿主，由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以糖基化或者未糖基化。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸残基或不包括起始甲硫氨酸残基。
也可以采用无细胞翻译系统来产生本发明的多肽。无细胞翻译系统可以应用由DNA构建物转录得到的mRNA，所述DNA构建物包括与编码所述多肽或其片段的核酸可操作地连接的启动子。在一些方面，该DNA构建物在进行体外转录反应之前可以被线性化。转录得到的mRNA然后与合适的无细胞翻译提取物例如兔网状细胞提取物温育，产生所需的多肽或其片段。
表达载体可以含有一个或多个选择性标记基因，为选择转化的宿主细胞提供表型特征，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者例如大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
本发明的核酸可以在任何体外或体内表达系统中表达或过度表达。任何细胞培养系统可被用于表达或过度表达重组蛋白，包括细菌、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物培养物。通过启动子、增强子、载体(例如，复制子载体、双顺反子载体的使用(参见，例如Gurtu(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.229：295-8))、培养基、培养系统等等的合适选择，可以实现过度表达。在一方面，使用选择标记如谷氨酰胺合酶(参见，例如Sanders(1987)Dev.Biol.Stand.66：55-63)在细胞系统中进行的基因扩增被用于过度表达本发明的多肽。
各种哺乳动物细胞培养系统也可以被用于表达重组蛋白，哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，其在“SV40-transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants”(Gluzman，1981)中得以描述，以及能表达相容载体的其它细胞系，如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起始点、适合的启动子和增强子，并且还包括任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。衍生于SV40剪接子和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录基因元件。
含有目的多核苷酸的宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养，培养基被改良以适合激活启动子、选择转化体或扩增基因。培养条件，例如温度、pH等，是那些先前用于选择进行表达的宿主细胞使用的，对本领域普通技术人员是明显的。鉴定具有特异性酶活性的克隆然后可被测序，以识别编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
核酸的扩增
在实施本发明中，编码本发明多肽的核酸或修饰的核酸可以通过如扩增而复制。本发明提供了扩增编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽或其子序列的核酸的扩增引物序列对，其中引物对能够扩增包括示例性SEQIDNO：1和上述至少一个具体序列修饰的核酸序列。本领域的技术人员能够设计这些序列的任何部分或全长的扩增引物序列对；例如：
“亲本”SEQIDNO：1如上所示。因此，用于扩增该亲本序列或具有本文提出的至少一个具体序列修饰的本发明的示例性序列之一的扩增引物序列对，可以是SEQIDNO：1的残基1到21(即，ATGAAAGCGATCTTAATCCCA)和SEQIDNO：1最后21个残基的互补链(即，TGCAGTTTGAGATCTCATCTA的互补链)。
扩增反应也可以被用于量化样品中核酸的量(如细胞样品中信息的量)、标记核酸(例如将其应用于阵列或印迹)、检测核酸，或量化样品中特异核酸的量。在本发明的一个方面，扩增从细胞或cDNA文库分离出的信息。技术人员可以选择和设计合适的寡核苷酸扩增引物。扩增方法在本技术领域也是熟知的，包括，例如聚合酶链式反应PCR(例如参见PCRPROTOCOLS，AGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS，ed.Innis，AcademicPress，N.Y.(1990)和PCRSTRATEGIES(1995)，ed.Innis，AcademicPress，Inc.N.Y.，连接酶链式反应(LCR)(例如参见Wu(1989)Genomics4：560；Landegren(1988)Science241：1077；Barringer(1990)Gene89：117)；转录扩增(例如参见Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173)；和自主维持序列复制(例如参见Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874)；Qβ复制酶扩增(例如参见Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)，自动Q-β复制酶扩增测定法(例如参见Burg(1996)Mol.Cell.Probes10：257-271)和其它的RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也参见Berger(1987)MethodsEnzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology13：563-564。
确定序列同一性程度
本发明提供分离的、合成的或重组的核酸，其包含与SEQIDNO：1具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列，和包括至少一个上述对SEQIDNO：1具体列举的修饰。在一方面，序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数来确定，包括本文描述的那些，如BLAST2.2.2或FASTA3.0t78版本，参数为默认值。
同源序列也包括RNA序列，其中尿嘧啶取代核酸序列中的胸腺嘧啶。同源序列可以使用本文描述的任意一种方法获得，或者从对测序错误的纠正中产生。
本文确定的各种序列比较程序可用于本发明的这一方面。蛋白和/或核酸序列的同一性(同源性)可使用任何本领域已知的各种序列比较算法和程序来评估。这些算法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8)：2444-2448，1988；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Thompson等人.NucleicAcidsRes.22(2)：4673-4680，1994；Higgins等人，MethodsEnzymol.266：383-402，1996；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Altschul等人.NatureGenetics3：266-272，1993。
同源性或同一性可使用序列分析软件来测量(例如，位于1710UniversityAvenue，Madison，WI53705的威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(GeneticsComputerGroup)的序列分析软件包)。这样的软件通过对各种缺失、置换和其它的修饰指定同源性程度来匹配相似的序列。在两个或者更多个核酸或者多肽序列的上下文中，术语“同源性”和“同一性”是指这样的两个或者更多个序列或子序列，当两个或更多个序列或子序列在某一比较窗口(comparisonwindow)或者指定区域内被比较和联配以确定最大对应性时，这些序列是相同的，或者具有特定百分比例的相同氨基酸残基或核苷酸，其可以应用各种序列比较算法或者通过人工联配和视觉观察来确定。对于序列比较，可以将一个序列作为参考序列(本发明的示例性序列)，而将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，指定子序列坐标，如果必要，也指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定别的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括参考具有任意数目的连续残基的片段。例如，在本发明的可选的方面，两个序列被最佳联配后，本发明的示例性序列的20至全长之间范围的连续残基与相同数目的连续位置参考序列比较。如果参考序列与本发明的示例性序列具有必需的序列同一性，如与SEQIDNO：1、SEQIDNO：298％序列同一性，和具有上述的具体序列修饰之一，那么该序列在本发明的范围内。在可选实施方式中，两个序列被最佳联配后，大约20至600、大约50至200和大约100至150范围内的子序列与相同数目的连续位置参考序列比较。用于比较的序列联配方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳联配可通过以下方法进行，如：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970，person&Lipman的同源性联配算法、person&Lipman，Proc.Nat’1，Acad.Sci.USA85：2444，1988的搜索相似性方法、这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、FASTA和Wisconsin遗传学软件包中的TFASTA，遗传学计算机工作组，575ScienceDr.，Madison，WI)、或通过手工联配和视觉观察。其它检测同源性或同一性的算法包括，例如，除BLAST程序(在NationalCenterforBiologicalInformation的BasicLocalAlignmentSearchTool(基本局部联配搜索工具)，如BLAST、BLAST2、BLASTN和BLASTX)以外，还有ALIGN、AMAS(AnalysisofMultipleAlignedSequences)(多联配序列分析)、AMPS(ProteinMultipleSequnceAlignment)(蛋白多序列联配)、ASSET(AlignedSegmentStatisticalEvaluationTool)(联配片段统计评估工具)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(BiologicalSequenceComparativeAnalysisNode)(生物学序列比较分析节点)、BLIMPS(BLocksIMProvedSearcher)、FASTA、Intervals&Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、LasVegas算法、FASTA(PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444，1988)、FASTDB(Brutlagetal.Comp.App.Biosci.6：237-245，1990)、FNAT(ForcedNucleotideAligmentTool)(强制的核苷酸联配工具)、帧联配、帧搜索、DYNAMIC、FILTER、FSAP(FristenskySequenceAnalysisPackage)、GAP(GlobalAlignmentProgram)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(SensitiveSequenceComparison)敏感性序列比较、LALIGN(LocalSequenceAlignment)(局部序列联配)、LCP(LocalContentProgram)(局部含量程序)、MACAW(MultipleAlignmentConstruction&AnalysisWorkbench)(多联配构建和分析工作台)、MAP(MultipleAlignmentProgram)(多联配程序)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-InducedMulti-sequenceAlignment)(晶格诱导的多序列联配)、SAGA(SequenceAlignmentbygeneticAlgorithm)(通过遗传算法进行的序列联配)和WHAT-IF。其他用于实践本发明的程序和数据库包括但不限于：MacPattern(EMBL)、DiscoveryBase(MolecularApplicationsGroup)、GeneMine(MolecularApplicationsGroup)、Look(MolecularApplicationsGroup)、MacLook(MolecularApplicationsGroup)、Catalyst(MolecularSimulationsInc.)、Catalyst/SHAPE(MolecularSimulationsInc.)、Cerius2.DBAccess(MolecularSimulationsInc.)、HypoGen(MolecularSimulationsInc.)、InsightII、(MolecularSimulationsInc.)、Discover(MolecularSimulationsInc.)、CHARMm(MolecularSimulationsInc.)、Felix(MolecularSimulationsInc.)、DelPhi、(MolecularSimulationsInc.)、QuanteMM、(MolecularSimulationsInc.)、Homology(MolecularSimulationsInc.)、Modeler(MolecularSimulationsInc.)、ISIS(MolecularSimulationsInc.)、Quanta/ProteinDesign(MolecularSimulationsInc.)、WebLab(MolecularSimulationsInc.)、WebLabDiversityExplorer(MolecularSimulationsInc.)、GeneExplorer(MolecularSimulationsInc.)、SeqFold(MolecularSimulationsInc.)、MDL可用化学品目录数据库、MDL药品数据报告数据库、综合药物化学(ComprehensiveMedicinalChemistry)数据库、Derwent世界药物索引数据库、BioByteMasterFile数据库、GenBank数据库、GenSeq数据库和GenomeQuest数据库。多种其他程序和数据库将对获得本公开的技术人员来说显而易见。这种排列程序也可用于筛选基因组数据库以鉴定具有基本上相同序列的多核苷酸序列。多个基因组数据库可用，例如，通过NCBI(国家生物技术信息中心)网站。含有基因组信息的数据库注有一些功能信息，被不同的团体所持有，并可通过互联网获得。
BLAST、BLAST2.0和BLAST2.2.2算法也用于实施本发明。它们被描述于，如Altschul(1977)Nuc.AcidsRes.25：3389-3402；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。进行BLAST分析的软件可经国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开地获得。此算法涉及，首先通过识别查询序列中长度W的短字符串(word)而确定高分值序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字符串联配时，HSP匹配或满足某正值极限计分T。T是指相邻的字符串计分阈值(Altschul(1990)见上)。这些最初的相邻字符串命中(hit)作为启动搜索的开端以发现含有它们的较长的HSP。字符串命中沿每一条序列向两个方向延长直到累积联配计分能够增加。对于核苷酸序列，累积计分采用参数M计算(匹配残基对的奖励计分；总是＞0)。对于氨基酸序列，用计分矩阵来计算累积计分。在以下情况下，字符串命中在每个方向的延长中止：累积联配计分通过参量X从其最大获得值降低；由于一个或多个负分残基联配的累加，累积计分到0或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定着联配的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列)使用默认值为：字符串长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两链都比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值为：字符串长度3，期望值(E)10和BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)联配(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，和两链都比较。BLAST算法还进行两个序列间相似性的统计分析(见，如Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873)。BLAST算法提供的一个相似性测量方法是最小总概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然地发生的概率指标。例如，在待测核酸与参考核酸的比较中，如果最小总概率小于大约0.2、小于大约0.01或小于大约0.001，则核酸被考虑为与参考序列相似。在一个方面，蛋白质和核酸序列的同源性评估使用基本局部联配搜索工具(″BLAST″)。例如，5个具体的BLAST程序可用于执行下面的任务：(1)BLASTP和BLAST3比较氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库；(2)BLASTN比较核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库；(3)BLASTX比较查询核苷酸序列的六框概念性翻译产物(两个链)与蛋白质序列数据库；(4)TBLASTN比较查询蛋白质序列与在所有六阅读框中翻译的核苷酸序列数据库(两个链)；和(5)TBLASTX比较核苷酸查询序列的六框翻译与核苷酸序列数据库的六框翻译。BLAST程序通过识别相似片段鉴定同源的序列，在这里被称作查询氨基酸或核酸序列与测试序列间的“高分值片段对”，测试序列可以从蛋白质或核酸序列数据库中获得。高分值片段对可以依靠计分矩阵鉴别(即被联配)，它们的许多在本领域是已知的。所用的实例计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等人.Science256：1443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins17：49-61，1993)。可选地，可以使用PAM或PAM250矩阵(参见，如SchwartzandDayhoff，eds.，1978，MatricesforDetectingDistanceRelationships：AtlasofProteinSequenceandStructure，Washington：NationalBiomedicalResearchFoundation)。
在本发明的一个方面，为确定具有必需序列同一性的核酸是否在发明的范围内，使用NCBIBLAST2.2.2程序。默认值选择为blastp。在BLAST2.2.2程序中有大约38个设置选择。在本发明的这个示例方面，除默认过滤设置以外，使用所有的默认值(即，除过滤设为OFF外，所有参数设为默认值)；得当的是，使用“-FF”设置，使不能过滤。由于序列长度短，使用默认过滤常常导致Karlin-Altschul扰乱。
在本发明的这个示例性方面中使用的默认值包括：
“低复杂性过滤器：ON
>字符串大小：3
>矩阵：Blosum62
>空位成本：存在：11
>延伸：1”
“低复杂性过滤器：ON”
其它默认设置是：低复杂性过滤器OFF，对于蛋白质，字符串大小为3，BLOSUM62矩阵，空位存在罚分为-11，空位延伸罚分为-1。
在一些方面，可利用序列比较算法将本发明的核酸序列或氨基酸序列与参考序列进行比较。例如，序列比较算法可将本发明核苷酸序列或氨基酸序列与“亲本”序列SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2或与参考序列进行比较，以鉴定同源性或结构基序。可进行序列比较以确定第一序列是否与第二序列相同。重要的是注意到，此比较类型并不限于进行新序列和数据库中第一条序列间的精确比较。比较两条核苷酸或蛋白质序列的方法，即使它们是不同的，也是本领域技术人员熟知的。例如，为了提高两个待测序列间的同源性水平，可以在一条序列中引入空位。在比较过程中控制空位或其它特征是否引入序列中的参数通常由比较算法使用者输入。
一旦对两个序列已经进行比较，会做出两个序列是否相同的判定。当然，术语“相同”并不限于序列绝对地一样。序列比较可表明比较序列之间的序列同一性水平或鉴定结构基序，或其可鉴定与这些核酸密码和多肽密码进行比较的序列的结构基序。序列同一性水平通过计算序列间相同特征在第一序列的序列总数中的比例而确定。因此，如果第一100个核苷酸序列的每个特征与第二序列的每个特征对齐，则序列同一性水平将是100％。
可选地，该算法可以将参考序列与本发明的序列进行比较，以确定序列是否在一个或多个位置上不同。对于参考序列或本发明的序列，比较结果可以表明插入、缺失或取代的核苷酸或氨基酸残基的长度和同一性。在其他方面，该算法可用于鉴定本发明的核酸或多肽的特征。例如，鉴定器(identifier)特征可包括开放阅读框(ORF)、“起始密码子”(例如，密码子“ATG”)、“TAATAA盒”或基序如α螺旋、β折叠、或是功能性多肽基序如酶活性位点、螺旋-转角-螺旋基序、亮氨酸拉链、糖基化位点、泛素化位点、α螺旋、β折叠、编码指导被编码的蛋白质分泌的信号肽的信号序列、在转录调节中涉及的序列如同源框、酸性序列片段(acidicstretches)、酶活性位点、底物结合位点和酶切割位点和本领域技术人员已知的其他基序。
抑制肌醇六磷酸酶的表达
本发明进一步提供了与本发明的核酸序列互补的核酸(如反义序列)，其包括含有反义、iRNA、核糖核酸酶的核酸。反义序列能够抑制肌醇六磷酸酶编码基因的转运、剪接或转录。抑制作用可以通过靶向基因组DNA或信使RNA而实现。通过例如杂交和/或切割，可以抑制被靶向核酸的转录或功能。本发明提供的特别有用的一组抑制剂包括能够结合肌醇六磷酸酶基因或信使的寡核苷酸，在任一情况下阻止或抑制肌醇六磷酸酶的产生或功能。可以经序列特异性杂交进行联合。另一类有用的抑制剂包括导致肌醇六磷酸酶信使失活或切割的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以具有导致这种切割的酶活性，如核糖核酸酶。寡核苷酸可被化学修饰或与能够切割互补核酸的酶或组合物连接。可以对许多不同的这样的寡核苷酸的库进行筛选来寻找那些具有期望活性的那些寡核苷酸。
反义寡核苷酸
本发明提供了包括本发明的新的肌醇六磷酸酶序列修饰的反义寡核苷酸，其中这些反义寡核苷酸能够结合肌醇六磷酸酶信使，它可以通过靶向mRNA而抑制肌醇六磷酸酶的活性。设计反义寡核苷酸的策略被很好地描述在科学和专利文献中，普通技术人员能够使用本发明的新试剂设计这种肌醇六磷酸酶寡核苷酸。例如，基因步移/RNA图谱分析方案以筛选有效的反义寡核苷酸是本领域熟知的，参见，如Ho(2000)MethodsEnzymol.314：168-183，描述了RNA图谱分析，它依据标准分子技术提供容易的和可靠的选择有效反义序列的方法。也参见Smith(2000)Euro.J.Pharm.Sci.11：191-198。
天然发生的核酸被用作反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是任何长度；例如，在可选的方面，反义寡核苷酸在大约5至100、大约10至80、大约15至60、大约18至40之间。最佳长度可以通过常规筛选来确定。反义寡核苷酸可以呈现任何的浓度。最佳浓度可以通过常规筛选来确定。很多种合成的、非天然发生的核苷酸和核酸类似物是已知的，其可以解决此潜在的问题。例如，可以使用含非离子骨架如N-(2-氨乙基)甘氨酸单位的肽核酸(PNA)。也可以使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸，如以下文献中描述的：WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)ToxicolApplPharmacol144：189-197；反义治疗学(AntisenseTherapeutics)，ed.Agarwal(HumanaPress，Totowa，N.J.，1996)。本发明提供的具有合成DNA主链类似物的反义寡核苷酸还可以包括二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三烷酯、氨基磺酸酯、3’-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3’-N-氨基甲酸酯和吗啉代氨基甲酸酯核酸，如上面描述的。
组合化学方法可用于产生大量数目的寡核苷酸，其能够迅速地筛选对任何靶标具有适当的结合亲合力和特异性的特异寡核苷酸，如本发明的正义和反义肌醇六磷酸酶序列(参见，如Gold(1995)J.ofBiol.Chem.270：13581-13584)。
抑制性核糖核酸酶(核酶)
本发明提供包括本发明的新肌醇六磷酸酶序列修饰的核糖核酸酶，其中本发明所述的核糖核酸酶能够结合肌醇六磷酸酶信使，它可以通过靶向mRNA而抑制肌醇六磷酸酶的活性。设计核糖核酸酶和选择肌醇六磷酸酶特异性反义序列进行靶向的策略被很好地描述在科学和专利文献中，普通技术人员能够使用本发明的新试剂设计这种核糖核酸酶。核糖核酸酶经它的靶RNA结合部分通过结合靶RNA而起作用，靶RNA结合部分极靠近切割靶RNA的RNA酶促部分。因此，核糖核酸酶经互补碱基配对识别和结合靶RNA，且一旦连接到正确的位点，酶促地起作用，以切割和失活靶RNA。如果切割发生在编码序列中，这种方式的靶RNA切割会破坏其引导编码蛋白质合成的能力。在核糖核酸酶已结合和切割其RNA靶以后，它通常从RNA上释放，因此可以重复地结合和切割新靶。
在一些情况下，核糖核酸酶的酶促性质相对于其它技术可以是有利的，如反义技术(其中核酸分子简单地结合到核酸靶上以阻止其转录、翻译或与另一个分子结合)，因为实现治疗所必需的核糖核酸酶有效浓度可以低于反义寡核苷酸所需的浓度。此潜在优势反映了核糖核酸酶酶促地起作用的能力。因此，单一的核糖核酸酶分子能够切割许多靶RNA分子。另外，核糖核酸酶通常是高度特异的抑制剂，其抑制特异性不仅依赖于结合的碱基配对机制，而且依赖于分子抑制其结合的RNA表达的机制。即，抑制作用因RNA靶切割所致，如此，特异性被定义为被靶向RNA的切割速率与非靶向RNA的切割速率的比值。此切割机理依赖于涉及碱基配对以外的因素。因此，核糖核酸酶作用的特异性可以大于反义寡核苷酸结合相同RNA位点的特异性。酶促核糖核酸酶RNA分子可以形成锤头基序，但也可形成发夹基序、肝炎δ病毒基序、I型内含子基序或核糖核酸酶P-样RNA(与RNA前导序列结合)基序。这种锤头基序的实例描述于Rossi(1992)AidsResearchandHumanRetroviruses8：183；发夹基序被描述于Hampel(1989)，Biochemistry28：4929和Hampel(1990)Nuc.AcidsRes.18：299；肝炎δ病毒基序被描述于Perrotta(1992)，Biochemistry31：16；核糖核酸酶P(RnaseP)基序被描述于Guerrier-Takada(1983)，Cell35：849；和I型内含子被描述于Cech的美国专利4,987,071。这些具体基序的描述并非旨在限制性；本领域普通技术人员会认识到，本发明的酶促RNA分子具有与一个或多个靶基因RNA区互补的特异性底物结合位点，以及具有在底物结合位点内或周围的核苷酸序列，使分子具有RNA切割活性。
RNA干扰(RNAi)
在一方面，本发明提供了被称为“RNAi”分子的RNA抑制性分子，其含有本发明的酶序列。RNAi分子包括双链RNA(dsRNA)分子。RNAi分子例如siRNA和/或miRNA可抑制肌醇六磷酸酶基因的表达。在一个方面，RNAi分子例如siRNA和/或miRNA的长度大约为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
虽然本发明不限于任何特定的作用机制，但RNAi可进入细胞中，引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，包括内源性mRNA。当细胞暴露于双链RNA(dsRNA)时，来自同源基因的mRNA被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi的一个可能的基本机制是将与特定的基因序列匹配的双链RNA(dsRNA)打断成为称为短的干扰RNA的短碎片，它可触发与其序列匹配的mRNA的降解。在一个方面，本发明的RNAi可用于基因沉默(gene-silencing)疗法中，参见，例如Shuey(2002)DrugDiscov.Today7：1040-1046。在一个方面，本发明提供了使用本发明的RNAi分子例如siRNA和/或miRNA选择性降解RNA的方法。在一个方面，微小抑制性RNA(micro-inhibitoryRNA(miRNA))抑制翻译，而siRNA抑制转录。该过程可在体外、先体外后体内或体内实施。在一个方面，本发明的RNAi分子可用来在细胞、器官或动物中产生丧失功能的突变。制备和应用RNAi分子例如siRNA和/或miRNA来选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的，参见，例如美国专利6,506,559；6,511,82；6,515,109；6,489,127。
核酸的修饰
本发明提供了产生本发明核酸变体的方法，如编码肌醇六磷酸酶的核酸变体。这些方法可被重复或以各种组合用于产生肌醇六磷酸酶，所述肌醇六磷酸酶具有与模板核酸编码的肌醇六磷酸酶改变的或不同的活性或稳定性。这些方法也可以重复或以各种组合使用，例如以产生以下方面的变化：基因/信使表达、信使翻译或信使稳定性。另一方面，细胞的基因组合物通过如下进行改变：例如先体外后体内修饰同源基因，然后再将其插入细胞。
本发明也提供通过诱变和其它方法改变本发明的肌醇六磷酸酶特性的方法，其包括定向进化，DiversaCorporation(SanDiego，CA)拥有的方法；例如DirectEvolution；(参见例如美国专利5,830,696)；基因位点饱和诱变(GSSM)(参见例如美国专利6,171,820和6,579,258)、定向进化中的核酸外切酶介导的基因装配(Exonuclease-MediatedGeneAssembly)(参见例如美国专利6,361,974和6,352,842)、定向进化中的端选择(EndSelection)(参见例如美国专利6,358,709和6,238,884)、基于重组的合成改组(Recombination-BasedSynthesisShuffling)(参见例如美国专利5,965,408和6,440,668、和澳大利亚专利AU724521)、以及嗜热酶的定向进化(参见例如美国专利5,830,696和6,335,179)。
在一方面，肌醇六磷酸酶的特性通过DirectEvolution方案修饰，其包括：a)应用一个或多个分子模板，如本发明的肌醇六磷酸酶核酸，进行诱变以产生新的分子，和b)在这些新分子的子代种类中选择具有更多的所需要的特征的子代。定向进化的动力依赖于起始模板的初始选择(如“亲本”SEQIDNO：1，或本发明的任何序列)，以及依赖于所选择的诱变过程(一种或多种)和所用的筛选过程(一种或多种)。所以，本发明提供肌醇六磷酸酶活性的高活性的、生理学上有效和经济的新来源，包括这样的新肌醇六磷酸酶：a)其在一个或多个具体应用中具有较高的活性，如食品的高温生产，因此可用于优化这些具体应用；b)其被用作定向进化的模板以获得更进一步改善的新分子；和c)其被用作鉴定其他的相关分子的工具，如通过以杂交为基础的方法进行。
本发明的核酸可以通过任何方法来改变。例如，随机(random或stochastic)方法、或者非随机、或者“定向进化”的方法。基因的随机突变方法在本领域是已知的，参见如，美国专利5,830,696。例如，可以应用突变剂来对基因进行随机突变。突变剂包括，如，紫外线或者γ辐射，或者化学诱变剂，如，丝裂霉素、亚硝酸、光活化补骨脂内酯，它们单独使用或者组合使用，以诱导DNA的断裂，其可以通过重组被修复。其它的化学诱变剂包括，如，亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或者甲酸。其它的诱变剂是核苷酸前体的类似物，如，硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或者吖啶。这些试剂可以加入到PCR反应中替换核苷酸前体，从而突变该序列。也可以应用嵌入剂如普罗黄素、吖啶黄、奎纳克林和类似物。
可以应用分子生物学上的任何技术，如随机PCR诱变，参见，如，Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5467-5471；或者组合式多重盒式诱变，参见如，Crameri(1995)Biotechinques18：194-196。可选地，核酸，如基因，可以在随机或“随即的”片段化后重装配，参见，如，美国专利号6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514，5,811,238；5,605,793。在可选的方面，修饰、添加或者缺失可以通过易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点专一性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、重组、递归序列重组(recursivesequencerecombination)、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、含有尿嘧啶模板的诱变、空位双链体诱变(gappedduplexmutagenesis)、点错配修复诱变(pointmismatchrepairmutagenesis)、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变(restriction-selectionmutagenesis)、限制纯化诱变(restriction-purificationmutagenesis)、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和/或者这些方法和其它方法的组合来产生。
以下的出版物描述了可以并入到本发明的方法中的各种递归重组程序和/或方法：Stemmer(1999)″Molecularbreedingofvirusesfortargetingandotherclinicalproperties″TumorTargeting4：1-4；Ness(1999)NatureBiotechnology17：893-896；Chang(1999)″EvolutionofacytokineusingDNAfamilyshuffing″NatureBiotechnology17：793-797；Minshull(1999)″Proteinevolutionbymolecularbreeding″CurrentOpinioninChemicalBiology3：284-290；Christians(1999)″DirectedevolutionofthymidinekinaseforAZTphosphorylationusingDNAfamilyshuffing″NatureBiotechnology17：259-264；Crameri(1998)″DNAshufflingofafamilyofgenesfromdiversespeciesacceleratesdirectedevolution″Nature391：288-291；Crameri(1997)″MolecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybyDNAshuffling，″NatureBiotechnology15：436-438；Zhang(1997)″DirectedevolutionofaneffectivefucosidasefromagalactosidasebyDNAshufflingandscreening″Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Pattenetal.(1997)″ApplicationsofDNAShufflingtoPharmaceuticalsandVaccines″CurrentOpinioninBiotechnology8：724-733；Cramerietal.(1996)″Constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbyDNAshuffling″NatureMedicine2：100-103；Cramerietal.(1996)″ImprovedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingDNAshuffling″NatureBiotechnology14：315-319；Gatesetal.(1996)″Affinityselectiveisolationofligandsfrompeptidelibrariesthroughdisplayonalacrepressor`headpiecedimer`″JournalofMolecularBiology255：373-386；Stemmer(1996)″SexualPCRandAssemblyPCR″In：TheEncyclopediaofMolecularBiology.VCHPublishers，NewYork.pp.447-457；CrameriandStemmer(1995)″Combinatorialmultiplecassettemutagenesiscreatesallthepermutationsofmutantandwildtypecassettes″BioTechniques18：194-195；Stemmeretal.(1995)″Single-stepassemblyofageneandentireplasmidformlargenumbersofoligodeoxyribonucleotides″Gene，164：49-53；Stemmer(1995)″TheEvolutionofMolecularComputation″Science270：1510；Stemmer(1995)″SearchingSequenceSpace″Bio/Technology13：549-553；Stemmer(1994)″RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling″Nature370：389-391；和Stemmer(1994)″DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly：Invitrorecombinationformolecularevolution.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751。
产生多样性的突变方法包括，例如，定点诱变(Lingetal.(1997)″ApproachestoDNAmutagenesis：anoverview″AnalBiochem.254(2)：157-178；Daleetal.(1996)″Oligonucleotide-directedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod″MethodsMol.Biol.57：369-374；Smith(1985)″Invitromutagenesis″Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein&Shortle(1985)″Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis″Science229：1193-1201；Carter(1986)″Site-directedmutagenesis″Biochem.J.237：1-7；和Kunkel(1987)″Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis″在NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein，F.andLilley，D.M.J.eds.，SpringerVerlag，Berlin))；使用含尿嘧啶模板的诱变(Kunkel(1985)″Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection″Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkeletal.(1987)″Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection″MethodsinEnzymol.154，367-382；和Bassetal.(1988)″MutantTrprepressorswithnewDNA-bindingspecificities″Science242：240-245)；寡核苷酸定向诱变(MethodsinEnzymol.100：468-500(1983)；MethodsinEnzymol.154：329-350(1987)；Zoller&Smith(1982)″Oligonucleotide-directedmutagenesisusingM13-derivedvectors：anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment″NucleicAcidsRes.10：6487-6500；Zoller&Smith(1983)″Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors″MethodsinEnzymol.100：468-500；和Zoller&Smith(1987)″Oligonucleotide-directedmutagenesis：asimplemethodusingtwooligonucleotideprimersandasingle-strandedDNAtemplate″MethodsinEnzymol.154：329-350)；硫代磷酸酯修饰DNA诱变(Tayloretal.(1985)″Theuseofphosphorothioate-modifiedDNAinrestrictionenzymereactionstopreparenickedDNA″Nucl.AcidsRes.13：8749-8764；Tayloretal.(1985)″Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphosphorothioate-modifiedDNA″Nucl.AcidsRes.13：8765-8787(1985)；Nakamaye(1986)″InhibitionofrestrictionendonucleaseNciIcleavagebyphosphorothioategroupsanditsapplicationtooligonucleotide-directedmutagenesis″Nucl.AcidsRes.14：9679-9698；Sayersetal.(1988)″Y-TExonucleasesinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis″Nucl.AcidsRes.16：791-802；和Sayersetal.(1988)″Strandspecificcleavageofphosphorothioate-containingDNAbyreactionwithrestrictionendonucleasesinthepresenceofethidiumbromide″Nucl.AcidsRes.16：803-814)；使用空位双链体DNA的诱变(Krameretal.(1984)″ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedmutationconstruction″Nucl.AcidsRes.12：9441-9456；Kramer&Fritz(1987)MethodsinEnzymol.″Oligonucleotide-directedconstructionofmutationsviagappedduplexDNA″154：350-367；Krameretal.(1988)″ImprovedenzymaticinvitroreactionsinthegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedconstructionofmutations″Nucl.AcidsRes.16：7207；和Fritzetal.(1988)″Oligonucleotide-directedconstructionofmutations：agappedduplexDNAprocedurewithoutenzymaticreactionsinvitro″Nucl.AcidsRes.16：6987-6999)。
用于本发明方法的另外的方案包括点错配修复(Kramer(1984)″PointMismatchRepair″Cell38：879-887)、应用修复缺陷型宿主株的诱变(Carteretal.(1985)″Improvedoligonucleotidesite-directedmutagenesisusingM13vectors″Nucl.AcidsRes.13：4431-4443；和Carter(1987)″Improvedoligonucleotide-directedmutagenesisusingM13vectors″MethodsinEnzymol.154：382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh(1986)″Useofoligonucleotidestogeneratelargedeletions″Nucl.AcidsRes.14：5115)、限制-选择和限制-纯化(Wellsetal.(1986)″Importanceofhydrogen-bondformationinstabilizingthetransitionstateofsubtilisin″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423)、通过全基因合成的诱变(Nambiaretal.(1984)″TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein″Science223：1299-1301；SakamarandKhorana(1988)″Totalsynthesisandexpressionofageneforthea-subunitofbovinerodoutersegmentguaninenucleotide-bindingprotein(transducin)″Nucl.AcidsRes.14：6361-6372；Wellsetal.(1985)″Cassettemutagenesis：anefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites″Gene34：315-323；和Grundstrometal.(1985)″Oligonucleotide-directedmutagenesisbymicroscale`shot-gun`genesynthesis″Nucl.AcidsRes.13：3305-3316)、双链断裂修复(Mandecki(1986)；Arnold(1993)″Proteinengineeringforunusualenvironments″CurrentOpinioninBiotechnology4：450-455.″Oligonucleotide-directeddouble-strandbreakrepairinplasmidsofEscherichiacoli：amethodforsite-specificmutagenesis″Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：7177-7181)。
很多以上的方法的另外的细节或可选的方案可在MethodsinEnzymology第154卷中发现，其也描述了用于解决各种诱变方法中所遇到的问题的有用方案(control)。也参见授权给Stemmer的美国专利5,605,793(1997年2月25日)″MethodsforInVitroRecombination″；授权给Stemmer等的美国专利5,811,238(Sep.22，1998)″MethodsforGeneratingPolynucleotideshavingDesiredCharacteristicsbyIterativeSelectionandRecombination″；授权给Stemmer等的美国专利5,830,721(1998年9月22日)，″DNAMutagenesisbyRandomFragmentationandReassembly″；授权给Stemmer等的美国专利5,834,252(1998年11月10日)″End-ComplementaryPolymeraseReaction″；授权给Minshull等的美国专利5,837,458(1998年11月17日)，″MethodsandCompositionsforCellularandMetabolicEngineering″；Stemmer和Crameri的WO95/22625，″MutagenesisbyRandomFragmentationandReassembly″；Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，″EndComplementaryPolymeraseChainReaction″；Stemmer和Crameri的WO97/20078，″MethodsforGeneratingPolynucleotideshavingDesiredCharacteristicsbyIterativeSelectionandRecombination″；Minshull和Stemmer的WO97/35966，″MethodsandCompositiohsforCellularandMetabolicEngineering″；Punnonen等的WO99/41402，″TargetingofGeneticVaccineVectors″；Punnonen等的WO99/41383，″AntigenLibraryImLmunization″；Punnonen等的WO99/41369，″GeneticVaccineVectorEngineering″；Punnonen等的WO99/41368，″OptimizationofImmunomodulatoryPropertiesofGeneticVaccines″；Stemmer和Crameri的EP752008，″DNAMutagenesisbyRandomFragmentationandReassembly″；Stemmer的EP0932670，″EvolvingCellularDNAUptakebyRecursiveSequenceRecombination″；Stemmer等的WO99/23107，″ModifcationofVirusTropismandHostRangebyViralGenomeShuffling″；Apt等的WO99/21979，″HumanPapillomavirusVectors″；delCardayre等的WO98/31837，″EvolutionofWholeCellsandOrganismsbyRecursiveSequenceRecombination″；Patten和Stemmer的WO98/27230，″MethodsandCompositionsforPolypeptideEngineering″；Stemmer等的WO98/27230，″MethodsforOptimizationofGeneTherapybyRecursiveSequenceShufflingandSelection″，WO00/00632，″MethodsforGeneratingHighlyDiverseLibraries″，WO00/09679，″MethodsforObtaininginVitroRecombinedPolynucleotideSequenceBanksandResultingSequences″，Arnold等的WO98/42832，″RecombinationofPolynucleotideSequencesUsingRandomorDefinedPrimers″，Arnold等的WO99/29902，″MethodforCreatingPolynucleotideandPolypeptideSequences″，Vind等的WO98/41653，″AninVitroMethodforConstructionofaDNALibrary″，Borchert等的WO98/41622，″MethodforConstructingaLibraryUsingDNAShuffling″，以及Pati和Zarlin的WO98/42727，″SequenceAlterationsusingHomologousRecombination″。
就各种多样性产生方法而言，美国申请提供另外的细节或可选的方案，包括Patten等的″SHUFFLINGOFCODONALTEREDGENES″，1999年9月28日提交(美国系列号09/407,800)；delCardayre等的″EVOLUTIONOFWHOLECELLSANDORGANISMSBYRECURSIVESEQUENCERECOMBINATION″，1998年7月15日提交(美国系列号09/166,188)和1999年7月15日提交(美国系列号09/354,922)；Crameri等的″OLIGONUCLEOTIDEMEDIATEDNUCLEICACIDRECOMBINATION″，1999年9月28日提交(美国系列号09/408,392)、和Crameri等的″OLIGONUCLEOTIDEMEDIATEDNUCLEICACIDRECOMBINATION″，2000年1月18日提交(PCT/US00/01203)；Welch等的″USEOFCODON-VARIEDOLIGONUCLEOTIDESYNTHESISFORSYNTHETICSHUFFLING″，1999年9月28日提交(美国系列号09/408,393)；Selifonov等的″METHODSFORMAKINGCHARACTERSTRINGS，POLYNUCLEOTIDES&POLYPEPTIDESHAVINGDESIREDCHARACTERISTICS″，2000年1月18日提交(PCT/US00/01202)和例如Selifonov等的″METHODSFORMAKINGCHARACTERSTRINGS，POLYNUCLEOTIDES&POLYPEPTIDESHAVINGDESIREDCHARACTERISTICS″，2000年7月18日提交(美国系列号09/618,579)；Selifonov和Stemmer等的″METHODSOFPOPULATINGDATASTRUCTURESFORUSEINEVOLUTIONARYSIMULATIONS″，2000年1月18日提交(PCT/US00/01138)；和Affholter的″SINGLE-STRANDEDNUCLEICACIDTEMPLATE-MEDIATEDRECOMBINATIONANDNUCLEICACIDFRAGMENTISOLATION″，2000年9月26日提交(美国系列号09/656,549)。
非随机或“定向进化”方法包括，例如基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)或其组合，它们被用于修饰本发明的核酸，以产生具有新的或改变的特性(例如在高度酸性或碱性条件下的活性，在高温或低温的活性，等等)的肌醇六磷酸酶。由修饰的核酸编码的多肽可以在测试肌醇六磷酸酶活性或其它活性之前被筛选活性。可以使用任何测试模式或实验方案，例如使用毛细管阵列平台。例如参见美国专利6,361,974；6,280,926；5,939,250。
饱和诱变或GSSM
本发明也提供了使用基因位点饱和诱变或GSSM制备酶的方法，如在本文中以及美国专利6,171,820和6,579,258所述的。
在一方面，含有简并N，N，G/T序列的密码子引物被用于将点突变引入多核苷酸中，例如本发明的肌醇六磷酸酶或抗体，以便产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换，置换发生的位置例如或将要被修饰的酶活性位点或配体结合位点中的氨基酸残基。这些寡核苷酸可以包括相邻的第一同源序列，简并N，N，G/T序列，和任选地第二同源序列。由使用这些寡核苷酸而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化，这是由于N，N，G/T序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。一方面，一个这样的简并寡核苷酸(例如包括一个简并N，N，G/T序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面，使用至少两个简并序列盒，或在相同的寡核苷酸中或不在相同的寡核苷酸中，用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。例如，一个寡核苷酸中可以包含一个以上N，N，G/T序列，以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N，N，G/T序列可以直接相邻，或被一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面，用于引入插入和缺失的寡核苷酸可以单独使用，或者与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用，以便引入氨基酸插入、缺失和/或置换的任何排列组合。
在一方面，两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是使用含有相邻N，N，G/T三联体的寡核苷酸进行的，即简并(N，N，G/T)n序列。另一方面，使用与N，N，G/T序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如，在一些情况下，可能期望(例如，在寡核苷酸中)使用仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在该三联体的剩余两个位置上，可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可选地，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N，N，N三联体序列。
在一方面，使用简并三联体(例如N，N，G/T三联体)允许在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且容易地产生完全范围的可能的天然氨基酸(总共20种氨基酸)(在可以选择的方面，这些方法也包括在每一氨基酸残基或密码子、位置产生少于全部的可能置换)。例如，对于100个氨基酸的多肽，可以产生2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)。通过使用含有简并N，N，G/T三联体的寡核苷酸或一组寡核苷酸，32种不同序列可编码所有20种可能的天然氨基酸。因此，在其中使用至少一种这样的寡核苷酸对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中，产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点诱变中使用非简并寡核苷酸在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽。非简并寡核苷酸可以任选地与所公开的简并引物组合使用；例如，非简并寡核苷酸可以被用于在工作多核苷酸中产生特异性点突变。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段相应表达的点突变的手段。
在一方面，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽(例如肌醇六磷酸酶)分子的多核苷酸，以便所有的20种天然氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码子位置的特定氨基酸位置(其它方面使用了少于20个天然的组合)。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的宿主中，例如大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定，显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时，如在碱性或酸性条件下增高的葡聚糖水解活性)，可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
在一方面，如本文所公开的，应用饱和诱变对亲本多肽的各个和每个氨基酸位置进行诱变后，可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多个新的子代分子，其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如，如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化，那么出现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性，以及两个有利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此，总共有3×3×3种或27种可能性，其中包括了先前被检验的7种可能性，即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位置上没有变化的点突变。
在另一方面，位点饱和诱变可以与改组、嵌合、重组和其它诱变方法以及筛选一起使用。本发明提供了以迭代的方式使用任何诱变方法(一种或多种)，包括饱和诱变。在一个实例中，任何诱变方法的迭代使用与筛选结合使用。
本发明还提供了使用专有密码子引物(含有简并N，N，N序列)将点突变引入多核苷酸中，以便产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换(基因位点饱和诱变(GSSM))。使用的这些寡聚体连续地包括相邻的第一同源序列，简并N，N，N序列，以及一方面包括但不必须包括第二同源序列。由使用这些寡聚体而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化，这是由于N，N，N序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。
在一方面，一个这样的简并寡聚体(包括一个简并N，N，N序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面，使用至少两个简并N，N，N序列盒，或在相同的寡聚体中或不同的寡聚体中，用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。因此，一个寡聚体中可以包含一个以上N，N，N序列，以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N，N，N序列可以直接相邻，或由一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面，用于引入插入和缺失的寡聚体可以单独使用，或者与含有N，N，N序列的密码子组合使用，以便引入氨基酸插入、缺失和/或置换的任何排列组合。
在一个具体的示例中，使用含有相邻N，N，N三联体的寡聚体，即简并(N，N，N)n序列，进行两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是可能的。
在另一方面，本发明提供了使用与N，N，N序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在三联体的剩余两个位置上，可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可以选择地，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N，N，N三联体序列、N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列。
但是，应该理解，由于若干个原因，使用如本发明公开的简并三联体(例如N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列)是有利的。一方面，本发明提供了在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统地且相对容易地产生完全范围的可能的氨基酸(总共20种氨基酸)的置换的方法。因此，对于100个氨基酸的多肽，本发明提供了系统地且相对容易地产生产生2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)的方法。可以理解，通过使用含有简并N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列的寡聚体，32种不同序列可编码20种可能的氨基酸。因此，在其中使用一种这样的寡聚体对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中，产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点诱变中使用非简并寡聚体在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽产物。
本发明还提供了非简并寡聚体的使用，其可以任选地与所公开的简并引物组合使用。应该理解，在一些情况中，使用非简并寡聚体在工作多核苷酸中产生特异性点突变是有利的。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段的相应表达的点突变的手段。
因此，在本发明的一方面，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸，以便所有的20种氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码子位置的一个特定氨基酸位置。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定，显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时)，可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
应当理解，如本文所公开的，一旦应用饱和诱变对亲本多肽的各个和每个氨基酸位置进行诱变后，可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多个新的子代分子，其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如，如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化，那么出现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性，以及两个有利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此，总共有3×3×3种或27种可能性，其中包括了先前被检验的7种可能性，即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位置上没有变化的点突变。
因此，在一个非限制性示例中，本发明提供了结合另外的诱变方法使用饱和诱变，例如其中两个或更多个相关多核苷酸被引入合适的宿主细胞的方法，以便通过重组和还原重排产生杂合多核苷酸。
除了沿着基因的全序列进行诱变之外，本发明提供了：诱变可用于替代多核苷酸序列中任意数量的碱基的每一个，其中待被诱变的碱基的数量在一个方面为从15至100,000中的每一个整数。因此，并不是沿着分子诱变每一个位置，可以对每一个或离散数目的碱基(在一个方面为总共15至100,000的亚组)进行诱变。一方面，单独的核苷酸被用于沿着多核苷酸序列诱变每一个位置或一组位置。待被诱变的3个位置的组可以是密码子。使用诱变引物可以引入突变，该诱变引物含有异源序列盒，也称为诱变序列盒。示例性的序列盒可以具有1至500个碱基。在这样的异源序列盒中每一个核苷酸位置可以是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是非A、C、G或T的任何碱基(E可以被称为设计寡聚体(designeroligo))。
一般而言，饱和诱变包括诱变有待诱变的限定多核苷酸序列(其中待诱变的序列长度一方面为约15至100,000个碱基)中的一整组诱变序列盒(其中每一个序列盒的长度一方面为约1-500个碱基)。因此，一组突变(范围从1至100个突变)被引入每一个待诱变的序列盒。在应用一轮饱和诱变的过程中，一组待被引入到一个序列盒的突变可以与第二组待被引入到第二个序列盒的突变不同或相同。这样的分组通过缺失、插入、特定密码子的分组以及特定核苷酸序列盒的分组加以例示。
待被诱变的限定(确定)序列包括全基因、通路、cDNA、整个开放阅读框(ORF)以及整个启动子、增强子、阻抑物/反式激活蛋白、复制起点、内含子、操纵子或任何多核苷酸功能组。通常，为了此目的，“限定(确定)序列(definedsequence)”可以是15碱基多核苷酸序列以及长度在15个碱基至15,000个碱基之间的多核苷酸序列(本发明特别指出中间的每一个整数)的任何多核苷酸。选择密码子分组时的考虑因素包括由简并诱变序列盒编码的氨基酸类型。
在一个实例中，可被引入到诱变序列盒中的突变分组，本发明特别提供了在每一个位置编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种氨基酸的简并密码子置换(使用简并寡聚体)以及由此编码的多肽文库。
合成连接重装配(SLR)
本发明提供了非随机的基因修饰系统，命名为“合成连接重装配”或简单地称作“SLR”，这是一种“定向进化方法”，产生具有新的或改变的特性的多肽，例如本发明的肌醇六磷酸酶或抗体。SLR是将寡核苷酸片段非随机地连接在一起的一种方法。该方法与随机寡核苷酸改组不同的地方在于，核酸构件(buildingblocks)不是被随意地改组、连接或嵌合，而是被非随机地装配。例如参见美国专利6,773,900；6,740,506；6,713,282；6,635,449；6,605,449；6,537,776。
在一方面，SLR包括下述步骤：(a)提供模板多核苷酸，其中模板多核苷酸包含编码同源基因的序列；(b)提供多个构件多核苷酸，其中这些构件多核苷酸被设计成可在预定的序列处与模板多核苷酸交换重装配(cross-overreassemble)，并且构件多核苷酸包含作为同源基因变体的序列和与变体序列两侧的模板多核苷酸同源的序列；(c)将构件多核苷酸与模板多核苷酸组合在一起，以便构件多核苷酸与模板多核苷酸交换重装配，以产生包含同源基因序列变异的多核苷酸。
SLR不依赖于将被重新排列的多核苷酸之间存在高度同源性。因此，该方法可以被用于非随机地产生包括超过10100个不同嵌合体的子代分子的文库(或集合)。SLR可以被用于产生包括超过101000个不同子代嵌合体的文库。因此，本发明的一些方面包括产生一组最终嵌合的核酸分子的非随机方法，所述最终嵌合的核酸分子具有按设计所选择的整个装配次序。该方法包括按设计产生多个特异性核酸构件的步骤，以及装配这些核酸构件的步骤，这样可以获得依设计而定的整个装配次序，所述的多个特异性核酸构件具有可被应用的互相相容的可连接末端。将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”，如果它们能使这些构件以预定的次序结合的话。因此，核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定的。如果使用多于一个的装配步骤，那么核酸构件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。在一方面，用酶例如连接酶(例如T4DNA连接酶)处理退火的结构片段，以实现结构片段的共价结合。在一方面，称为合成连接重装配(SLR)的非随机方法多少涉及随机改组，只是核酸构件模块不是随机地改组或连接或嵌合化，而是非随机地装配，可以用来创造变体。
SLR方法并不依赖于要改组的多核苷酸之间存在高水平的同源性。本发明可用来非随机地产生包含超过10100的不同嵌合体的子代分子文库(或集合)。令人信服地，SLR甚至可以用来产生包含超过101000的不同子代嵌合体的文库。
因此，在一个方面，本发明提供了产生一组具有按设计选择的整个装配次序的最终嵌合的核酸分子的非随机方法，该方法包括如下步骤：按设计产生多个具有可被应用的互相相容的可连接末端的特异的核酸构件，以及装配这些核酸构件，以便获得设计的整个装配次序。
将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”，如果它们能使这些构件以预定的次序结合的话。因此，一方面，核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定的。如果使用多于一个的装配步骤，那么核酸构件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。在本发明的一方面，用酶例如连接酶(例如T4DNA连接酶)处理退火的结构片段，以实现结构片段的共价结合。
另一方面，核酸构件的设计是通过分析一组祖先核酸(progenitornucleicacid)模板的序列而获得的，所述祖先核酸模板作为产生最终嵌合的核酸分子的子代集合的基础。因此这些祖先核酸模板作为序列信息的来源，所述序列信息帮助设计要被诱变即嵌合或改组的核酸构件。
在一个范例中，本发明提供了相关基因家族的嵌合作用及其编码的相关产物家族。在特定的范例中，编码的产物是酶。用于本发明中的酶和多肽可以按照这里描述的方法被诱变。
因此，按照本发明的一个方面，多个祖先核酸模板的序列被联配(比对)以选择一个或多个分界点，该分界点可以位于同源区。分界点可用来描绘要产生的核酸构件的边界。因此，在祖先分子中确定和选择的分界点作为子代分子装配中潜在的嵌合作用点。
典型地，有用的分界点是至少由两个祖先模板共享的同源区(包括至少一个同源核苷酸碱基)，但分界点可以是至少由一半祖先模板、至少三分之二祖先模板、至少四分之三祖先模板或几乎所有的祖先模板共享的同源区。在一个方面，有用的分界点是被所有祖先模板共享的同源区。
在一方面，为产生彻底的文库(exhaustivelibrary)，彻底进行连接重装配过程。换句话说，核酸构件的所有可能的次序组合都呈现在最终嵌合的核酸分子集合中。同时，每一个组合中的装配次序(即在每一个最终嵌合的核酸的5’至3’序列中每一个构件的装配次序)是按设计的(或非随机的)。由于所述方法的非随机性，不期望副产物的可能性大大减低。
在另一方面，所述方法规定，例如为了产生系统地划分的文库，可系统地进行连接重装配过程，其中区室(compartment)可被系统地筛选，例如逐个筛选。换句话说，本发明规定，经选择性和审慎地使用特定的核酸构件，联合选择性和审慎地使用顺序步进装配反应，可以获得实验设计，其中在数个反应瓶的每一个中制造了特定子代产物集合。这允许进行系统的检查和筛选方法。因此，它使潜在地非常大量的子代分子可以在较小的集合内被系统地检验。
由于其具有以高度灵活而彻底以及系统的方式进行嵌合的能力，特别是当祖先分子间的同源性水平较低时，本发明提供包含大量子代分子的文库(或集合)的产生。由于本发明的连接重装配的非随机性，产生的子代分子可以包括具有按设计选择的整个装配次序的最终嵌合的核酸分子文库。在具体的方面，这类产生的文库含有超过103至超过101000的不同子代分子种类。
在一方面，一组如所述产生的最终嵌合的核酸分子包括编码多肽的多核苷酸。按照一个方面，此多核苷酸是基因，它可以是人造基因。按照另一个方面，该多核苷酸是基因通路，它可以是人造基因通路。本发明规定，一个或多个本发明产生的人造基因可并入人造基因通路，如在真核生物体(包括植物)中可操作的通路。
在另一个示例中，产生构件的步骤的合成属性允许设计和引入核苷酸(例如一个或多个核苷酸，例如可以是密码子或内含子或调控序列)，这些核苷酸随后可以在体外过程中(例如通过诱变)或者在体内过程中(例如通过利用宿主生物体的基因剪接能力)被任选地去除。应该意识到，在许多情况下，除了产生有用的分界点的潜在好处之外，还有许多其它原因也使得可能期望引入这些核苷酸。
因此，按照另一个方面，本发明规定核酸构件模块可以用于引入内含子。因此，本发明规定功能性内含子可被引入本发明的人造基因中。本发明还规定，功能性内含子可被引入发明的人造基因通路中。因此，本发明提供产生嵌合的多核苷酸，它是含一个(或以上)人为引导的内含子(或多个)的人造基因。
相应地，本发明还提供了嵌合多核苷酸的产生，该嵌合多核苷酸是含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因通路。一方面，人工引入的内含子在一种或多种宿主细胞的基因剪接中发挥作用，其发挥作用的方式与天然发生的内含子在基因剪接中发挥作用的方式在很大程度上是相同的。本发明提供了产生含人造内含子的多核苷酸的方法，该多核苷酸将被引入宿主生物体中，用于重组和/或剪接。
使用本发明产生的人造基因也可充当底物，用于与另一核酸重组。同样，使用本发明产生的人造基因途径也可充当底物，用于与另一核酸重组。一方面，重组由人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域促进，或发生在人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域。一方面，重组伙伴也可以是本发明产生的核酸，包括人造基因或人造基因途径。重组可以由人造基中一个(或多个)人工引入的内含子上存在的同源区域促进，或发生在由人造基中一个(或多个)人工引入的内含子上存在的同源区域。
本发明的合成基因再装配方法使用多种核酸构件，其每一种可以具有两个可连接末端。在每一个核酸构件上的两个可连接末端可以是两个平端(即，每一个末端具有零个核苷酸的突出)，或一个平端和一个突出端，或两个突出端。
用于该目的的一个有用的突出端可以是3’突出端或5’突出端。因此，核酸构件可以具有一个3’突出端或可选地具有一个5’突出端或可选地具有两个3′突出端或可选地具有两个5’突出端。核酸构件被装配来形成最终嵌合的核酸分子的整个装配次序通过有目的试验设计确定并且是非随机的。
一方面，通过化学合成两个单链核酸(也称为单链寡聚体)并使它们接触以便允许它们退火形成双链核酸构件来生成核酸构件。
双链核酸构件可以具有不同的大小。这些构件的大小可以是小的或大的。构件的示例性大小在1碱基对(不包括任何突出端)至100,000碱基对(不包括任何突出端)之间。还提供了其它大小，其具有1bp至10,000bp(包括中间的每一个整数)的下限和2bp至100,000bp(包括中间的每一个整数)的上限。
存在许多方法，通过这些方法，可以产生可用于本发明的双链核酸构件；并且这些方法在本领域中是已知的，且普通技术人员容易进行。
根据一个方面，通过首先产生两个单链核酸并使它们退火形成双链核酸构件，从而产生双链核酸构件。双链核酸构件的两条链可以在每个核苷酸处互补，除了形成突出端的任何一个核苷酸；从而除了任何突出端外不含有错配。根据另一方面，双链核酸构件的两条链可以在比除了形成突出端的任何核苷酸外的每个核苷酸更少的核苷酸处互补。因此，根据一方面，双链核酸构件可用于引入密码子简并性。一方面，使用本文描述的位点饱和诱变，使用一个或多个N，N，G/T序列盒，或者可选地，使用一个或多个N，N，N序列盒，引入密码子简并性。
本发明的体内重组方法可以在未知杂合体或具体多核苷酸或序列的等位基因的库上进行盲试。然而，不必知道所述具体多核苷酸的实际DNA或RNA序列。
采用混合基因群内的重组的方法可用于产生任何有用的蛋白质，例如白细胞介素I、抗体、tPA和生长激素。该方法可用于产生具有改变的特异性或活性的蛋白质。该方法还可以用于产生杂合核酸序列，例如，基因的启动子区、内含子、外显子、增强子序列、3’未翻译区或5’未翻译区。因此，该方法可用于产生具有增加的表达速率的基因。该方法在研究重复DNA序列中也是有用的。最后，该方法可用于突变核酶或适体。
一方面，本文描述的多核苷酸和多肽的变体通过使用重复循环的还原重排、重组和选择而获得，它使高度复杂的线性序列如DNA、RNA或蛋白质经过重组进行定向分子进化。
分子的体内改组(shuffling)可用来提供变体，并能够应用细胞的天然特性进行分子的体内改组以重组多聚体。虽然体内重组已提供了分子多样性的主要天然路径，但基因重组仍然是相对复杂的过程，其涉及1)同源性识别；2)链切割、链侵入和引起重组交叉产生的代谢步骤；和最后3)将交叉分解成独立的重组分子。交叉的形成需要识别同源序列。
在另一方面，本发明包括由至少第一个多核苷酸和第二个多核苷酸产生杂交多核苷酸的方法。本发明可用于通过将至少第一个多核苷酸和第二个多核苷酸引入适合的宿主细胞而产生杂交多核苷酸，所述至少第一个和第二个多核苷酸共享具有部分序列同源性的至少一个区域(如，SEQIDNO：1)。具有部分序列同源性的区域促进引起产生杂交多核苷酸的序列再组织的过程。如本文所用的术语“杂交多核苷酸”，是来自本发明方法的任何核苷酸序列，含有来自至少两个原始多核苷酸序列的序列。这种杂交多核苷酸可来自促进DNA分子间序列整合的分子间重组事件，另外，这种杂交多核苷酸可来自分子内还原重排过程，其利用重复序列来改变DNA分子中的核苷酸序列。
本发明提供了产生杂合多核苷酸的方法，它可编码生物学活性的杂合多肽(如，杂合肌醇六磷酸酶)。一方面，原始多核苷酸编码生物学活性的多肽。本发明的方法通过应用细胞过程而产生新的杂合多肽，所述细胞过程整合原始多核苷酸的序列，以便得到的杂合多核苷酸编码的多肽显示出衍生自原始生物学活性多肽的活性。例如，原始多核苷酸可编码来自不同微生物的特定酶。由来自一个生物体或变体的第一个多核苷酸编码的酶，例如，在特定的环境条件如高盐度下有效地起作用。由来自不同生物体或变体的第二个多核苷酸编码的酶，可在不同的环境条件如极高温度下有效地起作用。含有来自第一和第二个原始多核苷酸序列的杂合多核苷酸可编码酶，其具有由原始多核苷酸编码的两个酶的特征。因此，由杂合多核苷酸编码的酶可在第一个和第二个多核苷酸编码的每一个酶所具有的环境条件下有效地起作用，如，高盐度和极度温度。
除了上面描述的各种方法，本领域已知可用于获得增加了酶促特性的杂合多核苷酸的各种方法。下面的实例举例说明应用这些方法通过诱变编码目的野生型酶的多核苷酸而获得热稳定的或耐热的酶。
例如，在一方面，本发明使用M.Lehmann等人(在BiochimicaetBiophystcaAda1543：408-415.2000中)描述的方法，其描述了“共有序列法”，其中同源的真菌肌醇六磷酸酶的序列对比被用来计算共有肌醇六磷酸酶氨基酸序列。在相应的共有基因的构建、重组表达和纯化后，所获得的重组肌醇六磷酸酶显示出15-22℃的解折叠温度(Tm)，其高于设计中使用的所有亲本肌醇六磷酸酶的解折叠温度。编码重组蛋白的基因的定点诱变被用来进一步提高Tm值至90.4℃。热稳定效应是由于分布于整个蛋白序列并主要影响表面暴露的残基的多氨基酸交换的组合。
在一方面，本发明使用获得具有增强的热特性的酶的方法，如L.Jermutus等人(J.ofBiotechnology85：15-24，2001)所描述的。在此方法中，土曲霉(Aspergillusterreus)肌醇六磷酸酶表面上的离子相互作用和氢键被首先被恢复，其相当于来自黑曲霉的同源但更加热稳定的酶中存在的离子相互作用和氢键。然后在同一区域内并基于黑曲霉肌醇六磷酸酶的晶体结构来替换整个二级结构元件。用黑曲霉肌醇六磷酸酶的相应一段序列置换土曲霉肌醇六磷酸酶表面上的一个α-螺旋，得到以结构为基础的嵌合酶(融合蛋白)，其热稳定性改善而酶活性不变。
在一方面，本发明使用L.Giver等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA95；12809-12813，1998)所述的方法，其描述了这样的过程，其中在编码枯草杆菌(Bacillussubtilis)对硝基苄基酯酶的多核苷酸的诱变PCR期间引入六代随机诱变，然后基于Stemmer的方法进行体外重组，得到重组酯酶，其热稳定性增加(Tm升高超过14℃)，而在较低温度下不损害催化活性。
在一方面，本发明使用C.Vetriani等人(Proc.Natl.Acad.SciUSA95：12300-12305，1998)所述的方法，其描述了这样的过程，通过所述过程，基于同源性的建模方法和来自最适生长温度分别为100℃和88℃的超嗜热菌强烈炽热球菌(pyrococcusfuriosus)和Thermococcuslitoralis的六谷氨酸脱氢酶的直接结构比较被用来确定关键的热稳定化特征。在较不稳定的酶中观察到实质性减少的亚单位间离子对网络通过诱变其中的两个残基而被改变，以恢复在更稳定的酶中发现的相互作用。尽管任一单突变对热稳定性已具有不利影响，但在适当位置上的两个突变的情况下，观察到在104℃超过野生型酶4倍的稳定性改善。
在一方面，本发明使用A.Tomschy等人(ProteinScience9：1304-1311，2000)描述的方法，其描述了这样的过程，该过程利用黑曲霉肌醇六磷酸酶的晶体结构(2.5埃的分辨率)来确定酶的所有活性位点。然后，使用多氨基酸序列对比来鉴定非保守活性位点残基，该残基可能与给出的有利的目标特性有关。使用这种方法，烟曲霉(A.fumigatus)肌醇六磷酸酶的Gln27，其不同于黑曲霉的Leu27，被鉴定为可能参与底物结合和/或释放，并且是引起烟曲霉肌醇六磷酸酶较低的比活性的原因(pH5.0下，26.5对1966U/mg蛋白)。烟曲霉肌醇六磷酸酶的Gln27向Leu的定点诱变将突变酶的比活性增加至92.1U/mg蛋白。
转基因植物和种子
本发明提供了转基因植物和种子，其包含本发明的核酸、多肽、表达盒、克隆机制或载体、或本发明的转染或转化的细胞。本发明也提供了包含本发明的核酸和/或多肽的植物产品，例如油、种子、叶、提取物和类似物。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明还提供制造和使用这些转基因植物和种子的方法。表达本发明的多肽的转基因植物或者植物细胞可以按照本领域任何已知的方法来构建。参见例如，美国专利6,309,872。
本发明的肌醇六磷酸酶分子的重组表达，或过度表达可与一种或多种其他的分子，如其他酶一起来完成。这种方法可用于产生组合产物，如含有此肌醇六磷酸酶分子以及一个或多个其他分子的植物或植物部分。本发明的肌醇六磷酸酶分子和其它分子可用于联合治疗。所得到的重组表达分子可以以均化和/或纯化的形式或可选择地以相对未纯化形式来使用(如，用作当与其它食品混合以催化肌醇六磷酸的降解时有用的可食用植物部分)。
在一个特定的方面，本发明提供了在转基因植物或植物器官中表达肌醇六磷酸酶和产生它的方法。在能够引导肌醇六磷酸酶表达的调控序列的控制下，含有肌醇六磷酸酶编码基因的DNA表达构建物被提供用于植物的转化。这些调控序列包括能够引导植物中转录的序列，可以是组成型的，或是以阶段和/或组织特异性的方式。
表达的方式部分地依赖于植物或其部分的使用。本发明提供的转基因植物和植物器官可用于多种工业过程，可直接地，如用于动物饲料中，或可选择地，表达的肌醇六磷酸酶可被提取，如果需要，在应用前纯化。可选地，重组的宿主植物或植物部分可直接使用。在一个特殊的方面，本发明提供了使用含有增加量肌醇六磷酸酶的种子来催化肌醇六磷酸水解反应的方法。本方法涉及用含肌醇六磷酸底物接触转基因的非野生型种子，如以磨碎或嚼碎的形式，并使种子中的酶增加反应速率。通过直接将种子加入含肌醇六磷酸的底物中，本发明为昂贵的和有问题的提取和纯化酶过程提供了一种解决方案。在一个实例中，本发明提供了治疗方法，由此，以含增加量的酶的种子的形式将酶给予缺乏足够供应量酶的生物体。在一个方面，将酶给予生物体的时间选择与含肌醇六磷酸的食物的消耗协调起来。
植物中肌醇六磷酸酶的表达可通过多种方法来达到。具体而言，例如有多种技术可转化大量的植物的种，包括双子叶种(如烟草，马铃薯，番茄，矮牵牛花，芸苔)和单子叶种。另外，例如，有许多在植物中表达外源基因的策略。另外，从植物基因中鉴定了许多调控序列，它们可用于构建可在植物和植物细胞中进行功能性表达的嵌合基因(如Klee(1987)Ann.Rev.ofPlantPhys.38：467-486；Clarketal.(1990)VirologyDec；179(2)：640-7；Smithetal.(1990)Mol.Gen.Genet.Dec；224(3)：477-81)。
可采用几种技术将基因构建物引入植物中，包括用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化。可以被如此转化的植物组织的非限制实例包括原生质体、小孢子或花粉和外植体如叶、茎、根、胚轴和子叶(cotyls)。而且，通过微注射、电穿孔、微粒轰击和直接DNA摄取可以直接将DNA引入原生质体和植物细胞或组织中。
蛋白质可通过多种表达系统而在植物中产生。例如，组成型启动子如花椰菜花叶病毒的35S启动子(Guilley等人，1982)可用来在转基因植物的基本上所有器官中积累表达的蛋白。可选地，高度组织特异性和/或阶段特异性的启动子可用于本发明(Higgins，1984；Shotwell，1989)，以使表达偏向所需的组织和/或偏向所需的发育阶段。本发明也采用在植物中表达本发明的肌醇六磷酸酶分子的方案，如在美国专利5,770,413(VanOoijen等人)和美国专利5,593,963(VanOoijen等人)中所公开的，这些专利教导了真菌肌醇六磷酸酶的使用。
编码序列和相邻序列的修饰
来自异源来源的基因在植物中的转基因式表达可涉及这些基因的修饰，以实现和优化它们在植物中的表达。特别地，编码单独的酶但由在天然微生物中相同转录体编码的细菌ORF在植物中在单独的转录体上被最好地表达。因此，在一方面，为实现该目的，每个微生物ORF被单独分离并且克隆在表达盒中，该表达盒在ORF的5’末端提供植物启动子序列和在ORF的3’末端提供植物转录终止子。所分离的ORF序列可包括起始ATG密码子和终止STOP密码子，但可以包含起始ATG和STOP密码子以外的另外的序列。另外，ORF可以被截短，但仍保持所需的活性；对于特别长的ORF，保持活性的截短的形式可优选用于在转基因生物中表达。可用于实施本发明的“植物启动子”和“植物转录终止子”包括在植物细胞内操作的任何启动子和转录终止子。这包括可来自非植物来源例如病毒(例子是花椰菜花叶病毒(CauliflowerMosaicVirus))的启动子和转录终止子。
在一些情况下，不需要对ORF编码序列和相邻序列进行修饰。分离含有目的ORF的片段并将它插入至植物启动子的下游是足够的。例如Gaffney等(Science261：754-756(1993))已经在转基因植物中在CaMV35S启动子和CaMVtml终止子控制下成功表达了假单胞菌(Pseudomonas)nahG基因，而没有对编码序列进行修饰，且假单胞菌基因在ATG上游的核苷酸仍附着着，并且STOP密码子下游的核苷酸仍附着至nahGORF。优选地，尽可能少的相邻微生物序列将保留附着至ATG上游和STOP密码子下游。在实践中，这种构建可依赖于限制性位点的可用性。
在其它情况下，来自微生物来源的基因表达可产生表达问题。这些问题已在本领域中被充分描述，并对于来自某些微生物来源的基因特别常见。这些问题可能适用于本发明的核苷酸序列，并且对这些基因的修饰可以使用本领域现在熟知的技术来进行。可能会遇到下列问题：
密码子使用(usage)
本发明提供具有密码子被修饰以用于植物的核酸；在一些情况中，在植物中的优选密码子使用不同于在某些微生物中的优选密码子使用。在克隆的微生物ORF中的密码子使用与植物基因(以及特别是来自目标植物的基因)中使用的比较，将能够鉴定ORF中应优选地被改变的密码子。通常地，植物进化趋向于在单子叶植物第三个碱基位置强优选核苷酸C和G，而双子叶植物通常在这个位置使用核苷酸A或T。通过修饰基因以整合用于具体目标转基因物种的优选密码子使用，将可克服许多如下所述的GC/AT含量和不正常剪接的问题。
GC/AT含量
本发明提供其GC含量被改变例如以用于植物的核酸；植物基因通常具有大于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列可能在植物中引起几个问题。首先，ATTTA基序被认为导致信息不稳定并且在许多短寿mRNA的3’末端被发现。其次，在信息中不适当位置的多聚腺嘌呤信号例如AATAAA的出现被认为导致转录的过早截短。另外，单子叶植物可识别作为剪接位点的AT富含序列(见下文)。
临近起始甲硫氨酸的序列
本发明提供临近ATG的核苷酸被修饰和/或加入的核酸；植物不同于微生物，在于它们的信息不含有确定的核糖体结合位点。更确切地，据认为核糖体连接至信息的5’末端并且扫描第一个可用的ATG，在此处开始翻译。然而，据认为，优选临近ATG的某个核苷酸并且微生物基因的表达可以通过在ATG包含真核共有翻译起始子来增强。Clontech(1993/1994目录，210页，通过引用引入本文)已提出一个作为共有翻译起始子的序列，用于在植物中表达大肠杆菌uidA基因。此外，Joshi(N.A.R.15：6643-6653(1987)，通过引用引入本文)已比较许多临近ATG的植物序列并提出另一个共有序列。当在植物中表达微生物ORF遇到困难的情况下，在起始ATG包含这些序列之一可改善翻译。在这些情况下，所述共有序列的最后三个核苷酸可能不适于包含在所修饰的序列中，原因在于它们第二个AA残基的修饰。在一些方面，临近起始甲硫氨酸的优选的序列在不同植物物种之间可不同。对14个位于GenBank数据库的玉米基因的调查提供下列结果：
14个玉米基因中在起始ATG之前的位置：
该分析可以对所期望的植物物种进行，该植物物种中正整合入核苷酸序列，并且邻近ATG的序列被修饰以整合入优选的核苷酸。
去除不正常剪接位点
本发明提供不正常剪接位点被修饰或去除或功能上“敲除”的核酸；从非植物来源克隆以及在植物中表达未进行优化的基因还可含有在植物中可作为5’或3’剪接位点被识别的基序，并被切割，从而产生截短的或缺失的信息。可以使用本领域熟知的技术去除这些位点。
修饰编码序列和相邻序列的技术是本领域熟知的。在微生物ORF的起始表达低，并被认为适合如上所述对序列做出改造的情况下，则可根据本领域熟知的方法完成合成基因的构建。这些方法是，例如，在公布的专利公开EP0385962(授予Monsanto)、EP0359472(授予Lubrizol)和WO93/07278(授予Ciba-Geigy)中描述的方法，其全部通过引用引入本文。在大部分情况下，使用瞬时分析方案(其是本领域熟知的)在基因构建物转移至转基因植物之前分析基因构建物的表达是优选的。
植物启动子
本发明的组合物可包含例如用于在目的植物中转化和表达的核酸序列，例如启动子。所述核酸序列可存在于DNA构建物或表达盒中。本发明的核酸可以是“表达盒”或包含“表达盒”，其包括能够指导具体核苷酸序列在适合的宿主细胞中表达的任何核酸分子，表达盒包括可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，而目的核苷酸序列被可操作地连接至终止信号。
本发明的组合物(例如核酸序列)还可包括核苷酸序列的正确翻译所需的序列。编码区通常编码目的蛋白，但也可在正义或反义方向编码目的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包括目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是它的至少一种组分相对于它的至少一种其它组分是异源的。表达盒还可以是天然发生的，但已经以重组形式获得用于异源表达。但是，典型地，表达盒对于宿主是异源的，例如，表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然发生，且必须已经通过转化事件被引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其中只有当宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激时，诱导型启动子才启动转录。另外，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段是特异性的。
本发明包括具有能够表达多核苷酸的表达盒的植物的转化。所述表达盒在5’-3’的转录方向包含转录和翻译起始区(即启动子)和感兴趣的多核苷酸。所述表达盒可任选地包括在植物中具有功能性的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方式中，所述表达盒包括可选择的标记基因，以允许选择稳定的转录体。本发明的表达构建物还可包括前导序列和/或允许诱导型表达感兴趣多核苷酸的序列。参见Guo等(2003)PlantJ.34：383-92和Chen等(2003)PlantJ.36：731-40，其作为允许诱导型表达的序列的例子。
表达构建物的调节序列被可操作地连接至感兴趣的多核苷酸。“可操作地连接”指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并调节相应于第二序列的DNA序列的转录。通常地，可操作地连接意思是指被连接的核苷酸序列是相邻的。
能够驱动在感兴趣植物中表达的任何启动子可用于本发明的实践。所述启动子对植物宿主可以是天然的或类似的或外来的或异源的。术语“异源”和“外源”在本文使用时指核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因，是指源自对特定宿主细胞是外来的来源的序列或，如果来自相同来源，则从它的原始形式修饰而来。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞是内源但已被修饰的基因。该术语还包括天然发生的DNA序列的非天然发生的多个拷贝。因此，该术语是指这样的DNA片段，其对于细胞是外来的或异源的，或对于细胞是同源但处于在宿主细胞核酸中该元件通常不被发现的位置。表达外源DNA片段以产生外源多肽。在可选的实施方式中，“同源”核酸(例如DNA)序列是这样的核酸(例如DNA或RNA)序列，其与被引入的宿主细胞天然相关。
待被包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、可诱导性、所期望的表达水平和细胞或组织优先表达。对本领域普通技术人员来说，通过相对于要表达的序列合适地选择和定位启动子和其它调节区域来调节该序列的表达是常规事情。
某些合适的启动子仅仅或主要在某些细胞类型中起始转录。因此，如本文使用的，细胞类型或组织优先启动子是优先地在靶组织中驱动表达的启动子，但是还可在其它细胞类型或组织中引起某些表达。用于鉴别和表征植物基因组DNA的启动子区的方法包括例如在下列参考文献描述的方法：Jordano等，PlantCell，1：855-866(1989)；Bustos等，PlantCell，1：839-854(1989)；Green等，EMBOJ.7，4035-4044(1988)；Meier等，PlantCell，3，309-316(1991)；和Zhang等，PlantPhysiology110：1069-1079(1996)。
在植物中几种组织优选的调节基因和/或启动子已报道。一些报道的组织优选的基因包括编码种子贮藏蛋白(例如油菜籽蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、β-伴大豆球蛋白、以及菜豆蛋白、醇溶谷蛋白、谷蛋白、球蛋白和玉米醇溶蛋白)、玉米醇溶蛋白或油体蛋白(例如油质蛋白)的基因，或涉及脂肪酸生物合成(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fattyaciddesatureses，fad2-1))的基因，以及其它在胚芽发育过程中表达的基因(例如Bce4，参见例如EP255378和Kridl等(1991)SeedScienceResearch，1：209)。
已经被描述的组织特异启动子的例子包括植物凝集素(Vodkin，Prog.Clin.Biol.Res.，138；87(1983)；Lindstrom等，(1990)Der.Genet.，11：160)、玉米醇脱氢酶1(Dennis等，NucleicAcidRes.，12：3983(1984))、玉米集光复合体(参见例如Simpson，(1986)Science，233：34；Bansal(1992)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3654)、玉米热休克蛋白(参见例如Odell等，(1985)Nature，313：810)、豌豆小亚基RuBP羧化酶(参见例如Poulsen等，(1986)Mol.Gen.Genet.，205：193-200；Cashmore等，(1983)Gen.Eng.ofPlant，PlenumPress，NewYork，29-38)、Ti质粒甘露氨酸合成酶(参见例如Langridge等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3219-3223)、矮牵牛花查耳酮异构酶(参见例如vanTunen(1988)(EMBOJ.7：1257)、豆甘氨酸富含蛋白1(参见例如Keller(1989)GenesDev.3：1639)、截短的CaMV35s(参见例如Odell(1985)Nature313：810)、马铃薯patatin(参见例如Wenzler(1989)PlantMol.Biol.13：347)、根细胞(参见例如Yamamoto(1990)NucleicAcidRes.18：7449)、玉米醇溶蛋白(参见例如Reina(1990)NucleicAcidRes.18：6425；Lopes等(1995)Mol.Gen.Genet.247：603-613；Kriz(1987)Mol.Gen.Genet.207：90；Wandelt(1989)NucleicAcidRes.，17：2354；Langridge(1983)Cell，34：1015；Reina(1990)NucleicAcidRes.，18：7449)、ADP-gpp启动子(参见例如美国专利号7,102,057)、球蛋白-1(参见例如Belanger(1991)Genetics129：863)、α-球蛋白(Sunilkumar等(2002)，TransgenicRes.11：347-359)、α-微管蛋白、cab(参见例如Sullivan(1989)Mol.Gen.Genet.，215：431)、PEPCase(参见例如Hudspeth和Grula，(1989)PlantMolec.Biol.，12：579-589)、R基因复合体相关启动子(Rgenecomplex-associatedpromoter)(Chandler等，(1989)PlantCell，1：1175)、豌豆球蛋白启动子(Czako等，(1992)Mol.Gen.Genet.，235：33；美国专利号5,625,136)、GTL1启动子(Takaiwa等(1991)PlantMol.Biol.16(1)，49-58)、查耳酮合酶启动子(Franken等，(1991)EMBOJ.，10：2605)、GY1启动子(Sims和Goldburg(1989)Nuc.AcidRes.17(11)4368)等等，所有这些文献通过引用引入本文。
本发明可以使用果实-优选的启动子，包括任何种类的果实-优选的启动子，例如在果实发育时或发育期间不表达，至少直到成熟开始，如在U.S.4,943,674中所讨论，其公开内容通过引用引入于本文。聚半乳糖醛酸酶基因的启动子在水果成熟中具有活性。本发明可以使用聚半乳糖醛酸酶基因，如在美国专利号4,535,060、美国专利号4,769,061、美国专利号4,801,590和美国专利号5,107,065中描述，所述公开内容通过引用引入本文。
本发明可以使用任何组织-优选的启动子，包括那些在叶子遭到损害之后(例如，遭到咀嚼式昆虫损害)在叶细胞中、在块茎(例如patatin基因启动子)和在纤维细胞(发育调节纤维细胞蛋白的例子是E6(John和Crow(1992)PNAS89：5769-5773)中指导表达的启动子。E6基因在纤维中是最具活性的，尽管在叶、胚珠和花中发现低水平的转录体。
本发明可使用在光合组织中具有活性例如以在绿色组织如叶和茎中驱动转录的启动子，当它们仅仅或主要在这些组织中驱动表达时是合适的。可选地，本发明可使用启动子以在整个植物中进行组成型表达，或对于绿色组织进行差异表达，或对于发生表达的绿色组织的发育阶段进行差异表达，或响应于外部刺激而表达。
用于实践本发明的示例性启动子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如美洲落叶松(easternlarch)(Larixlaricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等(1994)PlantCellPhysiol.35：773-778)、小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等(1990)PlantMol.Biol.15：921-932)、菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等(1994)PlantPhysiol.104：997-1006))、水稻的cab1R启动子(Luan等(1992)PlantCell4：971-981)、玉米的丙酮酸正磷酸盐二激酶(pyruvateorthophosphatedikinase，PPDK)启动子(Matsuoka等(1993)ProcNatlAcadSciUSA90：9586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等(1997)PlantMol.Biol.33：245-255)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truernit等(1995)Planta196：564-570)和菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS。其它在茎、叶和绿色组织中驱动转录的启动子在美国专利公开号2007/0006346中描述，该专利通过引用全部引入本文。
在一些实施方式中，一些“组织优选的”启动子的组织特异性可能不是绝对的，并且可以用报告基因测试，报告基因例如Gus或绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。还可通过不同组织优选的启动子的组合，用“渗漏”(“leaky”)表达实现组织优选的表达。其它组织优选的启动子可以由本领域普通技术人员分离(参见U.S.5,589,379)。
在一方面，一旦暴露于植物激素——例如植物生长素——而被诱导的植物启动子被用于表达本发明的核酸。例如，本发明可使用大豆(GlycinemaxL.)中的植物生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)PlantPhysiol.115：397-407)、植物生长素应答拟南芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢产生应答)(Chen(1996)PlantJ.10：955-966)、烟草的植物生长素诱导型parC启动子(Sakai(1996)37：906-913)、植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.PlantMicrobeInteract.10：933-937)以及对应激激素脱落酸产生应答的启动子(Sheen(1996)Science274：1900-1902)。
本发明的核酸还可被可操作地连接至因暴露于可用于植物的化学试剂而可诱导的植物启动子，所述化学试剂诸如除草剂或抗生素。例如，在化学配体——包括乙醇——存在下被激活的基因表达系统，例如可以在WO96/27673、WO93/01294、WO94/03619和WO02/061102中发现，所有这些专利申请通过引用引入本文。可使用被苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(DeVeylder(1997)PlantCellPhysiol.38：568-577)；应用不同的除草剂安全剂诱导不同的基因表达模式，包括在根、水囊和茎端分生组织中的表达。编码序列可以在例如四环素-诱导型启动子——例如对于含有AvenasativaL.(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物所述的(Masgrau(1997)PlantJ.11：465-473)、雌激素——例如蜕皮激素受体(WO01/52620)或水杨酸应答元件(Stange(1997)PlantJ.11：1315-1324)的控制下。通过使用化学(例如激素或杀虫剂)诱导的启动子，即对可以在田野中应用于转基因植物的化学品产生应答的启动子，本发明多肽的表达可以在植物发育的特定阶段被诱导。
可被用于实践本发明并且已被描述的示例性组成型启动子包括水稻肌动蛋白1(Wang等(1992)Mol.Cell.Biol.，12：3399；美国专利号5,641,876)、其它肌动蛋白同工型(McElroy等(1990)PlantCell2：163-171和McElroy等(1991)Mol.Gen.Genet.231：150-160)、CaMV35S(Odell等(1985)Nature，313：810)、CaMV19S(Lawton等(1987)PlantMol.Biol.9：315-324；美国专利号5,639,949)、nos(Ebert等(1987)PNASUSA84：5745-5749)、Adh(Walker等(1987)PNASUSA84：6624-6628)、蔗糖合成酶(Yang和Russell(1990)PNASUSA87：4144-4148)和泛素启动子(例如向日葵-Binet等(1991)PlantScience79：87-94；玉米-Christensen等(1989)PlantMolec.Biol.12：619-632和拟南芥-Callis等，J.Biol.Chem.(1990)265：12486-12493；以及Norris等，PlantMol.Biol.(1993)21：895-906。
任何转录终止子可用于实践本发明，例如可被用于载体、表达盒等等中。这些转录终止子负责转基因和正确的mRNA多聚腺苷酸化作用外的转录终止。该终止区可以对于转录起始区是天然的，可对于目的可操作连接的DNA序列是天然的，可对于植物宿主是天然的，或可获自另外的来源(即，对启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主或其任何组合是外来的或异源的)。适合的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶基因终止子以及豌豆rbcsE9终止子。这些转录终止子可用于单子叶植物和双子叶植物。另外，可使用基因的天然转录终止子。
本发明可使用任何序列增强来自转录单位内的基因表达；并且这些序列与本发明的基因联合用于增加它们在转基因植物中的表达。例如，已显示用各种内含子序列来增强表达，特别是在单子叶细胞中。例如，已经发现当被引入玉米细胞时，在同源启动子下，玉米Adhl基因的内含子显著增强野生型基因的表达。
还众所周知的是，许多源自病毒的非翻译前导序列增强表达，并且这些前导序列在双子叶细胞中特别有效。具体地，来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米退绿斑驳病毒(MCMV)和紫花苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示有效地增强表达(例如Gallie等Nucl.AcidsRes.15：8693-8711(1987)；Skuzeski等PlantMolec.Biol.15：65-79(1990))。
细胞内基因产物的靶向
例如在植物中靶向基因产物的任何机制可用于实践本发明，并且已知这些机制存在于植物中，并且控制这些机制发挥功能的序列已经被详细表征。已经表征了引起基因产物靶向至其它细胞区室的序列。氨基端序列可负责将目的蛋白靶向至任何细胞区室——例如植物的液泡、线粒体、过氧化物酶体、蛋白体、内质网、叶绿体、淀粉颗粒、造粉体、质外体或细胞壁(例如Unger等，PlantMolec.Biol.13：411-418(1989)；Rogers等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：6512-651；美国专利号7,102,057；WO2005/096704，所有这些文献通过引用引入于此)。任选地，信号序列可以是waxy的N-末端信号序列、γ-玉米醇溶蛋白的N-末端信号序列、淀粉结合结构域、C-末端淀粉结合结构域、叶绿体靶向序列——其将成熟蛋白质输入至叶绿体(Comai等(1988)J.Biol.Chem.263：15104-15109；vandenBroeck等(1985)Nature313：358-363；美国专利号5,639,949)或糊粉(aleurone)细胞的分泌信号序列(Koehler和Ho，PlantCell2：769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列一起负责基因产物的液泡靶向(Shinshi等(1990)PlantMolec.Biol.14：357-368)。
在一方面，选择的信号序列应该包括已知的切割位点，并且构建的融合物应考虑在切割位点(多个位点)之后的任何氨基酸，其是切割所需的。在某些情况中，这种要求可以通过在切割位点和转基因ATG之间加入少量的氨基酸来实现，或可选地，通过替代转基因序列中的一些氨基酸来实现。这些构建技术是本领域熟知的，并且可以相等地应用于任何细胞区室。
在一方面，上述的细胞靶向机制不但可以与它们的同源启动子，而且可以与异源启动子一起利用，以便在启动子的转录调节下实现特异性的细胞靶向目标，所述启动子具有不同于衍生出靶向信号的启动子的表达模式。
总之，多种方法可用于实施本发明，包括在转基因植物、种子、器官或任何植物部分中完成肌醇六磷酸酶的重组表达的任何方法。这样的转基因植物和植物部分可作为重组表达的肌醇六磷酸酶的来源，它们可直接加入至含肌醇六磷酸的来源中。可选地，重组植物表达的肌醇六磷酸酶可从植物来源中被提取，如果需要，在接触肌醇六磷酸酶底物之前被纯化。
在本发明的背景下，可被选择的植物(用于实践本发明)包括但不限于产生可食用花的作物如花耶菜(甘蓝(Brassicaoleracea))，朝鲜蓟(Cynarascolymus)，水果如苹果(苹果属，如domesticus)、香蕉(芭蕉属，如acuminata)、浆果(如黑醋栗，虎耳草库栗属，如rubrum)、樱桃(如甜樱桃，樱桃属，如avium)、黄瓜(香瓜属，如sativus)、葡萄(葡萄属，如vinifera)、柠檬(Citruslimon)、甜瓜(Cucumismelo)、坚果(如核桃，胡桃属，如regia；花生，落花生(Arachishypogeae))、桔(柑桔属，如maxima)、桃(李属，如persica)、梨(Pyra，如communis)，李子(李属，如domestica)、草莓(草莓属，如moschata)、番茄(番茄属，如esculentum)，叶，如紫花苜蓿(苜蓿属，如sativa)、甘蓝(如，Brassicaoleracea)、菊苣(Cichoreum，如endivia)、韭菜(葱属，如porrum)、莴苣属(莴苣属，如sativa)、菠菜(菠菜，如oleraceae)、烟草(烟草(Nicotiana)，如烟叶(tabacum))，根，如竹芋(竹芋，如arundinacea)、甜菜(甜菜属，如vulgaris)、胡萝卜(胡萝卜属，如carota)、木薯(木薯，如esculenta)、芜箐(芸苔，如rapa)、萝卜(萝卜属，如sativus)、薯蓣(薯蓣属，如esculenta)、甘薯(Ipomoeabatatas)，和种子，如菜豆(菜豆属，如vulgaris)、豌豆(Pisum，如sativum)、大豆(Glycin，如max)、小麦(小麦属，如aestivum)、大麦(大麦属，如vulgare)、玉米(玉蜀黍属，如mays)、大米(稻属，如sativa)、油菜籽(Brassicanapus)、小米(黍)、向日葵(Helianthusannus)、燕麦(Avenasativa)，块茎类，如甘蓝(芸苔，如oleraceae)、马铃薯(茄属，如tuberosum)和类似作物。
在一方面，本发明的核酸和多肽被表达在任何植物或者种子中或者插入到任何植物或者种子中。本发明的转基因植物可以是双子叶植物或者单子叶植物。本发明的单子叶转基因植物的例子是草，如牧草(蓝草，Poa)，饲料草如羊茅属，黑麦草属，温带草，如翦股颖属(Agrostis)，和谷类，如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、蜀黍和玉米(maize或corn)。本发明的双子叶转基因植物的例子是烟草，豆类如羽扇豆，马铃薯，甜菜，豌豆，蚕豆和大豆，以及十字花科植物(十字花科(Brassicaceae))，如花椰菜，油菜籽，和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)。这样，本发明的转基因植物和种子包括很宽范围的植物，包括，但不限于，以下属的种：腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天冬属(Asparagus)、茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子(Cocos)、咖啡(Coffea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、Daucus、Elaeis、Fragaria、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、墨角纶(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、洋橄榄(Olea)、稻属(Oryza)、Panieum、Pannisetum、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、Pistachia、Pisum、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卡属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、芥子(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、Theobromus、胡萝卜属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、Vtgna和玉蜀黍属(Zea)。
在可选择的实施方式中，本发明的核酸在含有纤维细胞的植物中表达，包括，如，棉、丝棉树(木棉、吉贝木棉)、沙漠柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜(winterfat)、轻木(balsa)、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、马尼拉剑麻和亚麻。在可选择的实施方式中，本发明的转基因植物可以是棉属(Gossypium)的成员，包括棉属的任何棉种的成员，如，亚洲棉(G.arboreum)、草棉(G.herbaceum)、海岛棉(G.barbadense)和陆地棉(G.hirsutum)。
另外的植物以及非植物表达系统可用于实践本发明。植物物种的选择主要是根据所要使用的植物或其部分和植物种属对转化的顺应性来确定。
几种技术可用来将含有编码肌醇六磷酸酶的DNA序列的表达构建物引入靶植物。转化多种高等植物种类的技术是公知的并在技术和科学文献中加以描述。参见例如Weising(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；美国专利5,750,870。这些技术也可包括但不限于使用钙/聚乙二醇方法、电穿孔和微注射或(包被的)微粒轰击(Potrykus，1990)来转化原生质体。除了这些所谓的直接DNA转化方法，涉及载体的转化系统可广泛地获得，如病毒载体(如，来自花椰菜花叶病毒(CaMV)和细菌载体(如，来自农杆菌属)(Potrykus，1990)。在选择和/或筛选后，已经被转化的原生质体、细胞或植物部分可使用本领域中已知的方法(Horsch等人；1985)被再生为完整植物。转化和/或再生技术的选择对本发明并不是关键的。
本发明的核酸和表达构建物可以用任何方式引入植物细胞。在实践本发明的可选择方面中，术语“引入”在多核苷酸——例如感兴趣核苷酸构建物的上下文中，意图是指以使多核苷酸得以进入植物细胞内部的方式给植物提供多核苷酸。当一种以上的多核苷酸被引入时，这些多核苷酸可以被组装成单一核苷酸构建物的一部分，或作为独立的核苷酸构建物，并且可以定位在相同或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以用单一转化事件、独立的转化事件或例如在植物中作为培植方法的一部分，引入感兴趣宿主细胞。本发明的方法不依赖于用于将一种或多种多核苷酸引入植物的具体方法，只要多核苷酸得以进入所述植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，这些方法包括但不限于：瞬时转化方法、稳定转化方法和病毒介导的方法。
“瞬时转化”可被用于实践本发明，并且在多核苷酸上下文中的一些方面中意图指多核苷酸被引入植物，并且不整合入植物的基因组。在多核苷酸引入植物的上下文中，“稳定引入”或“稳定引入的”可被用于实践本发明，并且在一些方面，其意图指所引入的多核苷酸被稳定地整合入植物基因组，并且因此植物是用所述多核苷酸稳定转化的。
在多核苷酸引入植物的上下文中，“稳定转化”或“稳定转化的”可被用于实践本发明，并且在一些方面，其意图指多核苷酸例如于本文所述的核苷酸构建物被引入植物，整合入植物的基因组，并且能够通过其后代遗传下去，更具体地，通过多个连续世代的后代遗传下去。引入所期望植物的基因组可以使得酶通过内源转录或翻译控制元件来调节。用于单子叶植物和双子叶植物的转化技术是本领域熟知的。
本发明的核酸可用于将所期望的特征赋予基本上任何植物。在一个实施方式中，本发明的酶可以以使酶直到需要之前不与它的底物接触的方式表达。例如，本发明的酶可被靶向并保持在植物细胞的内质网中。将酶保持在细胞内质网中，可防止酶与它的底物接触。然后，可通过各种能够破坏亚细胞结构的方式，例如研磨、碾磨、加热等等，使得所述酶和底物可接触。参见WO98/11235、WO2003/18766和WO2005/096704，所有通过引用引入于此。
为了鉴定已经成功整合了转基因的植物细胞或者组织，可以将选择性标记基因加入到基因构建物中。这可能是必要的，因为在植物细胞中完成基因的整合和表达是一个罕见的事件，仅仅在较少百分比的靶组织或细胞中发生。选择性标记基因编码对试剂有抗性的蛋白质，所述试剂一般对植物有毒性，如抗生素或者除草剂。当在含有适当的抗生素或者除草剂的培养基上生长时，只有已经整合了选择性标记基因的植物细胞可以成活。转化中常规使用的选择标记包括nptll基因——赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing和Vierra.Gene19：259-268(1982)；Bevan等，Nature304：184-187(1983))，bar基因——其赋予对除草剂草胺膦(phosphinothricin)的抗性(White等，Nucl.AcidsRes18：1062(1990)；Spencer等TheorAppl.Genet79：625-631(1990))，hph基因——其赋予对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，MolCellBiol4：2929-2931)，dhfr基因——其赋予对甲氨蝶呤(methatrexate)的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)：1099-1104(1983))，EPSPS基因——其赋予对草甘膦(glyphosate)的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)。
可选地，转基因植物原料可以通过阳性选择系统来鉴定，例如利用甘露糖-6-磷酸异构酶基因的系统，其提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。
在一方面，制备转基因植物或种子包括将本发明的序列以及任选的标记基因整合到目标表达构建物(如，质粒)中，同时安置启动子序列和终止子序列。这可以包括通过合适的方法将修饰的基因转移至植物中。本发明的一种或多种序列可与具有对昆虫、疾病、干旱的抗性，增加产率，改进谷物的营养质量，改进乙醇产率等等的序列结合。
例如，构建物可以应用如电穿孔和微注射植物细胞原生质体的技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，或者构建物可以应用弹道方法(ballisticmethods)，如，DNA粒子轰击(DNAparticlebombardment)的方法直接引入到植物组织中。例如，参见如，Christou(1997)PlantMol.Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature327：70-73；Talcumi(1997)GenesGenet.Syst.72：63-69，讨论了应用粒子轰击将转基因引入到小麦中；以及Adam(1997)如上，应用粒子轰击将YAC引入至植物细胞中。例如，Rinehart(1997)如上，用粒子轰击来产生转基因棉花植物。用于加速粒子的设备在美国专利5,015,580中有描述；而且，可以商购得到BioRad(Biolistics)PDS-2000粒子加速设备；也参见，John，美国专利5,608,148；和Ellis，美国专利号5,681,730，描述了粒子介导的裸子植物的转化。
在一方面，原生质体可以被固定，并与核酸例如表达构建物一起注射。尽管源自原生质体的植物再生对于谷类并不容易，但是应用体细胞胚胎发生由原生质体来源的愈伤组织进行植物再生在豆类中是有可能的。机化组织可以使用基因枪技术用裸DNA转化，其中，DNA被包裹于钨微射弹(tungstenmicroprojectiles)上，射出物的大小为细胞大小的1/100，它携带DNA深入到细胞和细胞器中。转化的组织然后被诱导再生，一般通过体细胞胚胎发生技术。这一技术已经在包括玉米和水稻的几个谷类物种中成功应用。
核酸，例如表达构建物，也可以应用重组病毒引入到植物细胞中。植物细胞可以用病毒载体转化，如，烟草花叶病毒衍生的载体(Rouwendal(1997)PlantMol.Biol.33：989-999)，参见Porta(1996)“Useofviralrepliconsfortheexpressionofgenesinplants”，Mol.Biotechnol.5：209-221。
可选地，核酸，如表达构建物，可以与合适的T-DNA侧翼区域组合，并引入到传统的根瘤农杆菌宿主载体中。根瘤农杆菌宿主的毒力功能将在植物细胞受该细菌感染时，引导构建物和邻近的标记插入至植物细胞DNA中。根瘤农杆菌介导的转化技术，包括解毒(disarming)和应用二元载体，在科学文献中有详细的说明。参见，如，Horsch(1984)Science233：496-498；Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4803(1983)；GeneTransfertoPlants，Potrykus，ed.(Springer-Verlag，Berlin1995)。根瘤农杆菌细胞的DNA被包含在细菌染色体中，也被包含在称为Ti(肿瘤诱导)质粒的另一种结构中。Ti质粒含有一段命名为T-DNA的DNA(～20kb长)和一系列毒力(毒性)基因，T-DNA在感染过程中被转移到植物细胞中，毒力基因则引导所述感染过程。根瘤农杆菌仅可以通过伤口感染植物：当一种植物的根或者茎受伤时，它释放某种化学信号，作为对这种信号的响应，根瘤农杆菌的毒力基因被激活，并引发一系列从Ti质粒转移T-DNA至植物染色体所必需的事件。T-DNA然后通过伤口进入到植物细胞。一个推测是T-DNA一直等到植物DNA被复制或者转录，然后将自身插入到暴露的植物DNA中。为了应用根瘤农杆菌作为转基因载体，必须去除T-DNA的肿瘤诱导部分，而保留T-DNA的边界区域和毒力基因。转基因然后插入到T-DNA的边界区域之间，从这里转移到植物细胞并且整合到植物的染色体中。
本发明提供了应用本发明的核酸进行包括重要的谷类植物在内的单子叶植物的转化，参见Hiei(1997)PlantMol.Biol.35：205-218。也参见如，Horsch，Science(1984)233：496；Fraley(1983)Proc.NatlAcad.SciUSA80：4803；Thykjaer(1997)如上；Park(1996)PlantMol.Biol.32：1135-1148，讨论了将T-DNA整合到基因组DNA中。也参见D’Halluin，美国专利5,712,135，描述了包含在谷类或者其它单子叶植物的细胞中的具有功能的基因的DNA的稳定整合过程。
在一方面，第三步可涉及完整植物的选择和再生，所述植物能够将整合的靶基因传递至下一代。这样的再生技术依赖于在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操作，其通常依赖于同所期望的核苷酸序列一起引入的杀虫剂和/或除草剂标记。源自培养的原生质体的植物再生在以下文献中有说明，Evans等，ProtoplastsIsolationandCulture，HandbookofPlantCellCulture，124-176页，MacMillilanPublishingCompany，NewYork，1983；和Binding，RegenerationofPlants，PlantProtoplasts，21-73页，CRCPress，BocaRaton，1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或者其中的一部分得到。这样的再生技术在Klee(1987)Ann.Rev.ofplantPhys.38：467-486中有概括性的说明。为了从转基因组织如未成熟的胚胎获得整个植物，它们可以在一系列含有营养物和激素的培养基中在可控制的环境条件下生长，即称为组织培养的过程。一旦整个植物再生并且产生种子，便开始评测其子代。
在一方面，在表达序列盒稳定地整入到转基因植物之后，其可以通过有性杂交(sexualcrossing)引入到其它的植物中。可以应用任何的标准繁殖技术，这依赖于待杂交的物种。参见例如WelshJ.R.，FundamentalsofPlantGeneticsandBreeding，JohnWiley和Sons，NY(1981)；CropBreeding，WoodD.R.(Ed.)AmericanSocietyofAgronomyMadison，Wis.(1983)；MayoO.，TheTheoryofPlantBreeding，第二版，ClarendonPress，Oxford(1987)；Singh，D.P.，BreedingforResistancetoDiseasesandInsectPests，Springer-Verlag，NY(1986)；以及Wricke和Weber，QuantitativeGeneticsandSelectionPlantBreeding，WalterdeGruyter和Co.，Berlin(1986)。
在一方面，因为本发明核酸的转基因表达导致表型变化，包含本发明的重组核酸的植物可以和第二种植物有性杂交而得到最终产物。因此，本发明的种子可以来自本发明的两个转基因植物的杂交，或者来自本发明的植物和另一种植物的杂交。当两个亲本植物都表达本发明的多肽(例如肌醇六磷酸酶)时，所需的效应(例如，表达本发明的多肽来产生一种开花行为被改变的植物)可以被增强。所需的效应通过标准的繁殖方法传到以后的植物世代中。
对于双子叶植物，可使用双载体系统(Hoekema等人，1983；EP0120516Schilperoort等人)。例如，可使用的农杆菌株含有具有致病基因的vir质粒和含要被传递的基因构建物的相容质粒。这种载体可在大肠杆菌中和农杆菌中复制，并可产生自双载体Bin19(Bevan，1984)，该双载体可被改变，其细节与本发明无关。在此实例中使用的双载体包含在T-DNA的左边界和右边界序列之间，相同的编码卡那霉素抗性的NPTII基因(Bevan，1984)和在所需基因构建物中克隆的多个克隆位点。
转化和再生单子叶作物可使用任何方法或标准过程进行实践；单子叶植物易于转化，并且增殖的转基因植物可以由转化的细胞再生。在可选的方面中，单子叶植物通过农杆菌属转化进行转化。
在一方面，采用编码潮霉素抗性的细菌hph基因作为选择标记物，可获得转基因水稻植物；该基因可通过电穿孔被引入。在一方面，通过将编码草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase)(一种灭活除草剂草胺膦的酶)的吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因经由微颗粒轰击引入玉米悬浮培养物的成胚细胞中，可获得转基因玉米植物。在一方面，可将遗传物质引入至单子叶作物的糊粉原生质体中，如小麦和大麦。在一方面，通过仅选择老化的致密和结节胚性愈伤组织，建立胚发生悬浮培养物，从胚发生悬浮培养再生出小麦植物。在一方面，与这些作物的转化系统组合能使本发明应用于单子叶植物。这些方法和其它方法也可用于双子叶植物的转化和再生。
在实践本发明中，肌醇六磷酸酶构建物的表达涉及的细节如通过植物聚合酶转录基因，翻译mRNA等，这些对于重组DNA技术领域的普通技术人员是已知的。本文讨论了与实践本发明的一些实施方式相关的细节。已知的或发现引起肌醇六磷酸酶表达的调控序列可在本发明中使用。所用的调控序列的选择依赖于目标靶作物和/或靶器官。这种调控序列可从植物或植物病毒中获得，或可化学合成。这些调控序列是启动子，在引导植物中的转录中有活性，根据使用的植物或其部分可以是组成型的或阶段性和/或组织特异性的。这些启动子包括但不限于，显示组成型表达的启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)(Guilley等人；1982)的35S启动子，用于叶特异性表达的启动子如核酮糖二磷酸羧化酶小亚单位基因的启动子(Coruzzi等人，1984)，用于根特异性表达的启动子如来自谷氨酰胺合酶基因的启动子(Tingey等人，1987)，用于种子特异性表达的启动子如来自油菜(Brassicanapus)的十字花科蛋白A启动子(Ryan等人，1989)，用于块茎特异性表达的启动子如马铃薯的I型patatin启动子(Koster-Topfer等人，1989；Wenzler等人，1989)，或用于果实特异性表达的启动子如番茄的多聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子(Bird等人，1988)。
其它的调控序列如终止子序列和多聚腺苷化信号可用于实践本发明，并且它们可包括在植物中如此发挥作用的任何这类序列，其选择在普通技术人员的水平范围内。这种序列的一个实例是根癌农杆菌的胭脂碱合酶(nos)基因的3’侧翼区(Bevan，见前)。调控序列也包括增强子序列，如在CaMV的35S启动子中发现的序列，和mRNA稳定序列如紫花苜蓿花叶病毒(A1MV)RNA4的前导序列(Brederode等人，1980)或以类似方式作用的其它任何序列。
在一些实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在可使表达蛋白稳定的环境中表达。根据肌醇六磷酸酶的生物物理参数，选择细胞区室，如胞液、内质网、液泡、蛋白体或壁膜间隙(周质间隙)可在本发明中用来建立稳定的环境。这类参数包括但不限于最适pH、对蛋白酶的敏感性或对优选区室摩尔浓度的敏感性。
在一些实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在胞浆中表达；在一些方面，为了在细胞胞浆中获得表达，表达的酶不应该含有分泌性信号肽或任何其它的靶序列。为了在叶绿体和线粒体中表达，表达的酶将含有特异的所谓的转运肽以进入这些细胞器中。为了达到这种目的，已知有可附着在目标酶上的寻靶序列(Smeekens等人，1990；vandenBroeck等人，1985；Wolter等人，1988)。如果需要在液泡中有酶活性，必须要存在分泌信号肽，以及可引导酶进入这些液泡的特异性寻靶序列(Tague等人，1990)。对于种子中的蛋白体也是这样的。编码目标酶的DNA序列应该以这样的方式修饰：该酶可在细胞中的期望位置发挥其作用。
在一些实施方式中，为了在细胞外表达肌醇六磷酸酶，本发明的表达构建物利用分泌信号序列。尽管与植物宿主种属同源的(天然的)信号序列可以是优选的，但也可使用异源信号序列，即那些来自其它植物种属或微生物来源的序列。这种信号序列对本领域的普通技术人员是已知的。在本发明的范围之内可使用的适当的信号序列公开于Blobel等人，1979；VonHeijne，1986；Garcia等人，1987；Sijmons等人，1990；Ng等人，1994；和Powers等人，1996)。
在一些实施方式中，如果需要，采用本领域普通技术人员已知的方法，本发明的相关DNA构建物的所有部分(启动子，调控序列，分泌序列，稳定序列，寻靶序列或终止序列)都进行修饰，以影响它们的控制特性。可使用经本发明获得的含有肌醇六磷酸酶的植物来获得具有更高肌醇六磷酸酶水平的植物或植物器官。例如，可能通过使用体细胞克隆变异技术或通过杂交育种技术来获得这种植物或植物器官。这种技术为本领域普通技术人员熟知。
在一方面，本发明提供了获得肌醇六磷酸酶和其它分子的高效过度表达系统的一种方法(及其产物)。在一个方面，本发明提供了在木霉属中获得肌醇六磷酸酶和pH2.5的酸性磷酸酶的高效过度表达系统的方法(及其产物)。这个系统产生在动物饲料工业中特别有用的酶组合物。关于这种方法的其它细节可见于公开发表的文献中和/或是普通技术人员已知的。在一个具体的非限制性实例中，这种公开可获得的文献包括EP0659215(WO9403612A1)(Nevalainen等人)，尽管这些文献并未教导本申请中的发明分子。
在一些实施方式中，本发明使用体内重排，所述体内重排可集中于统称为“重组”的“分子间”过程，其在细菌中可以是“RecA依赖性的”现象。本发明可依赖于宿主细胞的重组过程以重组和重排序列，或依赖细胞介导还原过程的能力以通过缺失作用降低细胞中准重复序列的复杂性。此“还原重排”的过程通过“分子内的”、非RecA依赖性的过程发生。
因此，在本发明的另一个方面，通过还原重排方法可以产生变体多核苷酸。该方法涉及产生含有连续序列(原始的编码序列)的构建物，它们插入进合适的载体中，以及随后它们被引入合适的宿主细胞。通过具有同源区的构建物中的连续序列之间或准重复单元之间的组合过程，发生各分子特性(identity)的重排。重排过程重组和/或减少重复序列的复杂性和程度，并导致新的分子种类的产生。可应用多种处理方法来增加重排的速率。这些处理方法可包括用以下方法处理：紫外线、或损害DNA的化学品，和/或使用显示水平增加的“遗传不稳定性”的宿主细胞系。因此重排过程可涉及同源重组或准重复序列的天然特性，以引导其本身的进化。
本发明可使用重复或“准重复”序列；这些序列在遗传不稳定性中可具有重要的地位。在本发明中，“准重复区”是不限制于其原始单元结构的重复区。准重复单元在一个构建物中表现为序列的阵列；相似序列的连续单元。一旦连接，连续序列之间的接合基本看不见，且得到的构建物的准重复特性目前在分子水平是连续的。细胞为了减少得到的构建物的复杂性而进行的缺失过程在准重复序列之间进行。准重复单元实际上提供了无限的模板库，滑动事件(slippageevent)可在所述模板上发生。因此，含有准重复序列的构建物可有效地提供足够的分子弹性，即缺失(和潜在地插入)事件实际上可发生在准重复单元内的任何位置。
在一些方面中，当准重复序列都在相同的方向上被连接，例如头尾相接或相反方向时，细胞不能区分各个单元。因此，还原过程可发生在整个序列中。相比之下，例如当所述单元表现为头对头，而不是头对尾，倒位界定了邻近单元的终点，使得缺失形成将促进不连续单元的丢失。因此，在本发明的一个方面，序列处于同一方向。准重复序列的随机方向将导致重排效率丧失，而序列方向一致将提供最高的效率。但是，虽然具有较少的同一方向的邻接序列降低了效率，仍可对新分子的有效回收提供足够的弹性范围。可用同一方向的准重复序列制备构建物以提供较高的效率。
可采用包括下列方法的多种方法的任何方法以头对尾的方向装配序列：
(a)可使用包括的引物，多聚-A头和多聚-T尾在制成单链时提供方向。可通
过含有从RNA制备的引物最初的少量碱基而达到此目的，并因此容易去掉RNAseH。
(b)可使用包括独特限制性切割位点的引物。将需要多个位点、一组独特的序列和重复的合成和连接步骤。
(c)引物内部的少数碱基可被硫醇化，而核酸外切酶可用来产生正确加尾的分子。
在一些方面，重排序列的回收依赖于鉴别具有还原RI的克隆载体。重排的编码序列然后可通过扩增被回收。产物被再克隆和表达。具有还原RI的克隆载体的回收可通过下列实现：
1)当构建物的复杂性被降低时，使用仅稳定保留的载体；
2)通过物理方法物理回收缩短的载体。在这种情况下，克隆载体使用标准质粒分离方法回收并且在琼脂糖凝胶或具有低分子量截留的柱上使用标准方法进行大小分级；
3)回收含有当插入片段大小降低时可被选择的间断基因的载体；和
4)采用表达载体和适当的选择，应用直接选择技术。
来自相关生物体的编码序列(例如，基因)可用于实践本发明，并且它们可显示出高度同源性，并编码完全不同的蛋白质产物。这些类型的序列在本发明中作为准重复区特别有用。但是，虽然下面讨论的示例性方案显示了几乎相同的原始编码序列(准重复区)的重排，但这个过程并不限于这种几乎相同的重复区。
一旦形成，构建物可以在或可以不在琼脂糖凝胶上根据已公布的方案进行大小分级，可以或可以不插入克隆载体，并可以或可以不转染至合适的宿主细胞。然后细胞被繁殖，且“还原重排”得以实现。如果需要，还原重排过程的速率可通过诱导DNA损害来激发。RI的降低是由重复序列间通过“分子内的”机制形成的缺失加以介导，或是由类似重组的事件通过“分子间的”机制介导并不重要。最终的结果是分子重排成所有可能的组合。
在一方面，本发明的方法包括筛选改组库中的文库成员的其它步骤，以鉴定具有结合或以另外的方式相互作用或催化一个特殊反应(如，催化肌醇六磷酸的水解)的能力的各个改组文库成员。
在一方面，从这些文库中鉴定到的多肽可用于治疗、诊断、研究和相关的目的(如，催化剂、用于增加水溶液的渗透性的溶质等等)，和/或可以进行改组和/或选择的一个或者多个另外的循环。
在另一个方面，在重组或重排之前，或在重组或重排的过程中，本发明的多核苷酸或通过在此描述的方法产生的多核苷酸可经受促进突变引入原始多核苷酸的试剂或过程。引入这些突变将增加获得的杂合多核苷酸和它们编码的多肽的多样性。引入这样的突变将会增加得到的杂合多核苷酸及由其编码的多肽的多样性。促进诱变的所述试剂或方法可以包括，但不限于：(+)-CC-1065，或者合成的类似物如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)(参见Sun和Hurley，(1992)；能够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4’-氟-4-氨基联苯加合物(见，例如，vandePoll等(1992))；或者能够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4-氨基联苯加合物(也见，vandePoll等(1992)，751-758页)；三价铬、三价铬的盐、可以抑制DNA复制的多环芳香烃(PAH)DNA加合物，如7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷酸盐(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7，8-二氢二醇-9-10-环氧化物(“BPDE”)、铂(II)卤盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]-喹啉“N-羟基-IQ”)、和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-f]-吡啶(“N-羟基-PhIP”)。用于减慢或者停止PCR扩增的示例性方法由紫外线(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)组成。特别考虑的方法是DNA加合物或者来自多核苷酸或者多核苷酸库的含有DNA加合物的多核苷酸，在进一步的处理前，其可以通过包括加热含有所述多核苷酸的溶液的过程被释放或者去除。
另一方面，本发明涉及产生具有生物活性的重组蛋白的方法，其通过在根据本发明产生杂合或重排多核苷酸的条件下处理含有编码野生型蛋白的双链模板多核苷酸的样品进行。
本发明也提供了应用专有密码子引物(含有简并N，N，G/T序列)以将点突变导入多核苷酸，以产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换(基因位点饱和诱变(GSSM))。使用的寡聚体包括相邻的第一同源序列、简并N，N，G/T序列和任选地第二同源序列。由使用这些寡聚体而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化，这是由于N，N，G/T序列的简并性包括了所有20种氨基酸的密码子。
一方面，一个这样的简并寡聚体(包括一个简并N，N，G/T序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面，使用至少两个简并N，N，G/T序列盒，或在相同的寡聚体中或不在相同的寡聚体中，用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。因此，一个寡聚体中可以包含一个以上N，N，G/T序列，以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N，N，G/T序列可以直接相邻，或被一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面，用于引入插入和缺失的寡聚体可以单独使用，或者与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用，以便引入氨基酸插入、缺失和/或置换的任何排列组合。
在一方面，使用含有相邻N，N，G/T三联体的寡聚体即简并(N，N，G/T)n序列进行两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是可能的。
在另一个方面，本发明提供了应用与N，N，G/T序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如，在一些情况下，可能期望(例如，在寡聚体中)使用仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在该三联体的剩余两个位置上，可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可选地，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N，N，N三联体序列、或N，N，G/C三联体序列。
但是，可以理解，由于若干个原因，使用如本发明公开的简并三联体(例如N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列)是有利的。一方面，本发明提供了在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且地相对容易地产生完全范围的可能的氨基酸(总共20种氨基酸)的置换的方法。因此，对于100个氨基酸的多肽，本发明提供了系统地且相对容易地产生产生2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)的方法。可以理解，通过使用含有简并N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列的寡聚体，32种不同序列可编码所有20种可能的氨基酸。因此，在其中使用一种这样的寡聚体对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中，产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点诱变中使用非简并寡聚体在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽产物。
本发明还提供了非简并寡聚体的使用，其可以任选地与所公开的简并引物组合使用。可以理解，在一些情况中，使用非简并寡聚体在工作多核苷酸中产生特异性点突变是有利的。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段的相应表达的点突变的手段。
因此，在一方面，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸，以便所有的20种氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码子位置的一个特定氨基酸位置。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定，显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时)，可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
应意识到的是，如本文所公开的，应用基因位点饱和诱变(GSSM)对亲本多肽的各个和每个氨基酸位置进行诱变后，可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多个新的子代分子，其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如，如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化，那么出现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性，以及两个有利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此，总共有3×3×3种或27种可能性，其中包括了先前被检验的7种可能性，即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位置上没有变化的点突变。
在另一方面，位点饱和诱变可以与改组、嵌合、重组和其它诱变方法以及筛选一起使用。本发明提供了以迭代的方式使用任何诱变方法(一种或多种)，包括饱和诱变。在一个实例中，任何诱变方法的迭代使用与筛选结合使用。
因此，在一个非限制性的实例中，本发明的多核苷酸和多肽可通过联合其它诱变方法的基因位点饱和诱变(GSSM)进行衍生化，例如其中两个或更多个相关多核苷酸被引入合适的宿主细胞的方法，以便通过重组和还原重排产生杂合多核苷酸。
除了沿着基因的全序列进行诱变之外，诱变可用于替代多核苷酸序列中任意数量的碱基的每一个，其中待被诱变的碱基的数量可以是从15至100,000中的每一个整数。因此，并不是沿着分子诱变每一个位置，可以对每一个或离散数目的碱基(可以为总共15至100,000的亚组)进行诱变。单独的核苷酸被用于沿着多核苷酸序列诱变每一个位置或一组位置。待被诱变的3个位置的组可以是密码子。使用诱变引物可以引入突变，该诱变引物含有异源序列盒，也称为诱变序列盒。示例性的序列盒可以具有1至500个碱基。在这样的异源序列盒中每一个核苷酸位置可以是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是非A、C、G或T的任何碱基(E可以被称为设计寡聚体(designeroligo))。
一般而言，饱和诱变包括诱变有待诱变的限定多核苷酸序列(其中待诱变的序列长度可以为约15至100,000个碱基)中的一整组诱变序列盒(其中每一个序列盒的长度可以为约1-500个碱基)。因此，一组突变(范围从1至100个突变)被引入每一个待诱变的序列盒。在应用一轮饱和诱变的过程中，一组待被引入到一个序列盒的突变可以与第二组待被引入到第二个序列盒的突变不同或相同。这样的分组通过缺失、插入、特定密码子的分组以及特定核苷酸序列盒的分组加以例示。
待被诱变的限定序列包括全基因、通路、cDNA、整个开放阅读框(ORF)以及整个启动子、增强子、阻抑物/反式激活蛋白、复制起点、内含子、操纵子或任何多核苷酸功能组。通常，为了此目的，“限定序列(definedsequence)”可以是15碱基多核苷酸序列以及长度在15个碱基至15,000个碱基之间的多核苷酸序列(本发明特别指出中间的每一个整数)的任何多核苷酸。选择密码子分组时的考虑因素包括由简并诱变序列盒编码的氨基酸类型。
在一个方面，可被引入到诱变序列盒中的突变分组，本发明特别提供了在每一个位置编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种氨基酸的简并密码子置换(使用简并寡聚体)以及由此编码的多肽文库。
在可选的方面，本发明的核酸包含DNA，其包括cDNA、基因组cDNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链的，则DNA可以是编码链或非编码(反义)链。可选地，本发明的核酸可包括RNA。
如在下面更详细讨论的，本发明的分离的核酸序列可用于制备本发明的多肽。
因此，本发明的另一方面是分离的核酸序列，其编码本发明的多肽。本发明的核酸序列可包括另外的编码序列如前导序列或前体蛋白序列和非编码序列，如内含子或非编码序列5’和/或编码序列的3’。因此，如在此所使用的，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包括多肽的编码序列的多核苷酸以及包括其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
可选地，使用常规技术，例如定点诱变或本领域技术人员熟悉的其它技术，本发明的核酸序列可被诱变，以将沉默改变引入本发明的多核苷酸。如本文所使用，“沉默改变(silentchanges)”包括，例如不改变由所述多核苷酸编码的氨基酸序列的改变。这样的改变可能是期望的，以通过引入在宿主微生物中频繁发生的密码子或密码子对而增加由宿主细胞产生多肽的水平，该宿主细胞含有编码所述多肽的载体。
本发明还涉及具有核苷酸改变的多核苷酸，所述核苷酸改变在本发明的多肽中导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。使用技术例如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III删除和其它重组DNA技术，可以导入这样的核苷酸改变。
在必要的时候，允许探针与互补序列特异性杂交的条件，可以通过将探针与来自样品的互补序列以及对照序列进行接触来确定，所述样品已知含有互补序列，所述对照序列不含有互补序列。杂交条件，如杂交缓冲液的盐浓度、杂交缓冲液的甲酰胺浓度或杂交温度，可以被改变以确定允许探针与互补核酸特异性杂交的条件。
如果该样品含有从中可分离出核酸的生物体，那么探针的特异性杂交被检测到。杂交可以通过用可检测的试剂标记探针来检测，所述可检测的试剂如放射性同位素、荧光染料或能催化可检测产物形成的酶。
使用标记探针来检测样品中互补核酸的存在的许多方法对于本领域技术人员是熟知的。这些方法包括DNA印迹法、RNA印迹法、集落杂交方法和斑点印迹法。这些方法中的每一种方法的方案存Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley503Sons，Inc.(1997)和Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual2nd Ed.，ColdSpringHarborLaboratoryPress1989中提供。
可以选择地，一种以上的探针(其中至少一种探针能与核酸样品中存在的任何互补序列特异性杂交)可以在扩增反应中使用，以确定样品是否包含含有本发明的核酸序列的生物体(例如从中可分离出所述核酸的生物体)。这些探针可以包括寡核苷酸。一方面，扩增反应可以包括PCR反应。PCR实验方案在Ausubel和Sambrook，同上中有所描述。可选地，扩增可以包括连接酶链式反应、3SR或链置换反应(参见Barany，F.，″TheLigaseChainReactioninaPCRWorld″，PCRMethodsandApplications1：5-16，1991；E.Fahyetah，″Self-sustainedSequenceReplication(3SR)：AnIsothermalTranscription-basedAmplificationSystemAlternativetoPCR″，PCRMethodsandApplications1：25-33，1991；以及WalkerGT.等，″StrandDisplacementAmplification-anIsothermalinvitroDNAAmplificationTechnique″，NucleicAcidResearch20：1691-1696，1992)。在这样的方法中，将样品中的核酸与探针接触，进行扩增反应，检测任何所得的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳并用嵌入剂如溴化乙锭对凝胶进行染色来检测。可以选择地，可以用放射性同位素标记一种或多种探针，放射性扩增产物的存在在凝胶电泳后通过放射自显影术来检测。
衍生自本发明序列的末端附近的序列的探针也可以在染色体步移(chromosomewalking)方法中使用，以鉴定含有临近上述核酸序列的基因组序列的克隆。这样的方法允许从宿主生物中分离编码额外蛋白的基因。
本发明的核酸序列可被用作探针，以鉴定和分离相关的核酸。在一些方面，该相关的核酸可以是来自生物体的cDNA或基因组DNA，这些生物体并不是从中分离出所述核酸的生物体。例如，其它生物体可以是相关生物体。在这样的方法中，核酸样品在允许探针与相关序列特异性杂交的条件下与探针接触。然后用上面描述的任意一种方法检测探针与来自相关生物体的核酸进行的杂交。
在核酸杂交反应中，用于得到特定严格性水平的条件将根据杂交中的核酸的性质而变化。例如，所述核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)和核酸类型(例如RNA和DNA)可以在选择杂交条件时加以考虑。另外的考虑因素是核酸之一是否被固定，例如固定在滤膜上。
杂交可以在低度严格性、中度严格性或高度严格性的条件下进行。作为核酸杂交的一个实例，含有固定化的变性核酸的聚合物膜首先在45℃在由如下成分组成的溶液中预杂交30分钟：0.9MNaCl、50mMNaH2PO4，pH7.0、5.0mMNa2EDTA、0.5％SDS、10×Denhardt’s和0.5mg/ml多核糖腺苷酸。然后在该溶液中加入大约2×107cpm(比活性为4-9×108cpm/ug)的32P末端标记的寡核苷酸探针。·在温育12-16小时后，在室温下在含有0.5％SDS的1×SET(150mMNaCl、20mMTris盐酸，pH7.8、1mMNa2EDTA)中将膜洗涤30分钟，随后，在该寡核苷酸探针的Tm-10℃的温度，在新鲜的1×SET中洗涤30分钟。然后将膜暴露于放射自显影胶片，以检测杂交信号。
通过改变用于鉴定与可检测探针杂交的核酸例如cDNA或基因组DNA的杂交条件的严格性，可以鉴定并分离与探针具有不同同源性水平的核酸。严格性通过在低于探针的解链温度的变化温度下进行杂交来改变。解链温度Tm是50％的靶序列与完全互补的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严紧的条件，使其与特定探针的Tm相等，或比Tm低大约5℃。可以使用下述公式计算探针的解链温度：对于长度在14到70个核苷酸的探针，使用如下公式计算解链温度(Tm)：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(600/N)，其中N是探针的长度。如果杂交在含有甲酰胺的溶液中进行，解链温度使用如下等式计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中N是探针的长度。预杂交可以在6×SSC、5×Denhardt’s试剂、0.5％SDS、100μg变性的片段化鲑精DNA或6×SSC、5×Denhardt’s试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、50％甲酰胺中进行。SSC和Denhardt’s溶液的配方可在如上Sambrook等中找到。
杂交通过将可检测探针加入到上面所列出的预杂交溶液中来进行。在探针包含双链DNA的情况下，在加入到杂交溶液之前对探针变性。将滤膜与杂交溶液接触充足的时间，以允许探针与含有与其互补的序列或与其同源的序列的cDNA或基因组DNA杂交。对于长度超过200个核苷酸的探针，杂交可以在比Tm低15-25℃的温度中进行。对于更短的探针，如寡核苷酸探针，杂交在比Tm低5-10℃的温度中进行。对于6×SSC中的杂交，杂交在大约68℃进行。通常，对于在包含50％甲酰胺的溶液中的杂交，杂交是在大约42℃进行的。所有的前述杂交将被认为在高严格条件下进行。
杂交后，洗涤滤膜以除去任何非特异性结合的可检测探针。用于洗涤滤膜的严格性也可以根据如下方面进行变化：被杂交的核酸的性质、被杂交的核酸的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)和核酸类型(例如RNA和DNA)。逐步增高的严格性洗涤条件的实例如下：2×SSC，0.1％SDS，室温下洗涤15分钟(低度严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，室温下洗涤30分钟到1小时(中度严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，在杂交温度至68℃之间洗涤15到30分钟(高度严格性)；和0.15MNaCl，72℃洗涤15分钟(极高严格性)。最终的低严格性洗涤可以在0.1×SSC在室温下进行。上述的实例仅仅是可用于洗涤滤膜的一组条件的示例性说明。本领域技术人员将知道，对于不同严格性的洗涤，可以有多种方案。下面给出了一些其它实例。
通过放射自显影或其它常规技术，可以鉴定已杂交至探针的核酸。
可以对上述方法进行修改，以鉴定与探针序列具有降低水平的同源性的核酸。例如，为了获得与可检测的探针具有降低的序列同源性的核酸，可以使用较低严格性的条件。例如，杂交温度可以以5℃的梯度从68℃降低到42℃而变化，杂交缓冲液的Na+浓度为大约1M。在杂交后，用2×SSC、0.5％SDS在杂交温度下洗涤滤膜。这些条件在高于50℃被认为是“中度”条件，在低于50℃被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在55℃进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在45℃进行。
可以选择地，杂交可以在含有甲酰胺的缓冲液如6×SSC中在42℃的温度下进行。在这种情况下，杂交缓冲液中甲酰胺的浓度可以以5％的梯度从50％降低到0％而变化，以鉴定与探针具有降低水平的同源性的克隆。在杂交后，用6×SSC、0.5％SDS在50℃洗涤滤膜。这些条件在高于25％的甲酰胺被认为是“中度”条件，在低于25％甲酰胺被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在30％甲酰胺中进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在10％甲酰胺中进行。
例如，前述方法可用于分离核酸，所述核酸具有与SEQIDNO：1中所示的核酸序列至少大约99％、至少98％、至少97％、至少95％、至少90％或至少80％的同源性的序列，与其基本上相同的序列，或含有其至少大约10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基的片段，和与前述任一序列互补的序列。同源性可以使用联配算法来测量。例如，同源多核苷酸可以具有编码序列，该编码序列是本文描述的编码序列之一的天然发生的等位基因变体。当与SEQIDNO：1中所示的核酸序列或其互补序列比较时，这样的等位基因变体可以具有一个或多个核苷酸的置换、剔除或添加。
另外，上述的方法可用于分离编码多肽的核酸，所述多肽与具有SEQIDNO：2中所示序列的多肽具有至少大约99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少70％的同源性、具有与其基本上相同的序列，或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段，正如使用序列联配算法(例如FASTA3.0t78版本算法，参数为默认值)所确定的。
本发明的另一个方面是一种分离的或纯化的多肽，其包含SEQIDNO：1中所示的序列、与其基本上相同的序列、或含有其至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段。如上所讨论，这些多肽可通过如下获得：将编码多肽的核酸插入至载体以使该编码序列可操作地连接至能够驱动编码的多肽在合适的宿主细胞中表达的序列。例如，表达载体可包括启动子，用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包含用于扩增表达的适合序列。
适合在细菌中表达多肽或其片段的启动子包括大肠杆菌lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子、λPL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子、和酸性磷酸酶启动子。真菌启动子包括因子启动子。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用在原核细胞或真核细胞或其它病毒中已知控制基因表达的其它启动子。
哺乳动物表达载体也可包含复制起点、任何需要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、5’侧翼非转录序列。在一些方面，衍生于SV40剪接子和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录基因元件。
在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可含有增强子以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件，长度通常为从大约10至大约300bp，可作用于启动子，以增强其转录。实例包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
另外，表达载体典型地含有一个或多个选择性标记物基因，使能够选择含有载体的宿主细胞。这样的选择性标记物包括编码二氢叶酸还原酶的基因或赋予真核细胞培养物以新霉素抗性的基因、在大肠杆菌中赋予四环素或氨苄青霉素抗性的基因和酿酒酵母TRP1基因。
用来从至少一个微生物体中获得的DNA中选择性分离目标靶DNA的探针DNA可以是已知活性的酶的DNA的全长编码区序列或部分编码区序列。原始DNA文库可采用探针的混合物来探测，混合物中含有至少一部分编码具有特定酶活性的酶的DNA序列。这些探针或探针文库可以是单链的，并且被探测的微生物DNA可以被转变为单链形式。适合的探针衍生自编码与将被筛选的特定酶活性相似或相同的活性的酶的DNA。
探针DNA可以为至少大约10个碱基或至少15个碱基。在一个方面，整个编码区可用作一个探针。其中通过使用至少一种DNA探针选择性地分离靶DNA的杂交条件可被设计为提供至少大约50％序列同一性的杂交严格性，更特别地是提供至少大约70％序列同一性的严格性。
探针DNA可被特异结合对中的一个伴侣(即配体)“标记”，并且该结合对中的另一个伴侣结合在固相基质上以便于容易从其来源物中分离靶标。配体和特异性结合伴侣可以任一倾向性选自下列：(1)抗原或半抗原和抗体或其特异性结合片段；(2)生物素或亚氨基生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；(3)糖和其特异性凝集素；(4)酶和其抑制剂；(5)脱辅酶和辅因子；(6)互补的同聚寡核苷酸；和(7)激素和其受体。固相可选自：(1)玻璃或聚合物表面；(2)聚合珠填充柱；和(3)磁颗粒或顺磁颗粒。
合适的DNA序列可以通过各种方法插入载体中。一般而言，将插入物和载体用合适的限制性内切酶消化后，DNA序列可以连接到载体中的所希望的位置。可选地，插入物和载体的平末端可以被连接。多种克隆技术被公开于Ausubel等CurrentProtocolsin MolecularBiology，JohnWiley503Sons，Inc.1997和Sambrook等，MolecularCloning： ALaboratoryManual2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的水平范围内。
载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成DNA序列，SV40的衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体在Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)中描述。
可以使用的特定细菌载体包括商业上可获得的质粒，其包括以下熟知的克隆载体的遗传元件：pBR322(ATCC37017)、pKK223-3(PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)、GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174pBluescriptIIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、DR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。具体的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，只要它可以在宿主细胞中复制和存活，可以使用任何其它载体。
宿主细胞可以是本领域普通技术人员熟悉的宿主细胞中的任何一种，包括原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。作为合适宿主的代表性实例，可提到：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各种，真菌细胞，如曲霉，酵母，如毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)的任何种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9(SpodopteraSf9)，动物细胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤和腺病毒。合适宿主的选择是本领域普通技术人员能力范围内的。
载体可以使用各种技术导入宿主细胞中，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法(lipofection)或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，BasicMethodsinMolecularBiology，(1986))。
在适当的情况下，工程化宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被转化和宿主株生长到合适的细胞密度之后，用合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)诱导所选择的启动子，并且细胞再培养一段时期，使得它们产生所需的多肽或其片段。
细胞一般可以通过离心收获，通过物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎，包括冻-融循环、超声处理、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话，可以应用蛋白质重折叠步骤来完成多肽的构象。假如需要的话，在最终的纯化步骤中可以采用高效液相色谱(HPLC)。
也可使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系(其描述见Gluzman，Cell，23：175，1981)，和其它能够从相容的载体中表达蛋白的细胞系，如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产方法中所用的宿主，由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以被糖基化或者未被糖基化。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸残基或不包括起始甲硫氨酸残基。关于蛋白质的重组表达的其它细节是本领域普通技术人员可获得的。例如，ProteinExpression： APracticalApproach(PracticalApproachSeriesbyS.J.Higgins(Editor)，B.D.Hames(Editor)(July1999)OxfordUniversityPress；ISBN：0199636249，对本领域普通技术人员在很多种的生物体中表达蛋白质提供了详细的指导。
可选地，本发明的多肽可以通过常规肽合成仪合成产生。在其它方面，通过肽合成，所述多肽的片段或部分可以被用于产生相应的全长多肽；因此，所述片段可用作产生全长多肽的中间体。
如本领域普通技术人员所了解的，本发明的核酸序列可被优化，以在多种生物体中表达。在一个方面，本发明的序列被优化以在目标生物体中进行密码子使用，目标生物体例如真菌如酿酒酵母，或细菌如大肠杆菌。为了密码子使用而进行的核酸序列优化在本领域中被充分理解，是指选择生物体优选的特定密码子来编码特定氨基酸。优化的密码子使用表对于许多生物体是已知的。例如，见在TransferRNAinProteinSynthesisbyDolphL.Hatfield，ByeongJ.Lee，RobertM.Pirtle(编者)(July1992)CRCPress；ISBN：0849356989。因此，本发明也包括适合生物体的密码子使用的发明核酸。
本发明的核酸序列的优化表达也指核酸的定向或随机诱变以实现所编码蛋白质的表达增强。本发明的核酸的诱变可直接或间接提供产量增加的蛋白质表达。通过非限制性实例，本文描述的诱变技术可用来实现核酸的5’非翻译区、3’非翻译区或编码区的突变，其突变可在RNA或蛋白质水平上产生增强的稳定性，因此引起增加的蛋白产量。
无细胞翻译系统也可用来产生本发明的多肽之一，其使用从DNA构建物转录的mRNA，该构建物含有与编码多肽或其片段的核酸可操作性连接的启动子。在一些方面，DNA构建物在被进行体外转录反应之前被线性化。然后转录的mRNA用合适的无细胞翻译提取物进行温育，如兔网织红细胞提取物，产生所需的多肽或其片段。
本发明也涉及本发明多肽的变体。术语“变体”包括这些多肽的衍生物或类似物。特别地是，变体可在氨基酸序列上与本发明的多肽和与其基本上相同的序列不同，其差异为一个或多个置换、添加、缺失、融合和截断，其可以任何组合形式存在。
变体可天然发生或在体外产生。特别的是，这种变体可采用基因工程技术如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III删除方法和标准克隆技术来建立。可选地，这些变体、片段、类似物、或衍生物可采用化学合成或修饰方法来建立。
制备变体的其它方法也是本领域普通技术人员所熟悉的。这些方法包括这样的过程，其中从天然分离群中获得的核酸序列被修饰以产生编码多肽的核酸，所述多肽具有的特性可增强其在工业或实验室应用中的价值。在这些方法中，相对于从天然分离群中获得的序列具有一个或多个核苷酸差异的大量变体序列被产生和表征。典型地，这些核苷酸差异相对于天然分离群的核酸编码的多肽引起了氨基酸变化。
例如，变体可以通过使用易错PCR产生。在易错PCR中，PCR在DNA聚合酶的复制保真性较低的情况下进行，这样便在全长的PCR产物中得到较高的点突变率。易错PCR在Leung，D.W.等，Technique，1：11～15，1989和Caldwell，R.C.和JoyceG.F.，PCRMethodsApplic.，2：28-33，1992中得到描述。简要地说，在这样的程序中，待诱变的核酸与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶以及适当浓度的dNTP混合，从而在全长的PCR产物中得到高的点突变率。例如，反应可以使用20fmol待诱变的核酸进行，每种PCR引物30pmol，反应缓冲液包含50mMKCl、10mMTrisHCl(pH8.3)和0.01％明胶、7mMMgCl2、0.5mMMnCl2、5单位的Taq聚合酶、0.2mMdGTP、0.2mMdATP、1mMdCTP和1mMdTTP。PCR可以进行30个循环，每个循环为94℃1分钟；45℃1分钟；和72℃1分钟。然而，应该意识到，这些参数可以适当地变化。诱变的核酸被克隆到一个适当的载体，并评价由诱变核酸编码的多肽的活性。
变体也可以用寡核苷酸定向诱变产生，在任何感兴趣的克隆DNA中产生位点特异性的突变。寡核苷酸诱变在Reidhaar-Olson，J.F.和Sauer，R.T.等人，Science，241：53-57，1988中得到描述。简要地说，在这样的程序中，合成多个具有将要被导入被克隆的DNA中的一个或多个突变的双链寡核苷酸，将这些寡核苷酸插入到待诱变的克隆DNA中。回收含有诱变DNA的克隆，并评估它们编码的多肽的活性。
另一种产生变体的方法是装配PCR。装配PCR涉及由小DNA片段的混合物来装配PCR产物。大量不同的PCR反应在相同的容器中平行地发生，一个反应的产物引发另一个反应的产物。装配PCR被描述于在审美国专利申请系列号第08/677,112，于1996年7月9日提交，题目为“DNAShufflingwithPolynucleotidesProducedbyBlockingorinterruptingaSynthesisorAmplificationProcess”。
还有另一种产生变体的方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，由于基于序列同源性的DNA分子随机片段化，在不同的但是高度相关的DNA序列的DNA分子之间，在体外强行发生同源重组，然后通过PCR反应的引物延伸，交换得到固定。有性PCR诱变在Stemmer，W.P.，PNAS，USA，91：10747-10751，1994中得到描述。简要地说，在这样的程序中，多个待重组的核酸用DNase消化，产生具有50到200个核苷酸的平均大小的片段。纯化具有所需的平均大小的片段，并重悬于PCR混合物中。在有利于核酸片段之间发生重组的条件下进行PCR反应。例如，PCR可以这样进行：将纯化的片段以10-30ng/μl的浓度重悬于含有0.2mM的各种dNTP、2.2mMMgCl2、50mMKCl、10mM的Tris-HCl，pH9.0以及0.1％的TritonX-100的溶液中。以100∶1的比例在反应混合物中加入2.5单位的Taq聚合酶，用以下的条件进行PCR：94℃60秒，94℃30秒，50-55℃30秒，72℃30秒(30-45次)，然后72℃进行5分钟。然而，可以意识到，这些参数可以进行适当的变化。在一些方面，寡核苷酸可以被包括在该PCR反应中。在其它方面，DNA聚合酶I的Klenow片段可以用于第一组PCR反应，而Taq聚合酶可以用于后续组的PCR反应。重组序列被分离，并评估它们编码的多肽的活性。
变体也可以通过体内诱变产生。在一些方面，感兴趣的序列中的随机突变通过在细菌菌株中增殖该感兴趣的序列而产生，所述细菌菌株例如在一个或者多个DNA修复途径中具有突变的大肠杆菌菌株。这样的“突变”菌株具有比野生型亲本更高的随机突变率。在一种这样的菌株中进行DNA的繁殖，最终可产生DNA中的随机突变。适于在体内诱变中应用的突变菌株在，例如，PCT公开号WO91/16427中有描述，其在1991年10月31日公开，发明名称为“MethodsforPhenotypeCreationfromMultipleGenePopulations”。
变体也可以通过应用盒式诱变而产生。在盒式诱变中，双链DNA分子的一个小的区域被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替代。所述寡核苷酸一般含有完全和/或部分随机的天然序列。
递归整体诱变也可以用于产生变体。递归整体诱变是一种用于蛋白质工程(蛋白诱变)的算法，它的开发是为了产生表型相关的突变体组成的多样性群体，其成员在氨基酸序列上有所不同。该方法应用反馈机制来控制连续多轮的组合式盒式诱变。递归整体诱变在Aikin，A.P和Youvan，D.C.，PNAS，USA89：7811-7815，1992中有描述。
在一些方面，用指数整体诱变产生变体。指数整体诱变是一个用于产生具有高百分比的独特且具功能性的突变体的组合文库的过程，其中少部分的残基被平行随机化，以在每一个被改变的位置确认产生功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变在Delegrave，S.和Youvan，D.C.，BiotechnologyResearch.11：1548-1552，1993中有描述。随机和定点诱变在Arnold，F.H.，CurrentOpinioninBiotechnology4：450-455，1993中有描述。
在一些方面，变体利用改组方法产生，其中编码不同多肽的多个核酸的部分被融合在一起，产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列，其描述见在审美国专利申请系列第08/677,112号中，该申请于1996年7月9日提交，名称为“MethodofDNAShufflingwithPolynucleotidesProducedbyBlockingorinterruptingaSynthesisorAmplificationProcess”，和在审美国专利申请系列第08/651,568中，该申请于1996年5月22日提交，名称为“CombinatorialEnzymeDevelopment”。
本发明的多肽的变体可以是这样的变体，其中本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(如保守氨基酸残基)置换，这样置换的氨基酸残基可以是由遗传密码编码或不由其编码的氨基酸。
保守置换是那些在多肽中一个给定的氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代的置换。作为保守置换典型可见的是下列替代：脂肪族氨基酸如Ala、Val、Leu和Ile被另一种脂肪族氨基酸替代；Ser被Thr替代或反之；酸性残基如Asp和Glu被另一个酸性残基替代；携带酰胺基的残基如Asn和Gln被另一个携带酰胺基的残基替代；碱性残基如Lys和Arg与另一个碱性残基交换；以及芳香族残基如Phe、Tyr被另一个芳香族残基置换。
其它变体是其中本发明多肽的一个或多个氨基酸残基包括取代基的那些变体。
还有其它变体是其中多肽与另一个化合物结合的变体，如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)。
其它变体是其中额外的氨基酸被融合到多肽上的那些变体，例如前导序列、分泌序列、蛋白原序列或有助于多肽的纯化、富集或稳定的序列。在一些方面，衍生物和类似物保持了与本发明的多肽的相同的生物功能或活性，并可包括蛋白原，这样，片段、衍生物或类似物可以通过蛋白原部分的切割来激活，以产生活性多肽。
优化密码子以便在宿主细胞中获得高水平的蛋白表达
本发明提供了修饰编码肌醇六磷酸酶的核酸来改变密码子使用的方法。一方面，本发明提供了修饰编码肌醇六磷酸酶的核酸中的密码子来增加或者降低其在宿主细胞中的表达的方法。本发明也提供了编码肌醇六磷酸酶的核酸，该核酸经过修饰从而增加其在宿主细胞中的表达；经过这样的修饰的肌醇六磷酸酶；以及制备修饰的肌醇六磷酸酶的方法。该方法包括鉴定编码肌醇六磷酸酶的核酸中的“非优选的”或“较不优选的”密码子，并且用编码相同氨基酸的“优选密码子”作为替换密码子替换一个或者多个这些非优选或者较不优选的密码子，并且在所述核酸中至少一个非优选或较不优选的密码子被编码相同氨基酸的优选密码子替换。优选密码子是在宿主细胞基因的编码序列中被较多使用的(over-represented)密码子，而不优选的或者较不优选的密码子是指在宿主细胞基因的编码序列中较少使用的(under-represented)密码子。
用于表达本发明的核酸、表达盒以及载体的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，本发明提供了在所有这些细胞中优化密码子使用的方法、密码子被改变的核酸，以及由所述的密码子被改变的核酸制成的多肽。示例性的宿主细胞包括革兰氏阴性细菌，如埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌；革兰氏阳性细菌，如加氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。示例性的宿主细胞也包括真核生物体，如，各种酵母，如酵母菌属某种(Saccharomycessp.)，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、黑曲霉(Aspergillusniger)和哺乳动物细胞和细胞系以及昆虫细胞和细胞系。因此，本发明也包括在这些生物体和物种中表达被优化的核酸和多肽。
例如，编码从细菌细胞中分离出的肌醇六磷酸酶的核酸密码子被修饰，以便该核酸在不同于获得肌醇六磷酸酶的细菌的细菌细胞、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中被优化地表达。优化密码子的方法在本领域是已知的，参见如，美国专利5,795,737；Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)ProteinExpr.Purif.12：185-188；Narum(2001)Inect.Immun.69：7250-7253。也参见Narum(2001)Infect.Immun.69：7250-7253，描述了在小鼠系统中优化密码子；Outchkourov(2002)ProteinExpr.Purif.24：18-24，描述了在酵母中优化密码子；Feng(2000)Biochemistry39：15399-15409，描述了在大肠杆菌中优化密码子；Humphreys(2000)ProteinExpr.Purif20：252-264，描述了大肠杆菌中优化影响分泌的密码子使用。
转基因非人动物
本发明提供了转基因非人动物，其包含本发明的核酸、多肽、表达盒或载体或转染细胞或转化细胞。转基因非人动物可以是，例如包含本发明核酸的山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠。这些动物可以用作例如体内模型来研究肌醇六磷酸酶的活性，或作为模型来筛选体内肌醇六磷酸酶活性的调节物。要在转基因非人动物中表达的多肽的编码序列可以设计为组成型的，或者在组织特异性、发育特异性或者可诱导的转录调控因子的控制之下。转基因非人动物可以应用本领域任何已知的方法设计和产生；参见，如，美国专利6,211,428；6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，它们描述了制造和应用转化的细胞和卵以及转基因小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛。也参见，如，Pollock(1999)J.Immunol.Methods231：147-157，描述了在转基因产奶动物的乳汁中生产重组蛋白；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，描述了转基因山羊的产生。美国专利6,211,428，描述了制备和应用在其脑中表达含有DNA序列的核酸构建物的转基因非人哺乳动物。美国专利5,387,742，描述了把克隆的重组或者合成的DNA序列注射至小鼠受精卵中，移植注射的卵至假孕的雌鼠中，并生长成为转基因鼠，它的细胞表达与阿尔茨海默氏病的病理相关的蛋白。美国专利6,187,992，描述了制备和应用转基因小鼠，它的基因组包括编码淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)的基因的断裂。
“基因敲除动物”也可以被用于实践本发明的方法。例如，一方面，本发明的转基因或修饰动物包括“基因敲除动物”，例如“基因敲除小鼠”，其被工程改造以至于不表达或不能表达肌醇六磷酸酶。
在另一个方面，提供了转基因非人生物体，它含有编码本发明的肌醇六磷酸酶(如，SEQIDNO：2的具体列举的序列修饰)的异源序列。多种方法可用来制备此发明的转基因动物。一般而言，可使用3种这类的方法。在一个这样的方法中，前核期的胚胎(“单细胞胚胎”)从雌性动物中收获，并且转基因被显微注射进胚胎中，其中转基因将被染色体整合至所得成体动物的生殖细胞和体细胞的中。在另一个方法中，分离胚胎干细胞，并且转基因通过电穿孔、质粒转染或微注射被引入其中，然后将干细胞再引入至胚胎中，在那里它们定居并发育成生殖系。哺乳动物的微注射方法的描述可见美国专利第4,873,191号。
在又一种示例性方法中，胚胎细胞被含有转基因的逆转录病毒感染，从而胚胎的生殖细胞中具有被染色体整合的转基因。当被制成转基因的动物为禽类时，因为禽类的受精卵通常在前20小时在输卵管中经历细胞分裂，微注射进受精卵的前核是有问题的，因为这时前核是难以进入的。因此，上面一般描述的制备转基因动物的方法中，逆转录病毒感染优选用于禽类，例如其描述可见于美国专利第5,162,215号。但如果微注射用于禽类，可应用Love等人公开发表的方法(Biotechnol.，12，1994年1月)，由此，胚胎得自在产下前次卵后大约两个半小时处死的雌禽，转基因被显微注射进胚盘的胞浆内，并且胚胎在蛋壳内培养至成熟。当被制成转基因的动物是牛或猪时，由于卵的不透明性而妨碍显微注射，因此使核很难由传统的微分干涉差显微镜来鉴别。为了克服这种问题，卵首先可被离心，以分离前核以便更好地观察。
在一方面，本发明的“非人动物”包括牛、猪、羊和禽类动物(如，母牛、猪、绵羊、小鸡)。本发明的“转基因非人动物”是通过将“转基因”引入至非人动物的生殖系中产生的。在各个发育阶段的胚胎靶细胞可用来引入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段可使用不同的方法。受精卵是微注射的最佳靶标。受精卵用作基因传递的靶标，其主要的优势是在大多数情况下，注射的DNA将在第一次分裂前被引入宿主基因中(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4438-4442，1985)。结果，转基因非人动物的所有细胞将携带被引入的转基因。通常这也将反映在转基因向创建体子代的有效传递中，因为50％的生殖细胞将携带转基因。
在一方面，术语“转基因”被用来描述在其所有细胞中含有外源遗传物质的动物。“转基因”动物可通过两种嵌合动物的杂交繁育来产生，其中这两种动物在用来繁殖的细胞中均含有外源性遗传物质。得到的子代中25％将是转基因的，即在它们的所有细胞内在两种等位基因中都含有外源性遗传物质的动物，50％得到的动物将在一个等位基因中含有外源性遗传物质，而25％将不含有外源性遗传物质。
在一方面，微注射法被用于实践本发明。例如通过凝胶电泳，转基因被消化，并纯化，没有从任何载体DNA。在一方面，转基因含有可操作地结合的启动子，它可与参与转录的细胞蛋白质相互作用，最终形成组成型表达。用于这方面的启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子、莫洛尼氏白血病毒(MLV)启动子和疱疹病毒启动子，以及来自金属硫蛋白、骨骼肌动蛋白、P-烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶的编码基因的启动子。也可使用病毒长末端重复区(LTRs)的启动子如罗斯肉瘤病毒。当被制成转基因的动物是禽类，优选的启动子可包括鸡β-球蛋白基因、鸡溶菌酶基因和鸟白血病病毒的启动子。用于胚胎干细胞的质粒转染的构建物将使用本领域中熟知的其它调控元件，如刺激转录的增强子元件、剪接受体、中止和多腺苷酸化信号、和允许翻译的核糖体结合位点。
如上所述，逆转录病毒感染也可用来将转基因引入至非人动物中。发育中的非人胚胎可在体外培养至胚泡期。在这个时间内，分裂球是逆转录病毒感染的靶标(Jaenich，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA73：1260-1264，1976)。分裂球的有效感染可通过酶处理去除透明带而获得(Hogan等人，(1986)鼠胚操作(ManipulatingtheMouseEmbryo)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)。用来引入转基因的病毒载体系统典型地是携带转基因的复制缺陷逆转录病毒(Jahner，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：6927-6931，1985；VanderPutten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：6148-6152，1985)。可通过在产生病毒的细胞单层上培养分裂球而很容易和有效的获得转染(VanderPutten，见前；Stewart等人，EMBOJ.6：383-388，1987)。可选择地，感染可在较后期进行。病毒或产生病毒的细胞可被注射进囊胚腔中(D.Jahner等人，Nature298：623-628，1982)。大多数创建体将是转基因的嵌合体，因为引入仅发生在形成转基因非人动物的细胞亚群中。进一步，创建体在基因组的不同位置上含有转基因的多个逆转录病毒插入，它们通常将在子代中分离。另外，尽管效率较低，也可能将转基因通过子宫内逆转录病毒感染中期妊娠胚胎而引入生殖系中(D.Jahner等人，见前)。
用于转基因引入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可从体外培养的植入前胚胎获得，并与胚胎融合(M.J.Evans等人，Nature292：154-156，1981；M.O.Bradley等人，Nature309：255-258，1984；Gossler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：9065-9069，1986；和Robertson等人，Nature322：445-448，1986)。转基因可通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导被有效地引入ES细胞中。这种转化的ES细胞此后可与来自非人动物的胚泡组合在一起。此后，ES细胞定植在胚胎中，并有助于得到的嵌合动物的生殖系。(综述见Jaenisch，R.，Science240：1468-1474，1988)。
在一方面，“转化”是指通过重组核酸技术已经引入了异源核酸分子的细胞(或引入进其亲代)。“异源”是指核酸序列来源于另一物种或从其原始形式或在细胞中主要表达的形式修饰而来。
在一方面，“转基因”是指通过各种手段被插入至细胞中并成为生物体基因组一部分(即，可被稳定整合或作为稳定的染色体外元件)的任何DNA片段，所述生物体可从该细胞发育形成。这样的转基因包括与转基因生物体部分或完全异源的(即外源的)基因，或可表现为与生物体的内源基因同源的基因。包括在这个定义内的是通过提供RNA序列而建立的转基因，该RNA序列被转录成DNA，然后引入基因组中。本发明的转基因包括编码肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并包括可在转基因非人动物中表达的多核苷酸。本文使用的术语“转基因的”另外包括通过体外处置早期胚胎或受精卵或通过任何转基因技术诱导特异的基因敲除而被改变基因组的任何生物体。在此所使用的术语“基因敲除”是指体内基因的靶向破坏，其功能完全丧失，可通过本领域普通技术人员熟悉的任何转基因技术来完成。在一个方面，含有基因敲除的转基因动物中，靶基因通过插入而转变为无功能，该插入靶向待通过同源重组转变为无功能的基因。
在一个方面，术语“转基因”包括本领域普通技术人员熟悉的任何转基因技术，它可产生携带引入转基因的生物体或其中内源基因已经被变为无功能或“敲除”的生物体。
用于实践此发明的转基因是DNA序列，它含有肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的编码序列。在一个方面，具有SEQIDNO：1中所示的序列或编码SEQIDNO：2中所示序列的多肽的序列的多核苷酸是转基因，如本文所定义的术语一样。在合适时，编码具有肌醇六磷酸酶活性但由于遗传密码的简并性而在核酸序列上有差异的DNA序列在此也可使用，可以是截短形式、等位基因变体和种间同源物。
在一方面，在胚胎被显微注射、转染的胚胎干细胞定植、或用含有转基因的逆转录病毒感染后(除了在本文其它地方提到的禽类中实施此发明外)，胚胎被植入进假孕雌性动物的输卵管中。通过使用转基因特异性探针进行血液或组织样品的DNA印迹分析，检测后续子代的转基因引入。PCR在这个方面是特别有用的。阳性子代(G0)被杂交，以产生子代(Gl)，通过Northern印迹分析组织样品来分析其转基因的表达。
在一方面，所述方法包括增加转基因动物的磷摄取和/或减少转基因生物体的粪肥中污染物的量大约15％、大约20％、或大约20％至大约50％或更高。
在一方面，考虑用于实践本发明的动物是通常被认为是家养动物的那些动物，包括宠物(如，犬、猫、禽类等)和用于食品加工的动物，即，禽类如肉食和产卵的鸡和火鸡，羊如羔羊，牛如肉牛和奶牛，鱼和猪。在一个方面，当这些动物已经具有异源DNA序列，或具有一条或多条正常是动物内源的、已被染色体整合进入动物的生殖细胞中的其它DNA序列(本文统称为“转基因”)时，这些动物被称为“转基因的”动物。转基因动物(包括其子代)也将含有偶然被整合进体细胞染色体中的转基因。
筛选方法和“在线”监控设备
在实践本发明的方法中，多种仪器和方法可与本发明的多肽和核酸一起使用，如筛选多肽的肌醇六磷酸酶活性，筛选作为活性的潜在调节物的化合物(如酶活性的增强或抑制)，获得与本发明的多肽结合的抗体，与本发明的核酸杂交的核酸等。
固定的酶固体支持物
肌醇六磷酸酶、其片段和编码该酶和片段的核酸可被附着在固体支持物上。这在工业过程中使用肌醇六磷酸酶时经常是经济和有效的。例如，被用于特殊的化学反应中的肌醇六磷酸酶(或其活性片段)的聚生体或夹心体，可被附着于固体支持物上，并浸入加工桶中。能够发生酶促反应。然后固体支持物被拿出桶中，酶固定在上面供重复使用。在本发明的一个实施方式中，本发明的分离核酸被固定在固体支持物上。在发明的另一个实施方式中，固体支持物选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极和其任何组合。
例如，用于本发明的固体支持物包括凝胶。凝胶的一些实例包括Sepharose、明胶、戊二醛、壳聚糖处理的戊二醛、白蛋白-戊二醛、壳聚糖-黄原胶、Toyopearl凝胶(聚合物凝胶)、藻酸盐、藻酸盐-多聚赖氨酸、角叉菜胶、琼脂糖，乙醛酰琼脂糖、磁性琼脂糖、葡聚糖-琼脂糖、聚(氨基甲酰磺酸盐)水凝胶、BSA-PEG水凝胶、磷酸化聚乙烯醇(PVA)、单氨乙基-N-氨乙基(monoaminoethyl-N-aminoethyl，MANA)、氨基、或其任何组合。
用于本发明的其它固体支持物是树脂或聚合物。树脂或聚合物的一些实例包括纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造纤维、聚脂、阴离子交换树脂、AMBERLITETMXAD-7、AMBERLITETMXAD-8、AMBERLITETMIRA-94、AMBERLITETMIRC-50、聚乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、或其任何组合。用于本发明的另一类型固体支持物是陶瓷。一些实例包括非多孔陶瓷、多孔陶瓷、SiO2、Al2O3。用于本发明的另一类型固体支持物是玻璃。一些实例包括非多孔玻璃、多孔玻璃、氨丙基玻璃(aminopropylglass)或其任何组合。另一类可使用的固体支持物是微电极。一个实例是聚乙烯亚胺包被的磁石。石墨颗粒可用作固体支持物。固体支持物的另一个实例是细胞，如红细胞。
固定的方法
存在许多本领域普通技术人员已知的方法来固定酶或其片段，或核酸在固体支持物上。这些方法的一些实例包括，如静电液滴产生(electrostaticdropletgeneration)、电化学手段、经吸附、经共价结合、经交联、经化学反应或过程、经包裹作用、经包载、经藻酸钙、或经聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)。类似的方法描述于MethodsinEnzymology，ImmobilizedEnzymesandCells，PartC.1987.AcademicPress.EditedbyS.P.ColowickandN.O.Kaplan.Volume136；和ImmobilizationofEnzymesandCells.1997.HumanaPress.EditedbyG.F.Bickerstaff.Series：MethodsinBiotechnology，EditedbyJ.M.Walker。
毛细管阵列
毛细管阵列，如GIGAMATRDCTM，DiversaCorporation，SanDiego，CA，可用于发明的方法中。发明的核酸或多肽可被固定或应用于阵列上，包括毛细管阵列。阵列可被用来筛选或监测组合物的文库(如小分子、抗体、核酸等)的结合本发明的核酸或多肽或调节其活性的能力。毛细管阵列提供了另一个系统来固定和筛选样品。例如，样品筛选仪器可包括形成相互邻接毛细管阵列的多个毛细管，其中每个毛细管包含至少一个限定用于保持样品的管腔的壁。该仪器可进一步包括在阵列中排列于邻接毛细管之间的间隙材料，和一个或多个在间隙材料中形成的参考标记。筛选样品的毛细管，其中毛细管适合在毛细管的阵列中被结合，可包括限定用于保持样品的管腔的第一个壁，和由滤光材料形成的第二个壁，用于过滤向管腔提供的激发能量来激发样品。
多肽或核酸，如配体，可被引入至第一个组分中，至少进入毛细管阵列的毛细管的一部分。毛细管阵列的每一个毛细管包括至少一个限定用于保持第一个组分的管腔的壁。气泡可被引入位于第一个组分之后的毛细管中。第二个组分可被引入该毛细管，其中第二个组分与第一个组分通过气泡被分开。目标样品可被作为用可检测颗粒标记的第一种液体被引入毛细管阵列的毛细管中，其中毛细管阵列的每个毛细管包括至少一个限定用于保持第一种液体和可检测颗粒的管腔的壁，并且其中所述至少一个壁用结合材料包被，以将所述可检测颗粒结合于所述至少一个壁。该方法可进一步包括从毛细管上除去第一种液体，其中该结合的可检测颗粒保留在毛细管中，并将第二种液体引入毛细管。
毛细管阵列可包括多个单独的毛细管，它含有限定管腔的至少一个外壁。毛细管的外壁可以是一个或多个互相融合的壁。相似地，所述壁可限定这样的管腔，其是圆柱形的、正方形的、六边形的或其它任何几何形状，只要其壁能够形成管腔以保留液体或样品。毛细管阵列的毛细管可相互靠近联合在一起形成平面结构。毛细管可通过融合(例如，当毛细管由玻璃制成时)、粘合、键合或面对面的夹合而结合在一起。毛细管阵列可由任何数量的单个毛细管形成，例如，100至4,000,000个毛细管。毛细管阵列可形成具有大约100,000或更多个互相结合的单个毛细管的微滴定管。
阵列，或“生物芯片”
本发明的核酸或者多肽可以固定于阵列或者应用于阵列。可以应用阵列来筛选或者监测组合物(例如，小分子、抗体、核酸等等)的文库，所述筛选或者监测是针对它们结合本发明的核酸或多肽或者调控本发明的核酸或多肽的活性的能力。例如，在本发明的一个方面，一个被监测的参数是肌醇六磷酸酶基因的转录体表达。细胞的一种或多种或所有的转录体可以通过包含细胞转录体、或代表细胞转录体的核酸、或与细胞转录体互补的核酸的样品的杂交，通过与阵列或“生物芯片”上的固定化核酸的杂交来测定。通过在微型芯片上应用核酸“阵列”，细胞的一些或所有的转录体可以同时被定量。可选择地，包含基因组核酸的阵列也可以用于确定通过本发明的方法制造的新的工程菌株的基因型。“多肽阵列”也可以用于同时定量多种蛋白。
在可选的方面，本发明的“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”除了本发明的核酸和/或多肽或肽以外还包括多个靶元件；每个靶元件可包含规定量的一种或多种多肽(包括抗体)或核酸，它们被固定在基材表面的规定区域上，如下面进一步详细讨论的。
本发明可以用任何已知的“阵列”进行实践，所述“阵列”也被称为“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”，或者它们的变型。阵列一般是多个“点”或者“靶元素”，每一个靶元素包括确定数量的一种或多种生物分子，例如，固定于基材表面的确定区域、用于特异结合样品分子如mRNA转录体的寡核苷酸。
在实践本发明的方法时，任何已知的阵列和/或制备和应用阵列的方法都可以被全部或者部分地并入，或者引入它们的变型，例如在下列文献中描述的：美国专利6,277,628、6,277,489、6,261,776、6,258,606、6,054,270、6,048,695、6,045,996、6,022,963、6,013,440、5,965,452、5,959,098、5,856,174、5,830,645、5,770,456、5,632,957、5,556,752、5,143,854、5,807,522、5,800,992、5,744,305、5,700,637、5,556,752、5,434,049；也参见，例如WO99/51773、WO99/09217、WO97/46313、WO96/17958；也参见，例如Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques23：1087-1092；Kern(1997)Biotechniques23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，Chromosomes&Cancer20：399-407；Bowtell(1999)NatureGeneticsSupp.21：25-32。也参见公开的美国专利申请号20010018642、20010019827、20010016322、20010014449、20010014448、20010012537、20010008765。
多肽和肽
本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽，其具有与SEQIDNO：2至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合。本发明进一步提供分离的、合成的或重组的核酸，其编码如下多肽：具有与SEQIDNO：2至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并包含表4、5、6、7、9所列突变中的至少一个或其任意组合。作为参考，合成产生的“亲本”SEQIDNO：2为：
MetLysAlaIleLeuIleProPheLeuSerLeuLeuIleProLeuThr
151015
ProGlnSerAlaPheAlaGlnSerGluProGluLeuLysLeuGluSer
202530
ValValIleValSerArgHisGlyValArgAlaProThrLysAlaThr
354045
GlnLeuMetGlnAspValThrProAspAlaTrpProThrTrpProVal
505560
LysLeuGlyGluLeuThrProArgGlyGlyGluLeuIleAlaTyrLeu
65707580
GlyHisTyrTrpArgGlnArgLeuValAlaAspGlyLeuLeuProLys
859095
CysGlyCysProGlnSerGlyGlnValAlaIleIleAlaAspValAsp
100105110
GluArgThrArgLysThrGlyGluAlaPheAlaAlaGlyLeuAlaPro
115120125
AspCysAlaIleThrValHisThrGlnAlaAspThrSerSerProAsp
130135140
ProLeuPheAsnProLeuLysThrGlyValCysGlnLeuAspAsnAla
145150155160
AsnValThrAspAlaIleLeuGluArgAlaGlyGlySerIleAlaAsp
165170175
PheThrGlyHisTyrGlnThrAlaPheArgGluLeuGluArgValLeu
180185190
AsnPheProGlnSerAsnLeuCysLeuLysArgGluLysGlnAspGlu
195200205
SerCysSerLeuThrGlnAlaLeuProSerGluLeuLysValSerAla
210215220
AspCysValSerLeuThrGlyAlaValSerLeuAlaSerMetLeuThr
225230235240
GluIlePheLeuLeuGlnGlnAlaGlnGlyMetProGluProGlyTrp
245250255
GlyArgIleThrAspSerHisGlnTrpAsnThrLeuLeuSerLeuHis
260265270
AsnAlaGlnPheAspLeuLeuGlnArgThrProGluValAlaArgSer
275280285
ArgAlaThrProLeuLeuAspLeuIleLysThrAlaLeuThrProHis
290295300
ProProGlnLysGlnAlaTyrGlyValThrLeuProThrSerValLeu
305310315320
PheIleAlaGlyHisAspThrAsnLeuAlaAsnLeuGlyGlyAlaLeu
325330335
GluLeuAsnTrpThrLeuProGlyGlnProAspAsnThrProProGly
340345350
GlyGluLeuValPheGluArgTrpArgArgLeuSerAspAsnSerGln
355360365
TrpIleGlnValSerLeuValPheGlnThrLeuGlnGlnMetArgAsp
370375380
LysThrProLeuSerLeuAsnThrProProGlyGluValLysLeuThr
385390395400
LeuAlaGlyCysGluGluArgAsnAlaGlnGlyMetCysSerLeuAla
405410415
GlyPheThrGlnIleValAsnGluAlaArgIleProAlaCysSerLeu
420425430
在图4中示出了由例如SEQIDNO：1编码的亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2的序列——其示出选择用于GeneReassemblyTM文库构建的基因位点饱和诱变(GSSM)-产生的序列修饰，如实施例1所述。由例如SEQIDNO：1编码的亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2经历进一步基因位点饱和诱变(GSSM)序列修饰、位点定向诱变(SDM)和TMCA库构建，如实施例2所述。
在一方面，本发明的多肽和肽具有肌醇六磷酸酶活性。在可选的方面，它们也可被用作例如标记探针、抗原、耐受原、基序、肌醇六磷酸酶活性位点。
在可选的方面，本发明的多肽和肽是合成的或是重组产生的多肽。肽和蛋白质可在体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可采用本领域已知的任何方法制备和分离。本发明的多肽和肽也可采用本领域熟知的化学方法被全部或部分合成。参见例如，Caruthers(1980)NucleicAcidsRes.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)NucleicAcidsRes.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，TherapeuticPeptidesandProteins，Formulation，ProcessingandDeliverySystems(1995)TechnomicPublishingCo.，Lancaster，PA。例如，肽合成可采用多种固相技术来进行(见如，Roberge(1995)Science269：202；Merrifield(1997)MethodsEnzymol.289：3-13)，并且自动合成可采用如ABI431A肽合成仪(PerkinElmer)根据厂商提供的说明书来完成。
本发明的酶和多肽可以以分离形式提供或者纯化为同质性。本发明的肌醇六磷酸酶多肽可以使用数种标准方法获得。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在标准重组表达系统(如上所述)中产生、化学合成(尽管对小肌醇六磷酸酶肽片段有一些限制)或从它在其中天然表达的有机体纯化。有用的重组表达方法包括哺乳动物宿主、微生物宿主和植物宿主。
在可选的方面，本发明的多肽和肽包括“氨基酸”或“氨基酸序列”，其为寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或可选地，为任意这些的片段、部分或亚单位，并且可以是天然发生或合成的分子。
在可选的方面，本发明的“重组的”多肽或蛋白质包括(指)通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质；例如，由用编码期望多肽或蛋白质的外源DNA构建物转化的细胞产生的多肽或蛋白质。本发明的“合成的”核酸(包括寡核苷酸)、多肽或蛋白质是通过化学合成制备的那些，如在本文详细描述的。在可选的方面，本发明的多肽或蛋白质包括通过肽键或修饰的肽键即肽等排体(peptideisosteres)彼此结合在一起的氨基酸，并且可以含有除20个由基因编码的氨基酸之外的修饰的氨基酸。所述多肽可以通过天然过程，如，翻译后加工或者通过本领域所熟知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以发生在所述多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在给定的多肽中以相同的或者不同的程度在几个位点处发生。一个给定的多肽也可以具有很多类型的修饰，例如乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂质或者脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联的环化作用、形成二硫键、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、葡聚糖水解酶处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用，和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化作用。
在可选的方面，本发明的“合成的”多肽或蛋白质是通过化学合成制备的那些。固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)(也参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，SolidPhasePeptideSynthesis，第二版，PierceChemicalCo.，Rockford，III，11-12页)，并且这些方法最近已经被用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearchBiochemicals)。商业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，并将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端，而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时，一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中，所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤，即是，反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中，将氨基酸构建成所要的肽。此外，大量的可利用的FMOC肽合成系统是可利用的。例如，应用AppliedBiosystems，Inc.的Model431A自动肽合成仪可以在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得，或者通过直接的合成或者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
在可选的方面，本发明的肽和多肽被糖基化。所述糖基化可以在翻译后通过化学方法或者通过细胞的生物合成机制而加上，其中后者包括应用已知的糖基化作用基序，所述糖基化作用基序可以对于所述序列是天然的，或者是作为肽段而被加入的，或者是在核酸编码序列中加入的。糖基化作用可以是O-联接的或者是N-联接的，或它们的组合。
在可选的方面，本发明的肽和多肽，如以上所定义的，包括部分或完整的的“模拟物(mimetic)”和“肽模拟物(peptidomimetic)”形式。在一个方面，术语“模拟物”和“肽模拟物”是指具有与本发明的多肽基本上相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物。该模拟物或者完全由合成的非天然的氨基酸类似物组成，或者是由部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物构成的嵌合分子。所述模拟物也可以包括任意数量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换本质上不改变该模拟物的结构和/或活性即可。对于作为保守性变体的本发明多肽，常规实验将可以确定一种模拟物是否在本发明的范围内，即，其结构和/或功能并没有基本上的改变。因此，一方面，如果一种模拟组合物具有肌醇六磷酸酶活性，那么它在本发明的范围内。
在可选的方面，本发明的肽和多肽具有包括对SEQIDNO：2特异性修饰的序列，如上所定义的，并且也包括可能修饰活性或可能不修饰活性的保守置换，所述活性例如酶活性。在可选的方面，保守置换是在多肽内，用另一个相同性质的氨基酸置换一个给定的氨基酸。在可选的方面，保守置换是下列的置换：用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸例如Ala、Val、Leu和Ile；用Thr置换Ser，或者反之；用另一种酸性残基置换一种酸性残基例如Asp和Glu；用另一种含有酰胺基的残基置换含有酰胺基的残基例如Asn和Gln；用另一种碱性残基交换碱性残基如Lys和Arg；和用另一种芳族残基置换芳族残基如Phe、Tyr。
本发明的多肽模拟组合物可以包含非天然结构成分的任何组合。在可选的方面，本发明的模拟组合物包括以下三种结构基团中的一种或全部：a)不是天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)置换天然发生的氨基酸残基的非天然残基；或者c)诱导二级结构拟态(mimicry)的残基，即，可以诱导或者稳定二级结构，如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象，以及类似的结构。例如，当本发明的多肽的所有残基或者一些残基通过非天然肽键的化学方式连接时，该多肽可以表征为模拟物。各个肽模拟物残基可以通过肽键、其它的化学键或者偶联方式连接，如，通过戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可以替代传统的酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，如，酮基亚甲基(如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、亚乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或者酯(参见如，Spatola(1983)在ChemistryandBiochemistryofAminoAcids，PeptidesandProteins，第7卷，267-357页，“PeptideBackboneModifications”MarcellDekker，NY)。
本发明的多肽也可以由于含有全部或者部分替代了天然发生的氨基酸残基的非天然残基而被表征为模拟物。在科学和专利文献中充分描述了非天然的残基；用作为天然氨基酸残基的模拟物的一些示例性的非天然组合物及指导在下面有描述。芳香族氨基酸的模拟物可以通过用以下进行取代来产生，如，D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨基，D-或L-2噻吩基丙氨酸；D-或L-1，-2，3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸，D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-p-氟-苯基丙氨酸；D-或L-p-二苯基苯基丙氨酸；D-或L-p-甲氧基-二苯基苯基丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和，D-或L-烷基丙氨酸，其中的烷基可以是取代的或非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异基(sec-isotyl)、异戊基或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括，如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
酸性氨基酸的模拟物可以通过用以下的置换来产生，如，保持负电荷的非羧酸氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化的苏氨酸。羧基侧链基团(如，天冬氨酰基或者谷氨酰基)也可以通过与碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应进行选择性的修饰，所述碳二亚胺如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰基或者谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。碱性氨基酸的模拟物可以通过用如，(除了赖氨酸和精氨酸外)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)烷基-乙酸取代产生，其中烷基如以上定义。腈衍生物(如，含有取代COOH的CN-部分)可以取代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基可以脱氨基成为相应的天冬氨酰基或者谷氨酰基残基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰基与例如一种或者多种常规试剂反应而产生，所述的常规试剂包括如苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或者茚三酮，对于这些试剂可优选使用碱性条件。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰基与例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反应而产生。N-乙酰基咪唑基甲烷和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相应的胺反应而产生；得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞苯甲酸盐；2-氯汞-4硝基苯酚，或者，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑反应而产生。可以通过赖氨酰基与例如琥珀酸或者其它的羧酸酸酐反应而产生赖氨酸模拟物(和改变氨基末端残基)。赖氨酸和其它的含有α-氨基的残基模拟物也可以通过与亚氨酸酯例如吡啶亚氨酸甲酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基-苯磺酸、O-甲基异脲、2，4，戊二酮的反应，和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应而产生。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应而产生。脯氨酸的模拟物包括，例如，2-哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸，或者3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰基与例如二乙基原碳酸酯或对溴苯甲酰甲基溴化物反应而产生。其它的模拟物包括，例如，由脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用产生的模拟物；由丝氨酰或者苏氨酰残基的羟基的磷酸化作用产生的模拟物；由赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α氨基基团的甲基化作用产生的模拟物；由N-末端胺的乙酰化作用而产生的模拟物；由主链酰胺残基的甲基化或用N-甲基氨基酸取代而产生的模拟物；或者，由C-末端羧基的酰胺化而产生的模拟物。
本发明的多肽的残基例如氨基酸也可以用相反手性的氨基酸(或者肽模拟物残基)替代。因此，天然发生的L-构型(也可以被称为R或者S，取决于化学实体的结构)的任何氨基酸都可用相同化学结构类型但是具有相反手性的氨基酸或者肽模拟物替代，相反手性的氨基酸称为D-氨基酸，但也可以称R-或者S-型。
本发明也提供了通过天然过程，如，翻译后加工(如，磷酸化，酰化以及类似作用)或者通过化学修饰技术来修饰本发明的多肽的方法，以及所得到的经修饰的多肽。修饰可以发生在所述多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在给定的多肽中以相同的或者不同的水平在几个位点处发生。一个给定的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括乙酰化作用、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连接血红素组分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化作用、二硫键形成、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化作用。参见，如，Creighton，T.E.，Proteins-StructureandMolecularProperties2ndEd.，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1993)；PosttranslationalCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork，11-12页(1983)。
固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)(也参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，SolidPhasePeptideSynthesis，第二版，PierceChemicalCo.，Rockford，III，11-12页)，并且这些方法近来已经可以用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearchBiochemicals)。这样的商业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，它们将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端，而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时，一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中，所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤，即是，反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中，将氨基酸构建成所要的肽。此外，大量的可利用的FMOC肽合成系统是可利用的。例如，应用AppliedBiosystems，Inc.的Model431ATM自动肽合成仪可以在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得，或者通过直接的合成或者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
在一方面，本发明的肽和多肽具有包含对SEQIDNO：2特异性修饰的序列，如上所述，并且也具有“基本上相同”的氨基酸序列，即通过一个或多个保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或插入而不同的序列，特别是当这种取代发生在不是分子活性位点的位点上，并且条件是多肽基本地保留其功能特性时。在一个方面，本发明的肽和多肽具有包含对SEQIDNO：2特异性修饰的序列，如上所述，和保守的氨基酸取代，其取代一个氨基酸为另一个同类的氨基酸，例如，取代一个疏水的氨基酸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸为另一个，或取代一个极性氨基酸为另一个，如取代精氨酸为赖氨酸、谷氨酸为天冬氨酸或谷氨酸为天门冬氨酸。在一方面，例如可以从本发明的肌醇六磷酸酶多肽中缺失一个或多个氨基酸，从而导致多肽结构的修饰而不显著地改变其生物学活性或可选地故意显著地改变其生物学活性。例如，可以去除和/或加入对肌醇六磷酸酶生物学活性需要的或可选的不需要的氨基-或羧基-末端氨基酸。本发明修饰的多肽序列可以通过许多方法检测肌醇六磷酸酶生物学活性，包括将修饰的多肽序列与肌醇六磷酸酶底物接触，并检测修饰的多肽是否减少测定中特异底物的量或增加功能性肌醇六磷酸酶与底物的酶反应的生物产物。
本发明的另一方面包括具有与SEQIDNO：2大约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽，和具有特定列出序列修饰之一的多肽，如上所讨论(列出)的。
本发明的这些氨基酸序列变体可以通过预先确定的变异的性质来表征，所述预先确定的变异的性质是使它们与天然存在的形式区分开的特征，例如肌醇六磷酸酶序列的等位基因的或种间的变异。在一方面，本发明的变体显示出与天然存在的类似物相同性质的生物活性。可选地，可以选择具有改良特性的变体。在一方面，尽管引入氨基酸序列变异的位点或区域是预先确定的，但该突变本身不需要被预先确定。例如，为了最优化在给定位点的突变性能，可以在靶密码子或区域进行随机诱变并筛选表达的肌醇六磷酸酶变体，以寻求期望活性的最佳组合。在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是熟知的，如本文描述地，例如M13引物诱变和PCR诱变。可以使用例如催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)为肌醇和无机磷酸的方法；或者水解肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸)的方法来进行突变体的筛选。在可选的方面，氨基酸取代可以是单个残基；插入可以是大约1到20个氨基酸的水平，尽管可以进行大得多的插入。缺失的范围可以在大约1到大约20、30、40、50、60、70个残基或更多残基。为了获得具有最佳特性的最终衍生物，置换、缺失、插入或其任何组合可以被使用。一般地，这些改变在少数氨基酸上进行，以使分子的改变最小化。然而，在某些情况下可以容忍较大的改变。
本发明的多肽可通过生物化学富集或纯化方法来获得。可能的同源多肽或片段的序列可通过葡聚糖水解酶消化、凝胶电泳和/或微测序来测定。
本发明的另一方面是用于鉴定本发明多肽的片段或变体的分析。本发明的多肽可用于催化生物化学反应，以显示所述片段或变体保留本发明多肽的酶活性。
用于测定变体的片段是否保持本发明多肽的酶活性的示例性分析包括：在使得多肽片段或变体发挥功能的条件下将多肽片段或变体与底物分子接触，以及检测底物水平的降低或多肽和底物之间的反应的具体反应产物水平的增加。
本发明的多肽可用于催化生物化学反应。根据本发明的一方面，提供了利用本发明的多肽作为肌醇六磷酸酶的方法。
本发明提供肌醇六磷酸酶，其不具有或具有修饰的信号序列(也称为信号肽(SP)或前导肽)或异源信号序列。本发明的多肽也可不具有或具有修饰的或异源的前原结构域和/或催化结构域(CD)。掺入本发明多肽的修饰的或异源的SP、前原结构域和/或CD可以是融合蛋白的一部分，例如作为嵌合蛋白中的异源结构域，或者通过化学连接剂加入。例如本发明的酶可以在载体例如pPIC系列载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中含有异源SP和/或前原。
另外，本发明的多肽可进一步包括异源序列，该序列来自其它肌醇六磷酸酶或来自非-肌醇六磷酸酶来源，或者完全合成的序列。因此，在一个方面，本发明的核酸包括内源、修饰或异源信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列和异源序列(即，与本发明信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)天然不相关的序列)。异源序列可在SP、前原结构域和/或CD编码序列的3’末端、5’末端和/或两个末端上。
鉴定“前原”结构域序列和信号序列的方法在本技术领域是熟知的，参见例如VandeVen(1993)Crit.Rev.Oncog.4(2)：115-136。例如，为了鉴定前原序列，从胞外空间纯化出蛋白质，确定其N末端蛋白序列，并将其与未加工的形式进行比较。识别信号序列的各种方法是本领域技术人员已知的。例如，在一方面，与本发明的多肽一起使用的信号肽通过称为SignalP的方法鉴定。SignalP使用识别信号肽和它们切割位点的结合的神经网络；参见例如Nielsen(1997)“Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites”ProteinEngineering10：1-6。
本发明提供了肌醇六磷酸酶，其中多肽骨架结构、二级或三级结构，如α-螺旋或β-折叠结构，已经被修饰。在一方面，电荷或疏水性已经被修饰。在一方面，侧链大小已经被修饰。通过选择较不保守的置换来产生功能或免疫特性的实质变化。例如，可以进行这样的置换，它们将更加显著地影响：发生变化的区域的多肽骨架的结构，例如α螺旋或β折叠结构；分子的电荷或疏水位点，其可以是活性位点；或侧链。本发明提供了在本发明的多肽中的置换，其中(a)亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰，被疏水残基例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰取代(或者相反)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何别的残基取代(或者相反)；(c)具有正电性侧链的残基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰被带负电的残基，例如谷氨酰或天冬氨酰取代(或者相反)；或者(d)具有大体积侧链的残基，例如苯丙氨酸，被不具侧链的氨基酸例如甘氨酸取代(或者相反)。所述变体可以表现出相同性质的生物学活性(即，肌醇六磷酸酶活性)，尽管变体可被选择以根据需要改变肌醇六磷酸酶的特征。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶包括表位或纯化标签、信号序列或其它的融合序列等。在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶可以与随机的肽融合，形成融合多肽。“融合”或者“可操作地连接”在此是指随机肽和肌醇六磷酸酶连接在一起，其连接方式对肌醇六磷酸酶活性稳定性的破坏最小。所述的融合多肽(或者编码该融合多肽的融合多核苷酸)也可以包含进一步的成分，包括在多个环处的多个肽。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶是嵌合多肽，例如包含异源SP、碳水化合物结合分子、肌醇六磷酸酶酶催化结构域、连接子和/或非-肌醇六磷酸酶催化结构域。本发明提供了产生可以编码生物学活性杂合多肽(例如，杂合肌醇六磷酸酶)的嵌合多肽的方法。在一方面，原始的多核苷酸编码生物学活性多肽。本发明的方法通过利用细胞加工产生新的杂合多肽，所述细胞加工整合原始多核苷酸序列，使得得到的杂合多核苷酸编码显示源自原始生物学活性多肽的活性的多肽。例如，原始的多核苷酸可以编码来自不同微生物的特定酶。由来自一个生物体的第一多核苷酸编码的酶、或变体可以例如在特定的环境条件下，例如高盐条件下，有效地发挥功能。由来自不同生物体的第二多核苷酸编码的酶、或变体可在不同的环境条件下，如超高温条件下有效地发挥功能。含有来自第一和第二原始多核苷酸的序列的杂合多核苷酸可以编码这样的酶，所述酶显示出由原始多核苷酸编码的两种酶的特性。因此，由杂合多核苷酸编码的酶可在第一和第二多核苷酸编码的每一种酶所共有的环境条件下，例如高盐和极端温度下有效地发挥功能。
因此，由本发明的方法得到的杂合多肽可显示出在原始酶中不具有的特异酶活性。例如，在编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸重组和/或还原重排后，从由杂合多核苷酸编码的所得杂合多肽中可筛选由每个原始酶获得的特异性酶活性，例如，水解酶、肽酶、磷酸化酶等的活性。因此，例如所述杂合多肽可以被筛选以确定那些可区分杂合多肽和原始亲本多肽的化学官能度，如确定杂合多肽发挥作用的温度、pH或盐浓度。
由本发明的方法得到的杂合多肽可显示出在原始酶中不具有的特异酶活性。例如，在编码水解酶活性的多核苷酸重组和/或还原重排后，从由杂合多核苷酸编码的所得杂合多肽中可筛选由每个原始酶获得的特异水解酶活性，即，水解酶作用的键的类型以及水解酶发挥作用的温度。因此，例如肌醇六磷酸酶可以被筛选以确定那些可区分杂合肌醇六磷酸酶和原始肌醇六磷酸酶的化学官能度，如：(a)酰胺(肽键)即，蛋白酶；(b)酯键，即酯酶和脂肪酶；(c)乙缩醛，即糖苷酶，以及确定例如杂合多肽发挥作用的温度、pH或盐浓度。
在一方面，本发明涉及用于产生生物活性杂合多肽以及筛选具有增强活性的这样的多肽的方法，通过如下步骤进行：
1)以可操纵的连接来导入至少第一多核苷酸和以可操纵的连接来导入第二多核苷酸到合适的宿主细胞中，所述的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共有具有部分序列同源性的至少一个区域；
2)在促进序列再组织的条件下培养宿主细胞，得到可操纵连接的杂合多核苷酸；
3)表达由所述杂合多核苷酸编码的杂合多肽；
4)在有利于鉴定增强的生物活性的条件下筛选所述的杂合多肽；和
5)分离编码该杂合多肽的多核苷酸。
筛选各种酶活性的方法对于本领域技术人员是已知的并且在整个本说明书中被讨论。当分离本发明的多肽和多核苷酸时，可以采用这些方法。
在一方面，本发明提供了产生稳定的具有肌醇六磷酸酶活性的水溶液制剂的方法(及其产物)，该制剂对酶活性的热灭活具有较高的抵抗性，并可在延长的储存期间保留其肌醇六磷酸酶活性。液体制剂可通过加入尿素和/或多元醇如山梨醇和甘油作为稳定剂而被稳定。也提供了对单胃动物的喂养制剂及其产生方法，它们是使用这样稳定的水溶液制剂获得的。关于这样的方法的其它细节可见公开发表的文献和/或是普通技术人员已知的。在一个非限制的具体实例中，这种公开可获得的文献包括EP0626010(WO9316175A1)(Barendse等人)，尽管公开可获得的文献中的参考文献不能教导本申请中的发明分子。
抗体和基于抗体的筛选方法
本发明提供了可特异结合本发明的肌醇六磷酸酶的分离、合成或重组抗体。这些抗体可用来分离、鉴定或定量本发明的肌醇六磷酸酶或相关的多肽。这些抗体可用来抑制本发明的酶的活性。这些抗体可用于与发明的多肽相关的分离多肽，如相关的肌醇六磷酸酶。
本发明的抗体可包括由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因衍生(derived)、仿造(modeledafter)或基本上由其编码的肽或多肽或者其片段，它们能特异地结合抗原或表位，见例如，FundamentalImmunology，第三版，W.E.Paul，ed.，RavenPress，N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25：85-97。术语抗体包括结合抗原的部分，即，保留与抗原结合的能力的“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也被包括在术语“抗体”中。
所述抗体可以在免疫沉淀、染色(例如FACS)、免疫亲合柱等等中被应用。如果需要的话，编码特异抗原的核酸序列可以通过免疫产生，随后分离多肽或核酸，进行扩增或克隆，并且将多肽固定在本发明的阵列上。可选地，本发明的方法可以用于修饰由细胞产生的待修饰的抗体的结构，如，抗体的亲和性可以被增加或降低。而且，制备或修饰抗体的能力可以是通过本发明方法改造到细胞中的表现型。
免疫、产生和分离抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的方法是本领域技术人员已知的，并且在科学和专利文献中有描述，参见，如Coligan，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASICANDCLINICALIMMUNOLOGY(第7版)LangeMedicalPublications，LosAltos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLESANDPRACTICE(第2版)AcademicPress，NewYork，NY(1986)；Kohler(1975)Nature256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL，ColdSpringHarborPublications，NewYork。除了使用动物的传统的体内方法外，抗体也可以在体外产生，例如，应用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见如，Hoogenboom(1997)TrendsBiotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。
多肽可以被用于产生与本发明的多肽特异性结合的抗体。得到的抗体可应用于免疫亲和层析方法，以分离或纯化多肽，或确定多肽是否存在于生物样品中。在这样的方法中，蛋白质制备物，如提取物，或生物样品与能够同本发明的多肽之一特异结合的抗体接触。
在免疫亲和方法中，抗体被连接到固态支持物，如珠子或其它柱基质。在抗体特异性结合本发明的一种多肽或其片段的条件下，蛋白质制备物被置于与抗体接触。经清洗去除非特异性结合的蛋白质之后，特异性结合的多肽被洗脱。
在生物样品中蛋白质结合抗体的能力可以通过使用本领域技术人员所熟悉的各种方法中的任何一种来确定。例如，结合可以通过用可检测标记物，例如荧光试剂、酶标记或放射性同位素标记抗体来确定。可选地，抗体与样品的结合可以通过应用具有这样的可检测标记的二抗来检测。特定的分析包括ELISA分析、夹心分析、放射免疫分析以及蛋白质印迹法。
针对本发明的多肽产生的多克隆抗体可通过直接将多肽注射进动物中或通过将多肽给予动物，例如非人动物而获得。这样获得的抗体然后可结合多肽本身。以这种方式，甚至仅编码多肽的片段的序列也可用来产生可与整个天然多肽结合的抗体。这种抗体然后可用来从表达多肽的细胞中分离多肽。
为了制备单克隆抗体，可使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术、三体瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(参见例如Cole等人，1985，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。
描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可被改良，以使之适于产生本发明的多肽的单链抗体。可选地，转基因小鼠可用来表达这些多肽或其片段的人源化抗体。
针对本发明的多肽产生的抗体可被用于筛选来自其它生物体和样品的类似多肽。在这样的技术中，来自生物体的多肽与抗体接触，并且检测可与抗体特异性结合的那些多肽。上述的任何方法可用来检测抗体的结合。
试剂盒
本发明提供了含有组分，如本发明的核酸、表达盒、载体、细胞、多肽(如，肌醇六磷酸酶)和/或抗体的试剂盒。如在此所述，试剂盒也含有教导本发明的方法和工业应用的说明材料。
本发明的多肽也可用来产生与酶多肽或片段特异结合的抗体。得到的抗体可用于免疫亲和层析方法中分离或纯化多肽或确定多肽是否存在于生物样品中。在这样的方法中，蛋白制剂，如提取物，或生物样品接触能特异结合SEQIDNO：2的多肽、其基本上相同的序列或前述序列的片段之一种的抗体。
在免疫亲和方法中，抗体被连接到固态支持物，如珠子或其它柱基质。蛋白制剂在抗体与SEQIDNO：2的多肽、其基本上相同的序列、或其片段之一种特异结合的条件下被置于与抗体接触。经清洗去除非特异性结合的蛋白质之后，特异性结合的多肽被洗脱。
例如在检测酶的肌醇六磷酸酶活性的测定中，可以测量分离的多核苷酸序列、多肽序列、其变体和突变体的本发明酶的生物学活性特征的保留(FoodChemicalsCodex，第四版)。这种酶包括肌醇六磷酸酶的截短形式和变体，如SEQIDNO：2中所示的多肽序列的缺失和插入变体。这些肌醇六磷酸酶具有耐热性。也就是，肌醇六磷酸酶在70℃处理30分钟残留的比活性大约为90％，在75℃时处理30分钟大约为50％。本发明的肌醇六磷酸酶的耐热性在使用该酶作为饲料添加剂时是有利的，因为饲料在高温度下可模制、成颗粒状、或粒化。
例如，在一方面，本发明提供了可食用的粒化酶输送基质和用来输送肌醇六磷酸酶至动物体内的方法，例如作为一种营养补充物。在水相介质中，如动物的消化液中，酶输送基质容易释放肌醇六磷酸酶，如具有SEQIDNO：2的氨基酸序列或其至少30个连续氨基酸的酶。本发明的酶输送基质可从颗粒状的可食用载体中制备，载体选自下列的这些成分，如被耗干油的谷物胚芽、甘草、紫花苜蓿、梯牧草、豆壳、向日葵籽粉、小麦粉和类似物，它可容易地将含在其中的重组酶分散至水相介质中。在使用中，可食用的粒化酶输送基质被给予动物，以将肌醇六磷酸酶输送至动物体内。合适的基于谷物的基质可包含或来自任何合适的可食用谷物，如小麦、玉米、大豆、高梁、紫花苜蓿、大麦和类似物。示例性的基于谷物的基质是基于玉米的基质。基质可来自谷物的任何合适的部分，例如被批准用于动物饲料的谷类胚芽，如在湿的或干的研磨过程中获得的玉米胚芽。谷物胚芽可包含废胚芽(spentgerm)，它是油已经排出的谷物胚芽，油如通过挤压或己烷或其它溶剂萃取排出。可选地，谷类胚芽通过螺旋式压榨器提取，也即是，油1已经通过挤压除去。
本发明的酶输送基质是以分离的多个微粒、丸粒或颗粒形式存在。“颗粒”的含义是被压缩或压紧的微粒，如通过制丸、挤压或类似的压制过程从基质中去除水分。微粒的这种压缩或压紧也可促进微粒的微粒内粘结力。例如，通过在制丸机中将基于谷类的基质进行制丸来制备颗粒。由此制备的丸粒被研磨或粉碎成适合用作动物饲料辅料的颗粒大小。因为基质本身被批准用于动物饲料，所以它可内用作动物饲料中输送酶的稀释剂。
酶输送基质可以是颗粒的形状，其大小的范围为从大约4至大约400筛目(美国工业标准(USS))；或大约8至大约80筛目；或大约14至大约20筛目。如果谷类胚芽通过溶剂萃取被耗尽，可能有必要在造粒机中使用润滑剂如玉米油，但是，如果所述胚芽被螺旋式压榨器提取，这种润滑剂通常是不必要的。在本发明的其它方面，通过其它的压紧或压缩方法如，例如，通过模挤压基于谷类的基材和将挤压物磨碎至合适的颗粒大小来制备基质。
酶输送基质可以进一步包括多糖成分，作为粘结剂，增强基质颗粒的粘结性。粘结剂被认为提供了额外的羟基，其增强了基质颗粒内谷类蛋白质之间的键合。进一步认为，所述额外的羟基通过增强蛋白质与淀粉以及与其它蛋白质的氢键合起作用。粘结剂可以以适合增强酶输送基质颗粒的粘结性的任何量存在。合适的粘结剂包括糊精、麦芽糊精、淀粉如玉米淀粉、面粉、纤维素、半纤维素和类似物质的一种或多种。例如，基质(不包括酶)中的谷类胚芽和粘结剂的百分比按重量计为78％的玉米胚芽粉和20％的玉米淀粉。
因为本发明的酶-释放基质是用生物可降解的原料制成的，所述基质可以受到损坏，如通过发霉。为了防止或抑制这种发霉，基质可以包括霉菌抑制剂，如丙酸盐，其可以以足以抑制酶-释放基质中的发霉的任何量存在，因而提供了在不需要冷藏的稳定制剂中的输送基质。
包含在本发明的酶输送基质和方法中的肌醇六磷酸酶在一个方面上是一种耐热的肌醇六磷酸酶，如本文所述，以便在制造过程中，在使用升高的温度和/或蒸汽来制备粒化的酶输送基质的情况下抵抗肌醇六磷酸酶的失活。在消化含有本发明的酶输送基质的饲料过程中，含水消化液将引起活性酶的释放。其它类型的耐热酶和耐热的营养补充物也可以被掺入到输送基质中，从而在任何类型的含水条件下释放。
出于许多不同的目的，可以对本发明的酶基质微粒施加涂层，如为了向动物饲料添加调味剂或营养补充物，为了在胃内条件下延缓动物饲料补充物和酶的释放，以及类似的目的。或者，可施加涂层来实现功能性的目的，例如在需要延缓酶从基质微粒的释放或控制酶将被释放的条件时。涂层材料的组分可以是这样的，其可选择性地被其敏感的剂(如热、酸或碱、酶或其它化学物质)分解。可选择地是，对不同的这样的分解剂敏感的两种或更多种涂层可被连续地施加于基质微粒。
本发明也涉及制备酶释放基质的方法。根据本发明，该方法包括提供基于谷类的基材的多个分散颗粒，其颗粒大小适合用作酶释放基质，其中所述颗粒包括由本发明的肌醇六磷酸酶。该方法包括将酶释放基质的颗粒压制或压缩成小粒，其可通过造粒方法来完成。霉菌抑制剂和粘结剂，当被使用时，可在任何合适的时间被加入，并且可以所需的比例与基于谷类的基材在将基于谷类的基材造粒之前混合。造粒机进料中的含水量可以是在上面关于最终产物含水量所述的范围中，或大约14-15％，或大约10％到20％。水分以酶的含水制剂的形式加入至原料中，使该原料达到此含水量。在造粒机中的温度可用蒸汽达到大约82℃。造粒机可在任何条件下进行操作，使得对原料进行足够的操作以提供丸粒。对于从含酶组合物中去除水分来说，造粒方法本身是一个成本上有效的方法。
在一方面，造粒机在100磅/分钟的压力下，在82℃用1/8英寸×2英寸的模进行操作，以提供丸粒，然后其在造粒机的粉碎部件中被粉碎以提供多个分散颗粒，所述分散颗粒具有能够通过8目筛但是保留在20目筛上的颗粒大小。
在此所述的耐热肌醇六磷酸酶可具有较高的最适温度，并且可具有较高的热抵抗性或耐热性。因此，本发明的肌醇六磷酸酶在通常认为高于最适温度的温度下进行酶反应。本发明的肌醇六磷酸酶也在暴露于高温后进行酶反应(耐热性是在一定温度下保持酶活性的能力，其中野生型肌醇六磷酸酶在前面暴露于高温后是活性的，即使高温能灭活或减小该酶的活性，也见上面对耐热性的定义)。编码本发明的肌醇六磷酸酶的基因可用于制备肌醇六磷酸酶(如采用本文所述的GSSM和/或TMCA技术)，其具有的特性与SEQIDNO：2的肌醇六磷酸酶不同(就最适pH、最适温度、热抵抗性、对溶剂的稳定性、比活性、对底物的亲和性、分泌能力、翻译速率、转录控制和类似特性而言)。而且，本发明的多核苷酸可用来筛选本文所述的方法制备的肌醇六磷酸酶变体以确定含有所需活性如改善的或修饰的热稳定性或耐热性的那些变体。例如，美国专利第5,830,732号，描述了用于测定肌醇六磷酸酶耐热性的筛选测定。
这种筛选测定的体外实例是随后检测肌醇六磷酸酶活性的测定法：肌醇六磷酸酶活性的测定可通过将150μl酶制剂与600μl2mM肌醇六磷酸钠在100mMTrisHCl缓冲液，pH7.5，添加1mMCaCl2的情况下于37℃温育30分钟。在温育后，添加750μl5％三氯乙酸中止反应。在添加1500μl显色试剂(4体积5.5％硫酸中的1.5％钼酸铵和1体积2.7％硫酸亚铁；Shimizu，1992)后在分光光度计700nm处相对于磷酸标准品测定释放的磷酸。一单位的酶活性被定义为在检测条件下每分钟释放1μmolPi所需要的酶量。比活性可表示为每mg蛋白质的酶活性的单位数。本发明的酶具有水解肌醇六磷酸为肌醇和游离磷酸的酶活性。
在一方面，本发明提供了水解肌醇六磷酸的方法，包括将肌醇六磷酸与本文公开的一种或多种新的肌醇六磷酸酶分子(如具有SEQIDNO：2的具体修饰的蛋白质)接触。因此，本发明提供了催化肌醇六磷酸水解为肌醇和游离磷酸的方法，其中从肌醇六磷酸复合体中释放无机物。该方法包括将肌醇六磷酸底物与降解有效量本发明的酶接触。术语“降解有效”量是指与不接触所述酶的肌醇六磷酸相比，降解至少50％肌醇六磷酸所需要的酶量。80％的肌醇六磷酸被降解。
在另一个方面，本发明提供了水解肌醇六磷酸中磷酸单酯键的方法。该方法包括应用有效量的本发明的肌醇六磷酸酶分子，以产生肌醇和游离磷酸。在一方面，“有效”量是指与不与所述酶接触的肌醇六磷酸相比，水解至少50％磷酸单酯键所需的酶的量。在一个方面，至少80％的键被水解。
在一个具体方面，当需要时，肌醇六磷酸酶分子可与其它试剂如其它催化剂组合使用；以便在肌醇六磷酸分子和/或底物来源的其它分子中实现化学变化(如，水解)。根据这个方面，肌醇六磷酸酶分子和其它的试剂将不互相抑制。肌醇六磷酸酶分子和其它的试剂可具有总体相加效应，或可选地，肌醇六磷酸酶分子和其它试剂可具有总体协同效应。
底物肌醇六磷酸分子的相关来源包括食品、潜在食品、食品的副产物(体外和体内的副产物，如先体外后体内反应产物和动物排泄产物)、食品的前体和肌醇六磷酸的任何其它原料来源。
在一个非限制性的方面，重组肌醇六磷酸酶可被生物体摄取，并在摄取过程中保留活性。在另一个例证中，转基因方法可用来完成重组肌醇六磷酸酶的表达——如，以可控制的方式(这些方法用来以时间特异性和组织特异性的方式控制转基因分子的表达)。
在一方面，在来源原料(如，转基因植物来源或重组原核生物宿主)中肌醇六磷酸酶活性可在摄取的过程中增加；这种活性的增加可发生在，例如原-形式的前体肌醇六磷酸酶分子转变为明显更高活性酶的更成熟形式的过程中，其中所述的转变例如可来自肌醇六磷酸酶来源的摄入和消化。肌醇六磷酸酶底物的水解可发生在肌醇六磷酸酶与肌醇六磷酸接触过程中的任何时间；例如可发生在摄入前或消化后或摄入底物或酶或两者的之前或之后。另外要理解的是，肌醇六磷酸底物除了与肌醇六磷酸酶以外，可与一种或多种其它试剂接触，如另一种酶，所述另一种酶也可直接应用或在从其来源原料中纯化后应用。
可理解的是，肌醇六磷酸酶来源原料可直接与肌醇六磷酸来源原料接触；如在体外或体内研磨或咀嚼肌醇六磷酸酶来源和肌醇六磷酸来源之一或两者的过程中。可选择地，在肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸底物接触之前，肌醇六磷酸酶可从来源原料中被纯化，或肌醇六磷酸底物从来源原料中被纯化，或肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸底物都从来源原料中被纯化。可以理解的是，可使用纯化和未纯化的试剂的组合——包括酶或底物或两者都包括。
可理解的是，一种以上的来源原料可作为肌醇六磷酸酶活性的来源。这可用作从来源原料形成试剂的时控释放的一种方法，其中不同的试剂从它们的来源原料中分别释放，例如，如所摄入的来源原料在体内被消化或来源原料在体外应用中被加工。肌醇六磷酸酶活性的一种以上的来源原料也可在一定范围的条件及其波动范围内获得肌醇六磷酸酶活性，例如在应用的不同加工步骤中可遇到的条件如pH值的范围、温度、盐度和时间间隔。不同来源原料的应用也可用来获得不同的试剂，如通过肌醇六磷酸酶的一种或多种形式或异构体和/或肌醇六磷酸和/或其它原料为例证。
可以理解的是，单种来源原料，如一种转基因植物种属(或其植物部分)，可以是肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸的来源原料；酶和底物可在所述单种来源内被差异划分——如分泌与不分泌的，在不同的植物部分或器官或组织内或在同一植物部分或器官或组织内的亚细胞区室内差异表达和/或具有差异丰度。其中含有的肌醇六磷酸酶分子的纯化可包括分离和/或进一步加工一种或多种所需的植物部分或器官或组织或亚细胞区室。
在一方面，本发明提供了采用含有增加量酶的种子催化体内和/或体外反应的方法。该方法包括以例如碾碎形式将转基因的非野生型种子加入反应混合物中，并使种子中的酶增加反应速率。通过将种子直接加入至反应混合物中，该方法为更昂贵和繁琐的提取和纯化酶的过程提供了一种解决方案。也提供了治疗方法，由此，以来自一种或多种植物物种如转基因植物物种的种子的形式将酶给予酶供应不足的生物体，所述植物物种的种子含有增加量的酶。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员所了解的。在一个非限制性的具体例证中，这些公开可获得的文献包括美国专利第5,543,576(VanOoijen等人)和美国专利第5,714,474(VanOoijen等人)，尽管这些文献并未教导本申请中的发明分子，而是教导真菌肌醇六磷酸酶的应用。
在一方面，本肌醇六磷酸酶分子可用来产生重组的消化系统生活型(或微生物或菌群)和用来将所述的重组消化系统生活型给予动物。给予可选择地单独进行或与其它酶和/或可在消化系统中提供酶活性的其它生活型一起给予，其中所述的其它酶和所述的生活型可以是重组的或其它类型。例如，给予可与分解木聚糖细菌一起进行。
在一方面，本发明提供了一种方法，将玉米粒或高粱仁在存在酶制剂的情况下浸入含有二氧化硫的温水中，所述的酶制剂含有一种或多种降解肌醇六磷酸镁钙的酶，如以存在于玉米或高粱中的肌醇六磷酸镁钙大体上被降解的量。酶制剂可含有肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶和任选的其它植物材料降解酶。浸泡时间为12至18小时。通过中间研磨步骤可中断浸泡，减少浸泡时间。在一个方面，玉米粒或高粱仁在存在酶制剂的情况下被浸泡在含有二氧化硫的温水中，所述的酶制剂包括一种或多种肌醇六磷酸镁钙降解酶，如肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶，以消除或大幅度减少肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的盐。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员了解的，例如美国专利第4,914,029(Caransa等人)和EP0321004(Vaara等人)。
在一方面，本发明提供了一种方法，以获得具有所需物理特性如无粘性和弹性的面团和具有优良的特性如比容的面包产品，该方法包括将肌醇六磷酸酶分子加入至面团中。在一个方面，本发明的肌醇六磷酸酶分子被加入至正在加工的面团制品中，该制品随后成形并被烘烤。关于这种方法的其它细节可见公共的文献和/或是普通技术人员了解的，例如JP03076529(Hara等人)。
在一方面，本发明提供了一种产生改良大豆食品的方法。大豆与本发明的肌醇六磷酸酶分子混合在一起，从大豆中去除肌醇六磷酸，因此产生了大豆食品，这些食品在供应摄取生物体所必需的痕量营养物和对蛋白质的消化性方面得到改善。在一个方面，在产生豆奶的过程中，本发明的肌醇六磷酸酶分子可被加入或带入与大豆接触，以便减少肌醇六磷酸的含量。在一个非限制性的例证中，可通过将豆奶与酶在加热下搅动或通过在一个搅动容器中使用固化酶进行混合型反应来促进该应用过程。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如JP59166049(Kamikubo等人)。
在一方面，本发明提供了产生饮用水或液体形式的动物饲料的混合物产品的方法，并且其包括使用矿物质混合物和维生素混合物，以及还使用本发明的新颖肌醇六磷酸酶分子。在一个方面，获得了摄取生物体的必需营养素的正确剂量和组成的混合物，而没有重要矿物质/维生素沉淀和破坏的任何危险，同时在饲料中肌醇六磷酸钙镁结合的磷酸得到了最佳的利用。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员已知的，如EP0772978(Bendixen等人)。
可以理解的是，基于霉菌和/或谷物和/或其它植物的应用，本发明的肌醇六磷酸酶分子也可用于产生其它酒精和非酒精饮用食品(或饮料)。这些饮用食品包括白酒、葡萄酒、混合酒精饮料(如，冷酒器(winecooler)、其它酒精咖啡如爱尔兰咖啡等)、啤酒、淡啤酒(near-beers)、果汁、浸膏、匀浆和浓汤(purees)。在一个方面，本文公开的肌醇六磷酸酶分子被用来产生转基因的霉菌和/或谷物和/或其它植物，它们可用来产生这类饮用食品。在另一个方面，本文公开的肌醇六磷酸酶分子被用作这类饮用食品的制造过程中和/或最终含量中的附加成分。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员已知的。
在一方面，本发明提供了获得精制清酒(refinedsake)的手段，该精制清酒含有减少量的肌醇六磷酸钙镁和增加含量的肌醇。这样的清酒可通过直接效应和/或精神效应对肝脏疾病、动脉硬化和其它疾病具有预防作用。在一个方面，通过繁殖具有高肌醇六磷酸酶活性的米曲霉菌为原料，从米曲(ricekoji)产生清酒。可以理解的是，本发明的肌醇六磷酸酶分子可用来产生一种具有增强活性和/或外源性加入以增加酒曲霉菌的效应的可用霉菌(如转基因霉菌)。该菌株被加入至煮沸的大米中，并通过常规的步骤来产生酒曲。在一个例证中，使用已制备的酒曲，整米在两个阶段中进行制备，在恒定的清酒温度15℃下生产清酒，得到目标精制清酒，其含有减少量的肌醇六磷酸钙镁和增加量的肌醇。关于这种方法的其它细节可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如JP06153896(Soga等人)和JP06070749(Soga等人)。
在一方面，本发明提供了获得能够促进矿物质吸收的吸收促进剂的方法，所述矿物质包括未被胃液或肠液低成本消化的摄入钙。在一个方面，矿物质吸收促进剂含有肌醇六磷酸的部分水解产物作为活性成分。肌醇六磷酸的部分水解产物可采用本发明的新肌醇六磷酸酶分子水解肌醇六磷酸或其盐而产生。使用肌醇六磷酸酶分子的处理可单独进行和/或组合处理进行(抑制或增强最终效应)，然后在一定范围内抑制水解以便不释放所有的磷酸基团。关于这种方法的其它细节可见公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如JP04270296(Hoshino)。
在一方面，本发明提供了产生酶组合物的方法(及其产物)，该组合物具有附加的或协同的肌醇六磷酸水解活性；所述组合物包含本发明的新的肌醇六磷酸酶分子和一种或多种其它试剂以形成可用来联合处理的组合物。在一个方面，本发明的联合处理可使用至少两种不同位置特异性的肌醇六磷酸酶来完成，即1-、2-、3-、4-、5-和6-肌醇六磷酸酶的任意组合。通过组合不同位置特异性的肌醇六磷酸酶，获得了一种附加的或协同的效应。组合地包含这类肌醇六磷酸酶的组合物诸如食品和饲料或食品和饲料添加剂，以及其制备过程也包含在本发明中。关于这种方法的其它细节可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如WO30681(Ohmann等人)。
在另一个方面，本发明的联合处理可使用酸性磷酸酶来完成，该酸性磷酸酶在pH2.5具有肌醇六磷酸水解活性，对应于pH2.5∶5.0活性曲线的比例较低，为从大约0.1∶1.0至10∶1，或从大约0.5∶1.0至5∶1，或从大约0.8∶1.0至3∶1，或从大约0.8∶1.0至2∶1。酶组合物可在热处理过程中显示更高的肌醇六磷酸协同水解效率。酶组合物可用在食品(饮用食品和固体食品、饲料和草料产品)的处理以改善肌醇六磷酸水解。关于这种方法的其它细节或可选方案可见公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如美国专利第5,554,399号(Vanderbeke等人)和美国专利第5,443,979号(Vanderbeke等人)，其教导了真菌(特别是曲霉属)肌醇六磷酸酶的应用。
在另一个方面，本发明提供了产生组合物的方法(及其产物)，该组合物含有本发明的新型肌醇六磷酸作用酶，连同一种或多种其它作用于多糖的酶。这种多糖可选自阿聚糖、果聚糖、脱氧半乳聚糖、半乳聚糖、半乳醛糖(galacturonans)、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉胶、半乳卡罗聚糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、胶淀粉、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、右旋糖酐、石脐素、几丁质、琼脂糖、角质素、软骨素、皮肤素(dermatan)、透明质酸、褐藻酸、和含有至少一个醛糖、酮糖、酸或胺的多糖，选自赤癣糖、苏阿糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤癣酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖和神经氨酸。
在一方面，本发明提供了产生具有肌醇六磷酸协同水解活性的组合物的方法(及其产物)，该组合物含有一种或多种本发明的新型肌醇六磷酸酶分子、纤维素酶(也可包括木聚糖酶)、任选地蛋白酶和任选地一种或多种其它试剂。在可选的方面，这种联合处理可用于处理食品、木制品如纸制品、以及用作清洁溶液和固体。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶可与纤维素成分一起组合使用。已知许多纤维素分解细菌的纤维素酶可组构成独立的多酶复合体，称为纤维素酶小体(cellulosomes)。纤维素酶小体的多个亚单位由大量的功能结构域组成，它们相互作用并与纤维质底物作用。这些亚单位之一包括一种独特的新类型的非催化骨架多肽，它可选择性地将多个纤维素酶和木聚糖酶亚单位整合成内聚复合体。纤维素酶小体杂合物和纤维素小体结构域的嵌合构建物的灵活应用应该能够更好的应用纤维素生物质，并可提供在研究、医学和工业中的广阔新应用。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶分子可单独或以组合处理的方式用于生物制浆和生物漂白的领域，其中需要减少在制浆和纸业中传统使用的对环境有害的化学制品的应用。污水处理代表了另一个巨大的应用领域，其中生物酶已经显示不仅在除色，而且在将潜在有害物质生物转变为有用的生物产品方面均是有作用的。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶可用来产生生活型，它可提供用在生物体消化系统的处理中的至少一种酶活性——单独或组合处理的形式。尽管反刍类生物体也可得益于这种处理，要被处理的特别相关的生物体包括非反刍类生物体。具体而言，可以理解，这种方法可单独进行或与其它生物分子(例如，木聚糖酶)组合进行，以产生表达多个生物学分子的重组宿主。也可理解的是，本发明肌醇六磷酸酶分子和/或表达本发明肌醇六磷酸酶分子的重组宿主的施用可单独进行或与其它生物学分子、和/或可在消化系统中提供酶活性的生活型联合进行——其中所述其它酶和所述生活型可以是重组形式的或其它形式的。例如，施用也可与木聚糖分解(xylanolytic)细菌组合进行。
例如，除了肌醇六磷酸，许多生物体也不能充分消化半纤维素。半纤维素或木聚糖是植材料的主要成分(35％)。对于反刍类动物，大约50％的饮食木聚糖被降解，但在非反刍类动物和人类的下段肠道中仅有小量的木聚糖降解。在瘤胃中，主要的木聚糖分解物种是溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvents)和栖瘤胃拟杆菌(Bacteroidsruminicola)。在人结肠中，卵形拟杆菌(Bacteroidsovatus)和脆弱拟杆菌亚种“a”(Bacteroidesfragilissubspecies“a”)是主要的木聚糖分解细菌。木聚糖是化学复合体，并且其降解需要多种酶。这些酶通过肠道细菌的表达在物种间变化很大。溶纤维丁酸弧菌制造胞外木聚糖酶，但拟杆菌具有细胞结合的木聚糖酶活性。来自肠道细菌的木聚糖分解酶的生化表征并没有进行完全。一种木糖苷酶基因已经从溶纤维丁酸弧菌克隆。使用从溶纤维丁酸弧菌克隆的木聚糖酶基因进行的DNA杂交数据表明这种基因可存在于其它溶纤维丁酸弧菌菌株中。从栖瘤胃拟杆菌(Bact.ruminicola)中克隆的木聚糖酶被传递至并高度表达在脆弱拟杆菌(Bact.fragilis)和均一拟杆菌(Bact.Uniformis)中。来自卵形拟杆菌(Bact.ovatus)的阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶已经被克隆，且两种活性似乎都可被单一的双功能的新酶催化。
在一方面，本发明的肌醇六磷酸酶可用来1)传递至合适的宿主(如脆弱拟杆菌或均一拟杆菌)；2)在得到的重组宿主中获得充分的表达；和3)将所述的重组宿主给予生物体以改善被处理生物体降解肌醇六磷酸的能力。在遗传学和生物化学领域的持续研究将为在肠道水平调控消化作用提供知识和思路，并提高对结肠纤维消化作用的理解。
关于这种方法的其它细节或可选的方案可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如，本发明可包括在美国专利5,624,678(Bedford等人)、美国专利5,683,911(Bodie等人)、美国专利5,720,971(Beauchemin等人)、美国专利5,759,840(Sung等人)、美国专利5,770,012(Cooper)、美国专利5,786,316(Baeck等人)、美国专利5,817,500(Hansen等人)中描述的方法。
本发明教导本发明的肌醇六磷酸酶分子可加入至已公开的试剂(一种或多种)中以便获得具有附加的肌醇六磷酸酶活性的制剂。在一方面，试剂(一种或多种)和额外的肌醇六磷酸酶分子不互相抑制。在一方面，试剂(一种或多种)和额外的肌醇六磷酸酶分子可具有总体附加效应。在一方面，试剂(一种或多种)和附加的肌醇六磷酸酶分子可具有总协同效应。
在一方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，用于增强肌醇六磷酸的磷的利用、以及治疗和预防动物，特别是家禽的胫骨发育不良，这通过给予动物含有羟基化维生素D3衍生物的饲料组合物而进行。维生素D3衍生物可包含在含有降低水平的钙和磷的饲料中而给予动物，以增强肌醇六磷酸的磷的利用。因此，维生素D3衍生物可与本发明的新的肌醇六磷酸酶分子一起组合施用，以进一步增强肌醇六磷酸的磷的利用。关于这种方法的其它细节或可选方案可见公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如美国专利第5,516,525(Edwards等人)和美国专利第5,366,736(Edwards等人)、美国专利第5,316,770(Edwards等人)。
在一方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，以获得食品，其1)含有在生物体的机体内很容易吸收并以肌醇形式得到利用的肌醇六磷酸钙镁；2)能够以排泄物的方式减少磷；和3)因此可用于改善环境污染。所述食品包含含有肌醇六磷酸钙镁的谷物、产生乳酸的微生物和本发明的新颖肌醇六磷酸酶分子的混合物。在一个方面，所述食品如下产生：通过将含有肌醇六磷酸钙镁的谷物(优选，如米糠)与具有嗜酸特性的、产乳酸而不产丁酸的、去除了致病性的有效微生物种群和肌醇六磷酸酶混合在一起。有效的微生物群的实例包括如属于放线菌属种群的链霉菌属某种(Streptomycessp.)(美国模式微生物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)编号ATCC3004)和属于乳酸杆菌种群的乳酸菌属某种(Lactobicillussp.)(IFO3070)。
有效微生物种群的示例性添加量基于谷物原料的量以细菌体重量计算为0.2wt％。在一方面，肌醇六磷酸酶的添加量基于谷物原料中肌醇六磷酸钙镁的量为1-2wt.％。关于这种方法的其它细节或可选方案可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如，JP08205785(Akahori等人)。
在一方面，本发明提供了一种方法，以改善植物蛋白的溶解性。更具体地是，本发明涉及在植物蛋白来源中溶解蛋白质的方法，该方法包括用有效量的一种或多种本发明的肌醇六磷酸酶来处理植物蛋白来源，并用有效量的一种或多种蛋白水解酶来处理植物蛋白来源。在另一个方面，本发明提供了动物饲料添加剂，其包含本发明的肌醇六磷酸酶和一种或多种蛋白水解酶。关于这种方法的其它细节或可选方案可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如EP0756457(WO9528850Al)(Nielsen和Knap)。
在一方面，本发明提供了一种产生植物蛋白制剂的方法，包括在2至6的pH范围下在水中分散植物蛋白来源原料，并与本发明的肌醇六磷酸酶分子混合。含有可溶性蛋白质的酸性提取物被分离和干燥，产生所需特性的固体蛋白质。一种或多种蛋白酶也可用来改善所述蛋白质的特性。关于这种方法的其它细节或可选方案可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如美国专利3,966,971。
在一方面，本发明提供了一种方法(及其产物)，以活化土壤和/或堆肥中的无机磷，以改善氮化合物的利用率，以及以通过向堆肥中添加三种试剂——肌醇六磷酸酶、皂角苷和壳聚糖来抑制致病性霉菌的繁殖。
在一方面，该方法包括通过下列方式处理所述堆肥：1)例如以100ml培养基/100kg湿堆肥，加入在培养基中的含肌醇六磷酸酶的微生物，例如过度表达本发明的新肌醇六磷酸酶分子的重组宿主；2)可选地，例如以0.2至1kg/100kg湿堆肥(compost)，还加入含有肌醇六磷酸酶的植物来源，如麦麸；3)例如以0.5至3.0g/kg加入含有皂角苷的来源，如泥炭、艾属植物和丝兰植物；4)例如以100至300g/kg湿堆肥，加入含有壳聚糖的材料，如虾、蟹等的壳粉。
在一方面，使用三种试剂——肌醇六磷酸酶、皂角苷和壳聚糖的重组来源。关于这类方法的其它细节或可选方案可见于公共文献和/或是普通技术人员已知的，例如JP07277865(ToyaTaisuke)。
在一些情况下，局部(如，在特殊的组织或细胞类型中)输送和表达本发明的肌醇六磷酸酶序列是有益的。例如，在动物的肠道中肌醇六磷酸酶或消化酶的局部表达分别有助于例如肌醇六磷酸和磷的消化和摄取。核酸序列可直接被输送至唾液腺、组织和细胞和/或输送至例如肠道内层的上皮细胞。这种输送方法是本领域中已知的，包括电穿孔、病毒载体和直接DNA摄取。具有肌醇六磷酸酶活性的任何多肽可用于本发明的方法(如，特别描述在6.3.18节的那些，以及描述在本发明的其它部分的那些)。
例如，本发明的核酸构建物包括适合被宿主组织内的靶细胞摄取的形式的核酸分子。核酸可以是裸DNA或RNA分子的形式，其中所述分子可包括一条或多条结构基因、一条或多条调控基因、反义链、能够形成三联体的链或类似物。一般地，核酸构建物将含有在合适的调控区的转录和翻译控制下的至少一条结构基因。更普遍的是，本发明的核酸构建物将包括引入输送载体以改善转染效率的核酸，其中输送载体将被分散在含有干燥的亲水赋形剂材料的大微粒中。
一种这样的输送载体包括病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒，它们被灭活以防止自我复制，但保留了结合靶宿主细胞、输送遗传物质至靶宿主细胞胞浆内、并促进已经被引入颗粒中的结构基因或其它基因的表达的天然病毒能力。介导基因传递的合适的逆转录病毒载体被描述于Kahn等人，(1992)Circ.Res.71：1508-1517中。合适的腺病毒基因输送被描述于Rosenfeld等人，(1991)Science252：431-434中。逆转录病毒和腺病毒输送系统都被描述于Friedman(1989)Science244：1275-1281中。
第二种类型的核酸输送载体包括脂质体转染载体，其包括阴离子和阳离子脂质体构建物。使用阴离子脂质体需要核酸被包裹在脂质体内。阳离子脂质体则不需要核酸的包裹，相反可通过核酸和脂质体的简单混合就可形成。阳离子脂质体与带负电荷的核酸分子紧密结合，产生在许多细胞类型中获得理想转染效率的复合体，所述核酸分子包括DNA和RNA。参见Farhood等人，(1992)Biochem.Biophys.Acta.1111：239-246。形成脂质体载体的实例材料是lipofectin，它由二油醇磷酯酰乙醇胺(DOPE)(dioleylphosphatidyl)和二油醇丙氧基三乙铵(DOTMA)(dioleyloxypropyl-triethylammonium)的等摩尔浓度的混合物组成，其描述见Feigner和Ringold(1989)Nature331：387-388。
也可能组合这两种类型的输送系统。例如，Kahn等人，(1992)，见前，教导了逆转录病毒可被组合进阳离子DEAE-右旋糖苷载体中以进一步增强转化效率。也可能将核蛋白引入进病毒和/或脂质体输送载体，以更加进一步改善转染效率。参见Kaneda等人，(1989)Science243：375-378。
在另一个方面，提供了含有酶的消化助剂，所述酶或作为单一的活性成分或与一种或多种其它剂和/或酶组合在一起。在家畜或家养动物的消化助剂中使用酶和其它剂不仅改善了动物的健康和寿命预期，也协助增加了家畜的健康和从家畜产生的食品产量。
本发明也可使用家畜饲料(如，某种家禽饲料)，其被高度地补充了大量的矿物质(如，无机磷)、酶、生长因子、药物和输送给家畜的其它药剂。例如，这些补充物替代了谷物中存在的许多卡路里和天然营养素。通过从饲料本身减少或消除无机磷补充物或其它补充物(如，微量无机盐、生长因子、酶、抗生素)，饲料能够携带更多的营养素和能量。因此，剩余的食物将含有更加可利用的能量。例如，谷粒-含油种子粗粉食品通常含有大约3,200kcal(千卡)代谢能/千克食品，而无机盐不供应代谢能。去掉不需要的无机物，并代替以谷粒，因此增加了食物中可利用的能量。因此，本发明区别于常用的含肌醇六磷酸酶饲料。例如，在一个方面，使用生物相容性材料，其对生物体的胃肠道消化具有抵抗力。
在许多生物体中，包括例如，家禽或鸟类，例如鸡、火鸡、鹅、鸭、鹦鹉、孔雀、鸵鸟、雉、鹌鹑、鸽子、鸸鹋、几维、潜鸟、澳洲鹦鹉、美冠鹦鹉、金丝雀、企鹅、红鹳和鸽，消化道包括储存和使用硬的生物相容性物体(如，岩石和贝壳鱼的壳)的砂囊以帮助消化鸟类摄入的种子或其它饲料。这类生物体家族的典型消化道包括含有囊的食道，该囊称为嗉囊，在那里食物可短时间储存。食物从嗉囊向下移动至真胃或前胃，在那里盐酸和胃蛋白酶开始消化过程。下一步，食物移动进入砂囊，砂囊是卵圆形的、壁厚、并具有强有力的肌肉。砂囊的主要功能是研磨和磨碎食物微粒——一种由鸟类吞咽小量的细砂砾或粗砂而辅助的过程。食物从砂囊移动进入十二指肠。鸟类的小肠类似于哺乳动物。有两个盲袋或盲肠，长度大约为4-6英寸，位于小肠和大肠的连接处。大肠较短，主要由长度为大约3-4英寸的直肠组成。直肠排空至泄殖腔内，而粪便通过排泄口被排出。
在砂囊内被摄入(或以其它方式引入)和呈现的硬的生物相容性物体提供了输送多种酶剂、化学剂、治疗剂和抗生素剂的有用载体。这些硬的物质的半衰期为几小时至几天，并经过一段时间后才消失。因此，本发明提供了包被的、浸渍的(如，浸渍的基质和膜)、改良的饮食助剂，用于将有用的消化剂或治疗剂输送给生物体。这种饮食助剂包括典型地由生物体摄取以辅助砂囊内消化的物体(如，岩石或粗砂)。本发明提供了生物相容性物体，其可在其上包被这样的剂或在其中充满该剂，该剂可用作生物体的消化助剂或用于输送治疗剂或药剂或化学药品。
在一方面，本发明提供了饮食助剂，其具有设计用来释放帮助消化的剂的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物设计用来口服摄入并在生物体消化道(如，砂囊)中释放。“生物相容性”是指在与宿主生物体(如，鸟类)接触后，该物质不会产生有害的反应足以导致该物质的排斥或使该物质不可作用。这样的不可作用性可例如由于在该物质周围形成纤维化结构而限制浸渍的剂在宿主生物体内的扩散或形成一种由于毒性或感染可导致生物体死亡率或发病率增加的物质而发生。生物相容性物质可以是非生物可降解的或生物可降解的。在一个方面，生物相容性组合物对降解作用或胃肠道的消化作用是有抵抗性的。在另一个方面，生物相容性组合物具有岩石或石头的密度。
可用于本发明的非生物可降解材料是可允许饮食剂附着或浸渍的材料。这种非限制性的非生物可降解材料包括，例如热塑性塑料，如丙烯酸、变性聚丙烯腈、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜和聚偏二氟乙烯。弹性体也是可用的材料，并包括例如，聚酰胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙烯醇和硅酮(如，基于硅酮的或含二氧化硅的)。本发明提供，所述生物相容性组合物可含有多种这样的材料，它们可被例如混合或层叠，以形成掺混物、共聚物或其组合。
在一方面，“生物可降解的”材料是指在体内将腐蚀或降解形成更小的化学物质的组合物。例如，降解可通过酶促、化学或物理过程而发生。考虑用于发明中的合适的生物可降解材料包括，但不限于，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚醚酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚碳酸酯、聚氰丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯和类似物。这种物质可被混合或层叠，以形成掺混物、共聚物或其组合。
在一方面，本发明的许多不同的生物相容性物质可被给予动物，并继而摄取，或以其它方式同时被提供给同一生物体，或以多种组合形式(如，一种材料在另一种之前)提供给同一生物体。另外，本发明的生物相容性物质可被设计成缓慢地经过消化道。例如，大的或脂肪物质趋向于更缓慢地通过消化道移动，因此可使用具有较大体积的生物相容性材料，以防止迅速通过消化道。这种大的物质可以是非生物可降解和生物可降解物质的组合。例如，小的非生物可降解物质可被本发明的生物可降解物质包裹，这样在一段时间内生物可降解部分被降解，使非生物可降解部分通过消化道。另外，可以认识到，任何数量的调味剂可提供给本发明的生物相容性物质，以辅助摄入。
单独或与其它剂组合应用的任何数目的剂可被包被在本发明的生物相容性物质上，包括例如多肽(如，酶、抗体、细胞因子或治疗性小分子)，和抗生素。特别有用的剂的实例列于下面的表1和2中。也考虑的是，细胞可被包裹在发明的生物相容材料中，并用来输送酶或治疗剂。例如，可设计多孔物质，其具有的孔的大小足以使细胞在里面生长并穿过，并且这些多孔的材料然后可被摄入消化道中。例如，本发明的生物相容性物质可包含多种微生物区系环境(如，不同的空隙率、pH等)，其可提供对多种细胞类型的支持。细胞可被基因工程改造以输送特殊的药物、酶或化学制品给生物体。细胞是真核细胞或原核细胞。
表1
表2.治疗制剂
某些剂可被设计在某些状态下变成有活性的或失活的(如，在某种pH下，存在活化剂的情况下等)。另外，在发明的组合物中使用酶原是有益的。例如，酶原可被蛋白酶活化(如，存在于消化道或人工引入生物体消化道的唾液蛋白酶)。考虑的是，由本发明的生物相容组合物输送的剂通过加入活化剂被活化或灭活，该活化剂由生物体摄入或以另外的方式输送至生物体。在消化道中控制所述剂的另一个机制是环境敏感的剂，它在适当的消化腔内被活化。例如，所述剂可以在低pH下是无活性的，但在中性pH下是有活性的。因此，所述剂在胃内无活性，但在肠道内是有活性的。可选地，所述剂对微生物特异因子的存在反应而变为有活性的(如，存在于肠内的微生物)。
在一方面，本发明的潜在益处包括，例如，(1)减少或可能消除从每天的饲料或谷物中获得矿物质补充物(如，无机磷补充物)、酶、或动物(包括鱼)的治疗药物的需求，由此增加了饲料中存在的热量和营养剂的量，和(2)增进家养和非家养动物的健康和生长，这些动物包括，例如家禽、猪、牛、马、犬和猫科动物。
除了本发明的肌醇六磷酸酶以外，大量的酶可用于本发明的方法和组合物中。这些酶包括被消耗食物的适当消化所必需的、或者经消化道被输送至动物体内的化学物质、前药或其它剂或化合物的适当代谢、活化或衍生化所必需的酶。可被输送或掺入至发明的组合物中的酶的实例包括，例如选自下列的饲料增强酶：α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，特别是乳糖酶，肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶和内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纤维素酶，木糖苷酶，半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1，3-β-半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，特别是内切-1，2-β-葡聚糖酶，内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，特别是果胶酶，果胶酯酶，果胶裂解酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖胶酶，鼠李糖半乳糖醛酸酶，鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果胶酸裂解酶，和α-galacturonisidases，甘露糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，树胶醛木聚糖酶(arabinoxylanases)和脂肪分解酶如脂肪酶，肌醇六磷酸酶和角质酶(cutinase)。除了具有如SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶以外的肌醇六磷酸酶可用于本发明的方法和组合物中。
在一方面，用于本发明的组合物(如，饮食助剂)中的酶是肌醇六磷酸酶，它对热稳定，是热抵抗性的，并可催化肌醇六磷酸的酶促水解，即酶能在暴露于50℃以上的温度短暂的(即5至30秒)或更长的时期后，例如几分钟或几小后复性和恢复活性。
“饲料”和“食物”分别表示任何天然的、或人造的饮食、膳食或类似物，或需要或适合分别被动物和人吃入、摄入、消化的这些膳食的成分。如本文所使用，“饮食助剂”，表示例如含有这样的剂的组分，所述剂向动物或生物体提供治疗剂或消化剂。“饮食助剂”通常不是生物体摄取热量的来源，用其它话来说，饮食助剂通常不是生物体的能量来源，而是除典型的“饲料”或“食物”以外被摄取的组分。
在本发明的多个方面，提供饲料组合物，其包含重组肌醇六磷酸酶蛋白和含有肌醇六磷酸的食物，所述重组肌醇六磷酸酶蛋白具有这样的蛋白质的至少30个连续氨基酸，所述这样的蛋白质具有SEQIDNO：2的氨基酸序列。如本领域普通技术人员将了解的，这类组合物可以多种方法来制备，包括但不限于具有或不具有聚合物包被添加剂的丸粒形式、颗粒形式和通过喷雾干燥。作为非限制性的实例，在本领域中涉及饲料制备的教导包括国际公布W00070034Al、W00100042Al、W00104279Al、W00125411Al、W00125412Al和EP1073342A。
剂或酶(如，肌醇六磷酸酶)可在体外或体内发挥其效应，即分别在摄入前或在生物体的胃内或砂囊内发挥其效应。组合作用也是可能的。
尽管任何酶可被掺进饮食助剂中，本文提及肌醇六磷酸酶作为本发明方法和组合物的例证。本发明的饮食助剂包括酶(如，肌醇六磷酸酶)。通常，含有肌醇六磷酸酶组分的饮食助剂是液体或干燥的。
液体组合物不需要含有酶(如肌醇六磷酸酶)以外的任何物质，优选地以高度纯化的形式。但通常也加入稳定剂如甘油、山梨醇或单丙二醇。液体组合物也可含有其它添加剂，如盐、糖类、防腐剂、pH调节剂、蛋白质、肌醇六磷酸(肌醇六磷酸酶底物)。典型的液体组合物是水基或油基的混悬液。液体组合物可被加入至生物相容性组合物中以缓慢释放。优选地，酶被加入至饮食助剂组合物中，该组合物是生物相容性材料(如生物可降解的或非生物可降解的)，并包括将重组细胞加入至例如多孔微珠中。
干燥的组合物可以是喷雾干燥的组合物，在该情况下所述组合物不需要含有干燥形式的酶之外的任何物质。但通常，干燥组合物是所谓的颗粒，其可容易与食物或饲料成分混合，或更优选地，形成预混合的成分。酶颗粒的粒径优选与混合物的其它成分相容。这为将酶掺入至动物饲料中提供了安全和便利的方法。本发明的颗粒可以是生物相容性的，或者它们可以是非生物可降解的生物相容性颗粒。
由酶包被的本发明的附聚颗粒可采用附聚技术在高剪切混合器中进行制备。通过使载体材料的核吸附酶/被酶包被来制备吸附颗粒。在一方面，载体材料是生物相容性的非生物可降解材料，其模拟动物砂囊内的石头或砂粒的作用。用于附聚技术中的典型填充材料包括盐类，如硫酸钠。其它填料是高岭土、滑石、硅酸镁铝和纤维素纤维。任选地，粘合剂如糊精也被包含在附聚颗粒中。载体材料可以是任何的生物相容性材料，包括生物可降解的和非生物可降解的材料(如，岩石、石块、陶瓷和各种聚合物)。在一方面，颗粒用涂布混合物涂布。这种混合物包含涂布剂，例如疏水性涂布剂，如氢化棕榈油和牛油，并且如果需要，包含其它添加剂如碳酸钙或高岭土。
在一方面，饮食助剂组合物(如，肌醇六磷酸酶饮食助剂组合物)可含有其它的替代物如着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其它饲料或食物加强酶等。在一方面，用于本发明组合物的添加剂包括一种或多种化合物如维生素、矿物质或饲料加强酶和适当的载体和/或赋形剂。
在一方面，本发明的饮食助剂组合物另外包含有效量的一种或多种饲料加强酶，特别是选自以下的饲料加强酶：α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，特别是乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶和内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纤维素酶，木糖苷酶(xylosidases)，半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1，3-β-半乳糖苷酶，内切葡聚糖酶，特别是内切-1，2-β-葡聚糖酶，内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，特别是果胶酶，果胶酯酶，果胶裂解酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖胶酶，鼠李糖半乳糖醛酸酶，鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果胶裂解酶，和α-galacturonisidases，甘露糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，树胶醛木聚糖酶(arabinoxylanases)和脂肪分解酶如脂肪酶，肌醇六磷酸酶和角质酶。
本发明的动物饮食助剂可在饮食之前或与饮食同时补充给单胃动物。在一个方面，本发明的饮食助剂与饮食同时补充给单胃动物。在另一方面，饮食助剂以颗粒或稳定化液体的形式加入至饮食中。
在本发明的饮食助剂中酶有效量的范围是大约10-20,000；大约10至15,000、大约10至10,000、大约100至5,000或大约100至大约2,000FYT/kg饮食助剂。
本发明的肌醇六磷酸酶的其它特殊应用的非限制性实例是用在大豆的加工过程中和用在肌醇或其衍生物的制造过程中。
本发明也涉及在动物粪肥中减少肌醇六磷酸水平的方法，其中动物被喂食以含有有效量的本发明肌醇六磷酸酶的饮食助剂。如在本申请开始所说明的，其一个重要的效应是减少环境的磷酸污染。
在另一个方面，饮食助剂是磁性载体。例如，含有分布在磁性载体(例如，多孔磁珠)中、上或遍布其分布的酶(如肌醇六磷酸酶)的磁性载体可分布在高肌醇六磷酸的区域上，并在一段时间后通过磁铁收集。这种珠的分布和再收集减少了额外的污染，并可再使用这些珠。另外，在体内使用这些磁珠可将饮食助剂定位在消化道的一个点上，在那里例如可实现肌醇六磷酸酶活性。例如，在动物食用了具有磁性载体的饮食助剂后，含有消化酶(如，肌醇六磷酸酶)的本发明饮食助剂通过将磁铁与动物的砂囊并排放置而可被定位在动物的砂囊内。在经过允许饮食助剂通过消化道的一段时间后，可去掉磁铁。另外，磁性载体适合用来在处死后从生物体中去掉，或帮助收集。
当饮食助剂是多孔颗粒时，这种颗粒被这样的物质浸渍，对于该物质，期望缓慢释放，以形成缓释颗粒。这种缓释颗粒的制备不仅可通过用期望释放的物质浸渍多孔微粒来进行，而且可通过首先将期望的物质溶解在第一分散相中来进行。在这种情况下，由其中待释放的物质首先溶解在第一分散相的方法制备的缓释颗粒也包括在本发明的范围和精神内。多孔中空颗粒，例如可用缓释物质如药物、农业化学品或酶浸渍。特别是，当由酶浸渍的多孔中空颗粒由生物可降解聚合物制成时，所述颗粒本身可用作农业化学药品或肥料，并且它们对环境没有任何副作用。在一个方面，多孔颗粒本质上是磁性的。
多孔中空颗粒可用作生物反应器支持物，特别是酶支持物。因此，采用缓释的方法制备饮食助剂是有益的，例如通过将酶剂包裹在微泡中，如脂质体，从中剂量可在几天的时程内释放，优选在大约3至20天。可选地，剂(如，酶)可被配制，用于缓释，如掺入缓释聚合物，从中剂(如，酶)的剂量在几天的时程例如2至30天内缓慢释放，并且可在动物寿命内缓慢释放。
在一方面，本发明的脂质体来源于磷脂或其它脂类物质。脂质体可由分散在水介质中的单或多层水合液晶形成。可使用任何能够形成脂质体的非毒性、生理可接受和可代谢的脂质。除了所述剂以外，脂质体形式的本发明的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。一些示例性的脂类是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，可以是天然的和合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的。例如参见Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology，VolumeXIV，AcademicPress，NewYork，N.Y.(1976)，p.33etseq。
也包含在发明的范围内的是在制备食品或饲料制剂或添加剂的过程中使用发明的肌醇六磷酸酶，即仅在制造的过程中肌醇六磷酸酶发挥其肌醇六磷酸酶活性，而在最终的食品或饲料产品中则是无活性的。例如，这个方面与面团制备和烘烤相关。因此，肌醇六磷酸酶或表达肌醇六磷酸酶的重组酵母可被浸渍在磁性载体之中、之上或贯通其中，分布在面团中或食品介质中，和由磁铁回收。
本发明的饮食助剂可以在生物相容性(如，生物可降解或非生物可降解的)载体中单独给予动物，或与其它消化添加剂联合给予动物。本发明的饮食助剂可很容易地作为顶肥(dropdressing)使用或将其直接混合进动物饲料中，或者倘若与饲料分开，则通过单独口服、通过注射或通过经皮的方式或与其它生长相关的食用化合物一起应用，组合中每种化合物的比例依赖于特定生物体或要解决的问题和期望应答的程度。应该理解的是，在任何给定的情况下施用的具体饮食用量将根据待施用的具体化合物、待处理的问题、受者的状况和其它相关事实来调整，这些实际因素可改变有效成分的活性或受者的应答，如对于本领域普通技术人员是熟知的。通常，如本领域所熟知的，可使用单一日剂量或分次日剂量。
如果与动物饲料分开施用，饮食助剂的形式可通过将其与非毒性药学上可接受的可食用载体组合在一起形成立即释放或缓释剂型而加以制备，如本领域熟知的。这种可食用载体可以是固体或液体，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄榄油、芝麻油和丙二醇。如果使用固体载体，化合物的剂型可以是片剂、胶囊、粉末、糖锭或锭剂或微分散形式的顶肥。如果使用液体载体，剂型可以是软明胶胶囊、或糖浆或液体悬液、乳剂或溶液。剂型也可含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂等。它们也可含有其它有治疗价值的物质。在高温下制备颗粒状可食用载体以便当被摄取时释放酶的方法被描述于共同未决的美国专利申请系列09/910,579，其于2001年7月20日提交。
在可选的实施方式中，本发明的明显优势可包括，1)便于制造装载活性成分的生物相容性组合物；2)具有多功能性，因为它涉及可应用的聚合物和/或活性成分的类型；3)较高的产量和装载效率；和4)提供了持续释放的剂型，它在体内释放活性的、完整活性剂，因此可在长期的时间内提供活性剂的可控释放。在一个实施方式中，优势可以是因为所述剂在生物体的消化道(如，砂囊)内的局部输送。在一方面，短语“包含在内(containedwithin)”是表示将剂配制成组合物的方法，该组合物可用于在长期的时间内可控释放所述剂。
在本发明的持续释放或缓释组合物的可选实施方式中，使用有效量的剂(如，酶或抗生素)。在一方面，持续释放或缓释是指剂从生物相容材料中在长期的时间内逐渐释放。持续释放可以是连续的或不连续的，线性的或非线性的，并可采用一种或多种生物可降解的或非生物可降解的组合物、药物负载、选择赋形剂或其它修饰来完成持续释放。但是，可认识到，可期望提供“快速”释放的组合物，一旦生物体食用后该组合物就可提供快速释放。也要理解的是，“释放”并不一定表示剂从生物相容载体中释放。而在一个方面，缓释包括存在于生物相容组合物上的剂的缓慢活化或连续活化。例如，肌醇六磷酸酶不需要从生物相容组合物中释放来发生作用。在这个方面，肌醇六磷酸酶固定在生物相容组合物上。
动物饲料可以是含有任何蛋白质的有机粉，其通常用来满足动物的饮食要求。许多这样的含蛋白质粉通常主要由玉米粉、大豆粉或玉米粉/大豆粉混合物组成。例如，典型的市售饲养家禽的产品包括LandO′LakesAGServices的一种家禽饲料产品EggMakerComplete，以及Agwa，Inc.的一种产品CountryGameandTurkeyGrower，(也参见TheEmuFarmer’sHandbookbyPhillipMinnaarandMariaMinnaar)。这两种市售产品都是动物饲料的典型实例，其中本饮食助剂和/或肌醇六磷酸酶被掺入其中以减少或消除这种组合物中所需的补充磷、锌、锰和铁的摄取量。
本发明提供新颖制剂和饮食补充物以及添加剂，和对于某些饮食如Atkins饮食、素食者饮食、长寿饮食、绝对素食者饮食或地区饮食如发展中国家的饮食进行饮食补充的方法。与某些选择性饮食如Atkins饮食、素食者饮食、长寿饮食、绝对素食者饮食或地区饮食(例如发展中国家饮食)相关的食物着重于某些食物类别，例如蛋白质和脂肪、大豆等，或者它们依赖本土作物，例如谷类、稻米、豆类等作为个体营养的主要来源或唯一来源。这些基于谷物的作物中的许多具有升高水平(3到10倍)的肌醇六磷酸。加工的食物产品如大豆蛋白质水解物和其它表现出保留升高水平的肌醇六磷酸，并且它们作为营养棒、粉末和其它食物或食物补充物和成分的蛋白源而包括在内增加了食用这些饮食的个体经历的肌醇六磷酸负荷。
预防和逆转骨丢失
本发明也提供用作补充物和添加剂的新颖药物和饮食制剂，以及饮食补充的方法，所述新颖药物和制剂包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶，包括本发明的肌醇六磷酸酶，用于易感染骨丢失的个体、患有骨丢失的个体和患有某些医疗病症例如骨质疏松症、恶病质的个体，和用于医学治疗如化学疗法，其可损害必需营养成分的恰当摄取或利用。本发明的方法和组合物可单独使用，或与其它补充物或或治疗方案结合使用，所述方案包括药物治疗等。例如，用于饮食补充的制剂、饮食补充物和方法可以与治疗或预防骨质疏松症的其它饮食补充物或药物治疗——例如与维生素D3和/或钙(其被证明预防骨丢失)——一起施用。在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶和维生素D3和/或钙的制剂。在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶的制剂，以预防骨丢失。在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶的制剂，以逆转骨丢失。
制剂可以是药物组合物的形式，或者可以是药物的添加剂，它们中的任何一种可以是液体、固体、粉末、洗剂、喷雾剂或气溶胶的形式。用于口服的本发明的药物组合物和制剂可以使用本领域公知的药学上可接受的载体以恰当和适当的剂量配制。这些载体能使药物以适合患者摄取的单位剂型如片剂、丸剂、粉末、糖衣片、胶囊剂、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬浮液等配制。口服应用的药物制剂可被配制为固体赋形剂，在加入适当的额外化合物后，任选地研磨所形成的混合物，并加工粒状混合物，如果希望，得到片剂或糖衣片核(drageecores)。适当的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，其包括例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯树胶和西黄芪树胶；和蛋白质如明胶和胶原。可加入崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，例如藻酸钠。
本发明提供水悬浮液，其包含肌醇六磷酸酶例如本发明的肌醇六磷酸酶，其与适合制造水悬浮液的赋形剂混合。这样的赋形剂包括助悬剂——例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄芪树胶和阿拉伯树胶——和分散剂或湿润剂，例如天然发生的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、烯化氧与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七烯化氧十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、烯化氧与从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯)、或烯化氧与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯)。水悬浮液也可含有一种或多种防腐剂例如p-羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂——例如蔗糖、天冬甜素或糖精。可以调节制剂的渗透性。
剂量方案也考虑本领域公知的药物动力学参数，即活性剂的吸收率、生物利用度、代谢作用、清除等(参见例如Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58：611-617；Groning(1996)Pharmazie51：337-341；Fotherby(1996)Contraception54：59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84：1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie50：610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24：103-108；thelatesteditionofRemington，TheScienceandPracticeofPharmacy20thEd.LippincottWilliams&Wilkins)。技术发展水平允许临床医师确定对每一个体患者的剂量方案、活性剂和治疗的疾病或病症。为用作药物制剂的相似组合物提供的指导可被用作确定剂量方案的指导，即实践本发明的方法(例如反转骨丢失或预防骨丢失)而施用的给药方案和剂量水平是恰当并正确的。
体格训练补充物
本发明也提供新颖的饮食补充物和添加剂，以及使用它们用于经历体育训练或其它激烈的体格训练如士兵训练的个体的方法，它们包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶。体育训练和过度努力(hyperexertion)可以消耗完必需营养成分，并且需要饮食补充。这些饮食和条件通常缺少必需的微量养料例如最佳营养所必需的金属(K、Ca、Fe、Zn、Mn、Se)和离子(PO4)。富含肌醇六磷酸的饮食加重了这个问题，并且也可导致慢性和急性病症，这由于自愿的或经济迫使的依赖高度富含肌醇六磷酸食物的饮食所引起。
例如，遵照各种低碳水化合物(“低碳”)饮食的个体通常困扰于肌肉——如腿部肌肉——痉挛。对于此的典型建议是对他们的饮食增加额外的钾、钙和其它营养成分。本发明提供用于饮食补充的组合物、饮食助剂和补充物、以及用于饮食补充的方法，以利用对饮食的肌醇六磷酸酶(包括使用任何任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶)补充，经由常量养料和微量养料的活动化(mobilization)来增强另外缺乏的营养成分。
在本发明的一个方面，优化肌醇六磷酸酶的应用(例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶的应用)以展示热不稳定或pH稳定特性，这将使其适于直接加入到食物和补充方法中，和/或展示出在人或动物胃肠道中的稳定性和活性的增强。
本发明也提供新颖的饮食补充物和添加剂，以及使用它们用于经历矿物质补充的个体的方法，它们包含肌醇六磷酸酶例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶。对于食用具有高肌醇六磷酸含量的食物的人进行矿物质补充实际上可能加重养分有效性的问题。参考文献表明，肌醇六磷酸、钙和锌的复合体比肌醇六磷酸和钙的复合体更加不溶。人通常服用多种矿物质补充物。将肌醇六磷酸酶加入到设计用来在存在高肌醇六磷酸食物中组合矿物质补充物的方案中，可使这些补充物更加有效得多。
在可选的方面，本发明的组合物和方法(包含任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶)被用作补充物或添加剂于下列：
·体重减轻方案，其限制摄入特定食物组——素食者饮食、长寿饮食或绝对素食者饮食，这限制或排除摄入肉、茄科植物蔬菜、面包等和其它强调摄入坚果的饮食，
·用于食用富含高肌醇六磷酸食物的低碳饮食的个体的特定补充物，以减轻基于矿物质摄取减少的生理症状，
·体育训练方案，其寻求通过饮食摄取增强表现，其包括军事训练方案，
·医院饮食，其被定制以满足摄取受损或限定于食物组的患者的特定需要，
·发展中国家中缺乏微量养料的谷类和豆科饮食，
·学校午餐方案。
本发明也提供包含本发明的组合物(其包含任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶)和关于将本发明的组合物或方法并入这些饮食中的说明书的试剂盒。所述试剂盒可包括任何包装、标签、产品说明书等。
在一方面，本发明提供天然肌醇六磷酸酶或本发明优化的肌醇六磷酸酶，其被配制或优化用于(例如序列，被优化用于)生产、加工或通过人或动物系统例如消化道。使用可选的配方，可优化肌醇六磷酸酶。
可选地，本发明的肌醇六磷酸酶或者任何肌醇六磷酸酶，可通过工程化其序列例如使用如定向进化、易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变(recursiveensemblemutagenesis)、指数整体诱变、位点特异性诱变、连接重装配、GSSMTM和其任意组合进行优化，以在加工、摄入和在人肠中期间保持活性。
组合物(例如包含任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶的饮食制剂)可以以多种方式输送，以提供饮食功效。例如，本发明提供组合物(例如包含任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶的饮食制剂或添加剂)和方法，其包括下列应用：
·包装的食品补充物例如咀嚼片剂或营养棒(nutritionalbars)，
·作为可用于摄入前水合的冻干产品，
·与饮食产品共包装，例如加工的大豆产品，或者作为含大豆蛋白质水解产物和来自完整食品的其它加工部分的制剂出售，所述完整食品作为成分出售给加工食品工业，
·商业烘烤商品，
·喷射到早餐谷类，
·喷雾施用(例如鼻腔喷雾剂)的制剂，
·作为在本土作物即谷类和豆科植物中表达的转基因产品(例如，作为微生物例如细菌的转基因产物)
·作为转基因生物例如微生物；例如，给人或动物喂食这样的细菌或其它微生物，它们在摄入或植入例如人或动物的肠后能够产生(以及在可选的实施方式中能够分泌)重组肌醇六磷酸酶，例如本发明的肌醇六磷酸酶。
本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法可以被标注为营养成分增强的、营养成分相容的或另外以增强营养成分性能并缓解与养分缺乏相关的各种病症的能力为特点。
本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法被用于减轻肌醇六磷酸的抗营养效果，所述肌醇六磷酸螯合重要的饮食矿物质例如锌、铜、铁、镁、锡和钙。因此，本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法被用作饮食补充物，以预防摄入食物中的金属结合酶和蛋白质的沉淀。在一方面，本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法被用于减轻人饮食特别是富含豆科植物和谷类的那些饮食中的肌醇六磷酸的抗营养效果，以增加矿物质的生物利用度。在一方面，本发明的饮食补充物中的肌醇六磷酸酶催化从肌醇六磷酸部分或完全水解除去正磷酸，其中完全水解肌醇六磷酸导致产生1分子肌醇和6分子无机磷酸。
本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法适用于人和大量动物的饮食，包括家禽和鱼类。例如，本发明的含有肌醇六磷酸酶的饮食补充物产品和饮食补充方法可以实践于商业上重要的物种，例如猪、牛、绵羊、山羊、实验室啮齿动物(大鼠、小鼠、仓鼠和沙鼠)、毛皮动物(fur-bearinganimals)例如水貂和狐狸、和动物园动物例如猴子和猿、以及家养哺乳动物如猫和狗。典型的商业上重要的禽类物种包括鸡、火鸡、鸭、鹅、雉、鸸鹋、鸵鸟、潜鸟、鹬鸵(kiwi)、鸽子、鹦鹉、澳洲鹦鹉、大冠鹦鹉、金丝雀、企鹅、红鹳和鹌鹑。商业养殖的鱼如鳟鱼也受益于本文公开的饮食助剂。其它能受益的鱼包括，例如鱼(特别是在鱼池或鱼缸培育环境下，如热带鱼)、金鱼和其它观赏性鲤鱼、鲶鱼、鳟鱼、鲑鱼、鲨鱼、鹞鱼、比目鱼、鳎鱼、罗非鱼、青鳉、虹鳉、帆鳍鲈、新月鱼、剑尾鱼、斑马鱼和泥鳅。
本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法也用于各种琼脂、凝胶、培养基和用于组织和/或细胞培养的溶液。不一致的大豆水解产物可以是使用组织和/或细胞培养时遇到的问题。在一方面，本发明的含肌醇六磷酸酶的产物和方法被用作细胞培养基添加剂或用作处理以例如增加细胞培养产率和性能一致性。在一方面，本发明提供细胞培养的水解产物，其包含肌醇六磷酸酶，例如本发明的肌醇六磷酸酶。
在一方面，为了提供均质的产物，本发明提供通过使用肌醇六磷酸酶生物标记制造细胞培养的水解产物、补充物或其它添加剂的方法，所述水解产物、补充物或其它添加剂包含肌醇六磷酸酶。例如，该方法包括在水解产物、补充物或其它添加剂的批次中给数种肌醇六磷酸酶分子“评分(scoring)”或“打分(marking)”，然后掺和水解产物、补充物或其它添加剂的批次，以实现一致性生物标记模式。在一方面，每一批次的培养物性能在小生物反应器(一种或多种)中测量，并且性能与每一生物标记批次相关。在一方面，得到掺合物，以产生与平均值相比一致或更好的高性能产品。在一方面，加入硫氧还蛋白(TRX)以通过消除二硫键引起的二级结构来增加许多蛋白质的生物利用度。在一方面，也将蛋白酶加入到本发明的水解产物、补充物或添加剂。蛋白酶可以用其它生物标记(如用肌醇六磷酸酶，如上讨论的)“评分”或进行质量控制以指导掺和过程。
在一方面，本发明提供将肌醇六磷酸酶加入谷物以使用与上文对于本发明的水解产物、补充物或其它添加剂所述的那些类似的生物标记“评分”或质量控制过程来提供均质产物的方法。
增加战斗人员效率和士气的酶增强饮食
在一方面，本发明提供新的饮食补充物和添加剂以及饮食补充的方法，它们包含肌醇六磷酸酶，例如任何肌醇六磷酸酶或本发明的肌醇六磷酸酶，用于增加战斗人员效率和士气的酶增强饮食。在一方面，本发明的这些饮食补充组合物以稳定、容易使用和期望的形式在原位发挥作用以增强能量、精力和士气，同时限制了食物浪费。
在一方面，本发明的这些饮食补充组合物和方法致力于军事行动挑战(militaryoperationalchallenge)，所述挑战包括营养成分的有效输送和士兵的相关的健康、士气和行动有效性。本发明提供优化以在人肠中有效行使功能的酶。这些酶可增强营养成分的提取和能量的产生，以及延长保持营养充足和个体饱满感。
除了肌醇六磷酸酶，其它酶例如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂酶，也被用于实践本发明的饮食补充组合物和方法。在一方面，本发明提供制剂、食品补充物、食品、独立餐即食型单元(self-containedmealReady-to-Eatunits)(MRE)、饮品、水合剂(hydratingagents)等，其包含肌醇六磷酸酶如本发明的肌醇六磷酸酶和其它酶如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂酶或其组合。当与食物一起摄入时，这些酶已经示出增强关键营养成分例如磷、必需金属和离子、氨基酸和糖的释放。而且，共同摄入这些酶通过解聚植物源纤维素、半纤维素和淀粉来增加胃肠力学和吸收。该白皮书(whitepaper)提出开发这些酶作为对军事饮食的补充物以为战斗人员提供增强的营养利用。
在一方面，本发明的食品补充物引起必需磷酸从正常抗营养的、植物源肌醇六磷酸酯的释放，以增加食品能量产量和骨CaPO4沉积。在一方面，肌醇六磷酸酶和其它潜在营养补充酶可抵抗肠pH和内源蛋白酶活性。
在一方面，本发明提供口粮(rations)、饮料、食品、MRE、水合剂等的酶补充物，以明显提高用于训练、战争或任何紧迫情况下的战斗人员的军事餐(或任何餐，其包括一般消费者的用餐和饮食补充产品)的营养价值、可消化性和能量含量。可配制补充物以方便使用和个人运输(在MRE、水合剂等中或用MRE、水合剂配制)。在一方面，酶补充物不损害食物外观、味道和/或一致性。在一方面，产品改善健康状况并增加战斗人员的精力。
在可选的方面，酶补充物以许多方式输送，以提供饮食功效；例如，本发明在下列产品中提供肌醇六磷酸酶，其包括本发明的肌醇六磷酸酶，并且在一些方面提供另外的酶：
-包装食品或饮料补充物，例如MRE、口粮、救生包、水合剂、咀嚼片剂或营养棒；
-作为可用于摄入前水合的冻干产品(例如粉末)；
-与饮食产品、食品、饮料共包装，例如加工的大豆产品，或者含大豆蛋白质水解产物和来自全食品的其它加工部分的制剂，所述全食品作为成分出售给加工食品工业；
-烘焙商品中；
-喷射到谷类；
-制剂例如片剂、凝胶锭、胶囊、喷雾剂等。
在一方面，本发明的组合物和方法提供从摄入餐快速释放卡路里和常量养料和微量养料的营养补充。在一方面，本发明的组合物和方法向处于紧迫情况——例如涉及过度努力和恶化不连续期——下的个体提供能量和身体力量。在一方面，本发明的组合物和方法提供这样的酶，其被最优化并被配制以在人肠中有效发挥作用，同时在期望环境例如军事环境中保持稳定性、储存期和可运输性。
在一方面，本发明的组合物和方法提供增加产品的味道特性、溶解性、可咀嚼性和个人运输效率的制剂。在一方面，本发明的组合物和方法进一步包含其它成分例如钾、葡萄糖、CaCl2。制剂中的CaCl2可与释放的磷酸结合，这又增强骨沉积和增加体重。在一方面，本发明的组合物和方法进一步包含其它酶例如分别用于蛋白质、纤维素和半纤维素消化的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶的制剂。这些酶可提高蛋白质和淀粉利用度，并进一步增加从许多富铁食品的铁吸收。
在一方面，本发明的组合物和方法进一步包含用于水解源自植物材料的食品的酶，所述植物材料富含葡萄糖和木糖基聚合物、纤维素、半纤维素和淀粉，以及氨基酸聚合物、蛋白质。在一方面，本发明的组合物和方法促进食物中聚合物的水解；即促进将聚合物完全消化为单体例如多糖消化为单糖，或者蛋白质消化为氨基酸部分。因此，在该方面，本发明的组合物和方法允许食品、饮料或口粮实现其完全卡路里和营养价值。在一方面，酶补充包括使用稳定的酶例如各种水解酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、脂酶、酰胺酶、蛋白酶和其它酶。在一方面，用于本发明的组合物和方法的酶可抵抗周围肠条件，即在低pH和存在胃蛋白酶情况下的稳定性。
肌醇六磷酸酶的工业应用
除了上述的那些，本发明提供肌醇六磷酸酶的新颖的工业应用，包括本发明的新颖肌醇六磷酸酶的应用。
减少环境中的磷酸污染
在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶(包括本发明的肌醇六磷酸酶)的组合物，以加入废物或粪堆(manurepiles)来转化“环境的”肌醇六磷酸。在一方面，这用于减少污染和增加养分可利用性的目的。本发明也提供用于将肌醇六磷酸酶加入土壤、天然或人工水体(例如湖、池塘、井、粪池(manureponds)等)、城市污水、任何污水流等的组合物和方法。如上所述，本发明提供用于减少废物或污水例如动物粪便中的肌醇六磷酸水平的组合物和方法，其中所述动物被喂食含有有效量肌醇六磷酸酶例如本发明的肌醇六磷酸酶的饮食助剂。本发明的组合物和方法的示例性应用是减少环境中的磷酸污染。因此，本发明的组合物和方法可被用于通过降解肌醇六磷酸而减少污染的任何应用中。
耕作和植物生长应用
在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶(包括本发明的肌醇六磷酸酶)的组合物和用于耕作应用或其它植物生长应用的方法，例如将肌醇六磷酸酶加入到用于植物例如室内植物的肥料或植物食品添加剂(例如，MIRACLEGROWTM)。在使用用于耕作应用的本发明的组合物和方法中，使用者包括从事有机农业的农民。本发明的组合物和方法可被用于将肌醇六磷酸酶加入到用于特定作物或应用的任何缺少磷或者需要补充磷的土壤中。因为磷释放帮助植物生长，本发明的组合物和方法可被用于将肌醇六磷酸酶加入到其中具有藻类或植物材料的任何事物中。
制造产品
本发明提供多种制造产品，其含有一种或多种本发明的肌醇六磷酸酶。例如，在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶(包括本发明的肌醇六磷酸酶)的组合物和用于美容应用的方法，所述美容应用例如含有植物产品的洗发剂、洗剂或肥皂。
在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶(包括本发明的肌醇六磷酸酶)的组合物和固定肌醇六磷酸酶的方法。在一方面，固定的肌醇六磷酸酶行使控释机制的功能。例如，在一方面，本发明提供用于室内植物等的土壤例如粘土应用的肌醇六磷酸酶的控释(随时间释放)的制剂。在一方面，将肌醇六磷酸酶固定在珠上例如Polysorb珠。这些珠可被输送至土壤，例如用于农业植物或室内植物。在另一方面，本发明的肌醇六磷酸酶的控释(随时间释放)制剂被用于饮食补充物和添加剂。
生物燃料和生物质转化
本发明提供制造燃料例如生物燃料的方法，包括使用一种或多种本发明的肌醇六磷酸酶；包括提供燃料例如生物燃料，其包含一种或多种本发明的肌醇六磷酸酶。本发明提供生物质转化的方法，包括使用一种或多种本发明的肌醇六磷酸酶。
在一方面，本发明提供包含肌醇六磷酸酶(包括本发明的肌醇六磷酸酶)的组合物，和在发酵或醇产生过程例如乙醇产生过程使用肌醇六磷酸酶的方法。例如，本发明的组合物和方法可被用于提供使用石油基产品的有效且可持续的替代品或添加剂，例如作为生物乙醇和汽油的混合物。
本发明提供表达本发明酶的生物，用于参加涉及天然生物质转化的化学循环。另外，肌醇六磷酸酶(例如本发明的酶)与一种或多种淀粉降解酶例如淀粉酶或葡糖淀粉酶的组合改善了从淀粉产生乙醇。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法，使得这些重要的新“生物质转化”和替代性的能源工业过程可行。
生物质转化和清洁生物燃料的生产
本发明提供了多肽，其包括酶(本发明的肌醇六磷酸酶)和抗体，以及除了饲料、食品和化学制品以外，将生物质或任何木素纤维材料(例如，包含纤维素、半纤维素和木质素的任何组合)加工成燃料(例如，生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇、生物柴油)的方法。例如，在一方面，本发明的酶分解生物质(例如木素纤维材料、谷物或含油种子)中的不可消化的肌醇六磷酸(phyticacid)(肌醇六磷酸(phytate))以释放可消化的磷；因此，在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用于处理或预处理生物质。
因此，本发明的组合物和方法可用于生物燃料的生产和/或加工，例如以提供了使用石油基产品的有效且可持续的替代品或添加剂；例如，本发明的组合物和方法可以与酶的混合物一起使用以产生生物燃料如生物甲醇、生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物柴油等；其可被加入到柴油燃料、汽油、煤油等中。本发明提供了表达本发明的酶的生物，用于参与涉及天然生物质转化的化学循环。在一方面，用于转化的酶和方法被用在酶整体(enzymeensembles)中，用于有效地加工生物质连同将多糖、纤维素和/或半纤维素聚合物解聚成可代谢的(例如可发酵的)碳部分。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法，使得这些重要的新“生物质转化”和替代性的能源工业过程可行。
本发明的组合物和方法可以被用于提供使用石油基产品的有效且可持续的替代品或添加剂，例如，作为生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇和/或生物柴油和汽油的混合物。本发明提供了表达本发明的酶的生物，用于参与涉及天然生物质转化的化学循环。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法，使这些重要的新的“生物质转化”和替代性的能源工业过程可行。
本发明提供了本发明的方法、酶和酶的混合物或“鸡尾酒”，用于处理材料，例如生物质材料，例如包含纤维寡糖、阿拉伯木聚糖寡聚体、木质素、木素纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素和/或可发酵糖的组合物；例如包括使组合物与本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽接触的方法，其中任选地，所述材料源自农作物(例如小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木)，是食品或饲料生产的副产物，是木素纤维素废品、或是植物残体或废纸或废纸产品，并且任选地所述植物残体包括茎、叶、壳、皮、玉米或玉米穗、玉米秸秆、玉米纤维、干草、稻草(例如，稻杆或小麦杆)、甘蔗渣、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮、木材、木屑(woodthinning)、木片、木浆、废浆、木材废料、木材刨花和锯屑、建筑和/或爆破废物和残片(例如木材、木材刨花和锯屑)，并且任选地，所述纸废品包括废弃或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料以及再生纸材料。此外，城市废物，例如城市固体废物的纸质部分、城市木材废料和城市绿色废物以及包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料可以被应用。在可选的实施方式中，材料例如生物质材料的处理产生生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。
可选地，本发明的多肽可以在生物质植物材料或原料本身中表达。
本发明的方法也包括获得转化的木素纤维材料(由本发明的酶处理)并且通过发酵和/或通过化学合成使其成为燃料(例如，生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。在一方面，所产生的糖类进行发酵和/或不可发酵的产物被气化。
本发明的方法也包括应用本发明的酶转化藻类、初榨植物油(virginvegetableoil)、废植物油、动物脂肪和软脂(例如，牛脂、猪油和黄色软脂)或污水，并且通过发酵和/或通过化学合成或转化使其成为燃料(例如生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。
本发明的酶(包括例如生物，如微生物，例如真菌、酵母或细菌，其产生本发明的重组酶并且在一些方面分泌本发明的重组酶)可以被用于或被包括/并入在任何生物质转化过程的任何阶段，例如，在任何一个步骤、几个步骤，或者被包括在所有的步骤中，或所有下列生物质转化过程的方法中，或所有这些生物燃料替代品中：
·直接燃烧：材料通过直接加热燃烧并且是最简单的生物质技术；如果生物质来源在附近，可能是非常经济的。
·热解：是在没有氧存在的情况下通过加热对生物质进行热降解。在一方面，生物质被加热至大约800到1400华氏度之间的温度，但是没有氧被引入以支持燃烧，导致气体、燃料油和炭的产生。
·气化：生物质可以被用于通过加热或厌氧消化产生甲烷。合成气，一氧化碳和氢的混合物，可以源自生物质。
·掩埋气：通过填埋物中掩埋的垃圾腐败(厌氧消化)产生。有机废物在分解时，产生气体，所述气体由大约50％的甲烷组成，甲烷是天然气的主要成分。
·厌氧消化：将有机物质转化为甲烷和二氧化碳的混合物，甲烷是天然气的主要成分。在一方面，生物质如废水(污水)、肥料或食品加工废物与水混合且在没有空气的情况下进料到消化罐中。
·发酵
·醇类发酵：燃料醇通过将纤维素物质和/或淀粉转化为糖，将糖发酵成醇类，然后通过蒸馏分离醇水混合物来产生。原料可以被转化为糖并且然后通过用酵母发酵转化为醇，所述原料如专用作物(例如，小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木)、农业残余物和废物(例如，水稻杆、玉米秸秆、小麦杆、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废料(例如，硬木和软木屑、来自木材加工的硬木和软木残余物、木材刨花和锯屑)、城市废物(例如，城市固体废物的纸质部分、城市木材废料以及城市绿色废物)、木材废物(例如，锯木厂废物、纸浆厂废物、建筑废物、爆破废物、木材刨花和锯屑)、和废纸或包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料。可选地，包含糖的材料可以通过发酵被直接转化为醇类。
·酯交换：将油转化为生物柴油的示例性反应称为酯交换作用。酯交换过程使醇(如甲醇)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。该反应需要热和强碱催化剂，如氢氧化钠或氢氧化钾。
·生物柴油：生物柴油是由植物油、动物脂肪或再循环油脂制造的脂肪酸烷基酯的混合物。生物柴油可以以纯的形式用作交通工具的燃料，但是其通常被用作石油柴油添加剂，以降低来自柴油动力交通工具的颗粒、一氧化碳、碳氢化合物和空气有毒物质的水平。
·水解：包括应用本发明的酶催化的化合物的水解，所述化合物例如生物质，如木素纤维材料。
·联产(cogeneration)：是采用单一的燃料和设备，同时生产一种以上形式的能量。在一方面，生物质联产比单独的生物质生产具有更具潜力的增长，因为联产产生热和电。
在一方面，本发明的多肽可以与其它酶结合使用，所述其它酶例如水解酶或具有纤维素水解活性的酶，例如葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶和/或其它的酶，用于从任何有机材料产生燃料例如生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油，所述有机原料例如生物质，如源自植物和动物的组分，包括任何农业作物或其它可再生的原料、农业残余物或动物废物、城市和工业废物的有机成分、或建筑或爆破废物或残片、或微生物如藻类或酵母。
在一方面，本发明的多肽被用在将木素纤维素生物质转化为燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)的过程中，或者另外被用在水解或消化生物材料的过程中，这样它们可以被用作燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)，或用于使生物质更加容易被加工成燃料。
在可选的方面，本发明的多肽，包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”被用在酯交换方法的过程中，所述酯交换方法使醇类(如乙醇、丙醇、丁醇、丙醇、甲醇)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。在一方面，生物柴油由大豆油或再循环的厨房用油制成。动物脂肪、其它的植物油和其它的再循环油也可以被用于生产生物柴油，这取决于它们的成本和可用性。在另一方面，各种脂肪和油的掺合物被用于生产本发明的生物柴油燃料。
本发明的酶，包括本发明的酶的混合物或“鸡尾酒”也可以被用在甘油精炼中。甘油副产品含有未反应的催化剂和用酸中和的肥皂。水和醇被除去以产生50％到80％的粗甘油。残留的污染物包括未反应的脂肪和油，其可以使用本发明的多肽处理。在本发明大型生物柴油厂中，甘油可以被进一步纯化到例如99％或更高的纯度，用于制药和化妆品工业。
应用本发明的多肽——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——制造的燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)可以与燃料含氧化物一起使用以改善燃烧特性。加入氧导致更完全的燃烧，其减少了一氧化碳的排放。这是用生物燃料(例如本发明的燃料)代替石油燃料的另一个环境益处。应用本发明的组合物和/或方法制造的生物燃料可以与汽油掺和，形成E10掺合物(大约5％到10％的乙醇和大约90％到95％的汽油)，但是其可以以更高的浓度使用如E85，或以其纯的形式使用。应用本发明的组合物和/或方法制造的生物燃料可以与石油柴油掺和，形成B20掺合物(20％的生物柴油和80％的石油柴油)，尽管可以使用高达B100(纯的生物柴油)的其它掺和水平。
本发明还提供了使用本发明的酶由包含生物质例如植物源的生物质如木素纤维素生物质的组合物制备生物燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的方法。生物质材料可以从农作物获得，作为食品或饲料生产的副产物，或作为废产物，包括木素纤维素废产物，诸如植物残体、废纸或建筑和/或爆破废物或残片。用本发明的多肽处理的合适的植物来源或植物残体的例子包括海藻、藻类、谷类、种子、茎、叶、壳、皮、玉米穗、玉米秸秆、稻草、甘蔗、甘蔗渣、草(例如，印度草如蓝刚草(Sorghastrumnutans)；或柳枝稷(switchgrass)，例如黍(Panicum)某种，如柳枝稷(Panicumvtrgatum))和类似物，以及木材、木片、木浆和锯屑。适合用本发明的多肽处理的纸废物的例子包括废弃的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸等等，以及报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料。建筑和爆破废物和残片的例子包括木材、木材碎屑、木材刨花和锯屑。
在一个实施方式中，本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——和方法可以与从生物质制备乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙醇和/或柴油的更“传统的”方法一起使用，例如，这样的方法，其包括通过使干燥的木素纤维材料在反应器中与由强酸和金属盐的稀释溶液组成的催化剂接触而水解木素纤维材料；这可以降低纤维素水解的活化能或温度，以获得更高的糖产率；参见，例如，美国专利号6,660,506和6,423,145。
掺和使用本发明的酶——其包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括水解生物质，通过在一定的温度和压力下在含水介质中使所述物质经受第一阶段的水解步骤而进行，所述生物质包括任何木素纤维材料例如含有半纤维素、纤维素和木质素或任何其它能被水解的多糖，所述温度和压力被选择来实现半纤维素的初步解聚而不将纤维素大部分解聚成葡萄糖。该步骤产生这样的浆，其中含水液相含有由半纤维素解聚得到的溶解的单糖，而固相含有纤维素和木质素。第二阶段水解步骤可以包括使得至少大部分纤维素解聚的条件，该步骤产生含有溶解的/可溶的纤维素解聚产物的含水液相。参见例如美国专利号5,536,325。本发明的酶(包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”)可以在该示例性方法的任何阶段加入。
并入使用本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括：通过一个或多个用大约0.4％至2％的强酸进行稀酸水解的阶段来处理含木素纤维素的生物质材料；以及通过碱性去木质作用来处理酸水解的生物质材料的未反应的固体木素纤维素成分，以产生可生物降解的热塑性塑料和衍生物的前体。参见例如美国专利号6,409,841。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
并入使用本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括：在预水解反应器中预水解木素纤维材料；向固体木素纤维材料加入酸性液体，制备混合物；将该混合物加热至反应温度；维持反应温度足够的时间，以将木素纤维材料分馏成含有至少大约20％的来自木素纤维材料的木质素的溶解部分以及含有纤维素的固体部分；当处于或接近固体部分中的纤维素变得更易于进行酶消化的反应温度时，从固体部分除去溶解部分；以及回收溶解部分。参见例如美国专利号5,705,369。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
本发明提供了制备基于液体烃的发动机燃料组合物(例如，用于火花点火发动机)的方法，所述液体烃掺混有利用本发明的酶或方法制备的燃料级醇。在一方面，利用本发明的酶制造的燃料包括例如液体煤气-醇掺合物或液体天然气-醇掺合物。在一方面，共溶剂是生物质衍生的2-甲基四氢呋喃(MTHF)。参见，例如美国专利号6,712,866。
在一方面，用于木素纤维素的酶促降解的本发明的方法，例如用于从木素纤维材料生产生物燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的方法，还可以包括使用生物质材料的超声处理；参见，例如美国专利6,333,181。
在另一方面，用于从纤维素底物生产生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的本发明的方法包括：提供浆形式的反应混合物，其包含纤维素底物、本发明的酶和发酵剂(例如，在反应容器内，如半连续固体给料的生物反应器)，并且该反应混合物在足以引发和维持发酵反应的条件下进行反应(如在美国专利申请第20060014260号中所述)。在一方面，实验或理论计算可以确定最佳给料频率。在一方面，额外数量的纤维素底物和酶以根据所述最佳给料频率的间隔(一次或多次)被提供到反应容器中。
用于制造本发明的生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的一个示例性方法被描述在美国专利申请公布第20050069998；20020164730号中；并且在一方面，包括如下的阶段：磨碎木素纤维素生物质(例如磨碎到15-30毫米的大小)；使获得的产物在反应器中受到水蒸气爆炸预处理(例如，在190-230℃的温度)1到10分钟；收集旋风分离器中的预处理材料或相关制造产物；并且通过在压滤机中过滤而分离液体和固体部分，将所述固体部分引入到发酵沉淀物中并且加入一种或几种本发明的酶，例如纤维素酶和/或β-葡糖苷酶(例如，溶解在pH4.8的柠檬酸盐缓冲液)。
应用本发明的酶制备包括生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇的本发明的生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的另一个示例性方法包括：预处理包含木素纤维素原料的起始材料，所述木素纤维素原料至少含有半纤维素和纤维素。在一方面，起始材料包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或成分或废物或食品或饲料生产副产物。起始材料(“原料”)在破坏植物纤维结构以实现半纤维素和纤维素至少部分水解的条件下发生反应。破坏性条件可以包括，例如使起始材料在pH0.5至2.5经受180℃至270℃的平均温度大约5秒至60分钟的时间；或在pH0.5至2.5经受220℃至270℃的温度5秒至120秒的时间，或等同条件。这产生了以增加的可及性被酶例如本发明的纤维素酶消化的原料。美国专利号6,090,595。
利用本发明的酶水解木素纤维材料的示例性条件包括在大约30℃至48℃之间的温度下和/或大约4.0至6.0之间的pH下反应。其它示例性条件包括在大约30℃至60℃之间的温度下和/或大约4.0至8.0之间的pH。
+葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用在生物质到燃料的转化中以及用在乙醇的生产中，例如如在PCT申请WO0043496和WO8100857中所述。葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以与肌醇六磷酸酶(例如本发明的酶)组合使用，以生产可以被转化为燃料乙醇的可发酵糖和含葡聚糖的生物质。淀粉酶、葡糖淀粉酶、普鲁兰酶(pullanases)、葡萄糖异构酶(glucoisomerase)、α-葡糖苷酶等可以与肌醇六磷酸酶(例如本发明的酶)组合使用，以将淀粉转化为可发酵糖或乙醇。请参见PCT申请WO2005/096804。
干酒糟加工
在另一方面，本发明的酶可用于处理/加工“干酒糟(distillersdriedsolubles)(DDS)”、“谷物干酒糟(distillersdriedgrains，DDS)”、“浓缩干酒糟(condenseddistillerssolubles)(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“可溶性谷物干酒糟(DDGS)”；谷物干酒糟可以是酿酒工艺的谷类副产品，并且可以包括可溶物。这些工艺可包括干磨植物副产品，例如用于饲料应用，例如禽类、牛、猪和其它家养动物的饲料应用。因此，本发明的酶可用于处理/加工谷物(grain)例如谷类，其是任何酿酒工艺的副产品，包括使用任何来源的谷物的工艺，所述任何来源的谷物例如来自酿酒商的传统来源或可选地来自生产乙醇的工厂(制造厂、厂等)。本发明的酶可用于处理/加工来自酿酒厂的干浆(dryingmash)；这种浆随后可用于多种目的，例如作为家畜的饲料，特别是反刍动物的饲料；因此本发明提供加工家畜例如反刍动物的饲料的方法，和包含本发明的肌醇六磷酸酶的酶加工饲料。
本发明的肌醇六磷酸酶可单独使用或与其它酶一起使用以加工“干酒糟(distillersdriedsolubles)(DDS)”、“谷物干酒糟(DDS)”、“浓缩干酒糟(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“可溶性谷物干酒糟(DDGS)”。例如，本发明的肌醇六磷酸酶可被用于醇生产工艺的任一步骤中，如在图14中所示。本发明的肌醇六磷酸酶可被用于增加任何生物燃料或潜在生物燃料中的磷的生物利用度，所述磷包括在“干酒糟(distillersdriedsolubles)(DDS)”、“谷物干酒糟(DDS)”、“浓缩干酒糟(CDS)”、“湿酒糟(DWG)”和“可溶性谷物干酒糟(DDGS)”中发现的磷(参见例如C.MartinezAmezcua，2004PoultryScience83：971-976)。
酒精饮料或可饮用醇生产
本发明的肌醇六磷酸酶也可用于加工谷物干酒糟，用于醇生产——作为在“酒精饮料(spirit)”例如啤酒或威士忌生产中的醇(除了用于加工生物质生产生物燃料之外)。本发明的肌醇六磷酸酶可被用于乙醇工厂例如用于加工谷粒例如玉米。谷物干酒糟可首先通过研磨谷物(例如玉米)至粗略一致性并加入到热水中而制备。冷却后，加入酵母，并发酵混合物数天至一周。发酵后残留的固体是谷物酒糟。本发明的肌醇六磷酸酶可在该过程的任何步骤中使用。
制剂
本发明提供包含肌醇六磷酸酶——如在本文所描述的那些——的新颖制剂和肌醇六磷酸酶的制剂，其包括包含本发明的新肌醇六磷酸酶的制剂。本发明的肌醇六磷酸酶可以单独或作为多种肌醇六磷酸酶的混合物或肌醇六磷酸酶与其它酶的混合物加以使用或配制，其它酶诸如木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、或氧化还原酶如漆酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶或还原酶。它们可以配制成固体形式如粉末、冻干制剂、颗粒、片剂、棒、晶体、胶囊、丸剂、丸粒，或液体形式如水溶液、气溶胶、凝胶、糊、浆、水/油乳状液、乳剂、胶囊、或配制在小泡或胶束悬浮液中。本发明的制剂可以包括任何下述组分或它们的组合：多元醇如聚乙二醇、聚乙烯醇、丙三醇；糖类如蔗糖、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖；胶凝剂如瓜尔树胶、鹿角菜胶、藻酸盐、葡聚糖、纤维素衍生物、果胶；盐如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁、氯化锌、硫酸锌、脂肪酸和脂肪酸衍生物的盐；金属螯合剂如EDTA、EGTA、柠檬酸钠；抗微生物剂如脂肪酸或脂肪酸衍生物、对羟基苯甲酸酯、山梨酸酯、苯甲酸酯；阻断酶诸如蛋白酶的作用的其它调节化合物；大体积蛋白质(bulkprotein)如BSA、小麦水解产物、硼酸盐化合物、氨基酸或肽、合适的pH或温度调节化合物，乳化剂如非离子型和离子型洗涤剂，氧化还原剂诸如胱氨酸/半胱氨酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽，或抗氧化剂化合物例如抗坏血酸，蜡或油，或分散剂。交联和蛋白质修饰例如聚乙二醇化、脂肪酸修饰、糖基化也可用于提高酶的稳定性。
测定代谢参数
本发明的方法涉及细胞的全细胞进化、或全细胞工程以通过修饰细胞的遗传成分而开发具有新的表型的新细胞株，其中遗传成分通过向细胞添加发明的核酸而被修饰。为了检测新的表型，在细胞中以“实时”或“在线”时帧来监测被修饰细胞的至少一个代谢参数。在一个方面，多个细胞，如细胞培养物，以“实时”或“在线”监测。在一个方面，多个代谢参数被“实时”或“在线”监测。
代谢通量分析(MFA)是基于已知的生化框架结构。线性非依赖性代谢矩阵的构建是遵循质量守恒定律和对细胞内代谢物的假稳态假设(PSSH)。在实施发明的过程中，建立了代谢网络，包括：
·所有的通路底物、产物和中间代谢物的特征
·相互转变通路代谢物的所有化学反应、通路反应的化学计量的特征，
·催化反应的所有酶、酶反应动力学的特征，
·通路成分之间的调控相互作用，如变构相互作用、酶-酶相互作用等，
·酶的细胞内区室化或酶的任何其它超分子组构，和，
·任何浓度梯度的代谢物、酶或效应器分子或其运动的扩散屏障的存在。
一旦指定株的代谢网络被建立，如果可获得在线代谢物数据，则可引入矩阵概念的数学表达式来估计细胞内的代谢通量。
代谢表型依赖于细胞内的全代谢网络的变化。代谢表型依赖于通路利用相对于环境条件、遗传调控、发育阶段和基因型等的变化。在本发明方法的一个方面，在线MFA计算后，细胞的动力学行为、它们的表型和其它特性通过研究通路利用而被分析。例如，如果在酵母发酵过程中葡萄糖供应增加而氧减少，呼吸通路的利用将减少和/或中止，而发酵通路的利用将占优势。在通路分析后细胞培养物生理状态的控制将成为可能。通过确定如何改变底物供应、温度、使用诱导剂等来控制细胞的生理状态以便沿所需的方向移动，本发明的方法将帮助确定如何调控发酵。在实施本发明方法的过程中，MFA的结果也可与转录组和蛋白质组数据比较以设计代谢工程或基因改组的试验和步骤等。
在实施发明方法的过程中，可赋予和检测任何修饰的或新的表型，包括细胞中新的或改良的特性。可监测代谢或生长的任何方面。
监测mRNA转录物的表达
在本发明的一个方面，工程改造的表型包括在细胞内增加或减少mRNA转录物的表达或产生新的转录物。mRNA转录物，或信使，可通过本领域已知的任何方法检测和定量，如Northern印迹、定量扩增反应、杂交到阵列和类似方法。定量扩增反应包括定量PCR，包括如定量逆转录聚合酶链式反应，或RT-PCR；定量实时RT-PCR，或“实时动力学RT-PCR”(参见如Kreuzer(2001)Br.J.Haematol.114：313-318；Xia(2001)Transplantation72：907-914)。
在本发明的一个方面，工程改造的表型通过敲除同源基因的表达而产生。基因的编码序列或一个或多个转录控制元件可被敲除，如启动子或增强子。因此，转录物的表达可被完全消除或仅得到降低。
在本发明的一个方面，工程改造的表型包括增加同源基因的表达。这可以通过敲除负调控元件来实现，包括以顺式或反式作用的转录调控元件，或通过诱变正调控元件来实现。
如在下面所详述的，细胞的一种或多种或所有转录物可通过与样品杂交而被测量，该样品含有所述细胞的转录物、或代表细胞转录物或与其互补的核酸，通过与固定在阵列上的核酸杂交而被测量。
监测多肽、肽和氨基酸的表达
在本发明的一个方面，工程改造的表型包括在细胞中增加或减少多肽的表达或产生新的多肽。多肽、肽和氨基酸可通过本领域已知的任何方法检测和定量，包括如核磁共振(NMR)、分光光度测定法、放射显影法(蛋白质放射标记)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱，各种免疫学方法如免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、凝胶电泳(如，SDS-PAGE)、抗体染色、荧光活化细胞分选仪(FACS)、热解质谱法、傅立叶变换红外光谱法、拉曼光谱法、GC-MS、和LC-电雾化和cap-LC-串联电雾化质谱法等。新的生物活性也可使用描述在美国专利第6,057,103号中的方法或其变化的方法来筛选。而且，如下面所详述的，细胞的一种或多种或所有的多肽可采用蛋白质阵列来测定。
生物合成的定向片段13C标记的产生蛋白质的氨基酸可通过将均一13C标记的和未标记的碳源化合物的混合物输送至生物反应网络中而进行监测。得到的标记图谱的分析可描绘出网络拓扑学的综合特性，并确定氨基酸的代谢通量率；见如Szyperski(1999)Metab.Eng.1：189-197。
下面实施例的目的是举例说明，而不是限制本发明。尽管在实施例中所描述的步骤是可用来实施发明的某些方面的典型实施例，但也可使用本领域普通技术人员已知的其它步骤。
实施例
实施例1：本发明的示例性肌醇六磷酸酶的活性表征
该实施例描述了表征本发明的多肽——其为亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2的序列修饰(所谓的“进化的”肌醇六磷酸酶)——的肌醇六磷酸酶活性和示例性肌醇六磷酸酶活性测定方法。该肌醇六磷酸酶活性测定方法可被用于确定多肽是否具有在要求保护的发明的范围内的足够活性。
通过表达本发明的GSSM-修饰的核酸序列而产生本发明的多肽后，纯化“进化的”肌醇六磷酸酶多肽——在该研究中仅单一残基突变示例性种类，然后在不同的温度下加热处理30分钟(pH7.0，0.01％吐温)。加热处理步骤后，用pH5.5、4mM的荧光底物(180uL)DiFMUP分析样品(20uL)。将该速率与每一相应未处理样品的速率进行比较。结果在图1中阐述。
在另一研究中，包括”混合的”单一突变的本发明“进化的”肌醇六磷酸酶——即肌醇六磷酸酶包含多种突变——在LBCARB100TM(LBcarb100)中于30℃生长过夜。100uL的每种培养物(混合突变体)在从72℃到100℃的热循环仪上热处理。20uL热处理的培养物与180uL、pH5.5的4mMDiFMUP混合。将该速率与每一相应未处理样品的速率进行比较；如在图2中所总结。在图3中图解阐述的表总结了用于产生图2的图的数据(四舍五入到最接近的十分位)。
样品1到21相应于亲本SEQIDNO：2的”混合”单一突变，如在图5的表中阐述的；注意，“进化的”肌醇六磷酸酶第10号具有没有通过GSSM引入的序列残基修饰(来自SEQIDNO：2)；该突变通过随机引入，并且与本发明的该示例性肌醇六磷酸酶的热稳定性可能相关或可能不相关。此外，注意，**标记的示例性肌醇六磷酸酶19、20和21具有C-末端组氨酸(6×His)标签(-RSHHHHHH)。图5阐明具有对亲本SEQIDNO：2的多个残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶；如在本文详述的。图6阐明具有对亲本SEQIDNO：2的单一残基修饰的示例性肌醇六磷酸酶；如在本文详述的。
图7示意性阐明使用荧光底物4-甲基伞形酮磷酸(MeUMB-磷酸，其结构也被阐述)的本发明的示例性肌醇六磷酸酶测定：(i)72℃、pH4.5下；并且在80℃、生理pH下(pH7.4)，肌醇六磷酸酶被加热激发20分钟；和(ii)在37℃、pH4.5下，检测残留活性：
·在高和低pH都测量残留活性，
·在热处理后，计算相对于野生型的残留活性。
图8示意性阐明了也使用荧光底物MeUMB-磷酸的另一个本发明的示例性肌醇六磷酸酶测定：(i)86℃、pH5.5下，肌醇六磷酸酶被加热激发30分钟；和(ii)在37℃、pH4.5下，检测残留活性：
·测量相对于6×变体对照的残留活性，
·选择命中数(hits)，并在更高的严格性下重新测定以选择顶变体(topvariants)。
该测定被用于筛选(SEQIDNO：1的)GSSM变体文库，这通过测定它们编码的多肽的肌醇六磷酸酶活性而进行。图9示意性阐明用于此文库筛选(如在图8中描述的)的方案，其中筛选的文库大小为24,576个变体。
实施例2：具有提高的耐热性和提高的胃不稳定性的肌醇六磷酸酶的建立。
本实施例描述了本发明多肽的肌醇六磷酸酶活性的建立和表征，其是亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2的进一步序列修饰(“进化的”肌醇六磷酸酶)。在此所述的进化的肌醇六磷酸酶已被优化以进行植物表达和大面积商业化(broad-acreagecommercialization)。肌醇六磷酸酶相对于亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2，由SEQIDNO：1编码)具有更好或同等的耐热性和下降的体外胃稳定性(提高的胃不稳定性)。
模板选择：
所选的GSSM骨架具有耐热性和SGF降解的迹象。评价以测试13种耐热性肌醇六磷酸酶分子的SGF性质开始(如以上实施例1和下表3所述)。关于纯化的肌醇六磷酸酶的SGF数据显示，所有耐热性变体——包括单位点耐热性亲本肌醇六磷酸酶突变N159V(SEQIDNO：2-N159V)，都是非常稳定的，经过2小时显示出最小的降解。
前述工作/文献表明，大肠杆菌肌醇六磷酸酶appA基因(来自菌株K12(GenBank登录号M58708))对SGF降解比亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)更敏感。在理解SGF稳定性现象的工作中，研究了appA与亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)之间的中间变体其中5个的SGF不稳定性。数据表明，耐热性与SGF不稳定性的强关联性(图11A和11B)。更重要地，appA-7X是不同于亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的一种氨基酸，培育10分钟后相对于亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)显示出～10％以上的SGF活性损失。此新数据表明，SEQIDNO：2中一个单独的突变可对SGF耐受性的改变产生影响，并且更重要地，在SGF分析中区别于亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)。基于此新证据，appA-7X被选作SGF进化的基准对照，SEQIDNO：2被选作进化的GSSM骨架。
由于蛋白质纯化将是表征过程的完整部分，因此以his-标签(SEQIDNO：2-HIS)和非-his标签(SEQIDNO：2)分子对SEQIDNO：2进行评价。对亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的纯化的his-标签和非his-标签版本进行SGF分析。以两种不同的胃蛋白酶剂量(0.15mg/mL和0.75mg/mL)进行SGF分析。在不同的时间点(7.5、15、30、60、90和120分钟)测定剩余活性。两种版本间没有SGF特征的显著差异
(图12)。
[本页剩余故意留空白]
测试纯化的肌醇六磷酸酶部分SEQIDNO：2和变体SEQIDNO：2-N159V至SEQIDNO：2-6x在胃蛋白酶剂量0.75mg/mL和0.15mg/mL下的SGF稳定性；数据未显示。测定不同时间点(7.5、15、30、60、90和120分钟)的剩余活性。在两种剂量下，没有观察到变体肌醇六磷酸酶之间SGF稳定性的显著差异。两种剂量下SEQIDNO：2在SGF中最不稳定。
通过SDS-PAGE分析的SGF测定：SDS-PAGE(数据未显示)测试表3所列全部变体的SGF稳定性。用SimplyBlueTMSafeStain将SDS-PAGE凝胶染色。在SGF分析中，SEQIDNO：2经过60分钟变性，此时SEQIDNO：2-N159V和其他变体经过两小时时间未显示显著的降解。
N-糖基化的去除：
前述研究表明，N-糖基化可提高SGF稳定性。因此，为降低SFG稳定性，进行饱和定向诱变(SDM)以去除亲本SEQIDNO：2分子上的两个N-糖基化位点。可通过将161的天冬酰胺(N)或163的苏氨酸(T)变为任意其他氨基酸，去除第一N-糖基化识别位点。可通过由相同方法改变339的N或341的T，去除第二N-糖基化识别位点。
通过以所需的密码子变化构建引物，然后利用具有引物和模板(亲本序列)的PCR生成具有所需密码子变化的新模板进行SDM。在SDM的过程中，在负责N-糖基化识别的四个残基：位点161、163、339和341中的每一个上对全部其他19种可能的氨基酸进行取代。然后将与SEQIDNO：2在四个位点显示最相似特性(比活性、耐热性和pH特性)的突变组合，以生成不具有任何N-糖基化识别位点的变体。保持亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)特性的4个靠前突变是N161K、T163R、N339E和T341D。以将去除相同分子上的两个N-糖基化识别位点的形式组合这些突变(表4)。
名称 突变
变体GLY1 N161K和N339E
变体GLY2 N161K和T341D
变体GLY3 T163R和N339E
变体GLY4 T163R和T341D
表4.去N-糖基化变体
构建4种去糖基化变体(glycosylationminusvariant)，将其在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达并进行表征。通过在80℃下热处理10分钟时间测定SEQIDNO：2去糖基化变体(变体GLY1-GLY4)和两个SEQIDNO：2对照的耐热性(半衰期)。毕赤酵母(Pichia)表达的SEQIDNO：2和去N-糖基化变体(变体GLY1-GLY4)具有近似相同的耐热性。但是，SEQIDNO：2(巴斯德毕赤酵母中表达)比大肠杆菌中表达的相同基因(SEQIDNO：2-HIS)具有更高的耐热性。主要的去糖基化变体——变体GLY3，与SEQIDNO：2具有相同的耐热性、pH特性和比活性(图13)。耐热性的数据是个惊奇，是一个假设，由前述工作表明糖基化提高耐热性，因此预期去糖基化变体将降低耐热性。如预期，表达SEQIDNO：2的大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母之间在耐热性上具有显著差异。但是，如果糖基化不是因素，耐热性差异或许可归因于两种表达宿主不同的蛋白质折叠环境；毕赤酵母胞内蛋白质折叠，大肠杆菌周质蛋白质折叠。
在计划后期将T163R和N339E突变整合到SGF最不稳定的变体中(参见下文TMCASM进化)。
在37℃下于pH2、2.5、3、4、5和6对肌醇六磷酸测定去糖基化变体(变体GLY1-GLY4)和纯化的毕赤酵母表达的SEQIDNO：2的肌醇六磷酸酶活性和pH特性。数据(未显示)表明，去糖基化变体与SEQIDNO：2具有相似的活性和pH特性。
SEQIDNO：2SGFGSSM SM 筛选
将SEQIDNO：2-HIS选作GSSM模板。进行GSSMSM(GeneSiteSaturationMutagenesisSM)进化(参见，例如美国专利号6,171,820)。
高通量分析建立：
使SEQIDNO：2和SEQIDNO：2-6X的培养物在384孔微孔板中生长，在自动控制分析形式下检测SGF稳定性。在65℃下将板热处理30分钟以溶解细胞。然后将培养物分成未处理对照板和SGF处理板。将SGF处理的样本的活性与未处理的对照样本进行比较。时间点取10、20、30和40分钟(图14)。得自自动分析的亲本肌醇六磷酸酶(全细胞溶胞产物)的SGF特性反映出纯化的实验室规模(benchscale)的SGF分析。
高通量分析结果
整个亲本序列(SEQIDNO：2，除起始密码子外)——432个密码子，进行突变，表达(在大肠杆菌中，如下文所述)，并利用已建立的肌醇六磷酸酶SGF高通量分析来筛选SGF降解的提高。在69个不同的残基位置上确定132种新突变的SGF不稳定性(表5)。至少8个单位点突变符合10分钟内蛋白质完全降解的SGF要求。但是，这些突变体中多数达不到亲本肌醇六磷酸酶的耐热性，降低4℃或以上。只有一种突变体——Q247H，具有等同于亲本肌醇六磷酸酶或比亲本肌醇六磷酸酶略高的耐热性，并且10分钟内在SGF中完全降解。
经过20分钟时间研究(图15)在二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)、50mM醋酸钠、pH5.5，0.75mg/mL胃蛋白酶中测定由GSSM筛选选择的突变体的SGF活性损失。这些SGF突变的表征显示，完全降解率落入三类，快速(2分钟以内)、中速(～10-15分钟)和慢速(≥20分钟)；慢速SGF突变体仅显示比亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)略微提高。数据表明，活性分析是测定肌醇六磷酸酶衰减较灵敏的方法；20％剩余活性的肌醇六磷酸酶带在SDS-Page凝胶上不可检测(数据未显示)。
通过两种方法测试SGF突变体的耐热性a)65℃30分钟热处理和b)30分钟50-70℃梯度。耐热性数据表明，除变体I427T和变体Q247H外多数SGF突变损失≥4℃。为迅速克服耐热性不足，建立快捷途径策略；多种极具希望的SGF突变被整合到更具耐热性的肌醇六磷酸酶骨架(由上文实施例1)，以测试是否可重获耐热性(在快捷途径策略标题下深入讨论)。
对所有突变进行比较，并通过FitnessValueFT(耐热性％-SGF％＝FT)排列靠前的48种(表6)。考虑靠前的单位点突变在定制多位点组合装配SM(TMCASM)阶段中组合(见下文)。
基于该数据，当亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)分子发生改变时存在某些氨基酸置换和残基位点，其相对于其他氨基酸置换和残基位点更有利于SGF不稳定性提高(图16)。在图16中，氨基酸标志下方的数字表示该分子在原蛋白质中出现多少次。例如，残基位置48——苏氨酸，可变成9种其他氨基酸(FYWMHKVIL)。最常提高SGF不稳定性的3种氨基酸添加是亮氨酸(14次)、脯氨酸(12次)和组氨酸(12次)。进一步例如，原蛋白质(在SEQIDNO：2中22次)中的精氨酸从未被另一种氨基酸取代，在此观察到随之而来的SFG不稳定性提高。但是，当原蛋白质中精氨酸被置换为另一种氨基酸时(7次)，在每个情况中，SGF不稳定性提高。SGFGSSM数据表明，SGF突变的热点存在于肌醇六磷酸酶分子中(图17)。最大的突变序列，一行七个，存在于残基145-151之间。还有三组，其中一行三个残基可进行突变。多种氨基酸残基与有利于SGF不稳定性的氨基酸置换混杂，最极端的是T48，其被9种不同的氨基酸(F、Y、W、M、H、K、V、I和L)替代。对于位置48和79，H是最佳突变，并被选作TMCA库的候选体。
[本页剩余故意留空白]
变体 突变 变体 突变 变体 突变 变体 突变
1 P 100 A 34 Q 137 F 67 F 194 L 100 P 149 N
2 P 149 L 35 L 157 C 68 H 272 W 101 Y 79 H
3 I 427 T 36 L 150 Y 69 V 191 A 102 Q 86 H
4 T 291 W 37 V 162 T 70 S 218 Y 103 Q 275 H
5 T 291 V 38 I 174 P 71 P 217 S 104 A 274 I
6 L 126 R 39 G 353 C 72 P 217 D 105 A 274 T
7 P 254 S 40 L 150 T 73 P 217 G 106 Y 79 S
8 L 192 F 41 S 102 A 74 S 102 Y 107 H 263 P
9 Q 377 R 42 I 174 F 75 S 218 I 108 A 274 V
10 V 422 M 43 G 171 S 76 A 232 P 109 A 274 L
11 L 157 P 44 N 148 M 77 W 265 L 110 A 274 F
12 I 107 H 45 Q 137 V 78 N 266 P 111 S 389 V
13 I 108 R 46 P 145 L 79 L 167 S 112 G 395 T
14 Q 309 P 47 I 108 Y 80 L 216 T 113 G 395 Q
15 I 108 A 48 E 113 P 81 P 217 L 114 G 395 L
16 I 108 S 49 F 147 Y 82 L 244 S 115 G 395 I
17 I 107 P 50 S 173 H 83 P 269 L 116 G 395 E
18 C 155 Y 51 T 163 P 84 T 48 F 117 S 389 H
19 I 108 Q 52 N 148 R 85 T 48 W 118 I 427 G
20 A 236 T 53 S 173 V 86 T 48 M 119 I 427 S
21 S 208 P 54 A 248 L 87 T 48 H 120 A 429 P
22 A 109 V 55 A 248 T 88 T 48 K 121 P 343 E
23 G 171 M 56 Q 247 H 89 T 48 Y 122 P 343 V
24 S 173 G 57 A 236 H 90 T 48 V 123 P 343 R
25 V 162 L 58 L 269 I 91 M 51 A 124 P 343 L
26 D 139 Y 59 S 197 G 92 M 51 L 125 P 343 V
27 L 146 R 60 L 235 I 93 T 48 I 126 N 348 K
28 Q 137 Y 61 S 211 H 94 M 51 G 127 P 343 I
29 Q 137 L 62 T 282 H 95 T 48 L 128 N 348 W
30 L 146 T 63 Q 246 W 96 L 50 W 129 P 343 N
31 K 151 P 64 G 257 R 97 G 67 A 130 L 379 V
32 N 148 K 65 L 269 T 98 Y 79 W 131 Q 381 S
33 K 151 H 66 G 257 A 99 Y 79 N 132 L 379 S
表5.GSSM筛选中发现的SGF降解提高的命中(hit)的变体名称和突变。
多数GSSM变体符合SGF要求(10MinSGF存活后快速降解＜10％)，但耐热性特性不足(65℃30min热处理后＜75％存活)。中速和慢速降解突变体符合耐热性要求，但不符合SGF要求。由GSSM筛选，仅变体56(Q247H)符合SGF性质和耐热性。
表6.排列靠前的SGF突变体。对全部132种突变体进行并排比较，以从SGF筛选确定最佳突变体。将靠前的49种SGF突变体排列并于六个单独的对照(亲本肌醇六磷酸酶-SEQIDNO：2)进行比较。就其耐热性特性(％存活率，65℃HT％)和SGF不稳定性(SGF存活率-SGF％)排列变体。建立任何适应值(FV)＝(65℃HT％)-(SGF％)，具有较高FV的变体，以橙色高亮，被考虑利用TMCA技术用于进一步进化。
前三种突变中的两种(Q246W和Q247H)显示出与亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)类似的耐热性特性和SGF不稳定性的显著提高。利用3-D建模，观察到W246预期被掩藏在蛋白质表面下，以使蛋白质必须适于更大的色氨酸侧链，其中谷氨酰胺侧链周围是紧密堆积的环境。同样，蛋白质必须适于Q246侧链的ε氧与G255的主链氮之间失去氢键，如色氨酸残基中没有侧链氧。结构分析也表明，当H247的主链被掩藏时，咪唑侧链将通至表面。虽然谷氨酰胺至组氨酸是相对保守的改变，但其在可用于在较低pH下发生质子化的该区域中产生了新的可到达表面的基团，该pH将显著改变局部氢键网络，潜在地充当酸性开关，用于干扰该区域的局部蛋白质结构，使蛋白质对酸和胃蛋白酶降解更加敏感。
快捷途径策略(FastTrackStrategy)
为克服在主要SGF不稳定性变体(除Q247H外)中损失的耐热性特性，启动快捷途径策略以设计具有所需特性：SGF和耐热性的肌醇六磷酸酶分子。将较早进化工作(参见上文实施例1)的耐热性肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2-N159V、SEQIDNO：2-6X和SEQIDNO：2-9X)选作骨架以进行两轮位点定向诱变(SDM)。
第一轮SDM使各单个SGF突变(T291V、A236T或L157P)整合到下表(表7)中所示的三种耐热性骨架的每一种中。
表7.SDM第I轮变体
第一轮SDM的数据表明，由骨架SEQIDNO：2-N159V制得的变体的SGF不稳定性得到提高。但是，那些SGF突变也使耐热性降低至目标以下。其他两种耐热性骨架(SEQIDNO：2-6X和SEQIDNO：2-9X)的变体仅显示SGF降解最低限度的改善。同样观察到，向SEQIDNO：2-N159V骨架增加更多SGF突变使耐热性降低至耐热性目标以下。
向其他两种耐热性变体附加更多SGF突变的第二轮SDM通过将高达两种SGF突变(T291V和/或L192F)整合到具有或不具有A236T突变的SEQIDNO：2-6X和SEQIDNO：2-9X中而进行(参见下表8)。
表8.SDM第II轮变体
该SDM的结果生成变体、变体O，其耐热性比亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)略好，并且10分钟以内在SGF中完全降解。例如，在T-0和T-10(min)的时间点，应用不同的SGF胃蛋白酶剂量(0.3、0.2、0.1、0.05、0.025和0mg/mL胃蛋白酶)，以SimplyBlueTMSafeStain染色的SDS-PAGE凝胶显示，变体O在0.3mg/mL和0.2mg/mL胃蛋白酶下10分钟内完全降解。在SDS-PAGE凝胶上再运行20分钟SGF时间(在0.3mg/mL胃蛋白酶下)，显示SEQIDNO：2-HIS在20分钟后未降解，而变体O在约7.5分钟时完全降解。
变体O和SEQIDNO：2-HIS的SGF稳定性在以下不同的胃蛋白酶剂量下测定：0.3、02、0.1、0.05、0.025和0.0mg/mL胃蛋白酶(图18)。在图18中，用于SEQIDNO：2-HIS的0.3mg/mL胃蛋白酶剂量被作为基准作图。剂量反应实验表明，完全降解需要胃蛋白酶，并且其不仅仅起酸处理的作用(图18)。
变体O和SEQIDNO：2-HIS的半衰期在75℃下测定(图19)。纯化的亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2-HIS)和肌醇六磷酸酶变体——变体O在两种不同的缓冲液(100mM柠檬酸盐pH5.5和100mMTrispH7.2)中经75℃下的热处理高达45分钟(T-0、5、10、15、20、30、45min)。分析10微升热处理样本在100μL100μMDiFMUP、50mMCitratepH5.5中的活性。将该活性与T-0活性进行比较。变体O符合SGF和耐热性要求，但比活性低于预期(图19)。预测比活性损失，因为较早进化工作(实施例1)得出的在前认知表明SEQIDNO：2-6X骨架仅具有2/3的亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的比活性。
最大化TMCA策略和克服变体O的缺陷的方法是，利用亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2-HIS)作为模板混合保持比活性的耐热性突变与SGF突变。
TMCA SM 进化
改良高通量分析以包括热处理步骤，从而选择具有所需耐热性和SGF特性的变体。利用定制多位点组合装配(TMCA)技术(参见PCT公开号WO09/018449)创建两个文库。TMCA进化包括生成多种在多个位点具有多个突变的不同组合的子代多核苷酸的方法。该方法可部分通过组合至少一个或多个以下步骤进行：
获得(“第一”或“模板”)多核苷酸的序列信息。例如，第一序列或模板序列可以是野生型(例如，SEQIDNO：2-N159V)或突变(例如，下文所述的“D164R模板”)序列。序列信息可是关于完整的多核苷酸(例如，基因或开放阅读框)的或关于目标部分区域的，如编码结合、结合特异性、催化或底物特异性位点的序列。
沿第一多核苷酸序列或模板多核苷酸序列确定三个或更多个目标突变。例如，突变可以在第一序列或模板序列的3、4、5、6、8、10、12、20个或更多个位置上。该位置可通过绝对位置或周围残基或同源性的前后关系而预先确定。对于肌醇六磷酸酶多肽的TMCA，造成酶性能提高的靠前的SGF和耐热性氨基酸变化被囊括为目标突变。可知任一侧突变位置侧翼的序列。各突变位置可包含两个或更多个突变，如对于不同的氨基酸。这种突变可通过利用基因位点饱和诱变SM(GSSMSM)技术来鉴定，如本文及美国专利号6,171,820；6,562,594和6,764,835所述。
提供包含目标突变的引物(例如，合成寡核苷酸)。在一个实施方式中，为各目标突变提供引物。因此，具有3种目标突变的第一或模板多核苷酸可在该位置上利用3种引物。引物也可被以引物库提供，该引物库的引物包含简并位以使目标突变是任意核苷酸或天然存在氨基酸的范围或该范围的子组。例如，可提供有利于脂肪族氨基酸残基突变的引物库。
引物可被制成正向引物或反向引物，或引物可被制成至少一种正向引物和至少一种反向引物。当突变的位置紧密在一起时，可方便地使用包含一个以上位置上的突变或在多个位置上的不同突变组合的引物。
提供包含模板序列的多核苷酸。第一或模板多核苷酸可以是环状的或可以是超螺旋的，如用于克隆、测序或表达的质粒或载体。多核苷酸可以是单链的(“ssDNA”)或可以是双链的(“dsDNA”)。例如，TCMA法使超螺旋的(“sc”)dsDNA模板经过95℃的加热步骤1min(参见Levy，NucleicAcidRes.，28(12)：e57(i-vii)(2000))。
添加引物至反应混合物中的模板多核苷酸。在允许引物与模板多核苷酸退火的条件下混合引物和模板多核苷酸。在TMCA方案的一个实施方式中，添加引物至单反应混合物中的多核苷酸，但可以添加至多反应中。
进行聚合酶延伸反应。可通过常规方法扩增延伸产物(例如，作为“子代”或“修饰的延伸多核苷酸”)。可分析产物的长度、序列、预期核酸特性或，或将产物表达为多肽。其他分析方法包括原位杂交、序列筛选或表达筛选。分析可包括预期特性的一轮或多轮筛选和选择。
也可将产物转化入细胞或其他表达系统如无细胞系统中。无细胞系统可包含与DNA复制、修复、重组、转录或翻译有关的酶。示例性宿主包括细菌、酵母、植物和动物细胞及细胞系，并且包括大肠杆菌、荧光假单胞菌、巴斯德毕赤酵母和黑曲霉。例如，大肠杆菌的XL1-蓝或Stb12菌株可被用作宿主。
本发明的方法可在不同反应条件下以相同或不同引物应用，从而促使产物具有不同组合或数量的突变。
通过进行上述示例性方法，本方案还提供由本TMCA进化法生成的一种或多种多核苷酸，然后可根据预期的特性筛选或选择该一种或多种多核苷酸。可将子代多核苷酸中的一种或多种表达成多肽，并且任选地筛选或选择预期特性。因此，该TMCA进化方案的实施方式提供多核苷酸和编码的多肽以及编码这种多肽的这种多核苷酸的文库。该TMCA进化方案的实施方式进一步通过如下提供筛选文库：筛选或选择文库以获得编码一种或多种具有预期活性的多肽的一种或多种多核苷酸。
PCT公开号WO2009/018449述及的TMCA进化方案的另一个实施方式包括生成多种修饰的多核苷酸的方法。该方法一般包括(a)向单反应混合物中的双链模板多核苷酸添加至少三种引物，其中该至少三种引物不重叠，并且其中该至少三种引物中的每一种包含至少一个不同于其他引物的突变，其中至少一种引物是可与模板负链退火的正向引物，并且至少一种引物是可与模板正链退火的反向引物；和(b)使反应混合物经过聚合酶延伸反应，由至少三种引物生成多种延伸的修饰多核苷酸。
PCT公开号WO2009/018449所述的TMCA进化方案的另一个实施方式包括如下方法：其中用多种还未经连接酶处理的延伸产物转化细胞。在本发明的另一个实施方式中，从细胞回收该多种延伸修饰多核苷酸。在另一个实施方式中，分析所回收的多种延伸修饰多核苷酸，例如，通过表达该多种延伸修饰多核苷酸中的至少一种并分析由其表达的多肽。在另一个实施方式中，选择包含目标突变的多种延伸修饰多核苷酸。
在TMCA进化方案的另一个实施方式中，获得关于模板多核苷酸的序列信息，并且可鉴定沿模板多核苷酸的三种或更多种目标突变。在另一个实施方式中，可在将多种延伸修饰产物转化至细胞中前分析通过聚合酶延伸获得的产物。
在TMCA进化方案的一个实施方式中，用酶——例如，限制性内切酶，如DpnI限制性内切酶——处理通过聚合酶延伸获得的产物，从而破坏模板多核苷酸序列。可将经处理的产物转化至细胞例如大肠杆菌细胞中。
在TMCA进化方案的一个实施方式中，可使用至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少六种、或至少七种、或至少八种、或至少九种、或至少十种、或至少十一种、或至少十二种、或更多种引物。在一个实施方式中，各引物包含单点突变。在另一个实施方式中，两种正向或两种反向引物包含模板多核苷酸上相同位置的不同改变。在另一个实施方式中，至少一种引物包含模板多核苷酸上不同位置的至少两种改变。还有另一个实施方式中，至少一种引物包含不同位置的至少两种改变，以及至少两种正向或两种反向引物包含模板多核苷酸上相同位置的不同改变。
在TMCA进化方案的一个实施方式中，将正向引物分组为正向组，将反向引物分组为反向组，并将正向组中的引物和反向组中的引物彼此独立地标准化为相应组的均等浓度，而不考虑在模板多核苷酸上的位置，且其中在标准化后，将等量的正向和反向引物加入反应。在该标准化方法中，一些位置的组合可存在偏差。该偏差可源于例如，一个包含单引物的位置与包含多引物的位置相比相对低的引物浓度。“位置偏差”指造成如下多核苷酸：其显示相对于正向或反向引物组中的其他位置在单个位置处结合引物的强优先性。其造成可在单个引物位置具有高百分比突变但在其正向或反向引物组的另一个位置具有低百分比突变的修饰多核苷酸的组合。当TMCA的目标是生成包括所有可能的模板改变组合的子代多核苷酸时，该偏差是不利的。该偏差可通过如下校正：例如，通过将引物标准化为在各个位置相等的库。
在TMCA进化方案的一个实施方式中，引物标准化通过如下进行：取决于其在模板多核苷酸上的位置，将引物分为多个组，其中覆盖相同的模板选择区的引物为一组；将分组的引物标准化，各组中具有相等浓度；将一组中的正向引物集中为正向组，并且将各正向引物组间的浓度标准化为相等浓度；将一组中的反向引物集中为反向组，并且将各反向引物组间的浓度标准化为相等浓度；和将等量的集中的正向和反向引物加入反应中。未观察到位置组合的偏差。
在TMCA进化方案的一个实施方式中，提供各自包含简并位置的简并引物组，其中目标突变是简并位置处不同核苷酸的范围。在另一个实施方式中，提供简并引物组，其包含相应于至少一个模板多核苷酸密码子的至少一个简并密码子和与模板多核苷酸序列密码子的相邻序列同源的至少一个相邻序列。在另一个实施方式中，简并密码子是N，N，N，并且编码20种天然存在氨基酸中的任一种。在另一个实施方式中，简并密码子编码少于20种天然存在的氨基酸。
PCT公开号WO2009/018449所述TMCA进化方案的另一个实施方式包括生成多种包含目标突变的修饰多核苷酸的方法。该方法一般包括(a)向单反应混合物中的双链模板多核苷酸添加至少两种引物，其中该至少两种引物不重叠，并且其中该至少两种引物各自包含不同于其他引物(一种或多种)的至少一个突变，其中至少一种引物是可与模板负链退火的正向引物，并且至少一种引物是可与模板正链退火的反向引物；(b)使反应混合物经过聚合酶延伸反应，从而由该至少两种引物生成多种延伸的修饰多核苷酸；(c)用酶处理该多种延伸的修饰多核苷酸，从而破坏模板多核苷酸；(d)将经处理的延伸修饰多核苷酸转化至细胞中，该延伸修饰多核苷酸还未经连接酶处理；(e)从细胞回收该多种延伸的修饰多核苷酸；和(f)选择包含目标突变的多种延伸修饰多核苷酸。
利用TMCA技术，建立小文库——文库A——以快速周转(turnaround)和简化过程(包含多达5种SGF突变和2种耐热性突变的96种不同变体，参见表9)。文库A使用单个模板，SEQIDNO：2-N159V，和下表10中所列的寡核苷酸。还利用TMCA技术建立第二种更广泛的文库——文库B，从而增大生成具有所需SGF特性的非常耐热的变体(包含多达7种SGF突变和5种耐热性突变的4096种不同变体，参见表9)的可能性。文库B使用两个模板，SEQIDNO：2-N159V和“D164R模板”，在两个独立的TMCA反应中各自利用表11所列的寡核苷酸，生成两个子文库。“D164R模板”在文库A中生成，并由并入D164R突变的SEQIDNO：2-N159V骨架组成。将两个文库均扩增至pQE60载体(Qiagen，Valencia，CA)中，然后转化至宿主PHY635(下述)中，从而确定初级和次级肌醇六磷酸酶活性。
通过筛选文库，发现共8种有希望的耐热性SGF不稳定命中(hit)。在小文库中发现5种耐热性(Tm比亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2高～5℃，表13)SGF不稳定变体(变体AA-EE，表12)。较大的TMCA文库产生10种候选体，但是，仅3种的耐热性比变体AA-EE大(变体FF-HH，表13，具有比亲本肌醇六磷酸酶SEQIDNO：2高～7.5℃的Tm)。对于表征筛选，将这些具有最佳单位点SGF突变的变体(变体56)——糖基化和去糖基化样本，全部在巴斯德毕赤酵母中表达(由N-糖基化消除研究，去糖基化样本包含两个突变，T163R和N339E，见上文)。
测定SGF处理过程中SGF不稳定肌醇六磷酸酶变体的剩余活性(图20)。用SGF(pH1.2)和胃蛋白酶(10U/μg肌醇六磷酸酶)处理纯化的亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)、变体56和变体AA-HH10.0分钟时间。通过对DiFMUP的活性测定肌醇六磷酸酶稳定性。将SGF不稳定肌醇六磷酸酶变体的比活性与SEQIDNO：2肌醇六磷酸酶进行比较(图21)。测试纯化的亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)和主要的肌醇六磷酸酶变体对肌醇六磷酸的活性。在37℃下，4mM肌醇六磷酸、100mM醋酸钠pH4.5中分析纯化的蛋白质。糖基化和去糖基化的毕赤酵母表达的主要变体之间的SGF特性和耐热性没有任何显著改变(图20和21)。之前的工作预测，糖基化变体将具有较高的耐热性，并对SGF具有更高的耐受性；我们的数据另外表明。
同样，在37℃、pH2、2.5、3、4、5和6下生成糖基化、去糖基化变体和亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)对肌醇六磷酸的肌醇六磷酸酶活性的pH特性。所分析的所有肌醇六磷酸酶均具有非常相似的pH特性(数据未显示)。
表9.TMCA进化选用的突变。利用TMCA技术、用SEQIDNO：2-N159V作为骨架混合耐热性突变和SGF突变。
表10.文库A所用的寡核苷酸。
表11.文库B所用的寡核苷酸。
表12.主要SGF不稳定耐热性肌醇六磷酸酶变体的序列。
变体AA是SEQIDNO：28(由SEQIDNO：27编码)，变体BB是SEQIDNO：32(由SEQIDNO：31编码)，变体CC是SEQIDNO：34(由SEQIDNO：33编码)，变体DD是SEQIDNO：36(由SEQIDNO：35编码)，变体EE是SEQIDNO：38(由SEQIDNO：37编码)，变体FF是SEQIDNO：24(由SEQIDNO：23编码)，变体GG是SEQIDNO：26(由SEQIDNO：25编码)，变体HH是SEQIDNO：40(由SEQIDNO：39编码)，和变体56是SEQIDNO：30(由SEQIDNO：29编码)。但是，注意SEQIDNO：23、25、27、29、31、33、35、37和39不包括编码天然信号序列的核酸，且SEQIDNO：24、26、28、30、32、34、36、38和40不包括天然信号序列氨基酸(SEQIDNO：2的氨基酸1-22)。在各参考序列中添加起始蛋氨酸(ATG)。如同天然信号序列存在般计数这些变体(例如，表12所列)点突变的位置。
表13.SEQIDNO：2和主要SGF候选体的解链温度(Tm)。将纯化的亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)和9种主要的SGF肌醇六磷酸酶候选体在巴斯德毕赤酵母中表达，纯化，在100mM柠檬酸盐pH5.5中透析，并利用AppliedThermodynamicsN-DSCII检测Tm。
选择前四种变体用于动物研究。
9个时间点(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和10分钟)的SGFSDS-PAGE分析，在每μg肌醇六磷酸酶10U的胃蛋白酶剂量下，基于此表征数据(未显示)选择四种变体用于动物实验所用的大规模发酵。所选的四种主要变体显示5分钟内蛋白质完全降解。
所选的主要变体：
变体56(SEQIDNO：30，由SEQIDNO：29编码)是最接近原亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)分子的变体，具有一个SGF突变和两个去糖基化突变。
变体AA(SEQIDNO：28，由SEQIDNO：27编码)具有两个SGF突变、两个耐热性突变和两个去糖基化突变。
变体FF(SEQIDNO：24，由SEQIDNO：23编码)具有三个SGF突变、四个耐热性突变和两个去糖基化突变。
变体GG(SEQIDNO：26，由SEQIDNO：25编码)具有三个SGF突变、五个耐热性突变、两个去糖基化突变。
主要候选体的发酵：
选择主要候选体(变体56、变体AA、变体FF和变体GG)用于动物实验，并扩大规模为30L发酵，以生成至少5g各种蛋白质。基于活性和Bradford蛋白质分析，各种变体生成≥16g蛋白质。将回收的样本冻干，然后进行再悬浮和热处理，以杀死潜在的微生物生长，然后再次冻干。将这些样本(表14)用于动物实验。连同这四种所选变体，将其他SGF不稳定变体(表12)的小样本(15-50mg)用于实验室规模的评价。
表14.用于动物实验和用于实验室规模评价的样本说明。通过活性和Bradford蛋白质分析定量冻干产物。
方法
生长、诱导和纯化
大肠杆菌肌醇六磷酸酶的表达(2L规模)
除糖基化研究中的肌醇六磷酸酶变体外，将所有肌醇六磷酸酶变体在大肠杆菌；菌株PHY635(phy-菌株；通过如下生成：通过制备大肠杆菌菌株CU1867(ATCC47092；appA缺陷型)RecA——通过P1噬菌体转导)中表达。使肌醇六磷酸酶变体的起始培养物在5mLLBcarb100中于37℃生长～18hrs。用过夜的起始培养物接种2L的LBcarb100，当培养物达到～OD6000.5时，用1mMIPTG诱导该培养物。诱导24hrs后，通过离心(SorvallRC5CPlusCentrifuge；SLC-4000rotor，7000RPM；9220RCF)20分钟粒化培养物来收集培养物。将细胞再悬浮于50mMTrispH8.0，并利用微流化器(MicrofluidicsModel11OL)进行溶解。为去除细胞碎片，将全细胞溶胞产物离心(SorvallRC5CPlus；F13S-14X50Rotor，12500RPM；25642RCF)30分钟。澄清的溶胞产物无菌过滤，并将肌醇六磷酸酶蛋白质通过AKTAFPLC上的HisTrapFF5mL柱纯化。用2MImmidizole、50mMTrispH8.0梯度洗脱肌醇六磷酸酶。测试馏分对100uMDiFMUP、100mM醋酸钠(pH5.5)的活性，并进行蛋白质纯度的SDS-凝胶分析。
巴斯德毕赤酵母肌醇六磷酸酶的表达(1L规模)
将最终的主要肌醇六磷酸酶变体(变体AA-HH和变体56的加糖基化和去糖基化样本)连同SEQIDNO：2的去糖基化样本(变体GLY1-GLY4)的表征在巴斯德毕赤酵母(X-33)中表达。使肌醇六磷酸酶变体的起始培养物在10mLBMGYzeo100中30℃下生长～18hrs(～OD60015-20)，将细胞粒化并再悬浮于具有0.5％MeOH的10mLMES*培养基。将1L的具有0.5％MeOH的MES*培养基用起始培养物接种，并在30℃下温育3-4天(每24hrs添加5mLMeOH，用于蛋白质诱导)。将分泌的蛋白质通过离心(SorvallRC5CPlusCentrifuge；SLC-4000转子，7000RPM；9220RCF)从细胞质分离，浓缩并利用MiniKros切向流分离模块(TangentialFlowSeparationModule)(SpectrumLabsM215-600-01P)进行缓冲交换(100mM醋酸钠，pH5.5)。为提高纯度，使样本经过AKTAFPLC上的HiTrapTMQFF5mL柱。用1MNaCl、100mM醋酸钠pH5.5梯度洗脱肌醇六磷酸酶。测试馏分对100uMDiFMUP、100mM醋酸钠(pH5.5)的活性，并进行蛋白质纯度的SDS-凝胶分析。
肌醇六磷酸酶表征
蛋白质耐热性
差示扫描量热法(DSC)-通过利用AppliedThermodynamicsN-DSCII测定毕赤酵母表达的肌醇六磷酸酶变体的蛋白质解链温度(Tm)。将蛋白质样本(～1.0mg/mL)在100mM柠檬酸盐pH5.5中进行透析，加载于检测室(600uL)中，并与对照样本(600ul100mM柠檬酸盐pH5.5)进行比较，扫描60至100℃，并返回60℃(从而评价蛋白质再折叠)。
改变的Tm的确定-在初步表征过程中建立快速耐热性工具以评价全细胞溶胞产物和非纯化的蛋白质样本，从而比较SGF不稳定肌醇六磷酸酶与亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的耐热性。将蛋白质样本经过96孔PCR板上的行而排列(每孔20uL)，并在PCR机上经过梯度(60-80℃)进行热处理30分钟。将热处理的蛋白质样本(10uL)与荧光底物(190uL100uMDiFMUP、50mM醋酸钠pH5.5)混合，测量5分钟时间后的荧光变化(EX360nm/EM465nm)。将保留50％活性所在的温度与亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)性能(50％活性的温度)进行比较。
SGF分析(改变-缩小规模)
建立在不同时间点猝灭的多个微型反应，从而确定肌醇六磷酸酶分子的SGF不稳定性。作为对照T-0参考，同样与实际实验类似地运行预先猝灭的SGF反应。在50uLpH1.2SGF(2mg/mLNaCl、7uL/mL浓HCl)和胃蛋白酶(剂量0.15、0.30和0.75mg/mL)中37℃下温育10uL蛋白质样本一段时间。通过添加10uLpH10.0，200mM碳酸钠缓冲液(对T-0参考，该步骤在添加蛋白质样本前进行)使反应猝灭。
SGFSDS凝胶分析-移取20uL猝灭的SGF反应并与210uLSDS样本缓冲液混合，煮沸10分钟，且将15uL加载于Tris-GlySDSPage凝胶上。利用180V、250mA，穿过SDS样本运行缓冲液～1小时或直到完成。
SGF活性分析-移取10uL猝灭的SGF反应并与底物(190uL100uMDiFMUP、50mM醋酸钠pH5.5)混合，测量荧光变化(EX360nm/EM465nm)5分钟时间。
SGF分析(改编自TheUnitedStatesPharmacopeia24，2000.Simulatedgastricfluid，TS，InTheNationalFormulary19；BoardofTrustees，Eds.；UnitedStatesPharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，MD，p.2235)
在预热37℃950uLSGF(2mg/mLNaCl，用HCl滴定至pH1.2)中用10U胃蛋白酶/ug测试蛋白质(760ug/mLSGF)于37℃下温育50uL5mg/mL肌醇六磷酸酶10分钟时间。通过去除50uL反应和混合50uL终止溶液(200mM碳酸钠，pH10.0)取时间点。将时间点(终止样本)保持在冰中，直到分析完成，并备用于分析(符合在SGF分析(改变-缩小规模)下所述的SGFSDS凝胶分析和SGF活性分析)。
肌醇六磷酸酶的比活性分析
分析肌醇六磷酸酶样本(50uL)在预热37℃的用NaOH滴定至pH4.5的950uL4.0mM肌醇六磷酸、100mM醋酸中的相对活性。通过去除50uL反应和混合50uL颜色/终止溶液(20mM钼酸铵/5mM钒酸铵/10％硝酸溶液)使反应猝灭。10分钟后，在415nm下测定显色时间点，并将结果相对于时间作图。将反应速率与磷酸盐标准进行比较，从而确定相对速率。
通过计算基于蛋白质浓度的相对速率确定比活性。通过260nm/280nm分析(1AOD280关联于0.93mg/mL)测定蛋白质浓度。通过在SDS凝胶上加载相等的肌醇六磷酸酶活性和利用GelPro凝胶密度测定分析定量蛋白质带强度来进行次级比较，从而比较肌醇六磷酸酶主要变体和亲本肌醇六磷酸酶(SEQIDNO：2)的活性关系。
肌醇六磷酸酶pH特性分析
除用更宽泛的缓冲能力(pH2-6)修饰底物外，与上述比活性方案相同。底物：4mM肌醇六磷酸、80mM苹果酸、80mM甲酸和80mM醋酸钠，被滴定至不同的pH(2、2.5、3、4、5和6pH单位)。将各变体的相对速率与pH4的最佳活性进行比较。
材料：
SGF分析
来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(SigmaP-6887)
HCl(FisherUN1789)
氯化钠(FisherS-271-1)
6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(umbelliferylphosphate)(DiFMUP)(Invitrogen-D22068)
4-20％Tris-甘氨酸SDSPAGE凝胶(InvitrogenEC60255BOX)
NovexTris-甘氨酸SDS样本缓冲液(InvitrogenNovexLC2676)
NovexSDS运行缓冲液(InvitrogenLC2675)
SimplyBlueTMSafeStain(InvitrogenLC6065)
肌醇六磷酸酶的比活性分析
水稻的肌醇六磷酸十二钠(SigmaP-3168)
偏钒酸铵(AcrosOrganics194910500)
钼酸铵(σA-7302)
磷酸氢二钾(FisherP288-500)
70％硝酸(Sigma380091)
25％铵溶液(AtlasChemicalAA-3060)
蛋白质纯化
HisTrapTMFF5mLNi-琼脂糖柱(GEHealthcare17-5255-01)
HiTrapTMQFF5mL阴离子交换柱(GEHealthcare17-5156-01)
Immidizole(SigmaI-0125)
本文提供的多个实施方式已被描述。然而，要理解的是，可进行不脱离本文公开的宗旨和范围的多种改变。因此，其他实施方式在所附权利要求的范围内。

Claims (29)

1.分离的、合成的或重组的核酸，包括
(a)，(i)，核酸序列，编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并与SEQIDNO:1具有至少95％序列同一性，其中所述多肽包含表4、5、6、7、9中所列的至少一个突变或其任意组合；或
(ii)，多核苷酸，编码与SEQIDNO:2具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述多肽包含表4、5、6、7、9所列的至少一个突变或其任意组合；
(b)，(a)所述的核酸，其中所述至少一个突变是：A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79S或Y79W；或
(c)，(b)所述的核酸，其中所述多肽进一步包含以下中的至少一个突变：C226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163R或T349Y。
2.表达盒、载体、克隆运载体、表达载体或克隆载体，包含权利要求1所述的核酸。
3.分离的、合成的或重组的肌醇六磷酸酶多肽，包含
(a)，(i)，由权利要求1所述的核酸编码的氨基酸序列；或
(ii)，与SEQIDNO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含表4、5、6、7、9所列的至少一个突变或其任意组合；
(b)，(a)所述的多肽，其中所述至少一个突变是：A109V、A232P、A236H、A236T、A248L、A248T、A274F、A274I、A274L、A274T、A274V、A429P、C155Y、D139Y、E113P、F147Y、F194L、G171M、G171S、G257A、G257R、G353C、G395E、G395I、G395L、G395Q、G395T、G67A、H263P、H272W、I107H、I107P、I108A、I108Q、I108R、I108S、I108Y、I174F、I174P、I427G、I427S、I427T、K151H、K151P、L126R、L146R、L146T、L150T、L150Y、L157C、L157P、L167S、L192F、L216T、L235I、L244S、L269I、L269T、L296T、L379S、L379V、L50W、M51A、M51G、M51L、N148K、N148M、N148R、N161K、N266P、N339E、N348K、N348W、P100A、P145L、P149L、P149N、P217D、P217G、P217L、P217S、P254S、P269L、P343E、P343I、P343L、P343N、P343R、P343V、Q137F、Q137L、Q137V、Q137Y、Q246W、Q247H、Q275H、Q309P、Q377R、Q381S、Q86H、S102A、S102Y、S173G、S173H、S173V、S197G、S208P、S211H、S218I、S218Y、S389H、S389V、T163P、T282H、T291V、T291W、T341D、T48F、T48H、T48I、T48K、T48L、T48M、T48V、T48W、T48Y、V162L、V162T、V191A、V422M、W265L、Y79H、Y79N、Y79S或Y79W；或
(c)，(b)所述的多肽，其中所述多肽进一步包含如下中的至少一个突变：C226D、D164R、G179R、N159V、Q275V、T163R或T349Y。
4.蛋白制备物，包含权利要求3所述的多肽，其中所述蛋白制备物包括液体、固体、凝胶；或药物制剂、食品或饲料或它们的补充物。
5.权利要求4所述的蛋白制备物，其中所述液体、固体和凝胶为浆、粉末、喷雾剂、悬液、冻干组合物/制剂、凝胶锭、丸剂和植入物。
6.异源二聚体：(i)，包括权利要求3所述的多肽和第二结构域；或(ii)，(i)所述的异源二聚体，其中所述第二结构域是多肽并且所述异源二聚体是融合蛋白，和/或所述第二结构域是表位或标签。
7.权利要求3所述的多肽，其中所述多肽被固定在细胞、囊泡、脂质体、膜、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠、凝胶、板、阵列、毛细管、晶体、片剂、丸剂、胶囊、粉末、团聚体、表面或多孔结构之上或内部。
8.水解肌醇-六磷酸为肌醇和无机磷酸的方法，包括：
(a)提供权利要求3所述的多肽；(b)提供包含肌醇-六磷酸的组合物；和(c)在所述多肽水解所述肌醇-六磷酸以产生肌醇和无机磷酸的条件下，将(a)所述的多肽与(b)所述的组合物接触。
9.油脱胶方法，包括：
(a)提供权利要求3所述的多肽；
(b)提供包含油的组合物；和
(c)在其中所述多肽能够切割肌醇-无机磷酸键的条件下，将(a)所述的多肽与(b)所述的油接触，从而使所述油脱胶。
10.生产动物饲料或食品、或者饲料或食品补充物的方法，包括：
(i)，(a)用权利要求1所述的核酸转化植物、植物部分或植物细胞；(b)在表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养所述植物、所述植物部分或所述植物细胞；和(c)将所述植物、植物部分或植物细胞转变成适合于动物饲料或食品、或者饲料或食品补充物的组合物，或将所培养的植物、植物部分或植物细胞加入到动物饲料、或食品、或者饲料或食品补充物，从而产生动物饲料、或食品、或者饲料或食品补充物；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述多核苷酸被包含在表达载体中，并且任选地所述载体包含能够在植物细胞中表达所述核酸的表达调控序列；
(iii)，(ii)所述的方法，其中所述动物是单胃动物，并且任选地所述动物是反刍动物；
(iv)，(i)至(iii)中任一项所述的方法，其中所述动物饲料或食品、或者饲料或食品补充物是输送基质、丸粒、片剂、凝胶、液体、喷雾剂、细粒或粉末的形式；
(v)，(i)至(iv)中任一项所述的方法，其中所述肌醇六磷酸酶被糖基化，或所述肌醇六磷酸酶被糖基化以在粒化条件下提供耐热性或热稳定性；或
(vi)，(iv)或(v)所述的方法，其中所述输送基质通过粒化包含谷物胚芽和肌醇六磷酸酶的混合物以产生颗粒而形成，并且任选地所述丸粒在包含应用蒸汽的条件下制成，并且任选地所述丸粒在包含应用超过80℃的温度5分钟的条件下制成，并且任选地，所述丸粒包含肌醇六磷酸酶，其含有每毫克酶至少350到900单位的比活性。
11.权利要求3所述的多肽在制备可食用的输送基质中的应用，其中：
(i)，(a)所述可食用的输送基质含有可食用的载体和权利要求3所述的多肽，其中当置于水介质中时，所述基质容易地分散并释放所述肌醇六磷酸酶，和(b)向所述动物或人施用所述可食用的酶输送基质；
(ii)，(i)所述的应用，其中所述可食用的输送基质包括颗粒状的可食用载体；
(iii)，(i)或(ii)所述的应用，其中所述可食用的输送基质是丸粒、片剂、凝胶、液体、浆、悬液、喷雾剂或粉末的形式，或者作为植入物；
(iv)，(i)、(ii)或(iii)所述的应用，其中所述可食用的载体包括选自下列的载体：谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆荚、向日葵种子粉、玉米粉、大豆粉和小麦粉；或
(v)，(i)至(iv)中任一项所述的应用，其中所述可食用的载体包括榨干油的谷物胚芽。
12.用于动物或人的食品、饲料、食品补充物或饲料补充物，
(i)，其包括权利要求3所述的多肽；
(ii)，(i)所述的食品、饲料、食品补充物或饲料补充物，其中所述多肽被糖基化，或所述肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的；或
(iii)，(i)或(ii)所述的食品、饲料、食品补充物或饲料补充物以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶锭、粉末或液体形式制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
13.权利要求12所述的食品、饲料、食品补充物或饲料补充物，其中所述液体为喷雾剂、浆或悬液。
14.可食用或可吸收的酶输送基质，
(i)，其包括权利要求3所述的多肽；
(ii)，(i)所述的可食用或可吸收的酶输送基质，其中所述多肽被糖基化，并且任选地所述肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的；或
(iii)，(i)或(ii)所述的可食用或可吸收的酶输送基质包括丸粒或以丸粒的形式制造，或者所述可食用或可吸收的酶输送基质以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶锭、粉末或液体形式制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
15.权利要求14所述的可食用或可吸收的酶输送基质，其中所述液体为喷雾剂。
16.可食用或可吸收的丸粒：
(i)，其包括颗粒状可食用或可吸收的载体和权利要求3所述的多肽；
(ii)，(i)所述的可食用或可吸收的丸粒，其中所述多肽被糖基化，和/或所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性，其是耐热性的或热稳定性的；或
(iii)，(i)或(ii)所述的可食用或可吸收的丸粒，其中所述丸粒以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶锭、粉末或液体形式制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者以颗粒形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
17.权利要求16所述的可食用或可吸收的丸粒，其中所述液体为喷雾剂、浆或悬液。
18.大豆粉，(i)其包括权利要求3所述的多肽；或(ii)，(i)所述的大豆粉，其以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、凝胶锭、粉末或液体形式制造。
19.权利要求18所述的大豆粉，其中所述液体为喷雾剂、浆或悬液。
20.加工玉米仁和高梁仁的方法，包括：
(a)提供权利要求3所述的多肽；
(b)提供包含玉米浸渍液或高梁浸渍液的组合物；和
(c)在其中所述多肽能够切割肌醇-无机磷酸键的条件下，使(a)所述的多肽和(b)所述的组合物接触。
21.药物或饮食制剂，
(i)，其包含权利要求3所述的多肽；
(ii)，(i)所述的药物或饮食制剂，其中所述多肽被糖基化，和/或所述肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的；
(iii)，(i)或(ii)所述的药物或饮食制剂，其中所述药物或饮食制剂以丸粒、丸剂、片剂、胶囊、凝胶锭、粉末、洗剂或液体形式配制或制造，或者使用聚合物包被的添加剂产生，或者作为植入物；或
(iv)，(i)至(iii)的任一项所述的药物或饮食制剂，其以颗粒状形式制造，或者通过喷雾干燥而产生。
22.权利要求21所述的药物或饮食制剂，其中所述液体为喷雾剂。
23.组合物，其包含(a)权利要求3所述的多肽；和(b)表2中列出的任何产品或表1中列出的任何组合物；其中任选地，所述多肽被糖基化，并且任选地所述肌醇六磷酸酶活性是耐热性的或热稳定性的。
24.包含权利要求3所述的多肽的组合物在制备用于改善骨质疏松的药物中的应用。
25.增加肌醇六磷酸酶的胃不稳定性的方法，包括(a)提供权利要求3所述的多肽，和(b)用精氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸替代编码所述多肽的序列中的一个或多个氨基酸；其中所述替代提高胃不稳定性。
26.分离的、合成的或重组的核酸，包含选自如下的核酸：SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39，其中所述核酸编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。
27.分离的、合成的或重组的多肽，包含选自如下的氨基酸序列：SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38和SEQIDNO:40，其中所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性。
28.权利要求3所述的肌醇六磷酸酶多肽，其中所述肌醇六磷酸酶在10分钟以内在受激胃液中完全降解，并且所述肌醇六磷酸酶在暴露于以下范围的温度后保持活性：75℃至85℃、85℃至90℃、90℃至95℃或80℃至86℃。
29.权利要求28所述的肌醇六磷酸酶多肽，其中所述肌醇六磷酸酶在4分钟以内在受激胃液中完全降解，并且所述肌醇六磷酸酶在暴露于80℃至86℃范围的温度后保持活性。
CN201080033132.4A 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法 Active CN102459303B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610323370.8A CN106011159A (zh) 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18028309P 2009-05-21 2009-05-21
US61/180,283 2009-05-21
PCT/US2010/035667 WO2010135588A2 (en) 2009-05-21 2010-05-20 Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610323370.8A Division CN106011159A (zh) 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102459303A CN102459303A (zh) 2012-05-16
CN102459303B true CN102459303B (zh) 2016-06-29

Family

ID=43126780

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610323370.8A Pending CN106011159A (zh) 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
CN201080033132.4A Active CN102459303B (zh) 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610323370.8A Pending CN106011159A (zh) 2009-05-21 2010-05-20 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

Country Status (17)

Country Link
US (3) US9695403B2 (zh)
EP (2) EP2698374B1 (zh)
JP (3) JP2012527247A (zh)
KR (1) KR101817253B1 (zh)
CN (2) CN106011159A (zh)
AU (1) AU2010249500B2 (zh)
BR (1) BRPI1011160A8 (zh)
CA (1) CA2763283C (zh)
DK (2) DK2432797T3 (zh)
EA (1) EA021178B1 (zh)
ES (2) ES2607688T3 (zh)
HU (2) HUE031003T2 (zh)
MX (1) MX355638B (zh)
NZ (1) NZ596459A (zh)
VN (1) VN30065A1 (zh)
WO (1) WO2010135588A2 (zh)
ZA (1) ZA201108491B (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8877478B2 (en) * 2006-09-21 2014-11-04 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DE102009038784B4 (de) 2009-08-25 2019-03-28 Siemens Healthcare Gmbh Vorbelegbares Sendedatenspeicherelement einer MR-Sendeeinheit in Array-Anwendungen
BR112014032940A2 (pt) * 2012-07-20 2017-06-27 Sophoro Biotechnologies Llc ésteres de carboidratos como indutores de expressão de genes
GB201308828D0 (en) 2013-03-12 2013-07-03 Verenium Corp Phytase
GB201308843D0 (en) 2013-03-14 2013-07-03 Verenium Corp Phytase formulation
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
BR112015032838A2 (pt) * 2013-07-25 2017-11-07 Basf Enzymes Llc fitase
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
EP3018203A1 (en) 2014-11-06 2016-05-11 Fertinagro Nutrientes, S.L. Novel phytase, method for obtaining the same and use thereof
US10386315B2 (en) * 2016-04-19 2019-08-20 Malvern Panalytical Inc. Differential scanning calorimetry method and apparatus
EP3476929A4 (en) 2016-06-28 2020-02-26 National Agriculture and Food Research Organization CELL ENCLOSURE DEVICE AND USE THEREOF
JP7051504B2 (ja) * 2018-03-14 2022-04-11 昭和産業株式会社 家禽の筋胃増大用飼料、家禽の筋胃増大用混合飼料、及び家禽の筋胃を増大させる方法
US11278670B2 (en) * 2018-04-26 2022-03-22 Carefusion 303, Inc. Semi-autonomous hot-swap infusion module
MX2020011305A (es) * 2018-04-26 2021-01-08 Danisco Us Inc Método para aumentar la estabilidad de una fitasa en una composición sólida y una composición granulada que comprende fosfato y fitasa.
CN111363775B (zh) * 2020-03-18 2022-08-05 浙江工业大学 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用
CN113699134B (zh) * 2020-05-22 2024-04-05 潍坊康地恩生物科技有限公司 植酸酶突变体
CN111653310B (zh) * 2020-06-29 2023-06-20 北京大学深圳研究生院 含二硫键多肽的结构预测方法及装置
EP4119661A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-18 AB Enzymes Oy Phytase variants with improved stability and ip4 activity
EP4119660A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-18 AB Enzymes Oy Phytase variants
CN115154331B (zh) * 2022-06-16 2024-01-16 武汉大学 一种具有介孔核壳结构的牙本质矿化脱敏材料及其制备方法
CN115011739B (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 南京邦康生物技术有限公司 一种益生菌的生产控制方法与系统

Family Cites Families (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3966971A (en) 1975-01-02 1976-06-29 Grain Processing Corporation Separation of protein from vegetable sources
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
DE2953302A1 (de) 1979-09-28 1982-02-04 Vsesoyuzny Ni Biotek Inst Method of production of ethyl alcohol from starch raw material
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS59166049A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Nippon Shinyaku Co Ltd 豆乳の製法
JPS60140506A (ja) 1983-12-28 1985-07-25 Hitachi Ltd 磁気ヘツド
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
JP2615013B2 (ja) 1985-08-07 1997-05-28 モンサント コンパニ− グリホセート耐性キメラ遺伝子
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
DE3623533A1 (de) 1986-07-12 1988-01-21 Beiersdorf Ag Pyrido(1,8)naphthyridinone, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung sowie diese verbindungen enthaltende zubereitungen
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
CA1340522C (en) 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
DE3725946A1 (de) 1987-08-05 1989-02-16 Boehringer Ingelheim Vetmed Stabilisierter futtermittelzusatz und verfahren zu seiner herstellung
NL8702735A (nl) 1987-11-17 1989-06-16 Dorr Oliver Inc Werkwijze voor het weken van granen met een nieuw enzympreparaat.
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
US5162215A (en) 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5316770A (en) 1989-02-16 1994-05-31 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vitamin D derivative feed compositions and methods of use
US5366736A (en) 1989-02-16 1994-11-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vitamin D derivative feed compositions and methods of use
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
JPH0376529A (ja) 1989-08-17 1991-04-02 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 生地およびそれを用いるパンの製造法
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
UA27702C2 (uk) 1989-09-27 2000-10-16 Гіст-Брокейдс Н.В. Фрагмент геномної днк, що кодує фітазу aspergillus niger,фрагмент кднк, що кодує фітазу aspergillus niger, рекомбінантна плазмідна днк для експресії фітази в aspergillus (варіанти), штам aspergillus-продуцент фітази aspergillus (варіанти), спосіб одержання фітази, рекомбінанта фітаза aspergillus niger
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
ATE157702T1 (de) 1990-02-07 1997-09-15 Abbott Lab Alkalische phosphatase mit verbesserter spezifischer aktivität zur verwendung in indikatorreagenzien
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
US5593963A (en) 1990-09-21 1997-01-14 Mogen International Expression of phytase in plants
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
AU7791991A (en) 1990-04-24 1991-11-11 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
AU646877B2 (en) 1990-06-15 1994-03-10 Scios Nova Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
EP0955371B1 (en) 1990-11-23 2006-02-22 Bayer BioScience N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
EP0563296B1 (en) 1990-12-20 1999-03-17 Ixsys, Inc. Optimization of binding proteins
JP2509824B2 (ja) 1991-02-23 1996-06-26 正美 星野 ミネラル吸収促進剤
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
IL104704A0 (en) 1992-02-13 1993-06-10 Gist Brocades Nv Stabilized aqueous liquid formulation of phytase
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
GB9216151D0 (en) 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
JPH0670749A (ja) 1992-08-27 1994-03-15 Nishinomiya Shuzo Kk 麹菌及びその育種方法
JPH06153896A (ja) 1992-08-27 1994-06-03 Nishinomiya Shuzo Kk 清酒の製造方法
ES2148323T3 (es) 1993-02-26 2000-10-16 Calgene Llc Sistema de expresion de un gen a base de geminivirus.
ES2202305T3 (es) 1993-04-05 2004-04-01 Aveve N.V. Hidrolisis de fitina y composicion de enzimas que tienen actividad hidrolizante de fitato.
JPH08509871A (ja) 1993-09-30 1996-10-22 アグラシータス インコーポレイテッド 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5492813A (en) 1993-11-01 1996-02-20 Boehringer Mannheim Corporation Muteins of β-galactosidase fragments having increased activity
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
JPH09509847A (ja) 1994-03-09 1997-10-07 アボツト・ラボラトリーズ 人乳化乳
NZ281041A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Non-human mammals transformed with a catalytic entity of enzymes or antibodies to produce a heterologous product in the animals milk
JPH07277865A (ja) 1994-04-14 1995-10-24 Ebara Res Co Ltd 堆肥およびその製造方法
JP3678310B2 (ja) 1994-04-22 2005-08-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 植物性タンパク質の溶解度を改善する方法
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
GB9409336D0 (en) 1994-05-10 1994-06-29 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for manufacturing an agent for the treatment and/or prophylaxis of coccidiosis
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5830732A (en) 1994-07-05 1998-11-03 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Phytase
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
JPH10504964A (ja) 1994-09-01 1998-05-19 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質を発現するトランスジェニック動物
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5786316A (en) 1994-10-27 1998-07-28 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising xylanases
US5770012A (en) 1994-11-18 1998-06-23 P. H. Glatfelter Co. Process for treating paper machine stock containing bleached hardwood pulp with an enzyme mixture to reduce vessel element picking
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
DE69617641T3 (de) 1995-01-26 2009-10-22 Novozymes A/S Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere
JPH08205785A (ja) 1995-02-03 1996-08-13 Ii M Kenkyu Kiko:Kk フィチン分解性飼料
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
EP0813604B1 (en) 1995-03-03 2005-04-20 Syngenta Participations AG Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand
WO1996039154A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5720971A (en) 1995-07-05 1998-02-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Enzyme additives for ruminant feeds
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US5721118A (en) 1995-10-31 1998-02-24 The Regents Of The University Of California, San Diego Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
DK172530B1 (da) 1995-11-10 1998-11-23 Leo Pharm Prod Ltd Tilsætningsprodukt til drikkevand og foder til dyr samt fremgangsmåde for tilsætning
US6352842B1 (en) 1995-12-07 2002-03-05 Diversa Corporation Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
KR0169913B1 (ko) 1996-03-14 1999-01-15 김은영 신균주 바실러스속 ds11과 이로부터 생산되는 신규 파이타아제
WO1997035016A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Novo Nordisk Biotech Inc Polypeptides having phytase activity and nucleic acids encoding same
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
WO1997046313A1 (en) 1996-06-07 1997-12-11 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
US5939303A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada Phytases of ruminal microorganisms
US5759840A (en) 1996-09-09 1998-06-02 National Research Council Of Canada Modification of xylanase to improve thermophilicity, alkalophilicity and thermostability
ES2242234T3 (es) 1996-09-12 2005-11-01 Syngenta Participations Ag Plantas transgenicas que expresan enzimas celuloliticas.
US6039942A (en) 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
WO1998030681A1 (en) 1997-01-09 1998-07-16 Novo Nordisk A/S Phytase combinations
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
AU743305C (en) 1997-01-17 2006-03-30 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
JP4263248B2 (ja) 1997-03-18 2009-05-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ Ｄｎａのシャッフリングによるライブラリーの作成方法
DK0973940T3 (da) 1997-03-18 2008-10-20 Novozymes As En in vitro-fremgangsmåde til konstruktion af et DNA-bibliotek
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
KR100206453B1 (ko) 1997-03-27 1999-07-01 박원훈 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
US20040091968A1 (en) * 1997-08-13 2004-05-13 Short Jay M. Recombinant phytases and methods of making and using them
US7078035B2 (en) 1997-08-13 2006-07-18 Diversa Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US6183740B1 (en) 1997-08-13 2001-02-06 Diversa Corporation Recombinant bacterial phytases and uses thereof
US6855365B2 (en) 1997-08-13 2005-02-15 Diversa Corporation Recombinant bacterial phytases and uses thereof
US5876997A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Diversa Corporation Phytase
US6720014B1 (en) 1997-08-13 2004-04-13 Diversa Corporation Phytase-containing foodstuffs and methods of making and using them
CA2300940A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
DK1012564T3 (da) 1997-09-11 2003-07-21 Bioventures Inc Fremgangsmåde til at fremstille højtæthedsarrays
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
US6596539B1 (en) 1997-10-31 2003-07-22 Maxygen, Inc. Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
DE69828574T2 (de) 1997-11-14 2005-10-06 Sankyo Co., Ltd. Transgenes Tier als Modell für Allergie und seine Verwendung
JP3712255B2 (ja) 1997-12-08 2005-11-02 カリフォルニア・インスティチュート・オブ・テクノロジー ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を生成するための方法
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO1999041383A1 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
WO1999041368A2 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
US6514495B1 (en) * 1998-03-23 2003-02-04 Novozymes A/S Phytase varinats
US6537749B2 (en) 1998-04-03 2003-03-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
EP1073342B1 (en) 1998-04-08 2004-06-16 Nutreco Aquaculture Research Centre A/S A method for the modification of protein structure in finish shaped feed pellets, balls or the like in order to achieve shape stability
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
KR20010071613A (ko) 1998-06-29 2001-07-28 추후기재 매우 다양한 라이브러리의 생산방법
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
FR2788782B1 (fr) 1999-01-25 2003-01-31 Gie Agro Ind Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l'etat solide de son de ble avec aspergillus niger
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
EP1165806B1 (en) 1999-03-31 2005-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Phosphatases with improved phytase activity
WO2000064247A1 (en) 1999-04-23 2000-11-02 University Of Guelph Transgenic animals expressing salivary proteins
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
DE19922753A1 (de) 1999-05-18 2000-11-23 Basf Ag Enzym-Instantformulierungen für die Tierernährung
DE19929257A1 (de) 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
CN1312280C (zh) 1999-07-09 2007-04-25 诺沃奇梅兹有限公司 一种制备含酶颗粒的方法
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
AU7405200A (en) 1999-10-01 2001-05-10 Novozymes A/S Spray dried enzyme product
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
AU1618801A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Cornell Research Foundation Inc. Site-directed mutagenesis of escherichia coli phytase
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
CA2396898A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
EP1259630A1 (en) 2000-02-23 2002-11-27 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
CA2425671A1 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Exelixis, Inc. Human ect2 and methods of use
US6958236B2 (en) 2000-10-24 2005-10-25 Syngenta Participations Ag Control of gene expression in plants
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
US6887687B2 (en) 2001-07-30 2005-05-03 Immunex Corporation Nucleic acids encoding human ataxin-1-like polypeptide IMX97018
JP2005503153A (ja) 2001-08-27 2005-02-03 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 自己加工植物及び植物部分
TWI262083B (en) * 2001-12-28 2006-09-21 Syngenta Participations Ag Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed
TW200305430A (en) * 2001-12-28 2003-11-01 Syngenta Participations Ag Thermotolerant phytase for animal feed
US7968342B2 (en) 2002-08-12 2011-06-28 Danisco Us Inc. Mutant E. coli appa phytase enzymes and natural variants thereof, nucleic acids encoding such phytase enzymes, vectors and host cells incorporating same and methods of making and using same
US7884261B2 (en) 2004-06-30 2011-02-08 CERES,Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
BRPI0418622B1 (pt) 2004-03-08 2020-01-28 Syngenta Participations Ag polinucleotídeo isolado, cassete de expressão e método para preparar açúcar fermentável, monossacarídeo ou oligossacarídeo
JP4587691B2 (ja) 2004-03-30 2010-11-24 アサヒビール株式会社 イノシトール含量の高いビール、発泡酒、麦芽発酵飲料およびその製造方法
WO2005096704A2 (en) 2004-04-08 2005-10-20 Kgk Synergize Inc. Cholesterol lowering composition
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
CN1706941A (zh) 2004-06-10 2005-12-14 安徽固源生物工程有限责任公司 高比活植酸酶的热稳定性改良及其高效表达
DE102004050410A1 (de) 2004-10-15 2006-06-08 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und dieses codierende Nucleotidsequenz
JP5221516B2 (ja) * 2006-04-04 2013-06-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ フィターゼ変異体
WO2008017066A2 (en) * 2006-08-03 2008-02-07 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
US8877478B2 (en) * 2006-09-21 2014-11-04 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DE102006053059A1 (de) 2006-11-10 2008-05-15 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und erhöhter Temperaturstabilität der Enzymaktivität sowie dieses codierende Nukleotidsequenz
ES2701883T3 (es) 2007-07-31 2019-02-26 Basf Enzymes Llc Ensamblaje de combinaciones de múltiples sitios a medida
WO2009110933A2 (en) * 2007-12-03 2009-09-11 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases

Also Published As

Publication number Publication date
CN102459303A (zh) 2012-05-16
BRPI1011160A8 (pt) 2018-01-02
CA2763283C (en) 2021-01-12
BRPI1011160A2 (pt) 2017-09-26
KR101817253B1 (ko) 2018-01-10
KR20120057585A (ko) 2012-06-05
EP2432797A2 (en) 2012-03-28
US20170306304A1 (en) 2017-10-26
AU2010249500B2 (en) 2016-03-24
CN106011159A (zh) 2016-10-12
HUE031003T2 (en) 2017-06-28
DK2432797T3 (en) 2017-01-16
EP2432797A4 (en) 2012-11-14
EA201171450A1 (ru) 2012-06-29
US20190127712A1 (en) 2019-05-02
MX2011012428A (es) 2012-02-01
WO2010135588A3 (en) 2011-01-13
EP2698374A1 (en) 2014-02-19
HUE030948T2 (en) 2017-06-28
MX355638B (es) 2018-03-26
WO2010135588A2 (en) 2010-11-25
DK2698374T3 (en) 2017-01-09
ES2607688T3 (es) 2017-04-03
ZA201108491B (en) 2017-04-26
AU2010249500A1 (en) 2011-12-08
ES2608690T3 (es) 2017-04-12
JP6227619B2 (ja) 2017-11-08
VN30065A1 (en) 2012-06-25
EA021178B1 (ru) 2015-04-30
NZ596459A (en) 2013-11-29
EP2698374B1 (en) 2016-09-14
JP2016039823A (ja) 2016-03-24
JP2016127823A (ja) 2016-07-14
EP2432797B1 (en) 2016-10-05
JP6226943B2 (ja) 2017-11-08
US20120066781A1 (en) 2012-03-15
JP2012527247A (ja) 2012-11-08
US9695403B2 (en) 2017-07-04
US10428340B2 (en) 2019-10-01
US9969992B2 (en) 2018-05-15
CA2763283A1 (en) 2010-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102459303B (zh) 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
CN101541822B (zh) 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
AU2013204086B2 (en) Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2013204082B2 (en) Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: American California

Applicant after: BASF Enzymes LLC

Address before: American California

Applicant before: Diversa Corp.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: DIVERSA CORP. TO: BASF ENZYMES LLC

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170526

Address after: Basel

Patentee after: Syngenta Participations AG

Address before: American California

Patentee before: BASF Enzymes LLC