JP3678310B2 - 植物性タンパク質の溶解度を改善する方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、植物性タンパク質の溶解度を改善する方法に関する。更に詳しくは、植物性タンパク質源中のタンパク質を可溶化する方法に関し、この方法は植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ(Phytase）酵素で処理し、次いで植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素で処理することを含んでなる。もう一つの面において、本発明はフィターゼおよび１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加剤を含んでなる。
背景技術
タンパク質は、ａ．ｏ．哺乳動物およびレヤー（layers）に対する必須栄養因子である。大抵の家畜および多くの人々は、植物性タンパク質源から必要なタンパク質を得ている。重要な植物タンパク質源は、例えば穀物植物、マメ科植物および脂肪種子作物である。
加水分解された植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質加水分解物は栄養素として、例えば食物および飲料に対する栄養添加物としてその適用が見出される。加水分解されたタンパク質は、未加水分解タンパク質よりもより容易に吸収される；何故ならタンパク質加水分解物は最も高い栄養価を有するものと考えられるからである。タンパク質加水分解物を製造する幾つかの方法は公知でありそして文献例えば米国特許4,324,805および国際公開（WO）92／15696に記載されている。
植物起源の本質的に全ての食物および飼料物質は、貯蔵リン源としてフィテート(phytate）およびフィチン酸を含有する〔注、review in E. Graft.(編）、phytic Acid, Chemistry and Applications、ミネアポリス、米国、1986〕。穀物植物中の約75−78％のリンがフィチン酸として結合している。フィテートは、全ての堅果、穀物植物、脂肪種子、胞子および花粉の１−３％を含んでなる。フィチン酸の錯塩は、フィチン（phytin）と称されている。
フィチン酸キレート鉱物例えばカルシウム、亜鉛、マグネシウムおよび鉄（これにより、天然に重要な鉱物の生物適合性を減少する）は、一般に抗栄養因子として考えられる。インビトロの研究ではフィチン酸は幾つかの動物タンパク質のペプシン消化を阻害し、一方トリプシン消化は影響されなかった〔注、Knuckles等、Journal of Food Science, 1989 54 1348−1350〕。
フィターゼは、フィテートをイノシトールおよび無機リンへの変換を触媒する酵素である。フィターゼは、例えばバシラス（Bacillus）、シュードモナス(Pseudomonas）、サッカロマイセス(Saccharomyces）およびアスペルギルス(Aspergillus）から得られてきた。
米国特許3,297,548において、飼料に無機リンを加えることを避けるため単胃動物の飼料に微生物フィターゼを加えることが提案された。
フィターゼを大豆の加工において用いられることが考察された。従って、ヨーロッパ公開特許0420358は、大豆ミル高レベルの抗栄養因子フィテートを含有し、このフィテートはこのタンパク質源を乳児食物並びに魚、子牛および他の非反すう動物においてこのタンパク質源を不適当ならしめる；何故ならフィテートはその中に存在する必須の鉱物とキレート形成するからである。
要約すると、植物性タンパク質源中に存在するフィテート／フィチン酸中に結合せしめられたリンを利用するため、又はフィチン酸錯体中で結合せしめられた天然に重要な鉱物を利用するため、フィターゼ酵素を利用することが先に提案された。
しかし、植物源、例えば穀物植物、マメ科植物および脂肪種子穀物中に存在するタンパク質の有効性を改善する必要がある、何故なら増加せしめられた有効性は、タンパク質加水分解プロセスの高収率並びに栄養上の利点、すなわち改善されたタンパク質の利用を導くからである。
発明の要約
今や以下の内容が見出された；すなわち、植物起源中に存在するタンパク質の溶解性は、植物起源を有効量のフィターゼ酵素で処理することにより増加できる。タンパク質分解プロセス中にフィターゼを添加することにより、より高程度の加水分解およい改善せしめられたタンパク質溶解性が得られ、そして収率が改善する。
従って、本発明は植物性タンパク質中のタンパク質を可溶化するための方法を提供し、その方法は有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
発明の詳細な開示
植物性タンパク質の可溶化
本発明は、植物性タンパク質源中のタンパク質の可溶化のための方法を提供し、これによりタンパク質加水分解物を得る。
前記方法は、次の工程：
（ａ）有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで
（ｂ）有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
タンパク質加水分解物を得るための公知方法と比較して、本発明方法はタンパク質の有効性を改善し、これにより増加せしめられた抽出、高収率および改善されたタンパク質の利用を導びく。
本発明方法に委ねられる植物性タンパク質源は全ての植物性タンパク質、特にマメ科植物、穀物植物、キク科植物又は十字花科植物である。好ましくは、マメ科植物は大豆、豆、えんどうおよびルピナス（ルピナスアルバス（Lupinus albus)）から選ばれ、より好ましくはマメ科植物は大豆である。好ましくは、穀物植物は、小麦、とうもろこし、大麦、ライ麦、からす麦、米、モロコシの類ごま（サザマムインジカム（Sesamum indicum)）およびきび（パニカムミリアセウム(Panicum miliaceum）から成る群から選ばれる。有用なキク科植物の例は、サンフラワー（ヘリアンタス（Helianthus)）であり、そして有用な十字花科植物の例は、西洋あぶらな（なたね、例えばブラシカナパス（Brassica napus）である。
植物性タンパク質源は好ましくは大豆である。
本発明方法に委ねられる植物性タンパク質は、「加工された形」を含む、あらゆる形をとることができ、ここにおいて乾燥物質のタンパク質含量は、タンパク質を本発明方法に委ねる前に増加される。例えば大豆タンパク質原料は、大豆、脂肪大豆フレーク、大豆あらびき粉、大豆濃縮物又は大豆単離物として得られ得る。このようなタンパク質原料は、典型的には約42％ないし約95％のタンパク質を含有する。
タンパク質源は、本発明方法に委ねる前に常法で予備処理されてもよい。特に、タンパク質源を乾燥しおよび／又は粉砕し、すなわちあらびき粉又はフレーク（例えば大豆あらびき粉又はフレーク）に加工される。
本発明方法の２工程、（ａ）および（ｂ）は、連続工程として行うことができ、又は２つの行程を同時に行なうことができる。
また、植物性タンパク質源を、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素を含んでなる１種の酵素調製品で処理され、又は植物性タンパク質源は１種以上のフィターゼ酵素および／又はタンパク質分解酵素を含んでなる２種以上の酵素で処理できる。
現在次のように考えられている；すなわち本発明方法は約pH３〜約pH９、より好ましくは約pH４〜約pH９の懸濁液のpHで好ましく行なわれる。
また、次のように企図される；すなわち本発明方法は約10℃〜約70℃、より好ましくは約35℃〜約65℃の温度で好ましく行なわれる。
より特異的態様において、本発明方法は、
（ｉ）植物性タンパク質源を水中に懸濁させ；
（ii）水性懸濁液を、１種又はそれ以上のフィターゼ酵素および１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて酵素処理に委ねることによりタンパク質をタンパク加水分解し；
（iii）酵素を失活させ；次いで所望により
（iv）可溶化タンパク質を水性懸濁液から分離する連続工程を含んでなる。
酵素の失活は、酵素を失活させる常法により、例えば熱処理により、すなわち加水分解懸濁液又は混合物の温度を酵素が変性する温度、典型的には85℃超の温度に上げることにより行うことができる。
分離工程は、懸濁液から加水分解されたタンパク質を常法により、例えばタンパク質加水分解物を含有する懸濁液を遠心分離又は膜濾過により行うことができる。
一般的に、本発明方法は米国特許4,324,805、米国特許4,100,024およびWO92／15696(これらの公報はその番号を引用して本明細書に加えられる）に記載の如く、タンパク質加水分解物を得る常法に類似の方法で行うことができる。
フィターゼ酵素
植物性タンパク質源中のタンパク質を可溶化するための本発明方法は、植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素で処理することを含んでなる。
本発明に関連して、フィターゼ酵素は種々のミオイノシトール(myoinositol）ホスフェートから無機リンの除去を触媒する酵素である。フィターゼ酵素は、好ましくは微生物源、例えば細菌、菌類および酵母から由来しそして植物起源であってもよい。
好ましい態様において、フィターゼ酵素は菌類、菌株、特にアスペルギルス(Aspergillus）菌株、好ましくはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）菌株、アスペルギルスフィクム（Aspergillus ficuum）菌株、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)菌株、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）菌株、アスペルギルステレウス(Aspergillus terreus）菌株およびアスペルギルスニドランス（Aspergillus nidulans）菌株から由来する。
アスペルギルスニガー菌株又はアスペルギルスオリゼ菌株から由来するフィターゼ酵素が最も好ましい。
もう一つの好ましい態様において、フィターゼ酵素は細菌菌株、特にバシラス（Bacillus）菌株又はシュードモナス(Pseudomonas)菌株から由来する。
更にもう一つの好ましい態様において、フィターゼ酵素は酵母、特にクルベロマイセス（Kluveromyces）菌株又はサッカロマイセス（Saccharomyces）菌株から由来する。好ましくは、フィターゼ酵素はサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の菌株から由来する。
本発明に関連し、「由来する酵素」は、特定の菌株により天然に生産される酵素又は、特定の菌株から単離されたDNA配列によりコードされそして該DNA配列で形質転換された宿主生物体内で生産される酵素を含む。
フィターゼ酵素は、好適な技術を用い対照の微生物から由来できる。特に、フィターゼ酵素は、好適な栄養培地内でフィターゼ生産微生物を発酵し、次いで公知方法で酵素を単離することにより得られる。
培養して用いられるブロス又は倍地は、対象の宿主細胞の増殖に好適な全ての好都合の培地であってよく、そして従来技術の原則に従って構成され得る。培地は、好ましくは炭素および窒素源並びに他の無機塩を含有する。適当な培地、例えば最少又は複合培地は商業上の供給者から入手可能であるか、又は出版されたレシート（receipts）、例えばアメリカン タイプ カルチア コレクション（ATCC）菌株カタログに従って生産できる。
培養後、フィターゼ酵素は培養ブロスからタンパク質の単離および精製のための常法により回収される。周知の精製手順には、遠心又は濾過により培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムの如き塩により培地のタンパク質成分の沈殿、およびクロマトグラフィー法例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等により培地から細胞を分離することが含まれる。
択一的に、フィターゼ酵素は例えばヨーロッパ特許公開420358（この公報はその番号を引用して本明細書に加えられる）に記載される如く、組換えDNA工学を用い多量に好ましく生産される。
好ましくは、種アスペルギルス フィクム（Aspergillus ficuum）又はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger）から得られるフィターゼコード遺伝子で形質転換された種アスペルギルスの菌類を、ヨーロッパ特許公開420358に記載の如きフィターゼコード遺伝子の発現を助成する条件下で培養される。
フィターゼ含有発酵ブロスを、本発明の（調合物）において使用される前にブロス濾過および限外濾過により好ましく処理される。
現在次のように考えられている；すなわち、植物性タンパク質の溶解度を改善するために有効なフィターゼの量は、１kgのタンパク質源当たり、約２〜約50000FYT（後に定義する如き）、好ましくは１kgのタンパク質源当たり約50〜約30000FYT、最も好ましくは１kgのタンパク質源当たり約100〜約10000FYTの量に相当する。
タンパク質分解酵素
植物性タンパク質源中のタンパク質の可溶化のための本発明方法はまた、植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素で処理することを含んでなる。
タンパク質分解酵素は、微生物酵素、好ましくは細菌又は菌類菌株から由来するプロテアーゼであってよく、又はタンパク質分解酵素はバシラス菌株、好ましくはバシラススブチリス(Bacillus subtilis）菌株又はバシラスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）菌株から由来する細菌プロテアーゼである。商業的に入手可能なバシラスプロテアーゼは、アルカラーゼ（Alcalase)(商標）およびニュートラーゼ（Newtrase)(商標)(ノボノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク）である。もう一つの好ましい態様において、タンパク質分解酵素は、アスペルギルス(Aspergillus）菌株、好ましくはアスペルギルスアクレタス(Aspergillus aculeatus）菌株、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger）菌株、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）菌株から由来する菌類プロテアーゼである。商業的に入手可能なアスペルギルスプロテアーゼはフレーバーザイム（Flavourzyme）(商標)(ノボノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク）である。
現在次のように考えられている；すなわち、植物性タンパク質の溶解度を改善するために有効なタンパク質分解酵素の量は、１kgのタンパク質源当たり約0.0001〜約0.5AU(後に定義する如き）、好ましくは１kgのタンパク質源当たり約0.001〜約0.05AU、より好ましくは１kgのタンパク質当たり約0.005〜約0.03AUの量に相当する。
追加酵素
前記の如く、本発明は植物性タンパク質中のタンパク質を可溶化するための方法を提供し、この方法は次の工程：
（ａ）有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで
（ｂ）有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
本発明の２つの工程、（ａ）および（ｂ）は、連続工程として行うことができ、又は２つの工程は同時に行うこともできる。
好ましい態様において、本発明は更に、（ｃ）脂肪分解酵素およびグルコシダーゼ酵素から成る群から選ばれる１種又はそれ以上の酵素の有効量を用い植物性タンパク質源を処理する工程を含んでなる。
本発明方法の３つの工程、（ａ)，(ｂ）および（ｃ）は、連続工程として行うことができ、又は３つの工程は同時に行うことができる。又は本発明方法の２つの工程、（ａ）および（ｂ）は同時に行うことができ、ついで工程（ｃ）を行う。
工程（ｃ）のタンパク質分解酵素は、あらゆるトリアシルグリセロールリパーゼ（EC３．１．１．３）であってよい。
工程（ｃ）のグリコシダーゼ酵素は、あらゆるグリコシダーゼ酵素（EC３．２、カルボヒドラーゼとして公知）であってよい。好ましくは、グルコシダーゼ酵素は、アミラーゼ特にα−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼ、セルラーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．４）又はエンド−１，３−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、キシラナーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．８）又はキシラン−エンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC３．２．１．32）、α−ガラクトシダーゼ（EC３．２．１．22）、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、エンドグルカナーゼ、特にエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
より好ましい態様において、グルコシダーゼ酵素は、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、又はエンドグルカナーゼ、好ましくはエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
産業上の適用
植物性タンパク質源におけるタンパク質の可溶化のための本発明方法は、種々の産業においてその適用が見出される。特に、本発明方法は栄養素として、例えば食品および飲料に対する栄養添加物としてタンパク質加水分解物の製造に対する適用を見出す。
従って、もう一つの面において、本発明は本発明方法によって植物性タンパク質源から得られるタンパク質加水分解物を提供する。
本発明のタンパク質加水分解物は、食品又は飲料に添加でき、これにより栄養価を増加させる。
特に、本発明のタンパク質加水分解物は、動物飼料、例えば単胃動物用飼料材料に添加できる。
動物飼料添加剤
本発明は、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加剤を提供する。
動物飼料に添加するとき、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素の組合わせは、植物起源の動物飼料中に存在するタンパク質の有効性を改善し、これにより植物性タンパク質の増加せしめられた抽出、高タンパク質収率および改善されたタンパク質利用性が導びかれる。これにより、窒素消化能およびまぐさの栄養価が高まり、そして動物の成長比および／又は飼料変換比（すなわち、重量増加に対する消化された飼料の重量）が改善される。
本発明に関連して、動物飼料添加剤は１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素および適当な担体および／又は賦形剤を含んでなる酵素調製品であり、そしてこの酵素調製品は動物飼料に添加されるのに適した形で提供される。本発明の動物飼料添加剤は、当業者に公知の方法により製造されそして乾燥又は液体調製品の形であってよい。調製品に含まれる酵素は、当業者に公知方法で所望により安定化される。
特異態様において、本発明の動物飼料添加剤は粒状酵素製品でありこれは飼料成分と容易に混合され、又はより好ましくはプレミックスの成分を形成する。粒状酵素製品は、被覆され又は被覆されなくてよい。酵素粒質物の粒径は、飼料およびプレミックス成分のそれに匹敵する。これは酵素を飼料に配合する安全かつ好都合な手段を提供する。
もう一つの特異的態様において、本発明の動物飼料添加剤は、安定化液体組成物であり、これは水性又はオイル基材スラリーであってよい。
更にもう一つの特異的態様において、１種以上の酵素が飼料のペレット化もしくは押出前又はペレット化もしくは押後に適用される。
本発明の動物飼料添加剤は、（飼料成分を改変することにより）インビトロで又はインビボでその効果を発現する。本発明の飼料添加物は高量の植物性タンパク質、特にマメ科植物、穀物植物、キク科植物又は十字花科植物を含有する動物飼料組成物への添加に特に適している。好ましくは、マメ科植物は大豆、ファバビーン（faba bean)、えんどうおよび／又はルピナス(Lupinus albus）である。最も好ましくはマメ科植物は大豆である。好ましくは、穀物は、小麦、とうもろこし、大麦、ライ麦、からす麦、米、ごま(Sesamum indicum）およびきび(Panicum miliaceum）である。キク花植物の例は、ひまわり（Helianthus）であり、そして有用な十字花科植物の例は西洋あぶらな（なたね、例えばBrassica napus）である。
もう一つの好ましい態様において、本発明は脂肪分解酵素およびグルコシダーゼ酵素から成る群から選ばれる１種以上の追加の酵素を含んでなる動物飼料添加剤を提供する。
脂肪分解酵素はトリアシルグリセロールリパーゼ（EC３．１．１．３）であってよい。
グリコシダーゼ酵素は、全てのグリコシダーゼ酵素（EC３．２、カルボヒドラーゼとして公知）であってよい。好ましくは、グルコシダーゼ酵素は、アミラーゼ特にα−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼ、セルラーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．４）又はエンド−１，３−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、キシラナーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．８）又はキシラン−エンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC３．２．１．32）、α−ガラクトシダーゼ（EC３．２．１．22）、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、エンドグルカナーゼ、特にエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
より好ましい態様において、グルコシダーゼ酵素は、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、又はエンドグルカナーゼ、好ましくはエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
現在次のように考えられている；すなわち動物飼料添加剤のpHは数pH２〜約pH８の範囲内にあるべきである。
現在次のように考えられる；すなわち動物飼料添加剤中のフィターゼ活性の量は、全組成物１ｇ当たり約200〜約50000FYT（以下に定義）の範囲内、好ましくは全組成物１ｇ当たり約500〜約10000FYTの範囲内、最も好ましくは全組成物１ｇ当たり約2000〜約6000FYTの範囲内にあるべきである。
好ましくは、動物飼料に添加される添加物の量は、飼料１kg当たり少なくとも50FYT、より好ましくは飼料１kg当たり約100〜約2000FYTを含有する飼料組成物を提供するために十分である。
次のように理解されるべきである；すなわち、栄養価、すなわち窒素消化能を高めるため飼料に添加されるべきフィターゼ単位の実際量は、飼料それ自身の組成に依存するであろう。高量のフィチン酸を含有する飼料は、一般により高量のフィターゼ活性の付加を要求するであろう。必要量のフィターゼは当業者により容易に測定されるであろう。
フィターゼ活性(FYT)
フィターゼ活性は基質としてフィチン酸ナトリウムを用いて測定され得る。フィターゼの作用に委ねるとき、無機リンはフィチン酸ナトリウムから放出される。鉄／モリブデン含有試剤においてホスホラウス（phosphorous)(PO4）は錯体を形成し、これは750nmで分光測定により監視できる。
１フィターゼ単位(FYT）は、標準条件下（すなわち、pH5.5，37℃で、50mMのフィチン酸ナトリウムの基質温度そして30分の反応時間）、毎分１μmolを遊離する酵素の量として定義される。
この分析方法をより詳しく記載する標準操作手順EAL-SM-0403.01は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に要求により入手可能であり、この出版物はその番号を引用して本明細書に加入される。
プロテアーゼ活性（AU）
タンパク質分解活性は、基質として変性ヘモグロビンを用いて測定できる。タンパク質分解活性を測定するアンソン−ヘモグロビン法において、変性ヘモグロビンを消化され、そして未消化ヘモグロビンは三塩化酢酸(TCA）で沈殿する。TCA可溶性生成物の量は、フェノール試薬で測定され、これはチロシンおよびトリプトファンで青色を与える。
１アンソン単位（AU）は、標準条件下（すなわち、25℃、pH7.5および10分間の反応時間）、チロシンの１ミリ当量としてフェノール試剤で同じ色を与えるTCA可溶性生成物を毎分当たり遊離するような初期速度でヘモグロビンを消化する酵素の量として定義される。
分析方法をより詳しく記載する折りたたんだ印刷物は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に要求することにより入手可能であり、これは番号を利用して本明細書に加えられる。
実施例
本発明を更に次の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
例１
大豆タンパク質加水分解
濃縮大豆タンパク質（Unico 75, Loders Crooklaan, NL）を50℃で脱イオン水に懸濁させた。
混合物を85℃で３分間加熱し次いで55℃加水分解の温度に冷却した。４ＮのNaOHを用いpHを8.5に調節した。
混合物を３つの比較実験のため３つの容器に分割した：
１）アルカラーゼ（商標）2.4ｌ、用量２ｗ／ｗ％のタンパク質含量、
ニュートラーゼ（商標）0.5ｌ、用量１ｗ／ｗ％のタンパク質含量、
フィターゼノボ（商標)(アスペルギルスフィターゼ、6900FYT／ｇ）、用量１mg／ｇ大豆コンセントレートを用いて加水分解する。フィターゼはpH＜6.6のとき加える。
２）アルカラーゼ（商標）2.4ｌ、用量２ｗ／ｗ％のタンパク質含量ニュートラーゼ（商標）0.5ｌ、用量１ｗ／ｗ％のタンパク質含量を用いて加水分解する。
３）pHをHClを用いて6.2に調節する。フィターゼノボ（商標)(アスパラギルスフィターゼ、6900FYT／ｇ）、用量１mg／ｇ大豆コンセントレート
３種の加水分解は、加水分解の程度および浸透圧モル濃度を監視することにより行った。結果を以下の表１および表２に示す。
加水分解の程度（％ DH)の双方の測定は、基質の増加せしめられた分解を示す。実験１は実験２（77.3％）と比較してより多くの可溶化したタンパク質（78.8％）を生成した。
例２
大豆ミールのインビトロＮ−消化率
２種のサンプルを調製した：
サンプルＡ：
１ｇの大豆ミール
サンプルＢ：
0.032ｇのフィターゼノボ（商標)(アスペルギルスフィターゼ、5000FYT／ｇ）を添加した１ｇの大豆ミール
各サンプルを、ペプシンと共にpH2.4で２時間インキュベートし次いでパンクレアチンと共にpH6.8で16時間と共にインキュベートした。消化されていないが懸濁したタンパク質をスルホサリチル酸で沈殿させた。未消化タンパク質（並びに他の未消化成分）を濾過により集めそして乾燥した。フィルターケーキおよびサンプルの乾燥物質を測定し、次いで窒素（Ｎ）の量をケールダール法により測定した。
Ｎ消化率を次のように計算した：
タンパク質消化率を、窒素（Ｎ）消化率に、6.25を乗ずることによって計算した。
次のタンパク質消化率結果を得た：
サンプルＡ（フィターゼなし）：88.4％
サンプルＢ（フィターゼあり）：89.9％
例３
見掛け窒素消化率に対するフィターゼの効果並びに豚における窒素利用
大豆−小麦−大豆ダイエットに関する豚（体重46−52kg）に対するバシラス試験
食物組成：
大 麦 50.8％
小 麦 20.0％
大 豆 24.0％
動物脂肪 2.0％
メラシー(Melasse) 1.0％
ミネラル、ビタミンおよびアミノ酸 2.2％
食物への無機ホスフェートの添加なし。食物を60℃超の温度でペレット化した。
バランス試験を、５日の適合期間および７日の採取期間により行なった。
12匹の豚を２つの群に分けた。第１の群に食物を与えそして第２の群に同じ食物を与えたが但し20.3ｇ／100kgフィード（feed）のフィターゼノボ（商標)(アスパルギルスフィターゼ、7370FYT／ｇ）を添加した。
食物、排せつ物および尿中の窒素の含量を測定しそして見掛け窒素消化率および窒素利用を計算した。
結果を以下の表３に示す。
本発明は、植物性タンパク質の溶解度を改善する方法に関する。更に詳しくは、植物性タンパク質源中のタンパク質を可溶化する方法に関し、この方法は植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ(Phytase）酵素で処理し、次いで植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素で処理することを含んでなる。もう一つの面において、本発明はフィターゼおよび１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加剤を含んでなる。
背景技術
タンパク質は、ａ．ｏ．哺乳動物およびレヤー（layers）に対する必須栄養因子である。大抵の家畜および多くの人々は、植物性タンパク質源から必要なタンパク質を得ている。重要な植物タンパク質源は、例えば穀物植物、マメ科植物および脂肪種子作物である。
加水分解された植物性タンパク質、例えば大豆タンパク質加水分解物は栄養素として、例えば食物および飲料に対する栄養添加物としてその適用が見出される。加水分解されたタンパク質は、未加水分解タンパク質よりもより容易に吸収される；何故ならタンパク質加水分解物は最も高い栄養価を有するものと考えられるからである。タンパク質加水分解物を製造する幾つかの方法は公知でありそして文献例えば米国特許4,324,805および国際公開（WO）92／15696に記載されている。
植物起源の本質的に全ての食物および飼料物質は、貯蔵リン源としてフィテート(phytate）およびフィチン酸を含有する〔注、review in E. Graft.(編）、phytic Acid, Chemistry and Applications、ミネアポリス、米国、1986〕。穀物植物中の約75−78％のリンがフィチン酸として結合している。フィテートは、全ての堅果、穀物植物、脂肪種子、胞子および花粉の１−３％を含んでなる。フィチン酸の錯塩は、フィチン（phytin）と称されている。
フィチン酸キレート鉱物例えばカルシウム、亜鉛、マグネシウムおよび鉄（これにより、天然に重要な鉱物の生物適合性を減少する）は、一般に抗栄養因子として考えられる。インビトロの研究ではフィチン酸は幾つかの動物タンパク質のペプシン消化を阻害し、一方トリプシン消化は影響されなかった〔注、Knuckles等、Journal of Food Science, 1989 54 1348−1350〕。
フィターゼは、フィテートをイノシトールおよび無機リンへの変換を触媒する酵素である。フィターゼは、例えばバシラス（Bacillus）、シュードモナス(Pseudomonas）、サッカロマイセス(Saccharomyces）およびアスペルギルス(Aspergillus）から得られてきた。
米国特許3,297,548において、飼料に無機リンを加えることを避けるため単胃動物の飼料に微生物フィターゼを加えることが提案された。
フィターゼを大豆の加工において用いられることが考察された。従って、ヨーロッパ公開特許0420358は、大豆ミル高レベルの抗栄養因子フィテートを含有し、このフィテートはこのタンパク質源を乳児食物並びに魚、子牛および他の非反すう動物においてこのタンパク質源を不適当ならしめる；何故ならフィテートはその中に存在する必須の鉱物とキレート形成するからである。
要約すると、植物性タンパク質源中に存在するフィテート／フィチン酸中に結合せしめられたリンを利用するため、又はフィチン酸錯体中で結合せしめられた天然に重要な鉱物を利用するため、フィターゼ酵素を利用することが先に提案された。
しかし、植物源、例えば穀物植物、マメ科植物および脂肪種子穀物中に存在するタンパク質の有効性を改善する必要がある、何故なら増加せしめられた有効性は、タンパク質加水分解プロセスの高収率並びに栄養上の利点、すなわち改善されたタンパク質の利用を導くからである。
発明の要約
今や以下の内容が見出された；すなわち、植物起源中に存在するタンパク質の溶解性は、植物起源を有効量のフィターゼ酵素で処理することにより増加できる。タンパク質分解プロセス中にフィターゼを添加することにより、より高程度の加水分解およい改善せしめられたタンパク質溶解性が得られ、そして収率が改善する。
従って、本発明は植物性タンパク質中のタンパク質を可溶化するための方法を提供し、その方法は有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
発明の詳細な開示
植物性タンパク質の可溶化
本発明は、植物性タンパク質源中のタンパク質の可溶化のための方法を提供し、これによりタンパク質加水分解物を得る。
前記方法は、次の工程：
（ａ）有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで
（ｂ）有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
タンパク質加水分解物を得るための公知方法と比較して、本発明方法はタンパク質の有効性を改善し、これにより増加せしめられた抽出、高収率および改善されたタンパク質の利用を導びく。
本発明方法に委ねられる植物性タンパク質源は全ての植物性タンパク質、特にマメ科植物、穀物植物、キク科植物又は十字花科植物である。好ましくは、マメ科植物は大豆、豆、えんどうおよびルピナス（ルピナスアルバス（Lupinus albus)）から選ばれ、より好ましくはマメ科植物は大豆である。好ましくは、穀物植物は、小麦、とうもろこし、大麦、ライ麦、からす麦、米、モロコシの類ごま（サザマムインジカム（Sesamum indicum)）およびきび（パニカムミリアセウム(Panicum miliaceum）から成る群から選ばれる。有用なキク科植物の例は、サンフラワー（ヘリアンタス（Helianthus)）であり、そして有用な十字花科植物の例は、西洋あぶらな（なたね、例えばブラシカナパス（Brassica napus）である。
植物性タンパク質源は好ましくは大豆である。
本発明方法に委ねられる植物性タンパク質は、「加工された形」を含む、あらゆる形をとることができ、ここにおいて乾燥物質のタンパク質含量は、タンパク質を本発明方法に委ねる前に増加される。例えば大豆タンパク質原料は、大豆、脂肪大豆フレーク、大豆あらびき粉、大豆濃縮物又は大豆単離物として得られ得る。このようなタンパク質原料は、典型的には約42％ないし約95％のタンパク質を含有する。
タンパク質源は、本発明方法に委ねる前に常法で予備処理されてもよい。特に、タンパク質源を乾燥しおよび／又は粉砕し、すなわちあらびき粉又はフレーク（例えば大豆あらびき粉又はフレーク）に加工される。
本発明方法の２工程、（ａ）および（ｂ）は、連続工程として行うことができ、又は２つの行程を同時に行なうことができる。
また、植物性タンパク質源を、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素を含んでなる１種の酵素調製品で処理され、又は植物性タンパク質源は１種以上のフィターゼ酵素および／又はタンパク質分解酵素を含んでなる２種以上の酵素で処理できる。
現在次のように考えられている；すなわち本発明方法は約pH３〜約pH９、より好ましくは約pH４〜約pH９の懸濁液のpHで好ましく行なわれる。
また、次のように企図される；すなわち本発明方法は約10℃〜約70℃、より好ましくは約35℃〜約65℃の温度で好ましく行なわれる。
より特異的態様において、本発明方法は、
（ｉ）植物性タンパク質源を水中に懸濁させ；
（ii）水性懸濁液を、１種又はそれ以上のフィターゼ酵素および１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて酵素処理に委ねることによりタンパク質をタンパク加水分解し；
（iii）酵素を失活させ；次いで所望により
（iv）可溶化タンパク質を水性懸濁液から分離する連続工程を含んでなる。
酵素の失活は、酵素を失活させる常法により、例えば熱処理により、すなわち加水分解懸濁液又は混合物の温度を酵素が変性する温度、典型的には85℃超の温度に上げることにより行うことができる。
分離工程は、懸濁液から加水分解されたタンパク質を常法により、例えばタンパク質加水分解物を含有する懸濁液を遠心分離又は膜濾過により行うことができる。
一般的に、本発明方法は米国特許4,324,805、米国特許4,100,024およびWO92／15696(これらの公報はその番号を引用して本明細書に加えられる）に記載の如く、タンパク質加水分解物を得る常法に類似の方法で行うことができる。
フィターゼ酵素
植物性タンパク質源中のタンパク質を可溶化するための本発明方法は、植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素で処理することを含んでなる。
本発明に関連して、フィターゼ酵素は種々のミオイノシトール(myoinositol）ホスフェートから無機リンの除去を触媒する酵素である。フィターゼ酵素は、好ましくは微生物源、例えば細菌、菌類および酵母から由来しそして植物起源であってもよい。
好ましい態様において、フィターゼ酵素は菌類、菌株、特にアスペルギルス(Aspergillus）菌株、好ましくはアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）菌株、アスペルギルスフィクム（Aspergillus ficuum）菌株、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)菌株、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）菌株、アスペルギルステレウス(Aspergillus terreus）菌株およびアスペルギルスニドランス（Aspergillus nidulans）菌株から由来する。
アスペルギルスニガー菌株又はアスペルギルスオリゼ菌株から由来するフィターゼ酵素が最も好ましい。
もう一つの好ましい態様において、フィターゼ酵素は細菌菌株、特にバシラス（Bacillus）菌株又はシュードモナス(Pseudomonas)菌株から由来する。
更にもう一つの好ましい態様において、フィターゼ酵素は酵母、特にクルベロマイセス（Kluveromyces）菌株又はサッカロマイセス（Saccharomyces）菌株から由来する。好ましくは、フィターゼ酵素はサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の菌株から由来する。
本発明に関連し、「由来する酵素」は、特定の菌株により天然に生産される酵素又は、特定の菌株から単離されたDNA配列によりコードされそして該DNA配列で形質転換された宿主生物体内で生産される酵素を含む。
フィターゼ酵素は、好適な技術を用い対照の微生物から由来できる。特に、フィターゼ酵素は、好適な栄養培地内でフィターゼ生産微生物を発酵し、次いで公知方法で酵素を単離することにより得られる。
培養して用いられるブロス又は倍地は、対象の宿主細胞の増殖に好適な全ての好都合の培地であってよく、そして従来技術の原則に従って構成され得る。培地は、好ましくは炭素および窒素源並びに他の無機塩を含有する。適当な培地、例えば最少又は複合培地は商業上の供給者から入手可能であるか、又は出版されたレシート（receipts）、例えばアメリカン タイプ カルチア コレクション（ATCC）菌株カタログに従って生産できる。
培養後、フィターゼ酵素は培養ブロスからタンパク質の単離および精製のための常法により回収される。周知の精製手順には、遠心又は濾過により培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムの如き塩により培地のタンパク質成分の沈殿、およびクロマトグラフィー法例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等により培地から細胞を分離することが含まれる。
択一的に、フィターゼ酵素は例えばヨーロッパ特許公開420358（この公報はその番号を引用して本明細書に加えられる）に記載される如く、組換えDNA工学を用い多量に好ましく生産される。
好ましくは、種アスペルギルス フィクム（Aspergillus ficuum）又はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger）から得られるフィターゼコード遺伝子で形質転換された種アスペルギルスの菌類を、ヨーロッパ特許公開420358に記載の如きフィターゼコード遺伝子の発現を助成する条件下で培養される。
フィターゼ含有発酵ブロスを、本発明の（調合物）において使用される前にブロス濾過および限外濾過により好ましく処理される。
現在次のように考えられている；すなわち、植物性タンパク質の溶解度を改善するために有効なフィターゼの量は、１kgのタンパク質源当たり、約２〜約50000FYT（後に定義する如き）、好ましくは１kgのタンパク質源当たり約50〜約30000FYT、最も好ましくは１kgのタンパク質源当たり約100〜約10000FYTの量に相当する。
タンパク質分解酵素
植物性タンパク質源中のタンパク質の可溶化のための本発明方法はまた、植物性タンパク質源を有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素で処理することを含んでなる。
タンパク質分解酵素は、微生物酵素、好ましくは細菌又は菌類菌株から由来するプロテアーゼであってよく、又はタンパク質分解酵素はバシラス菌株、好ましくはバシラススブチリス(Bacillus subtilis）菌株又はバシラスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）菌株から由来する細菌プロテアーゼである。商業的に入手可能なバシラスプロテアーゼは、アルカラーゼ（Alcalase)(商標）およびニュートラーゼ（Newtrase)(商標)(ノボノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク）である。もう一つの好ましい態様において、タンパク質分解酵素は、アスペルギルス(Aspergillus）菌株、好ましくはアスペルギルスアクレタス(Aspergillus aculeatus）菌株、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger）菌株、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）菌株から由来する菌類プロテアーゼである。商業的に入手可能なアスペルギルスプロテアーゼはフレーバーザイム（Flavourzyme）(商標)(ノボノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク）である。
現在次のように考えられている；すなわち、植物性タンパク質の溶解度を改善するために有効なタンパク質分解酵素の量は、１kgのタンパク質源当たり約0.0001〜約0.5AU(後に定義する如き）、好ましくは１kgのタンパク質源当たり約0.001〜約0.05AU、より好ましくは１kgのタンパク質当たり約0.005〜約0.03AUの量に相当する。
追加酵素
前記の如く、本発明は植物性タンパク質中のタンパク質を可溶化するための方法を提供し、この方法は次の工程：
（ａ）有効量の１種又はそれ以上のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；次いで
（ｂ）有効量の１種又はそれ以上のタンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる。
本発明の２つの工程、（ａ）および（ｂ）は、連続工程として行うことができ、又は２つの工程は同時に行うこともできる。
好ましい態様において、本発明は更に、（ｃ）脂肪分解酵素およびグルコシダーゼ酵素から成る群から選ばれる１種又はそれ以上の酵素の有効量を用い植物性タンパク質源を処理する工程を含んでなる。
本発明方法の３つの工程、（ａ)，(ｂ）および（ｃ）は、連続工程として行うことができ、又は３つの工程は同時に行うことができる。又は本発明方法の２つの工程、（ａ）および（ｂ）は同時に行うことができ、ついで工程（ｃ）を行う。
工程（ｃ）のタンパク質分解酵素は、あらゆるトリアシルグリセロールリパーゼ（EC３．１．１．３）であってよい。
工程（ｃ）のグリコシダーゼ酵素は、あらゆるグリコシダーゼ酵素（EC３．２、カルボヒドラーゼとして公知）であってよい。好ましくは、グルコシダーゼ酵素は、アミラーゼ特にα−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼ、セルラーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．４）又はエンド−１，３−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、キシラナーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．８）又はキシラン−エンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC３．２．１．32）、α−ガラクトシダーゼ（EC３．２．１．22）、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、エンドグルカナーゼ、特にエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
より好ましい態様において、グルコシダーゼ酵素は、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、又はエンドグルカナーゼ、好ましくはエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
産業上の適用
植物性タンパク質源におけるタンパク質の可溶化のための本発明方法は、種々の産業においてその適用が見出される。特に、本発明方法は栄養素として、例えば食品および飲料に対する栄養添加物としてタンパク質加水分解物の製造に対する適用を見出す。
従って、もう一つの面において、本発明は本発明方法によって植物性タンパク質源から得られるタンパク質加水分解物を提供する。
本発明のタンパク質加水分解物は、食品又は飲料に添加でき、これにより栄養価を増加させる。
特に、本発明のタンパク質加水分解物は、動物飼料、例えば単胃動物用飼料材料に添加できる。
動物飼料添加剤
本発明は、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加剤を提供する。
動物飼料に添加するとき、１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素の組合わせは、植物起源の動物飼料中に存在するタンパク質の有効性を改善し、これにより植物性タンパク質の増加せしめられた抽出、高タンパク質収率および改善されたタンパク質利用性が導びかれる。これにより、窒素消化能およびまぐさの栄養価が高まり、そして動物の成長比および／又は飼料変換比（すなわち、重量増加に対する消化された飼料の重量）が改善される。
本発明に関連して、動物飼料添加剤は１種以上のフィターゼ酵素および１種以上のタンパク質分解酵素および適当な担体および／又は賦形剤を含んでなる酵素調製品であり、そしてこの酵素調製品は動物飼料に添加されるのに適した形で提供される。本発明の動物飼料添加剤は、当業者に公知の方法により製造されそして乾燥又は液体調製品の形であってよい。調製品に含まれる酵素は、当業者に公知方法で所望により安定化される。
特異態様において、本発明の動物飼料添加剤は粒状酵素製品でありこれは飼料成分と容易に混合され、又はより好ましくはプレミックスの成分を形成する。粒状酵素製品は、被覆され又は被覆されなくてよい。酵素粒質物の粒径は、飼料およびプレミックス成分のそれに匹敵する。これは酵素を飼料に配合する安全かつ好都合な手段を提供する。
もう一つの特異的態様において、本発明の動物飼料添加剤は、安定化液体組成物であり、これは水性又はオイル基材スラリーであってよい。
更にもう一つの特異的態様において、１種以上の酵素が飼料のペレット化もしくは押出前又はペレット化もしくは押後に適用される。
本発明の動物飼料添加剤は、（飼料成分を改変することにより）インビトロで又はインビボでその効果を発現する。本発明の飼料添加物は高量の植物性タンパク質、特にマメ科植物、穀物植物、キク科植物又は十字花科植物を含有する動物飼料組成物への添加に特に適している。好ましくは、マメ科植物は大豆、ファバビーン（faba bean)、えんどうおよび／又はルピナス(Lupinus albus）である。最も好ましくはマメ科植物は大豆である。好ましくは、穀物は、小麦、とうもろこし、大麦、ライ麦、からす麦、米、ごま(Sesamum indicum）およびきび(Panicum miliaceum）である。キク花植物の例は、ひまわり（Helianthus）であり、そして有用な十字花科植物の例は西洋あぶらな（なたね、例えばBrassica napus）である。
もう一つの好ましい態様において、本発明は脂肪分解酵素およびグルコシダーゼ酵素から成る群から選ばれる１種以上の追加の酵素を含んでなる動物飼料添加剤を提供する。
脂肪分解酵素はトリアシルグリセロールリパーゼ（EC３．１．１．３）であってよい。
グリコシダーゼ酵素は、全てのグリコシダーゼ酵素（EC３．２、カルボヒドラーゼとして公知）であってよい。好ましくは、グルコシダーゼ酵素は、アミラーゼ特にα−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼ、セルラーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．４）又はエンド−１，３−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、キシラナーゼ、特にエンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．８）又はキシラン−エンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC３．２．１．32）、α−ガラクトシダーゼ（EC３．２．１．22）、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、エンドグルカナーゼ、特にエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
より好ましい態様において、グルコシダーゼ酵素は、ポリガラクツロナーゼ（EC３．２．１．15）、セルロース−１，４−β−セロビオシダーゼ（EC３．２．１．91）、又はエンドグルカナーゼ、好ましくはエンド−１，６−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．75）、エンド−１，２−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．71）、エンド−１，３−β−グルカナーゼ（EC３．２．１．39）又はエンド−１，３−α−グルカナーゼ（EC３．２．１．59）である。
現在次のように考えられている；すなわち動物飼料添加剤のpHは数pH２〜約pH８の範囲内にあるべきである。
現在次のように考えられる；すなわち動物飼料添加剤中のフィターゼ活性の量は、全組成物１ｇ当たり約200〜約50000FYT（以下に定義）の範囲内、好ましくは全組成物１ｇ当たり約500〜約10000FYTの範囲内、最も好ましくは全組成物１ｇ当たり約2000〜約6000FYTの範囲内にあるべきである。
好ましくは、動物飼料に添加される添加物の量は、飼料１kg当たり少なくとも50FYT、より好ましくは飼料１kg当たり約100〜約2000FYTを含有する飼料組成物を提供するために十分である。
次のように理解されるべきである；すなわち、栄養価、すなわち窒素消化能を高めるため飼料に添加されるべきフィターゼ単位の実際量は、飼料それ自身の組成に依存するであろう。高量のフィチン酸を含有する飼料は、一般により高量のフィターゼ活性の付加を要求するであろう。必要量のフィターゼは当業者により容易に測定されるであろう。
フィターゼ活性(FYT)
フィターゼ活性は基質としてフィチン酸ナトリウムを用いて測定され得る。フィターゼの作用に委ねるとき、無機リンはフィチン酸ナトリウムから放出される。鉄／モリブデン含有試剤においてホスホラウス（phosphorous)(PO4）は錯体を形成し、これは750nmで分光測定により監視できる。
１フィターゼ単位(FYT）は、標準条件下（すなわち、pH5.5，37℃で、50mMのフィチン酸ナトリウムの基質温度そして30分の反応時間）、毎分１μmolを遊離する酵素の量として定義される。
この分析方法をより詳しく記載する標準操作手順EAL-SM-0403.01は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に要求により入手可能であり、この出版物はその番号を引用して本明細書に加入される。
プロテアーゼ活性（AU）
タンパク質分解活性は、基質として変性ヘモグロビンを用いて測定できる。タンパク質分解活性を測定するアンソン−ヘモグロビン法において、変性ヘモグロビンを消化され、そして未消化ヘモグロビンは三塩化酢酸(TCA）で沈殿する。TCA可溶性生成物の量は、フェノール試薬で測定され、これはチロシンおよびトリプトファンで青色を与える。
１アンソン単位（AU）は、標準条件下（すなわち、25℃、pH7.5および10分間の反応時間）、チロシンの１ミリ当量としてフェノール試剤で同じ色を与えるTCA可溶性生成物を毎分当たり遊離するような初期速度でヘモグロビンを消化する酵素の量として定義される。
分析方法をより詳しく記載する折りたたんだ印刷物は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に要求することにより入手可能であり、これは番号を利用して本明細書に加えられる。
実施例
本発明を更に次の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
例１
大豆タンパク質加水分解
濃縮大豆タンパク質（Unico 75, Loders Crooklaan, NL）を50℃で脱イオン水に懸濁させた。
混合物を85℃で３分間加熱し次いで55℃加水分解の温度に冷却した。４ＮのNaOHを用いpHを8.5に調節した。
混合物を３つの比較実験のため３つの容器に分割した：
１）アルカラーゼ（商標）2.4ｌ、用量２ｗ／ｗ％のタンパク質含量、
ニュートラーゼ（商標）0.5ｌ、用量１ｗ／ｗ％のタンパク質含量、
フィターゼノボ（商標)(アスペルギルスフィターゼ、6900FYT／ｇ）、用量１mg／ｇ大豆コンセントレートを用いて加水分解する。フィターゼはpH＜6.6のとき加える。
２）アルカラーゼ（商標）2.4ｌ、用量２ｗ／ｗ％のタンパク質含量ニュートラーゼ（商標）0.5ｌ、用量１ｗ／ｗ％のタンパク質含量を用いて加水分解する。
３）pHをHClを用いて6.2に調節する。フィターゼノボ（商標)(アスパラギルスフィターゼ、6900FYT／ｇ）、用量１mg／ｇ大豆コンセントレート
３種の加水分解は、加水分解の程度および浸透圧モル濃度を監視することにより行った。結果を以下の表１および表２に示す。
例２
大豆ミールのインビトロＮ−消化率
２種のサンプルを調製した：
サンプルＡ：
１ｇの大豆ミール
サンプルＢ：
0.032ｇのフィターゼノボ（商標)(アスペルギルスフィターゼ、5000FYT／ｇ）を添加した１ｇの大豆ミール
各サンプルを、ペプシンと共にpH2.4で２時間インキュベートし次いでパンクレアチンと共にpH6.8で16時間と共にインキュベートした。消化されていないが懸濁したタンパク質をスルホサリチル酸で沈殿させた。未消化タンパク質（並びに他の未消化成分）を濾過により集めそして乾燥した。フィルターケーキおよびサンプルの乾燥物質を測定し、次いで窒素（Ｎ）の量をケールダール法により測定した。
Ｎ消化率を次のように計算した：
次のタンパク質消化率結果を得た：
サンプルＡ（フィターゼなし）：88.4％
サンプルＢ（フィターゼあり）：89.9％
例３
見掛け窒素消化率に対するフィターゼの効果並びに豚における窒素利用
大豆−小麦−大豆ダイエットに関する豚（体重46−52kg）に対するバシラス試験
食物組成：
大 麦 50.8％
小 麦 20.0％
大 豆 24.0％
動物脂肪 2.0％
メラシー(Melasse) 1.0％
ミネラル、ビタミンおよびアミノ酸 2.2％
食物への無機ホスフェートの添加なし。食物を60℃超の温度でペレット化した。
バランス試験を、５日の適合期間および７日の採取期間により行なった。
12匹の豚を２つの群に分けた。第１の群に食物を与えそして第２の群に同じ食物を与えたが但し20.3ｇ／100kgフィード（feed）のフィターゼノボ（商標)(アスパルギルスフィターゼ、7370FYT／ｇ）を添加した。
食物、排せつ物および尿中の窒素の含量を測定しそして見掛け窒素消化率および窒素利用を計算した。
結果を以下の表３に示す。
Claims (24)
- １又は複数のフィターゼ酵素、および１又は複数のタンパク質分解酵素を含んでなる、動物飼料添加剤。
- タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第１項に記載の飼料添加剤。
- １又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素を含んでなる、動物飼料。
- タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第３項に記載の飼料。
- 動物飼料を調製する方法であって、飼料成分に、
i) １又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素；あるいは
ii) 請求の範囲第１項記載の動物飼料添加剤、
を添加する工程を含んでなる方法。 - 飼料成分が植物性タンパク質源を含んでなる、請求の範囲第５項に記載の方法。
- 植物性タンパク質源がマメ科植物、キク科植物、十字花科植物、穀物植物、又はそれらの混合物である、請求の範囲第６項に記載の方法。
- 植物性タンパク質源が大豆である、請求の範囲第７項に記載の方法。
- 添加が飼料のペレット化又は押し出しの前又は後に行われる、請求の範囲第５項に記載の方法。
- タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第５項に記載の方法。
- 請求の範囲第５項に記載の方法によって得ることができる動物飼料。
- １又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素で植物性タンパク質源を処理することによって得ることができる、タンパク質加水分解物を含んでなる動物飼料。
- タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第１２項に記載の動物飼料。
- 動物飼料添加剤の製造方法であって、１又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素を、適当な担体および／又は適当な賦形剤に添加する工程を含んでなる方法。
- タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第１４項に記載の方法。
- １又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素を使用する方法であって、１又は複数の以下の目的、
(i) 動物飼料における、
(ii) 動物飼料の栄養価の改善、
(iii) 動物の成長比の改善、
(iv) 動物の飼料変換比の改善、および／又は
(v) 動物におけるタンパク質利用性の改善、
のための前記方法。 - タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第１６項に記載の方法。
- 動物飼料添加剤を製造するための、１又は複数のフィターゼ酵素および１又は複数のタンパク質分解酵素を使用する方法であって、１又は複数の以下の目的、
(i) 動物飼料における使用、
(ii) 動物飼料の栄養価の改善、
(iii) 動物の成長比の改善、
(iv) 動物の飼料変換比の改善、および／又は
(v) 動物におけるタンパク質利用性の改善、
のための前記方法。 - タンパク質分解酵素が細菌性タンパク質分解酵素の中から選択される、請求の範囲第１８項に記載の方法。
- 植物性タンパク質源中のタンパク質を可溶化するための方法であって、次の工程：
（ａ）有効量の１又は複数のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；
（ｂ）有効量の１又は複数の細菌性タンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理することを含んでなる、前記方法。 - 更に次の工程、（ｃ）有効量の１若しくは複数の脂肪分解酵素および／又は１若しくは複数のグリコシダーゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理すること、
を含んでなる、請求の範囲第２０項記載の方法。 - グリコシダーゼ酵素がカルボヒドラーゼである、請求の範囲第２０項記載の方法。
- タンパク質加水分解物を製造する方法であって、（ａ）有効量の１又は複数のフィターゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理し；
（ｂ）有効量の１又は複数の細菌性タンパク質分解酵素を用いて植物性タンパク質源を処理すること、
を含んでなる、前記方法。 - 更に（ｃ）有効量の１若しくは複数の脂肪分解酵素および／又は１若しくは複数のグリコシダーゼ酵素を用いて植物性タンパク質源を処理すること、
を含んでなる、請求の範囲第２３項記載の方法。
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