DE69524951T3 - Verfahren zum verbessern der löslichkeit von pflanzlichen proteinen - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbessern der Löslichkeit von pflanzlichen Proteinen. Spezieller betrifft die Erfindung Verfahren zur Solubilisierung von Proteinen in pflanzlichen Proteinquellen, welche Verfahren umfassen, die pflanzliche Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Phytaseenzymen, einem oder mehreren proteolytischen Enzymen und einem oder mehreren lipolytischen Enzymen und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen zu behandeln. Unter einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Tierfutterzusätze bereit, die solche Enzyme umfassen.
  • ZUGRUNDELIEGENDER STAND DER TECHNIK
  • Protein ist ein essentieller Ernährungsfaktor für u. a. Säugetiere und Legehennen. Die meisten Lebewesen und viele Menschen erhalten die notwendigen Proteine aus pflanzlichen Proteinquellen. Wichtige pflanzliche Proteinquellen sind z. B. Getreidepflanzen, Legumen und Olsamenpflanzen.
  • Hydrolysierte pflanzliche Proteine, wie Sojabohnen-Hydrolysa-te, finden Anwendung als Nährsubstanzen, z. B. als Nährzusätze zu Nahrungsmitteln/Futter und Tränken. Hydrolysierte Proteine werden leichter absorbiert als nicht-hydrolysiertes Protein, weshalb man annimmt, dass Proteinhydrolysate den höchsten Nährwert aufweisen. Es sind mehrere Methoden zum Herstellen von Proteinhydrolysaten bekannt und in der Literatur beschrieben, siehe z. B. US 4,324,805 und WO 92/15696 .
  • Im wesentlichen alle Lebensmittel- und Futtersubstanzen, die von Pflanzen stammen, enthalten Phytat und Phytinsäure als eine Phosphor-Speicherquelle [siehe Übersicht in E. Graf (Hrsg.), Phytic Acid, Chemistry and Applications, Minneapolis, U.S.A., 1986]. Ungefähr 75 bis 78% des Phosphors in Getreiden ist als Phytinsäure gebunden. Phytat macht 1–3% aller Nüsse, Getreide, Legumen, Ölsamen, Sporen und Pollen aus. Komplexe Salze von Phytinsäure werden als Phytin bezeichnet.
  • Phytinsäure komplexiert Mineralien, wie Calcium, Zink, Magnesium und Eisen, wodurch die biologische Verfügbarkeit von für die Ernährung wichtigen Mineralien verringert wird, und wird im allgemeinen als ein Anti-Ernährungs-Faktor angesehen. In vitro-Studien zeigen, dass Phytinsäure den Pepsinverdau von einigen tierischen Proteinen inhibiert, wohingegen der Trypsinverdau nicht beeinflusst wurde [siehe Knuckles et al., Journal of Food Science, 1989 54 1348–1350].
  • Phytasen sind Enzyme, die die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor katalysieren. Phytasen sind z. B. aus Bacillus, Pseudomonas, Saccharomyces und Aspergillus gewonnen werden.
  • In US 3,297,548 ist vorgeschlagen worden, Futtermaterialien für monogastrische Tiere mikrobielle Phytasen zuzusetzen, um zu vermeiden, dem Futter anorganischen Phosphor zur Ergänzung zuzusetzen.
  • Es ist ebenfalls daran gedacht worden, dass Phytasen bei der Verarbeitung von Soja eingesetzt werden könnten. So berichtet EP-A-0 420 358 , dass Sojabohnenmehl hohe Konzentrationen des Anti-Ernährungs-Faktors Phytat enthält, was diese Proteinquelle für eine Anwendung in Babynahrung wie auch in Futter für Fische, Kälber und andere Nicht-Wiederkäuer ungeeignet macht, da das Phytat essentielle Mineralien, die darin enthalten sind, komplexiert.
  • EP 0 682 877 , welche unter Art 54 (3) EPÜ nur gültig ist, soweit sie einen Anspruch auf Priorität hat, betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Hülsenfrüchten durch Fermentierung mit einem Koji-Pilz, welcher beta-Glucosidase, Phytase, Phosphatase und Protease produziert.
  • Zusammenfassend ist bereits zuvor vorgeschlagen worden, Phytaseenzyme entweder zum Ausnutzen des in dem Phytat/der Phytinsäure gebundenen Phosphats, das in pflanzlichen Proteinquellen enthalten ist, auszunutzen oder um die in Phytinsäurekomplexen gebundenen für die Ernährung wichtigen Mineralien auszunutzen.
  • Jedoch besteht eine Notwendigkeit, die Verfügbarkeit der in pflanzlichen Quellen, z. B. Getreiden, Legumen und Ölsaat-Pflanzen, vorhandenen Proteine zu verbessern, da eine erhöhte Verfügbarkeit zu höheren Ausbeuten von Proteinhydrolysierprozessen wie auch Nutzen hinsichtlich der Ernährung, z. B. einer verbesserten Proteinausnutzung, führt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist jetzt festgestellt worden, dass die Löslichkeit von Proteinen, die in pflanzlichen Quellen vorhanden sind, erhöht werden kann, indem die pflanzliche Quelle mit einer wirksamen Menge eines Phytaseenzyms behandelt wird. Durch Zugeben einer Phytase während eines proteolytischen Prozesses werden höhere Hydrolyseausmaße und verbesserte Proteinlöslichkeit erzielt und die Ausbeuten werden verbessert.
  • Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Solubilisieren von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle bereit, welches Verfahren umfasst, die pflanzliche Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Phytaseenzymen, einem oder mehreren proteolytischen Enzymen und einem oder mehreren lipolytischen Enzymen und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen zu behandeln, wie in Anspruch 1 beansprucht.
  • Unter einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen Tierfutterzusatz bereit, der solche Enzyme enthält, wie in Anspruch 2 beansprucht.
  • DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Solubilisierung von pflanzlichen Proteinen
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Solubilisierung von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle wie in Anspruch 1 definiert bereit.
  • Verglichen mit bekannten Verfahren zum Gewinnen von Proteinhydrolysaten verbessert das vorliegende Verfahren die Verfügbarkeit der Proteine, was zu erhöhter Extraktion, höheren Ausbeuten und verbesserter Proteinausnutzung führt.
  • Die pflanzliche Proteinquelle, die dem Verfahren der Erfindung unterworfen wird, kann eine beliebige proteinhaltige Pflanze sein, insbesondere eine Legume, ein Getreide, eine Komposite oder eine Crucifere. Vorzugsweise wird die Legume aus der Gruppe bestehend aus Sojabohne, Faba-Bohne, Erbse und Lupine (Lupinus albus) ausgewählt; mehr bevorzugt ist die Legume Sojabohnen. Vorzugsweise wird das Getreide aus der Gruppe bestehend aus Weizen, Korn, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum, Sesam (Sesamum indicum) und Hirse (Panicum miliaceum) ausgewählt. Ein Beispiel einer nützlichen Kompositen-Pflanze ist Sonnenblume (Helianthus) und ein Beispiel einer nützlichen Crucifere ist Raps (Rapssamen, z. B. Brassica napus).
  • Die pflanzliche Proteinquelle ist vorzugsweise Sojabohne.
  • Die proteinhaltige Pflanze, die dem Verfahren der Erfindung unterworfen wird, kann in einer jeglichen Form bereitgestellt werden, einschließlich „verarbeiteten Formen", worin der Proteingehalt des Trockenmaterials erhöht wird, bevor das Protein dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen wird. Beispielsweise kann Sojaprotein-Ausgangsmaterial als Sojabohnen, entfettete Sojaflocken, Sojabohnenmehl, Sojabohnenkonzentrat oder Sojabohnenisolat erhalten werden. Ein solches proteinhaltiges Ausgangsmaterial enthält typischerweise ungefähr 42% bis ungeführ 95% Protein.
  • Die Proteinquelle kann in einer jeglichen herkömmlichen Weise vorbehandelt werden, bevor sie dem Verfahren der Erfindung unterworfen wird. Insbesondere kann die Proteinquelle getrocknet und/oder zerkleinert, d. h. in Mehl oder Flocken (wie Sojabohnenmehl oder -flocken) verarbeitet werden.
  • Die zwei Schritte (a) und (b) des Verfahrens der Erfindung können als aufeinanderfolgende Schritte ausgeführt werden oder die zwei Schritte können gleichzeitig ausgeführt werden.
  • Auch kann die pflanzliche Proteinquelle mit einem Enzympräparat behandelt werden, das ein oder mehrere Phytaseenzyme und ein oder mehrere proteolytische Enzyme umfasst, oder die pflanzliche Proteinquelle kann mit zwei oder mehr Enzym, die ein oder mehrere Phytaseenzyme und/oder ein oder mehrere proteolytische Enzyme umfassen, behandelt werden.
  • Es wird gegenwärtig angenommen, dass das Verfahren der Erfindung vorzugsweise bei einem pH der Suspension von ungefähr 3 bis ungefähr 9, mehr bevorzugt von ungefähr pH 4 bis ungefähr pH 7 ausgeführt wird.
  • Es wird ebenfalls angenommen, dass das Verfahren der Erfindung vorzugsweise bei einer Temperatur von ungefähr 10°C bis ungefähr 70°C, mehr bevorzugt von ungefähr 35°C bis ungefähr 65°C ausgeführt wird.
  • In einer spezielleren Ausführungsform umfasst das Verfahren die aufeinanderfolgenden Schritte
    Suspendieren einer pflanzlichen Proteinquelle in Wasser;
    proteolytisches Hydrolysieren des Proteins, indem die Suspension einer enzymatischen Behandlung mit einem oder mehreren Phytaseenzymen und einem oder mehreren proteolytischen Enzymen unterworfen wird;
    Inaktivieren der Enzyme und gegebenenfalls
    Abtrennen des hydrolysierten Proteins von der Suspension.
  • Die Inaktivierung des Enzyms kann durch herkömmliche Methoden zum Inaktivieren von Enzymen ausgeführt werden, z. B. durch Wärmebehandlung, d. h. Erhöhen der Temperatur der Hydrolysesuspension oder -mischung auf eine Temperatur, die die Enzyme denaturiert, typischerweise auf eine Temperatur von über 85°C.
  • Der Trennschritt kann durch herkömmliche Methoden zum Abtrennen von hydrolysiertem Protein von Suspensionen ausgeführt werden, z. B. durch Zentrifugation oder Membranfiltration der Suspension, die das Proteinhydrolysat enthält.
  • Allgemein gesagt, kann das Verfahren der Erfindung ähnlich zu herkömmlichen Methoden zum Gewinnen von Proteinhydrolysaten ausgeführt werden, z. B. wie in US 4,324,805 , US 4,100,024 und WO 92/15696 beschrieben.
  • Phytaseenzyme
  • Das Verfahren der Erfindung zur Solubilisierung von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle umfasst das Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Phytaseenzymen.
  • In dem Kontext dieser Erfindung ist ein Phytaseenzym ein Enzym, das die Entfernung von anorganischem Phosphor von verschiedenen Myoinositolphosphaten katalysiert. Phytaseenzyme werden vorzugsweise von einer mikrobiellen Quelle, wie Bakterien, Pilzen und Hefen, abgeleitet, können aber auch von pflanzlicher Herkunft sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phytaseenzym von einem Pilzstamm, insbesondere einem Stamm von Aspergillus, z. B. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans und Aspergillus terreus, abgeleitet. Am meisten bevorzugt ist ein Phytaseenzym, das von einem Stamm von Aspergillus niger oder einem Stamm von Aspergillus oryzae abgeleitet ist.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Phytase-enzym von einem Bakterienstamm, insbesondere einem Bacillus-Stamm oder einem Pseudomonas-Stamm abgeleitet. Vorzugsweise ist das Phytaseenzym von einem Stamm von Bacillus subtilis abgeleitet.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Phytaseenzym von einer Hefe, insbesondere einem Kluveromyces–Stamm oder einem Saccharomyces-Stamm, abgeleitet. Vorzugsweise ist das Phytaseenzym von einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae abgeleitet.
  • In dem Kontext dieser Erfindung umfasst „ein Enzym, abgeleitet von" ein Enzym, das natürlicherweise von dem jeweiligen Stamm produziert wird, entweder aus jenem Stamm gewonnen wird oder von einer DNA-Sequenz, die aus diesem Stamm isoliert worden ist, codiert und in einem mit dieser DNA-Sequenz transformierten Wirtsorganismus produziert wird.
  • Das Phytaseenzym kann aus dem fraglichen Mikroorganismus durch Verwendung einer jeglichen geeigneten Technik gewonnen werden. Insbesondere kann das Phytaseenzym durch Fermentation eines Phytase produzierenden Mikroorganis mus in einem geeigneten Nährmedium, gefolgt von Isolierung des Enzyms durch in diesem Fachgebiet bekannte Methoden erhalten werden.
  • Die Brühe oder das Medium, die zum Kultivieren verwendet werden, kann ein jegliches herkömmliches Medium sein, das zum Vermehren der fraglichen Wirtszelle geeignet ist, und kann gemäß den Grundsätzen des Standes der Technik zusammengesetzt sein. Das Medium enthält vorzugsweise Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und andere anorganische Salze. Geeignete Medien, z. B. Minimal- oder komplexe Medien, sind von kommerziellen Vertreibern erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Belegen, z. B. dem „American Typ Culture Collection (ATCC) Catalogue of strains", hergestellt werden.
  • Nach der Kultivierung wird das Phytaseenzym durch herkömmliche Methoden zur Isolierung und Reinigung von Proteinen aus einer Kulturbrühe gewonnen. Wohl bekannte Reinigungsverfahren umfassen das Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren von proteinhaltigen Bestandteilen des Mediums mittels eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, und chromatographische Methoden, wie z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie u. s. w.
  • Alternativ wird das Phytaseenzym vorzugsweise in größeren Mengen unter Verwendung von Techniken der in vitro-DNA-Rekombina-tion, z. B. wie in EP-A1-0 420 358 beschrieben, hergestellt.
  • Vorzugsweise wird ein Pilz der Spezies Aspergillus, der mit dem Phytase codierenden Gen, das aus der Spezies Aspergillus ficuum oder Aspergillus niger erhalten worden ist, transformiert worden ist, unter Bedingungen kultiviert, die der Expression des Phytase codierenden Gens förderlich sind, wie in EP-A1-0 420 358 beschrieben.
  • Die Phytase enthaltende Fermentationsbrühe wird vorzugsweise sowohl mittels Filtration als auch Ultrafiltration behandelt, bevor sie in der (Formulierung) der Erfindung verwendet wird.
  • Gegenwärtig wird angenommen, dass eine Menge von Phytase, die wirksam ist, die Löslichkeit des pflanzlichen Proteins zu verbessern, ungefähr 2 bis ungefähr 50000 FYT (wie unten definiert) pro kg pflanzlicher Proteinquelle, vorzugsweise ungefähr 50 bis ungefähr 30000 FYT pro kg pflanzlicher Proteinquelle, am meisten bevorzugt ungefähr 100 bis ungefähr 10000 FYT pro kg pflanzlicher Proteinquelle entspricht.
  • Proteolytische Enzyme
  • Das Verfahren der Erfindung zur Solubilisierung von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle umfasst auch das Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren proteolytischen Enzymen.
  • Das proteolytische Enzym kann ein mikrobielles Enzym sein, vorzugsweise eine Protease, die von einem Bakterien- oder Pilzstamm abgeleitet ist, oder das proteolytische Enzym kann Trypsin oder Pepsin sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das proteolytische Enzym eine bakterielle Protease, die von einem Stamm von Bacillus, vorzugsweise einem Stamm von Bacillus subtilis oder einem Stamm von Bacillus licheniformis, abgeleitet ist. Kommerziell erhältliche Bacillus-Proteasen sind AlkalaseTM und NeutraseTM (Novo Nordisk A/S, Dänemark). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das proteolytische Enzym eine pilzliche Protease, die von einem Stamm von Aspergillus, vorzugsweise einem Stamm von Aspergillus aculeatus, einem Stamm von Aspergillus niger, einem Stamm von Aspergillus oryzae abgeleitet ist. Eine kommerziell erhältliche Aspergillus-Protease ist FlavourzymeTM (Novo Nordisk A/S, Dänemark).
  • Gegenwärtig wird angenommen, dass die Menge an proteolytischem Enzym, die wirksam ist, um die Löslichkeit des pflanzlichen Proteins zu erhöhen, ungefähr 0,0001 bis ungefähr 0,5 AU (wie unten definiert) pro kg pflanzlicher Proteinquelle, bevorzugt ungefähr 0,001 bis ungefähr 0,05 AU pro kg pflanzlicher Proteinquelle, mehr bevorzugt ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,03 AU pro kg pflanzlicher Proteinquelle entspricht.
  • Zusätzliche Enzyme
  • Das Verfahren der Erfindung umfasst ferner den Schritt (c) Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Enzymen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lipolytischen Enzymen und Glycosidaseenzymen.
  • Die drei Schritte (a), (b) und (c) des Verfahrens der Erfindung können als nacheinander erfolgende Schritte ausgeführt werden oder die drei Schritte können gleichzeitig ausgeführt werden. Oder die zwei Schritte (a) und (b) des Verfahrens der Erfindung können gleichzeitig ausgeführt werden, gefolgt von Schritt (c).
  • Das lipolytische Enzym von Schritt (c) kann eine beliebige Triacylglycerollipase (EC 3.1.1.3) sein.
  • Das Glycosidaseenzym von Schritt (c) kann ein beliebiges Glycosidaseenzym (EC 3.2, auch als Carbohydrasen bekannt) sein. Vorzugsweise ist das Glycosidaseenzym eine Amylase, insbesondere eine α-Amylase oder eine β-Amylase, eine Cellulase, insbesondere eine Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4) oder eine Endo-1,3-β-glucanase (3.2.1.6), eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.8) oder eine Xylan-endo-1,3-β-xylosidase (EC 3.2.1.32), eine α-Galactosidase (EC 3.2.1.22), eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15, auch als Pectinasen bekannt), eine Cellulose-1,4-β-cellobiosidase (EC 3.2.1.91, auch als Cellobiohydrolasen bekannt), eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,6-β- glucanase (EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-β-glucanase (EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-β-glucanase (EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-α-glucanase (EC 3.2.1.59).
  • In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Glycosidaseenzym eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15), eine Cellulose-1,4-β-cellobiosidase (EC 3.2.1.91) oder eine Endoglucanase, vorzugsweise eine Endo-1,6-β-glucanase (EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-β-glucanase (EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-β-glucanase (EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-α-glucanase (EC 3.2.1.59).
  • Industrielle Anwendungen
  • Das Verfahren der Erfindung zur Solubilisierung von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle kann in verschiedenen Industriezweigen Anwendung finden. Insbesondere findet das Verfahren der Erfindung Anwendung für die Herstellung von Proteinhydrolysaten, die als Nährmittel, z. B. als Nährzusätze zu Nahrungsmitteln/Futter und Tränken, nützlich sind.
  • Dementsprechend stellt die Erfindung unter einem anderen Aspekt auch ein Proteinhydrolysat bereit, das aus einer pflanzlichen Proteinquelle durch das Verfahren der Erfindung erhalten worden ist.
  • Das Proteinhydrolysat der Erfindung kann Lebensmitteln/Futter oder Tränken zugesetzt werden, wodurch der Nährwert erhöht wird.
  • Insbesondere kann das Proteinhydrolysat der Erfindung Tierfutter, z. B. Futtermaterialien für monogastrische Tiere, zugesetzt werden.
  • Tierfutterzusätze
  • Die Erfindung stellt einen Tierfutterzusatz wie in Anspruch 2 definiert bereit.
  • Bei einem Zusatz zu Tierfutter verbessert die Kombination von einem oder mehreren Phytaseenzymen und einem oder mehreren proteolytischen Enzymen die Verfügbarkeit der in dem Tierfutter pflanzlichen Ursprungs vorhandenen Proteine, was zu einer erhöhten Extraktion der pflanzlichen Proteine, höheren Proteinausbeuten und verbesserter Proteinausnutzung führt. Dadurch werden die Stickstoffverdaulichkeit und der Nährwert des Futters erhöht und die Wachstumsgeschwindigkeit und/oder das Futterumwandlungsverhältnis (d. h. das Gewicht des aufgenommenen Futters bezogen auf die Gewichtszunahme) des Tiers wird verbessert.
  • In dem Kontext dieser Erfindung ist ein Tierfutterzusatz ein Enzympräparat, das ein oder mehrere Phytaseenzyme und ein oder mehrere proteolytische Enzyme und geeignete Träger und/oder Excipientien umfasst und welches Enzympräparat in einer Form, die für eine Zugabe zu Tierfutter geeignet ist, bereitgestellt wird. Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann gemäß Methoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden und kann in Form eines trockenen oder flüssigen Präparats vorliegen. Das in das Präparat aufzunehmende Enzym kann gegebenenfalls gemäß Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, stabilisiert werden.
  • In einer speziellen Ausführungsform ist der Tierfutterzusatz der Erfindung ein granuliertes Enzymprodukt, das leicht mit Futterbestandteilen gemischt werden kann oder, mehr bevorzugt, einen Bestandteil einer Vormischung („Pre-Mix") bilden kann. Das granulierte Enzymprodukt kann überzogen oder nicht-überzogen sein. Die Teilchengröße der Enzymgranulate ist vorzugsweise mit jener der Futter- und Vormischungsbestandteile verträglich. Dies stellt ein sicheres und bequemes Mittel zum Einbringen der Enzyme in Futter bereit.
  • In einer anderen speziellen Ausführungsform ist der Tierfutterzusatz der Erfindung eine stabilisierte flüssige Zusammensetzung, die eine wässrige oder auf Öl basierende Aufschlämmung sein kann.
  • In noch einer anderen speziellen Ausführungsform werden eines oder mehrere der Enzyme vor oder nach dem Pelletieren oder Extrudieren des Futters eingesetzt.
  • Der Tierfutterzusatz der Erfindung kann seine Wirkung entweder in vitro (durch Modifizieren von Bestandteilen des Futters) oder in vivo ausüben. Der Futterzusatz der Erfindung ist für eine Zugabe zu Tierfutterzusammensetzungen, die hohe Mengen an proteinhaltigen Pflanzen, insbesondere Legumen, Getreiden, Kompositen oder Cruciferen, enthalten, besonders geeignet. Vorzugsweise ist die Legume Sojabohne, Faba-Bohne, Erbse und/oder Lupine (Lupinus albus). Am meisten bevorzugt ist die Legume Sojabohnen. Vorzugsweise ist das Getreide Weizen, Korn, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum, Sesam (Sesamum indicum) und Hirse (Panicum miliaceum). Ein Beispiel einer Komposite-Pflanze ist Sonnenblume (Helianthus) und ein Beispiel einer nützlichen Crucifere ist Raps (Rapssamen, z. B. Brassica napus).
  • Die Erfindung stellt einen Tierfutterzusatz bereit, der ein oder mehrere zusätzliche Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lipolytischen Enzymen und Glucosidaseenzymen, umfasst.
  • Das lipolytische Enzym kann eine beliebige Triacylglycerollipase (EC 3.1.1.3) sein.
  • Das Glycosidaseenzym kann ein beliebiges Glycosidaseenzym (EC 3.2, auch als Carbohydrasen bekannt) sein. Vorzugsweise ist das Glycosidaseenzym eine Amylase, insbesondere eine α-Amylase oder eine β-Amylase, eine Cellulase, insbesondere eine Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4) oder eine Endo-1,3-β-glucanase (EC 3.2.1.6), eine Xylanase, insbesondere eine Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.8) oder eine Xylan-endo-1,3-β-xylosidase (EC 3.2.1.32), eine α-Galactosidase (EC 3.2.1.22), eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15, auch als Pectinasen bekannt), eine Cellulose-1,4-β-cellobiosidase (EC 3.2.1.91, auch als Cellobiohydrolasen be kannt), eine Endoglucanase, insbesondere eine Endo-1,6-_-glucanase (EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-β-glucanase (EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-β-glucanase (EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-α-glucanase (EC 3.2.1.59).
  • In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Glycosidaseenzym eine Polygalacturonase (EC 3.2.1.15), eine Cellulose-1,4-β-cellobiosidase (EC 3.2.1.91) oder eine Endoglucanase, vorzugsweise eine Endo-1,6-β-glucanase (EC 3.2.1.75), eine Endo-1,2-β-glucanase (EC 3.2.1.71), eine Endo-1,3-β-glucanase (EC 3.2.1.39) oder eine Endo-1,3-α-glucanase (EC 3.2.1.59).
  • Es wird gegenwärtig angenommen, dass der pH des Tierfutterzusatzes im Bereich von ungefähr pH 2 bis ungefähr pH 8 liegen sollte.
  • Es wird gegenwärtig angenommen, dass die Menge von Phytaseaktivität in dem Tierfutterzusatz im Bereich von ungefähr 200 bis ungefähr 50000 FYT (wie unten definiert) pro Gramm der gesamten Zusammensetzung, vorzugsweise im Bereich von ungefähr 500 bis ungefähr 10000 FYT pro Gramm der gesamten Zusammensetzung, am meisten bevorzugt im Bereich von ungefähr 2000 bis ungefähr 6000 FYT pro Gramm der gesamten Zusammensetzung liegen sollte.
  • Vorzugsweise sollte die dem Tierfutter zugesetzte Menge an Zusatz ausreichend sein, um eine Futterzusammensetzung bereitzustellen, die mindestens 50 FYT pro kg Futter, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 100 und ungefähr 2000 FYT pro kg Futter enthält.
  • Es versteht sich, dass die tatsächliche Menge von Phytase-Einheiten, die dem Futter zugesetzt werden sollte, um den Nährwert, d. h. die Stickstoffverdaulichkeit, zu erhöhen, von der Zusammensetzung des Futters selbst abhängen wird. Futtermaterialien, die hohe Mengen an Phytinsäure enthalten, werden im allgemeinen die Zugabe von größeren Mengen von Phytaseaktivität erforderlich machen. Die notwendige Phytasemenge kann durch den Fachmann leicht bestimmt werden.
  • Der erfindungsgemäße Tierfutterzusatz umfasst ein proteolytisches Enzym in einer Menge, die 0,01 bis 20 AU pro Gramm der Zusammensetzung, vorzugsweise 0,1 bis 10 AU pro Gramm der Zusammensetzung, mehr bevorzugt 0,2 bis 5 AU pro Gramm der Zusammensetzung entspricht.
  • Phytaseaktivität (FYT)
  • Die Phytaseaktivität kann unter Verwendung von Natriumphytat als Substrat bestimmt werden. Wenn dieses der Einwirkung einer Phytase unterworfen wird, wird anorganischer Phosphor aus Natriumphytat freigesetzt. In einem Eisen(II)/Molybdän-enthal-tenden Reagens bildet Phosphor (PO4) einen Komplex, der spektrophotometrisch bei 750 nm beobachtet werden kann.
  • Eine Phytase-Einheit (FYT) ist als die Menge von Enzym definiert, die unter Standardbedingungen (d. h. bei pH 5,5, 37°C, einer Substratkonzentration von 5,0 mM Natriumphytat und einer Reaktionszeit von 30 min) 1 μmol Phosphat pro min freisetzt.
  • Eine Standard-Vorgehensweise EAL-SM-0403.01, die diese Analysenmethode detaillierter beschreibt, ist auf Anfrage an Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich.
  • Proteaseaktivität (AU)
  • Die proteolytische Aktivität kann mit denaturiertem Hämoglobin als Substrat bestimmt werden. In der Anson-Hämoglobin-Methode zur Bestimmung von proteolytischer Aktivität wird denaturiertes Hämoglobin verdaut und das nicht-verdaute Hämoglobin wird mit Trichloressigsäure (TCA) präzipitiert. Die Menge von in TCA löslichem Produkt wird mittels Phenol-Reagens, das mit Tyrosin und Tryptophan eine blaue Farbe ergibt, bestimmt.
  • Eine Anson-Einheit (AU) ist als die Menge von Enzym definiert, die unter Standard-Bedingungen (d. h. 25°C, pH 7,5 und 10 min Reaktionszeit) Hämoglobin mit einer solchen Anfangsgeschwindigkeit verdaut, dass pro min eine Menge von in TCA löslichem Produkt freigesetzt wird, die mit Phenol-Reagens die gleiche Farbe wie ein Milliäquivalent Tyrosin ergibt.
  • Ein Informationsblatt AF 4/5, das die Analysenmethode detaillierter beschreibt, ist auf Anfrage an Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird mittels Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die den Umfang der Erfindung, wie er beansprucht wird, in keiner Weise einschränken sollen, weiter veranschaulicht.
  • BEISPIEL 1
  • Sojaproteinhydrolyse
  • Sojaproteinkonzentrat (Unico 75, Loders Crooklaan, NL) wurde in entionisiertem Wasser bei 50°C suspendiert.
  • Die Mischung wurde 3 min bei 85°C wärmebehandelt und auf 55°C, die Hydrolysetemperatur, abgekühlt. Der pH wurde auf 5,5 unter Verwendung von 4 N NaOH eingestellt.
  • Die Mischung wurde für drei Vergleichsexperimente in drei Gefäße aufgeteilt:
    Hydrolyse mit:
    AlcalaseTM 2.4L, Dosierung 2% (Gew./Gew.) des Proteingehalts;
    NeutraseTM 0.5L, Dosierung 1% (Gew./Gew.) des Proteingehalts;
    Phytase NovoTM (eine Aspergillus-Phytase, 6900 FYT/g), Dosierung 1 mg/g Sojakonzentrat. pH mit HCl auf 4,5 eingestellt. Phytase wird zugesetzt, wenn pH < 6,6.
    Hydrolyse mit:
    AlcalaseTM 2.4L, Dosierung 2% (Gew./Gew.) des Proteingehalts;
    NeutraseTM 0.5L, Dosierung 1% (Gew./Gew.) des Proteingehalts.
  • pH wurde unter Verwendung von HCl auf 6,2 eingestellt. Phytase NovoTM (eine Aspergillus-Phytase, 6900 FYT/g), Dosierung 1 mg/g Sojakonzentrat.
  • Die drei Hydrolysen wurden verfolgt, indem das Ausmaß der Hydrolyse und die Osmolalität überwacht wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 2 unten angegeben. Tabelle 1 Osmolalität, mOsm/kg.
    Zeit (min) Exp. 1) Exp. 2) Exp. 3)
    0 103 102 103
    15 200 173 145
    35 211 183 147
    65 232 201 139
    125 241 208 142
    185 250 221 140
    Tabelle 2 Ausmaß der Hydrolyse, % DH
    Zeit (min) Exp. 1) Exp. 2) Exp. 3)
    20 12,2 11,9 –1,9
    40 13,9 12,6 –1,6
    70 13,2 12,8 –2,0
    130 17,3 15,0 –2,6
    190 19,5 18,2 –2,4
  • Beide Messungen des Ausmaßes der Hydrolyse (% DH) zeigen einen erhöhten Abbau des Substrats. Experiment 1 ergab mehr solubilisiertes Protein (78,8%) im Vergleich zu Experiment 2 (77,3%).
  • BEISPIEL 2
  • In vitro-N-Verdaulichkeit von Sojabohnenmehl
  • Es wurden zwei Proben hergestellt:
    • Probe A: 1 g Sojabohnenmehl Probe B:
    • 1 g Sojabohnenmehl mit Zusatz von 0,032 g Phytase NovoTm (eine Aspergillus-Phytase, 5000 FYT/g).
  • Jede Probe wurde mit Pepsin bei pH 2,4 2 h inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Pankreatin bei pH 6,8 für 16 h. Suspendiertes, aber nicht verdautes Protein wurde mit Sulfosalicylsäure präzipitiert. Das unverdaute Protein (wie auch andere unverdaute Bestandteile) wurde durch Filtration und Trocknung gesammelt. Die Trockensubstanz des Filterkuchens und der Probe wurden bestimmt und die Menge von Stickstoff (N) wurde durch die Kjeldahl-Methode bestimmt.
  • Die N-Verdaulichkeit wurde, wie folgt, berechnet:
    Figure 00180001
  • Die Proteinverdaulichkeit wurde berechnet, indem die Stickstoff (N)-Verdaulichkeit mit 6,25 multipliziert wurde.
  • Es wurden die folgenden Proteinverdaulichkeitsergebnisse erhalten:
    Probe A (ohne Phytase): 88,4%
    Probe B (mit Phytase): 89,9%
  • BEISPIEL 3
  • Wirkung von Phytase auf die scheinbare Stickstoffverdaulichkeit und Stickstoffausnutzung bei Schweinen
  • Bilanzversuche an Schweinen (Gewicht 46–52 kg) auf einer Gerste-Weizen-Soja-Diät.
  • Zusammensetzung der Diät:
    Gerste 50,8%
    Weizen 20,0%
    Soja 24,0%
    Tierisches Fett 2,0%
    Melasse 1,0%
    Mineralien, Vitamine
    und Aminosäuren 2,2%
  • Keine Zugabe von anorganischem Phosphat zu der Diät. Die Diät wurde bei einer Temperatur von über 60°C pelletiert.
  • Der Bilanztest wurde mit einer Anpassungsdauer von 5 Tagen und einer Sammlungsdauer von 7 Tagen ausgeführt.
  • 12 Schweine wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe wurde mit der Diät gefüttert und die zweite Gruppe wurde mit der gleichen Diät, aber mit Zugabe von 20,3 g/100 kg Futter von Phytase NovoTM (eine Aspergillus-Phytase, 7370 FYT/g) gefüttert.
  • Der Stickstoffgehalt in der Diät, den Faeces und dem Urin wurde gemessen und es wurden die scheinbare Stickstoffverdaulichkeit und die Stickstoffausnutzung berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 unten angegeben. Tabelle 3 Stickstoffverdaulichkeit und Stickstoffausnutzung
    Stickstoff (g/Tag) Diät ohne Phytase Diät mit Phytase S. E. M.
    Verbraucht 44,5 44,5
    Faeces 6,8 6,2 0,1*
    Urin 20,3 19,5 0,8 NS
    Ablagerung 17,4 18,7 0,6 NS
    Verdaut 37,6 38,3 0,1*
    Verdaut, % 84,7 86,1 0,3*
    • * p ≤ 0,01
    • * NS (nicht signifikant): p > 0,05
    • * S. E. M. Standardfehler des Mittelwerts

Claims (21)

  1. Verfahren zur Solubilisierung von Proteinen in einer pflanzlichen Proteinquelle, welches Verfahren die Schritte umfasst: a) Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Phytaseenzymen; b) Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren proteolytischen Enzymen; und c) Behandeln der pflanzlichen Proteinquelle mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren lipolytischen Enzymen (EC 3.1.1.3) und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen (EC 3.2) mit der Maßgabe, dass das Verfahren nicht das Behandeln von Hülsenfrüchten mittels Fermentation mit einem Koji-Pilz beinhaltet, der beta-Glukosidase, Phytase, Phosphatase und Protease erzeugt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte (a), (b) und (c) gleichzeitig ausgeführt werden.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Phytase von Schritt (a) eine pflanzliche Phytase, eine pilzliche Phytase, eine bakterielle Phytase oder eine Phytase, die von einer Hefe produziert werden kann, ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die pflanzliche Proteinquelle mit einer Phytase von Schritt (a) in einer Menge von ungefähr 2 bis ungefähr 50000 Phytase-Einheiten (FYT) pro kg Proteinquelle, vorzugsweise von ungefähr 50 bis ungefähr 30000 FYT pro kg Proteinquelle, am meisten bevorzugt von ungefähr 100 bis ungefähr 10000 FYT pro kg Proteinquelle behandelt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das proteolytische Enzym von Schritt (b) eine mikrobielle Protease, eine pilzliche Protease oder Pepsin oder Trypsin ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die pflanzliche Proteinquelle mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen von Schritt (b) in einer Menge von ungefähr 0,0001 bis ungefähr 0,5 AU pro kg Proteinquelle, vorzugsweise von ungefähr 0,001 bis ungefähr 0,05 AU pro kg Proteinquelle, mehr bevorzugt von ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,03 AU pro kg Proteinquelle behandelt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die pflanzliche Proteinquelle eine Legume, eine Komposite, eine Crucifere oder ein Getreide oder Mischungen davon ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die pflanzliche Proteinquelle Sojabohne ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das ferner den Schritt umfasst, die pflanzliche Proteinquelle in Wasser zu suspendieren und die Enzyme zu inaktivieren.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das ferner den Schritt umfasst, das hydrolysierte Protein von der Suspension abzutrennen.
  11. Tierfutterzusatz, der eine Phytase, ein proteolytisches Enzym und ein oder mehrere zusätzliche Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lipolytischen Enzymen (EC 3.1.1.3) und Glycosidaseenzymen (EC 3.2), enthält, wobei der Zusatz keinen Koji-Pilz enthält, der beta-Glukosidase, Phytase, Phosphatase und Protease erzeugt.
  12. Tierfutterzusatz nach Anspruch 11, wobei die Phytase eine pflanzliche Phytase, eine pilzliche Phytase, eine bakterielle Phytase oder eine Phytase, die durch eine Hefe produziert werden kann, ist.
  13. Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 12, der ein oder mehrere Phytaseenzyme in einer Menge entsprechend etwa 200 bis etwa 50000 Phytase-Einheiten (FYT) pro g der Zusammensetzung, vorzugsweise etwa 500 bis etwa 10000 FYT pro g der Zusammensetzung, mehr bevorzugt etwa 2000 bis etwa 6000 FYT pro g der Zusammensetzung enthält.
  14. Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das proteolytische Enzym eine mikrobielle Protease, eine pilzliche Protease oder Pepsin oder Trypsin ist.
  15. Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 14, der ein proteolytisches Enzym in einer Menge entsprechend etwa 0,01 bis etwa 20 AU (Anson-Einheiten) pro g der Zusammensetzung, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 10 AU pro g der Zusammensetzung, mehr bevorzugt etwa 0,2 bis etwa 5 AU pro g der Zusammensetzung enthält.
  16. Tierfutter, das einen Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 15 umfasst oder wirksame Mengen von (a) einem oder mehreren Phytaseenzymen; (b) einem oder mehreren proteolytischen Enzymen; und (c) einem oder mehreren lipolytischen Enzymen (EC 3.1.1.3) und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen (EC 3.2) enthält, wobei das Futter keinen Koji-Pilz enthält, der beta-Glukosidase, Phytase, Phosphatase und Protease erzeugt.
  17. Verfahren zum Herstellen von Tierfutter, wobei ein Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 15 und/oder wirksame Mengen von (a) einem oder mehreren Phytaseenzymen; (b) einem oder mehreren proteolytischen Enzymen; und (c) einem oder mehreren lipolytischen Enzymen (EC 3.1.1.3) und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen (EC 3.2) Tierfutterbestandteilen zugesetzt werden, wobei das Futter keinen Koji-Pilz enthält, der beta-Glukosidase, Phytase, Phosphatase und Protease erzeugt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei eines oder mehrere der Enzyme eingesetzt werden oder der Tierfutterzusatz eingesetzt wird vor oder nach dem Pelletieren oder Extrudieren des Futters.
  19. Vormischung, die den Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 11 bis 15 enthält.
  20. Verwendung von (a) einem oder mehreren Phytaseenzymen; (b) einem oder mehreren proteolytischen Enzymen; und (c) einem oder mehreren lipolytischen Enzymen (EC 3.1.1.3) und/oder einem oder mehreren Glycosidaseenzymen (EC 3.2) i. in Tierfutter, ii. in Tierfutterzusätzen, iii. zum Verbessern der Stickstoffverdaulichkeit von Tierfutter, iv. zum Verbessern der Tierwachstumsgeschwindigkeit, v. zum Verbessern des Tierfutterumwandlungsverhältnisses, vi. zum Verbessern der Proteinverfügbarkeit und/oder -ausnutzung; und/oder vii. für die in vitro-Modifizierung von Tierfutterbestandteilen mit der Maßgabe, dass die Verwendung nicht das Behandeln von Hülsenfrüchten mittels Fermentation mit einem Koji-Pilz beinhaltet, der beta-Glukosidase, Phytase, Phosphatase und Protease erzeugt.
  21. Verwendung eines Tierfutterzusatzes nach einem der Ansprüche 11 bis 15 für einen oder mehrere der Zwecke (i) oder (iii) bis (vii) von Anspruch 20.
DE69524951T 1994-04-22 1995-04-20 Verfahren zum verbessern der löslichkeit von pflanzlichen proteinen Expired - Lifetime DE69524951T3 (de)

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DK47094 1994-04-22
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