CN112367846A - 大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法、一种通过上述方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物以及一种包含所述水解物的饲料组成物。

Description

大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法

技术领域

本公开涉及一种大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法。

背景技术

大豆蛋白浓缩物(soy protein concentrate，SPC)是一种相较于大豆而言，通过自大豆中移除例如油以及碳水化合物等非蛋白(non-protein)而对蛋白进行浓缩的经加工大豆产品。由于其高蛋白含量，SPC被广泛用作鱼粉(fish meal)等的替代物。SPC不含皂素(saponin)，所述皂素包含于大豆中且会引起例如鲑鱼等鱼的炎症(inflammatory)反应，从而不利地影响鱼生长。因此，SPC作为植物蛋白源是最有用的饲料之一。

然而，大豆蛋白浓缩物是由包括高分子量蛋白在内的具有许多不同分子量的蛋白构成，此乃因所述大豆蛋白浓缩物包含构成大豆蛋白的天然次单元(subunit)。特别是，已知植物蛋白中所存在的高分子量蛋白相较于低分子量蛋白而言具有低消化率。因此，大豆蛋白浓缩物的水解可能是进一步提高其作为蛋白源(例如，饲料)的有用性的良好方法。

同时，目前生产的例如大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物(soy proteinisolate)、大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysate)等经加工大豆蛋白产品是通过化学或酶处理而生产的。美国专利公开案第2011-0136745号公开了在热处理之后使用胃蛋白酶(pepsin)、胰酶(pancreatin)等蛋白酶(proteases)对大豆(soy bean)进行水解。美国专利第4376128号公开了一种对含菠萝蛋白酶(bromelin)或木瓜蛋白酶(papain)的酶进行处理的方法，以提高豆类(legumes)中可食用蛋白的产量。如上所述，已进行许多不同的研究来提高大豆蛋白的可用性，但并不存在令人满意的结果。

鉴于此种情况，本发明人已付出很大努力来开发一种作为蛋白源非常有用的大豆蛋白浓缩物的水解物，结果，他们发现当在酶处理期间对大豆蛋白浓缩物的水含量进行调整时，可改善大豆蛋白浓缩物的蛋白降解程度，且同时亦可改善可溶性蛋白的含量，由此完成本公开。

发明内容

技术问题

本公开的目的是提供一种大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法，所述方法包括对包含大豆蛋白浓缩物、蛋白水解酶以及水的水性混合物进行培养，其中所述水性混合物的水含量为5％(w/w)至60％(w/w)。

本公开的另一目的是提供一种通过本公开的方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物。

本公开的再一目的是提供一种包含本公开的大豆蛋白浓缩物的水解物的饲料组成物。

通过以下对实施例的详细说明以及所附申请专利范围及附图，本公开的其他目的以及优点将变得更显而易见。由于本公开中未阐述的内容可由熟习此项技术者或熟习类似技术者充分认识到及推断出，因此将省略其说明。

解决问题的手段

本文所公开的每一说明以及实施例亦可应用于另一说明以及实施例。换言之，本文所公开的各种要素的所有组合皆落在本公开的范围内。此外，本公开的范围将不受以下阐述的具体说明限制。

本公开的实施方式提供一种大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法，所述方法包括对包含大豆蛋白浓缩物、蛋白水解酶以及水的水性混合物进行培养，其中所述水性混合物的水含量为5％(w/w)至60％(w/w)。

在一实施例中，在本公开的方法中，以总重量计，所述水性混合物的水含量可为8％(w/w)至60％(w/w)、5％(w/w)至55％(w/w)或8％(w/w)至55％(w/w)。

本文所使用的用语“大豆蛋白浓缩物”是一种相较于大豆而言，通过自大豆中移除例如油以及碳水化合物等非蛋白而对蛋白进行浓缩的经加工大豆产品。以大豆的总重量计，大豆的蛋白含量为30％(w/w)至40％(w/w)，而以大豆蛋白浓缩物的总重量计，大豆蛋白浓缩物的蛋白含量可为50％(w/w)或大于50％(w/w)、55％(w/w)或大于55％(w/w)、50％(w/w)至80％(w/w)、55％(w/w)至80％(w/w)、50％(w/w)至70％(w/w)、55％(w/w)至70％(w/w)、50％(w/w)至65％(w/w)或55％(w/w)至65％(w/w)。

本文所使用的用语“水性混合物”(aqueous mixture)是指包含大豆蛋白浓缩物、蛋白水解酶(protein hydrolase)以及水的混合物，且水性混合物的水含量可例如通过改变在水性混合物的制备期间所添加的水量或通过额外的干燥制程来调整。

本文所使用的用语“水解物”(hydrolysate)是指通过使水性混合物与蛋白水解酶接触而经历蛋白水解反应的产物。

生产大豆蛋白的常见制程包括例如浓缩、加热等加工制程。该些制程诱导例如蛋白聚集、疏水性增加等蛋白变性(protein denaturation)，从而可对例如低分子量蛋白的含量以及蛋白的水溶解度等品质特征产生影响，从而成为抑制蛋白消化率的因素。因此，通过该些制程产生的不溶性蛋白的解折迭(unfolding)或可溶性蛋白以及低分子量蛋白比例的增加可增强消化酶的功能以及消化过程中肠的吸收。换言之，大豆蛋白的低分子化以及可溶性蛋白含量的增加与作为蛋白源的品质密切相关。

在一实施例中，在本公开的培养中，本公开方法中的水性混合物的水含量可自大于25％(w/w)以及60％(w/w)或小于60％(w/w)降至5％(w/w)或大于5％(w/w)且小于25％(w/w)，且具体而言，自大于25％(w/w)以及55％(w/w)或小于55％(w/w)、大于25％(w/w)以及50％(w/w)或小于50％(w/w)、大于25％(w/w)以及45％(w/w)或小于45％(w/w)、大于25％(w/w)以及40％(w/w)或小于40％(w/w)、30％(w/w)至60％(w/w)、30％(w/w)至55％(w/w)、30％(w/w)至50％(w/w)、30％(w/w)至45％(w/w)或30％(w/w)至40％(w/w)降至8％(w/w)或大于8％(w/w)且小于25％(w/w)、8％(w/w)至20％(w/w)或5％(w/w)至20％(w/w)。

在一实施例中，降低本公开方法中的水含量可通过干燥来执行。在本公开的方法中，干燥可通过此项技术中已知的常见干燥方法，具体而言通过加热以及更具体而言通过施加热空气来执行。更具体而言，加热或热空气的温度可为50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至75℃、50℃至70℃、50℃至60℃、60℃至100℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至75℃、60℃至70℃、65℃至100℃、65℃至90℃、65℃至80℃、65℃至75℃、65℃至70℃、70℃至100℃、70℃至90℃、70℃至80℃或70℃至75℃。加热或热空气的温度可为任何温度，只要所述温度不会使本公开方法中的蛋白水解酶失活(deactivate)，同时使本公开方法中的水性混合物的中心温度(即，产品温度)等于本公开方法中的培养温度即可。更具体而言，当水含量降低时，水性混合物的中心温度可为50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至65℃、55℃至100℃、55℃至90℃、55℃至80℃、55℃至70℃或55℃至65℃。

在一实施例中，本公开方法中的干燥可被执行与本公开的培养时间相同的时间段，或者可在本公开的培养开始后执行。具体而言，本公开的干燥可被执行0.5小时至12小时、0.5小时至9小时、0.5小时至8小时、0.5小时至7小时、0.5小时至6小时、0.5小时至5小时、0.5小时至4小时、0.5小时至3小时、0.5小时至2小时、0.5小时至1小时、1小时至12小时、1小时至9小时、1小时至8小时、1小时至7小时，1小时至6小时、1小时至5小时、1小时至4小时、1小时至3小时、1小时至2小时、2小时至12小时、2小时至9小时、2小时至8小时、2小时至7小时、2小时至6小时、2小时至5小时、2小时至4小时、2小时至3小时、3小时至12小时、3小时至9小时、3小时至8小时、3小时至7小时、3小时至6小时、3小时至5小时、3小时至4小时、4小时至12小时、4小时至9小时、4小时至8小时、4小时至7小时、4小时至6小时、4小时至5小时、5小时至12小时、5小时至9小时、5小时至8小时、5小时至7小时、5小时至6小时、6小时至12小时，6小时至9小时、6小时至8小时、6小时至7小时、7小时至12小时、7小时至9小时、7小时至8小时或8小时至9小时。

当本公开的干燥在本公开的培养开始后执行时，干燥可在培养开始后的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时执行。此外，干燥可在本公开的培养中以二或更多个步骤执行。具体而言，当干燥以二或更多个步骤执行时，第二次干燥可在第一次干燥结束后的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时执行。

本文所使用的用语“蛋白水解酶”(protein hydrolase)是指在加水条件下对蛋白具有降解活性的酶。本公开的蛋白水解酶可包括胃蛋白酶(pepsin)、肽酶(peptidase)以及胰蛋白酶(trypsin)，但不限于此。在一实施例中，本公开方法中的蛋白水解酶可为化学酶或生物酶，包括自微生物衍生的酶，且具体而言，为选自由自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)衍生的蛋白水解酶组成的群组中的一或多种蛋白水解酶。在本公开的方法中，蛋白水解酶可通过根据大豆蛋白浓缩物的水解物中蛋白的组成以及含量选择适当酶的种类及浓度以及反应时间来使用。更具体而言，本公开方法中的蛋白水解酶可为自地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶。

在一实施例中，以大豆蛋白浓缩物的重量计，本公开方法中蛋白水解酶的浓度可为0.01％(w/w)至0.50％(w/w)、0.01％(w/w)至0.35％(w/w)、0.01％(w/w)至0.25％(w/w)、0.01％(w/w)至0.25％(w/w)、0.01％(w/w)至0.20％(w/w)、0.05％(w/w)至0.50(w/w)、0.05％(w/w)至0.35(w/w)、0.05％(w/w)至0.30(w/w)、0.05％(w/w)至0.25(w/w)、0.05％(w/w)至0.20(w/w)、0.10％(w/w)至0.50％(w/w)、0.10％(w/w)至0.35％(w/w)、0.1％(w/w)至0.30％(w/w)、0.10％(w/w)至0.25％(w/w)、0.10％(w/w)至0.20％(w/w)、0.15％(w/w)至0.50％(w/w)、0.15％(w/w)至0.35％(w/w)、0.15％(w/w)至0.25％(w/w)、0.15％(w/w)至0.20％(w/w)、0.20％(w/w)至0.50％(w/w)、0.20％(w/w)至0.35％(w/w)、0.20％(w/w)至0.30％(w/w)或0.20％(w/w)至0.25％(w/w)。

在一实施例中，本公开方法中的培养可在50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、50℃至65℃、55℃至100℃、55℃至90℃、55℃至80℃、55℃至70℃或55℃至65℃的温度条件下执行。此外，本公开方法中的培养可被执行0.5小时至12小时、0.5小时至9小时、0.5小时至8小时、0.5小时至7小时、0.5小时至6小时、0.5小时至5小时、0.5小时至4小时、0.5小时至3小时、0.5小时至2小时、0.5小时至1小时、1小时至12小时、1小时至9小时、1小时至8小时、1小时至7小时、1小时至6小时、1小时至5小时、1小时至4小时、1小时至3小时、1小时至2小时、2小时至12小时、2小时至9小时、2小时至8小时、2小时至7小时、2小时至6小时、2小时至5小时、2小时至4小时、2小时至3小时、3小时至12小时、3小时至9小时、3小时至8小时、3小时至7小时、3小时至6小时、3小时至5小时、3小时至4小时、4小时至12小时、4小时至9小时、4小时至8小时、4小时至7小时、4小时至6小时、4小时至5小时、5小时至12小时、5小时至9小时、5小时至8小时、5小时至7小时、5小时至6小时、6小时至12小时、6小时至9小时、6小时至8小时、6小时至7小时、7小时至9小时、7小时至8小时或8小时至9小时。

在本公开的方法中，当水性混合物的初始水含量增加，且干燥制程与水解反应一起执行以降低水性混合物的水含量时，或者当对具有高水含量的水性混合物执行水解时，水含量降低，且进一步执行水解时，水解物中水溶性蛋白的含量在所述两种情形中皆显著增加。该些效果较通过执行具有低初始水含量的水性混合物的水解以及干燥制程，或者通过执行具有高初始水含量的水性混合物的水解而不执行干燥制程所获得的效果更优异。因此，包含具有高初始水含量的水性混合物的大豆蛋白浓缩物的水解制程及其干燥制程可改善水解物的品质。此外，此干燥制程可降低欲使用的酶的浓度，且亦可容许省略用于制备最终产物的单独干燥制程，从而会提高整个生产制程的效率。

本公开的另一实施方式可提供一种通过本公开的方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物。

在通过本公开的方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物中，以水解物中的总蛋白计，分子量为30千道尔顿(kDa)或小于30千道尔顿的蛋白的比例可为30％至90％、具体而言为30％至80％、30％至70％、30％至60％、30％至50％、30％至40％、40％至90％、40％至80％、40％至70％、40％至60％、40％至50％、50％至90％、50％至80％、50％至70％、50％至60％、60％至90％、60％至80％、60％至70％、70％至90％、70％至80％或80％至90％。在本公开的蛋白的比例中，本公开的％代表部分面积的百分比，所述部分面积代表通过凝胶渗透层析法(gel permeation chromatography，GPC)得到的蛋白分子量分布中的特定分子量范围。

此外，通过本公开的方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物可具有5％(w/w)至40％(w/w)的氮溶解度指数(nitrogen solubility index，NSI)，且具体而言5％(w/w)至35％(w/w)、5％(w/w)至30％(w/w)、5％(w/w)至20％(w/w)、5％(w/w)至15％(w/w)、5％(w/w)至10％(w/w)、10％(w/w)至40％(w/w)、10％(w/w)至35％(w/w)、10％(w/w)至30％(w/w)、10％(w/w)至20％(w/w)、10％(w/w)至15％(w/w)、15％(w/w)至40％(w/w)、15％(w/w)至35％(w/w)、15％(w/w)至30％(w/w)或15％(w/w)至20％(w/w)。本文所使用的用语“NSI”是用于确定大豆蛋白的变性程度及KOH溶解度以及蛋白分散性指数(protein dispersibility index，PDI)的指数，且NSI可用于评价水解物中水溶性蛋白的含量。亦即，高NSI代表高含量的水溶性蛋白或低程度的蛋白变性。因此，具有高NSI的大豆蛋白浓缩物的水解物可指示其作为蛋白源的有用性得到改善。

本公开的再一实施方式提供一种包含通过本公开的方法制备的大豆蛋白浓缩物的水解物的饲料组成物。

本公开的饲料组成物中的大豆蛋白浓缩物的水解物的含量可依据待施用的家畜的种类及年龄、施用形式、期望效果等进行适当控制，且举例而言，含量可为1％(w/w)至99％(w/w)、10％(w/w)至90％(w/w)或20％(w/w)至80％(w/w)。

为了施用，除大豆蛋白浓缩物的水解物以外，本公开的饲料组成物可更包含以下中的一或多者的混合物：有机酸，例如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸等；磷酸盐，例如磷酸钾、磷酸钠、多磷酸盐等；天然抗氧化剂，例如多酚、儿茶酸、生育酚、维生素C、绿茶萃取物、壳聚糖、单宁酸等。若需要，则可添加其他常见添加剂，例如抗流感剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，可另外添加稀释剂、分散剂、界面活性剂、粘合剂或润滑剂，以将本公开的饲料组成物配制成例如水溶液、悬浮液、乳液等可注射制剂、胶囊、颗粒或片剂。此外，除包括例如粉碎或破碎的小麦、大麦、玉米等植物蛋白饲料、例如血粉、肉粉、鱼粉等动物蛋白饲料、动物脂肪及植物脂肪的主要成分以外，本公开的饲料组成物可与例如胺基酸、无机盐、维生素、抗氧化剂、抗真菌剂、抗微生物剂等各种辅助组分以及营养补充剂、生长促进剂、消化-吸收促进剂及预防剂一起使用。

当本公开的饲料组成物用作饲料添加剂时，所述饲料组成物可原样添加或与其他组分一起使用，且可根据常用方法适当使用。饲料组成物可与无毒性药学上可接受的载体结合而被制备成速释(immediate-release)配方或缓释(sustained-release)配方的施用形式。可食用载体可为玉米淀粉、乳糖、蔗糖或丙二醇。固体载体可为片剂、粉末、锭剂等施用形式，且液体载体可为糖浆、液体悬浮液、乳液、溶液等的施用形式。此外，施用剂可包括防腐剂、润滑剂、溶解促进剂或稳定剂，且亦可包括用于改善炎症性疾病的其他试剂以及可用于预防病毒的物质。

本公开的饲料组成物可应用于动物的饮食，即包括哺乳动物、家禽、鱼以及甲壳类动物的许多动物的饲料。所述饲料组成物可用于例如猪、牛、羊等商业上重要的哺乳动物、例如大象、骆驼等动物园的动物或例如狗、猫等家畜。商业上重要的家禽可包括鸡、鸭、鹅等，且鱼以及甲壳类动物可包括例如鳟鱼及虾等商业养殖的鱼以及甲壳类动物。

以家畜饲料的干重量计，本公开的饲料组成物可以约10克至500克的量混合，例如每一公斤10克至100克。在完全混合后，饲料组成物可作为糊状物提供，或者进一步经历造粒、扩大或挤出制程。

发明效果

根据对蛋白水解酶的处理，通过在大豆蛋白浓缩物水解期间调整水性混合物的水含量，本公开的方法可增加蛋白降解程度以及水解物中水溶性蛋白的含量。因此，本公开可提供作为蛋白源非常有用的大豆蛋白浓缩物的水解物。

附图说明

图1示出根据包含大豆蛋白浓缩物的水性混合物的水含量通过水解反应来检查蛋白降解程度变化的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)结果，其中M：生物标记，1：大豆蛋白浓缩物原材料，2：具有40％(w/w)的水的水解物，3：具有35％(w/w)的水的水解物，4：具有30％(w/w)的水的水解物，5：具有25％(w/w)的水的水解物，6：具有20％(w/w)的水的水解物，7：具有15％(w/w)的水的水解物，以及8：具有10％(w/w)的水的水解物。

图2示出在低水含量条件下通过水解来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，1：大豆蛋白浓缩物原材料，2：10％(w/w)的水以及反应1小时，3：10％(w/w)的水以及反应2小时，4：15％(w/w)的水以及反应1小时，以及5：15％(w/w)的水以及反应2小时。

图3示出根据蛋白水解酶的浓度通过水解来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，1：大豆蛋白浓缩物原材料，2：0.05％(w/w)的酶以及1小时的水解物，3：0.05％(w/w)的酶以及2小时的水解物，4：0.05％(w/w)的酶以及3小时的水解物，5：0.05％(w/w)的酶以及4小时的水解物，6：0.1％(w/w)的酶以及1小时的水解物，7：0.1％(w/w)的酶以及2小时的水解物，8：0.1％(w/w)的酶以及3小时的水解物，9：0.1％(w/w)的酶以及4小时的水解物，10：0.2％(w/w)的酶以及1小时的水解物，11：0.2％(w/w)的酶以及2小时的水解物，12：0.2％(w/w)的酶以及3小时的水解物，13：0.2％(w/w)的酶以及4小时的水解物，14：0.35％(w/w)的酶以及1小时的水解物，15：0.35％(w/w)的酶以及2小时的水解物，16：0.35％(w/w)的酶以及3小时的水解物，以及17：0.35％(w/w)的酶以及4小时的水解物。

图4示出通过同时对水含量为40％(w/w)的水性混合物进行水解及干燥的制程来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记；1：大豆蛋白浓缩物原材料；2：初始水为40％(w/w)，反应1小时并干燥，水为31.2％(w/w)；3：初始水为40％(w/w)，反应2小时并干燥，水为22.1％(w/w)；4：初始水为40％(w/w)，反应3小时并干燥，水为11.53％(w/w)；以及5：初始水为40％(w/w)，反应4小时并干燥，水为7％(w/w)。

图5示出通过同时对水含量为40％(w/w)的水性混合物进行水解及干燥的制程来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，S：大豆蛋白浓缩物原材料，0：酶促反应(enzymatic reaction)0小时，1：酶促反应1小时，2：酶促反应2小时，3：酶促反应3小时，4：酶促反应4小时，5：酶促反应5小时，6：酶促反应6小时，7：酶促反应7小时，8：酶促反应8小时，以及8.5：酶促反应8.5小时。

图6示出通过同时对水含量为30％(w/w)的水性混合物进行水解及干燥的制程来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，S：大豆蛋白浓缩物原材料，0：酶促反应0小时，1：酶促反应1小时，2：酶促反应2小时，3：酶促反应3小时，4：酶促反应4小时，5：酶促反应5小时，以及6：酶促反应6小时。

图7示出通过同时对水含量为20％(w/w)的水性混合物进行水解及干燥的制程来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，S：大豆蛋白浓缩物原材料，0：酶促反应0小时，1：酶促反应1小时，2：酶促反应2小时，3：酶促反应3小时，以及4：酶促反应4小时。

图8示出对水含量为40％(w/w)的水性混合物利用或不利用干燥制程来检查蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，S：大豆蛋白浓缩物原材料，2：与酶混合后的样本，3：酶促反应0小时，4：酶促反应1小时，5：酶促反应2小时，6：酶促反应3小时，7：酶促反应4小时，8：酶促反应1小时后进行干燥，9：酶促反应2小时后进行干燥；10：酶促反应3小时后进行干燥；以及11：酶促反应4小时后进行干燥。

图9示出根据水含量及酶来检查大豆蛋白浓缩物的水解物降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，1：大豆蛋白浓缩物原材料，2：解淀粉芽孢杆菌衍生的蛋白酶；水为25％(w/w)，3：解淀粉芽孢杆菌衍生的蛋白酶；水为15％(w/w)，4：地衣芽孢杆菌衍生的蛋白酶；水为25％(w/w)，以及5：地衣芽孢杆菌衍生的蛋白酶；水为15％(w/w)。

图10示出使用枯草芽孢杆菌衍生的蛋白酶根据水含量来检查大豆蛋白浓缩物的水解物的蛋白降解程度变化的SDS-PAGE结果，其中M：生物标记，1：40％(w/w)的水，2：35％(w/w)的水，3：30％(w/w)的水，4：25％(w/w)的水，5：20％(w/w)的水，6：15％(w/w)的水，以及7：10％(w/w)的水。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例仅用于说明目的，本发明的范围不限于这些实施例。

实例1.根据水含量的变化来比较大豆蛋白浓缩物的水解物中的蛋白降解程度以及水溶性蛋白的含量

通过以下方式制备了水性混合物：用水对以大豆蛋白浓缩物的重量计0.35％(w/w)的地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶(普罗米(Prozyme)AK，视觉生物化学公司(VisionBiochem))进行稀释，将此稀释液添加至含有大豆蛋白浓缩物(100克，X-大豆600，CJ赛莱克特公司(CJ Selecta)，以总重量计蛋白含量为60％(w/w)或大于60％(w/w))的反应容器中，并进一步向其中添加水，从而以总重量计将水含量调整为10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)或40％(w/w)。此后，通过在60℃下将水性混合物培养4小时来进行水解反应。通过在100℃将每一实验组加热20分钟而终止水解反应。将终止反应的每一实验组的水解物干燥，然后粉碎。通过将100毫克大豆蛋白浓缩物的粉碎水解物悬浮在5毫升8M脲(urea)溶剂中，对悬浮液进行超音波处理，然后在8000转/分钟(rpm)下将悬浮液离心分离10分钟来制备用于SDS-PAGE、凝胶渗透层析法(GPC)以及氮溶解度指数(nitrogen solubilityindex，NSI)分析的样本。此后，使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)对每一样本进行量化，且将预定量的样本装载在SDS-PAGE凝胶上。此外，通过经由0.45微米注射器过滤器对样本进行过滤、然后对滤液执行GPC分析来确认水解物中蛋白的分子量分布。

结果，随着水性混合物的水含量自40％降至10％，蛋白降解程度增加。因此，随着水含量的降低，在SDS-PAGE凝胶上一些高分子量蛋白带消失，而低分子量蛋白带增加(图1)。此外，随着水性混合物的水含量降低，低分子量蛋白带(＜30千道尔顿)的比例增加(表1)。

[表1]

此外，通过测量NSI对大豆蛋白浓缩物的水解物中水溶性蛋白的含量进行了评价。将水添加至含有1克大豆蛋白浓缩物的粉碎水解物的反应容器中，得到总体积为40毫升的溶液，将此溶液在30℃以及120转/分钟的条件下离心分离2小时，且获得所产生的上清液(supernatant)，然后通过凯氏测氮法(Kjeldahl method)根据以下方程式确定NSI：

[方程式1]

NSI(％，w/w)＝所萃取的上层蛋白/样本固体蛋白×100

结果，随着水性混合物的水含量自40％(w/w)降至25％(w/w)，NSI降低，而随着水性混合物的水含量自25％(w/w)降至10％(w/w)，NSI反而趋于增加(表2)。换言之，当在水含量为30％(w/w)或大于30％(w/w)或者20％(w/w)或小于20％(w/w)的水性混合物中进行水解反应时，观察到高水准的NSI。此外，当水含量为40％(w/w)时，观察到最高的NSI。

[表2]

样本	NSI(％(w/w))
		大豆蛋白浓缩物原材料	5.36
具有40％(w/w)的水的水解物	19.07
		具有35％(w/w)的水的水解物	12.41
具有30％(w/w)的水的水解物	8.47
		具有25％(w/w)的水的水解物	5.96
具有20％(w/w)的水的水解物	6.97
		具有15％(w/w)的水的水解物	11.70
具有10％(w/w)的水的水解物	13.58

另外，在将大豆蛋白浓缩物的重量增加至500克之后，水性混合物的水含量增加至50％(w/w)，且以与以上实例相同的方式执行培养，以检查NSI是否增加。亦检查了即使当大豆蛋白浓缩物的重量增加时，具有低水含量的水性混合物中的蛋白降解程度是否增加。具体而言，通过以下方式制备水性混合物：向含有大豆蛋白浓缩物(500克)的反应容器中添加以大豆蛋白浓缩物的重量计浓度为0.2％(w/w)的普罗米AK，并向其中添加水从而以总重量计将水含量调整为40％(w/w)、45％(w/w)或50％(w/w)。此后，通过在60℃下将水性混合物培养4小时来执行高水含量条件下的水解反应。每1小时收集经水解产物，并通过在100℃下加热20分钟而使其失活。此外，对水性混合物进行干燥以将水含量调整为10％(w/w)或15％(w/w)，且在与上述相同的条件下执行水解反应，然后使其失活。将失活的产物干燥并粉碎，且用作SDS-PAGE、GPC以及NSI分析的样本。以与以上相同的方式执行分析。同时，根据水解反应，使用非酶处理组(仅添加水)作为高水含量条件下的对照组来比较效果。

结果，当大豆蛋白浓缩物的重量增加时，通过对具有高水含量的水性混合物执行水解，亦观察到高水准的NSI(表3)，且通过对具有低水含量的水性混合物执行水解，蛋白降解程度增加(图2以及表4)。

[表3]

[表4]

实例2.根据水解酶浓度的变化来比较大豆蛋白浓缩物的水解物中的蛋白降解程度以及水溶性蛋白的含量

在此实例中，包含大豆蛋白浓缩物的水性混合物被制备成具有相同的15％(w/w)的水含量，且根据蛋白水解酶的浓度比较水解的效果。通过以下方式制备水性混合物：向含有大豆蛋白浓缩物(100克)的反应容器中添加以大豆蛋白浓缩物的重量计浓度为0.05％(w/w)、0.1％(w/w)、0.2％(w/w)或0.35％(w/w)的普罗米AK，并向其中添加水从而以总重量计将水含量调整为15％(w/w)。此后，通过在60℃下将水性混合物培养4小时来执行水解反应。此时，每1小时收集经水解产物，并通过在100℃下加热20分钟而使其失活。将失活的产物干燥并粉碎，且用作SDS-PAGE、GPC以及NSI分析的样本。以与实例1相同的方式执行分析。

结果，相较于其他浓度组而言，在经0.05％酶处理组中更清楚地观察到37千道尔顿至50千道尔顿的蛋白带，且随着酶浓度的增加，低分子量蛋白带的比例增加(图3)。此外，对水解物中所包含的蛋白的分子量分布进行分析，结果，蛋白水解酶的浓度对75千道尔顿或大于75千道尔顿的蛋白比例没有很大影响，而随着蛋白水解酶浓度的增加，10千道尔顿或小于10千道尔顿的蛋白比例增加(表5)。

[表5]

此外，随着蛋白水解酶浓度的增加，NSI增加。特别是，当蛋白水解酶的浓度为0.2％(w/w)或大于0.2％(w/w)时，观察到10％(w/w)或大于10％(w/w)的NSI(表6)。此外，几乎未观察到在相同浓度下根据1小时至4小时的反应时间的NSI差异，而酶浓度会极大地影响NSI(表6)。

[表6]

实例3.根据同时进行水解及干燥的制程来比较大豆蛋白浓缩物的水解物中的蛋白降解程度以及水溶性蛋白的含量

通过以下方式制备水性混合物：向含有大豆蛋白浓缩物(100克)的反应容器中添加以大豆蛋白浓缩物的重量计浓度为0.2％的普罗米AK，并向其中添加水从而以总重量计将水含量调整为40％(w/w)。此后，通过在60℃下将水性混合物培养4小时来执行水解反应，且同时，通过在60℃下施加热空气来执行干燥，使得水性混合物的中心温度与60℃的培养温度相同。此时，每1小时收集经水解产物，对其水含量进行测量，然后通过在100℃下加热20分钟来使产物失活。将失活的产物干燥并粉碎，且用作SDS-PAGE、GPC以及NSI分析的样本。以与实例1相同的方式执行分析。

结果，关于改善蛋白降解以及水溶性蛋白含量的效果，当在反应以及干燥制程期间水性混合物的水含量达到约20％(w/w)的特定水准时，即使初始水含量被调整为40％(w/w)，NSI与通过添加0.35％(w/w)的酶对水含量为15％(w/w)的大豆蛋白浓缩物执行水解4小时的情形类似(图4、表7以及表8)。换言之，水性混合物的水含量的动态变化，即在水解期间将水性混合物的水含量自高水含量调整至低水含量，使得即使使用少量的酶亦能获得优异的水解效果。

[表7]

MW(kDa)	SPC	1小时	2小时	3小时	4小时
						＞75	40.3	29.7	10.8	6.7	7.0
30～75	32.4	27.9	17.4	9.5	9.3
						10～30	13.1	18.2	28.4	13.1	12.9
5～10	4.3	8.3	17.0	20.2	19.9
						＜5	9.8	15.9	26.4	50.5	50.9
总	100	100	100	100	100

[表8]

时间(小时)	水(％(w/w))	NSI(％(w/w))
			0	40	5.21
1	312	7.75
			2	22.1	7.75
3	11.53	14.96
			4	7	15.53

另外，大豆蛋白浓缩物的量增加，且根据水性混合物的初始水含量来比较蛋白降解程度以及水溶性蛋白的含量。通过以下方式制备水性混合物：向含有大豆蛋白浓缩物(500克)的反应容器中添加以大豆蛋白浓缩物的重量计浓度为0.2％的普罗米AK，并向其中添加水从而以总重量计将初始水含量调整为40％(w/w)、30％(w/w)或20％(w/w)。此后，通过在60℃下将水性混合物培养8小时来执行水解反应，且同时，通过在60℃下施加热空气来执行干燥，使得水性混合物的中心温度与60℃的培养温度相同。此时，每1小时收集经水解产物，对其水含量进行测量，然后通过在100℃下加热20分钟来使产物失活。将失活的产物干燥并粉碎，且用作SDS-PAGE、GPC以及NSI分析的样本。以与实例1相同的方式执行分析。

根据初始水含量为40％(w/w)、30％(w/w)或20％(w/w)的水性混合物的水解以及干燥制程，蛋白的分子量分布分别如图5及表9、图6及表10以及图7及表11所示。结果，确认到当水解反应时间为4小时或8小时或大于8小时时，全部显示出蛋白降解程度显著增加。

[表9]

[表10]

MW(kDa)	原材料	0小时	1小时	2小时	3小时	4小时	5小时	6小时
									＞75	34.18	29.73	21.92	14.24	6.56	5.04	4.74	4.70
30～75	34.68	33.01	31.10	26.30	15.80	11.69	10.42	10.18
									10～30	16.55	18.75	24.09	31.31	34.69	22.06	18.79	17.72
5～10	5.52	7.71	10.26	13.88	22.28	30.08	30.65	31.07
									＜5	9.07	10.81	12.62	14.27	20.68	31.12	35.40	36.33
总计	100.00	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

[表11]

MW(kDa)	原材料	0小时	1小时	2小时	3小时	4小时
							＞75	24.38	3.80	2.03	2.27	2.19	2.23
30～75	44.45	14.42	11.21	10.52	9.61	9.54
							10～30	18.16	38.38	24.67	21.22	20.46	20.61
5～10	6.96	28.41	39.25	40.34	40.72	40.61
							＜5	6.05	15.00	22.85	25.65	27.01	27.00
总计	100.00	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

在本实例中，基于以上实验结果，针对包含初始水含量为40％(w/w)、30％(w/w)或20％(w/w)的大豆蛋白浓缩物的水性混合物，对水含量随反应时间的变化、＜30千道尔顿的蛋白的比例以及NSI的变化进行分析。

结果，当通过干燥制程将水性混合物的水含量降至20％(w/w)或小于20％(w/w)时，蛋白降解程度大大改善，因此＜30千道尔顿的蛋白的比例占整个蛋白的80％或大于80％，且随着大豆蛋白浓缩物的初始水含量增加，观察到高的NSI值(表12)。

[表12]

(*＜30千道尔顿的蛋白(％)是在以下根据水含量的GPC结果中小于30千道尔顿的蛋白比例的总和。)

换言之，当水性混合物的水含量低时，蛋白降解的程度得到改善。然而，在增加初始水含量之后，通过干燥制程逐渐降低水含量使NSI得到更大的改善。

实例4.根据在执行水解预定时间后的干燥制程来比较大豆蛋白浓缩物的水解物中的蛋白降解程度以及水溶性蛋白的含量

通过以下方式制备水性混合物：向含有25公斤大豆蛋白浓缩物的反应容器中添加水从而以总重量计将水含量调整为40％(w/w)，然后向其中添加以浓缩物的重量计浓度为0.2％(w/w)的普罗米AK。此后，通过在60℃下将水性混合物培养4小时来执行水解反应。此时，根据干燥制程的存在将实验组分成两组，且根据水解反应时间(1小时、2小时、3小时或4小时)分别将该些组进一步分成总计八个实验组。通过在70℃下施加热空气约45分钟至60分钟，使得水性混合物的中心温度与60℃的培养温度相同，将干燥制程与水解反应一起执行。此时，每1小时收集经水解产物，然后通过在100℃下加热20分钟使产物失活。将失活的产物干燥并粉碎，且用作SDS-PAGE、GPC以及NSI分析的样本。以与实例1相同的方式执行分析。

结果，蛋白降解程度显著增加，且水溶性蛋白的含量亦显著增加(图8、表13以及表14)。

[表13]

[表14]

样本	NSI(％(w/w))
		SPC	5.5017
混合后/达到60℃之前	7.724
		在60℃下反应0小时	14.199
在60℃下反应1小时	24.045
		在60℃下反应2小时	29.769
在60℃下反应3小时	31.911
		在60℃下反应4小时	34.387
反应1小时→干燥	29.754
		反应2小时→干燥	32.803
反应3小时→干燥	37.302
		反应4小时→干燥	35.813

实例5.使用自各种物质衍生的蛋白水解酶来测量蛋白降解程度

(1)解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶

在测量大豆蛋白浓缩物中的水含量之后，通过向其中添加水从而以总重量计将水含量分别调整为15％(w/w)或25％(w/w)来制备水性混合物。以大豆蛋白浓缩物的重量计，向每一实验组中添加0.35％(w/w)的量的解淀粉芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶(阿尔法酶(Alphalase)NP，视觉生物化学公司)或地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶(福德普罗碱性蛋白酶(FoodPro Alkaline Protease)，视觉生物化学公司)。使其中添加水及酶的大豆蛋白浓缩物在60℃下经历酶促反应4小时。为了测量完成酶促反应的实验组中的蛋白降解程度，通过在100℃下对每一组热处理20分钟来终止酶促反应。将每一实验组的大豆蛋白浓缩物干燥并粉碎。通过在实例1中阐述的SDS-PAGE以及GPC方法测量每一实验组中的蛋白降解程度及其分子量分布。

结果，相较于在25％(w/w)的水含量下执行水解的情形而言，当在15％(w/w)的水含量下执行水解时，两种酶均显示出大量的低分子量蛋白(图9以及表15)。具体而言，在水含量为15％(w/w)的泳道3及泳道5中，现有的高分子量蛋白带是模糊的，而低分子量蛋白带变强。此外，关于用两种酶处理的大豆蛋白浓缩物的水解物，当使用解淀粉芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶时，在25％(w/w)以及15％(w/w)的水含量下，30千道尔顿或小于30千道尔顿的低分子量蛋白的组成比分别为33.9％以及68.1％，且当使用地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶时，在25％(w/w)以及15％(w/w)的水含量下，30千道尔顿或小于30千道尔顿的低分子量蛋白的组成比分别为69.1％以及83.6％(表15)。换言之，确认到当对具有低水含量的大豆蛋白浓缩物进行水解时，通过使用解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶，大豆蛋白浓缩物的蛋白降解程度大大增加。

[表15]

(2)枯草芽孢杆菌衍生的蛋白酶

在测量大豆蛋白浓缩物中的水含量之后，通过向其中添加水从而以总重量计将水含量分别调整为10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)及40％(w/w)来制备水性混合物。以大豆蛋白浓缩物的重量计，向每一实验组中添加0.35％(w/w)的量的枯草芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶(碱性蛋白酶，邦赛公司(Benesol))。使其中添加水及酶的大豆蛋白浓缩物在45℃下经历酶促反应4小时。接下来，为了测量完成酶促反应的实验组中的蛋白降解程度，通过在100℃下对每一组热处理20分钟来终止酶促反应。将每一实验组的大豆蛋白浓缩物干燥并粉碎。通过在实例1中阐述的SDS-PAGE以及GPC方法来测量每一实验组中蛋白的分子量分布。

结果，当使用酶执行水解时，低分子量蛋白的量随着水含量的降低而增加。特别是，在水含量为20％(w/w)或小于20％(w/w)时，具体而言为15％(w/w)或小于15％(w/w)时，观察到大量的低分子量蛋白(表16)。此外，当对水含量为10％(w/w)至20％(w/w)的大豆蛋白浓缩物进行水解时，30千道尔顿或小于30千道尔顿的低分子量蛋白的量为约64％至约80％。换言之，确认到当对具有低水含量的大豆蛋白浓缩物进行水解时，即使通过使用枯草芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶，大豆蛋白浓缩物的降解程度亦会大大增加(表16)。

[表16]

应理解，本文所述实施例应被视为仅具有说明性意义而非用于进行限制。对每一实施例内的特征或实施方式的说明应通常被视为可用于其他实施例中的其他相似特征或实施方式。尽管已参考各图阐述了一或多个实施例，然而此项技术中技术人员将理解，在不背离由以下权利要求界定的本公开的精神及范围的条件下，可在本文中作出各种形式及细节上的改变。

Claims (13)

1.一种大豆蛋白浓缩物的水解物的制备方法，所述方法包括：

对包含大豆蛋白浓缩物、蛋白水解酶以及水的水性混合物进行培养，其中所述水性混合物的水含量为5％(w/w)至60％(w/w)。

2.根据权利要求1项所述的方法，其中，在进行所述培养时，所述水性混合物的所述水含量自大于25％(w/w)以及60％(w/w)或小于60％(w/w)降至5％(w/w)或大于5％(w/w)且小于25％(w/w)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水含量的降低是通过干燥来执行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养是在50℃至100℃的条件下执行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养被执行0.5小时至12小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白水解酶是选自由自地衣芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶、解淀粉芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶以及枯草芽孢杆菌衍生的蛋白水解酶组成的群组中的一或多种蛋白水解酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其中以所述大豆蛋白浓缩物的重量计，所述蛋白水解酶的浓度为0.01％(w/w)至0.50％(w/w)。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述干燥是通过加热来执行。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述加热是在50℃至100℃下执行。

10.一种大豆蛋白浓缩物的水解物，是通过如权利要求1至9中任一项所述的方法来制备。

11.根据权利要求10所述的大豆蛋白浓缩物的水解物，其中在所述大豆蛋白浓缩物的水解物中，以总蛋白计，分子量为30千道尔顿或小于30千道尔顿的蛋白的比例为30％至90％。

12.根据权利要求10所述的大豆蛋白浓缩物的水解物，其中所述大豆蛋白浓缩物的水解物具有5％(w/w)至40％(w/w)的氮溶解度指数(NSI)。

13.一种饲料组成物，包含如权利要求10所述的大豆蛋白浓缩物的水解物。

Images