KR100411485B1

KR100411485B1 - 내열성 피타아제를 대량 생산하는 신규한 아스퍼질러스 속 균주와 이를 이용한 피틱산의 분해방법

Info

Publication number: KR100411485B1
Application number: KR10-2000-0006286A
Authority: KR
Inventors: 김형락; 김두상; 오명주; 김흥윤; 김재호; 오은실; 서해점; 양종순; 변대석
Original assignee: 김형락
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2003-12-18
Also published as: KR20010081175A

Abstract

본 발명은 내열성 phytase를 대량으로 생산하는 신규한Aspergillus속 균주와 이를 이용한 phytic acid의 분해방법에 관한 것으로, 토양으로부터 phytase 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리 및 동정하여 조사한 결과, 분리한 균주로부터 생산되는 phytase는 높은 활성과 내열성을 나타내었으며, 분리한 균주로부터 phytase를 대량 생산하는 배양방법을 확립하고, 분리한 균주를 이용하여 사료원인 미강 및 대두박중에 함유된 phytic acid의 최적분해조건을 확립함으로써, 식품 및 축산사료의 첨가제로서의 이용가치를 향상시켰다.

Description

내열성 피타아제를 대량 생산하는 신규한 아스퍼질러스 속 균주와 이를 이용한 피틱산의 분해방법{Novel Aspergillus sp. 5990 producing thermostable phytase and method for degradation of phytic acid using the same}

본 발명은 내열성 피타아제(phytase)를 대량 생산하는 신규한 아스페르길루스(Aspergillus)속 균주와 이를 이용한 피틱산(phytic acd)의 분해방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 토양으로부터 phytase 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리하고, 분리균주로부터 생산된 phytase의 특성을 조사하고, phytase를 대량 생산하는 배양방법을 확립하고, 분리균주를 식품 또는 사료산업에 이용하기 위한 phytic acid의 분해조건을 확립하는 방법에 관한 것이다.

Phytic acid (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)는 곡류와 콩과식물의 씨앗 중에 인과 inositol의 중요한 저장물질이다. 곡류 중에서 총 인의 70-80%가 phytic acid 상태로 존재하며, 구조적으로는 단백질과 결합된 마그네슘염 또는 칼슘염의 형태로 존재한다. 현재 가축과 양어용 사료의 식물성 단백질원으로 사용되고 있는 옥수수, 대두 및 쌀겨 중에는 다량의 인을 함유하는 phytic acid가 단백질과 결합된 phytin 상태로 존재하며, 전제 중량의 1-10%에 달한다. 이러한 인산염의 형태는 단위동물의 소화관에서 분해되지 않아서 인체와 가축의 무기질 결핍을 유발하고, 또한 분뇨로서 배출되어 가축 사육 밀집지역의 하천이나 호수를 부영양화시켜 수질오염을 야기시킨다.

Phytic acid를 분해시키기 위한 방법으로 화학적인 처리가 시도되었으나, 공존하는 영양소를 파괴시키기 때문에 실용화되지 못하는 실정이다. 식품이나 사료에 대한 영양적인 악영향이 없이 phytic acid를 분해시키기 위한 수단으로 phytase가 가장 효과적이라고 입증된 후, phytase를 생산하는 미생물을 검색하기 위한 연구가 1960년대부터 진행되었다. 특히, 1990년대에 곰팡이로부터 phytase 유전자가 분리된 것을 계기로, 새로운 효소활성을 지닌 유전자의 분리와 기존 phytase의 활성과 내열성을 향상시키기 위한 연구가 진행되고 있다.

식물의 조직 중에 분포하는 phytase는 사료 제조시 열처리에 의하여 효소가 변성되어 소화관에서 그 기능을 발휘하지 못하고, 특히 식물유래 phytase는 위장에서의 낮은 pH와 pepsin의 작용에 의하여 대부분의 활성이 소멸된다. 따라서 보다 내열성이 강하고 낮은 pH와 pepsin에 보다 안정한 phytase를 찾기 위한 연구로 미생물이 주 대상으로 부각되고 있다.

세균성 phytase의 연구로서 대장균에서 분리된 2종의 phytase와 토양의 인 cycle에 관여하는 것으로 판명된 4종의Pseudomonas속으로부터 분리된 phytase는 균체내 효소로 산성의 pH 영역에서 최대활성을 나타낸다.Bacillus subtilis (natto)N-77과BacillusDS-11로부터 분리된 phytase들은 균체외로 분비되기 때문에 상용화 가능성이 높고, 특히BacillusDS-11로부터 분리된 phytase는 내열성이 높아서, 사료 제조시에 수반되는 고온의 팔렛팅 온도에서도 안정한 것으로 보고되어 유용한 phytase원이 될 수 있다.

일반적으로 세균이 생산하는 phytase는 glycosylation이 되어 있지 않기 때문에 곰팡이가 생산하는 phytase에 비하여 분자량이 적고, 단백질 분해효소에 대하여 민감하며, 낮은 pH에서 불안정하여 사료첨가제로서의 실용화가 어려운 면이 있다. 세균에 의해 생산되는 phytase는 1종으로, 2종류의 phytase와 1종의 phosphatase를 동시에 생산하는A. niger속의 곰팡이에 비하여 phytase 활성이 10배 가량 낮다. 이러한 이유로 곰팡이가 생산하는 phytase가 보다 효율적이며, 토양으로부터 84종의 곰팡이를 검색한 결과,Aspergillus속이 phytase 생산성이 가장 우수한 것으로 나타났고, 그 중에서도A. nigerNRRL 3135가 가장 높은 활성의 phytase를 생산하는 것으로 보고되었다.

상기와 같이, phytase에 관한 연구는 주로 축산사료 분야에 적용할 목적으로 진행되고 있으며, 대부분의 연구는A. nigerNRRL 3135의 phytase A 유전자를 이용한 promoter와 vector의 개발, site-specific mutation과 glycosylation에 의한 내열성과 단백질 분해효소에 대한 안정성 향상에 집중되어 있다. 그러나, 국내의 경우 phytase에 관한 연구는 내열성 세균인BacillusDS-11에 국한되어 있으며, 보다 촉매활성이 높고, 산성의 pH 영역에서 안정한 곰팡이 phytase에 관한 체계적인 연구는 전무한 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 활성이 높고, 산성의 pH 영역에서 안정한 내열성 phytase를 대량 생산하는 균주를 토양으로부터 분리하여 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 분리된 균주로부터 phytase를 대량 생산하는 방법과 분리된 균주를 식품 및 사료산업으로 적용하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 토양으로부터 phytase 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리하고, 분리균주로부터 생산된 phytase의 특성을 조사하고, 분리균주로부터 phytase를 대량 생산하는 배양방법을 확립하고, 분리한 균주를 이용하여 사료원인 미강 및 대부박중에 함유된 phytic acid의 최적분해조건을 확립함으로써 달성하였다.

도 1은 Phytase 활성에 미치는 pH의 영향을 나타낸다.

도 2는 Phytase 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸다.

도 3은Aspergillussp. 5990으로부터 생산된 phytase와 BASF phytase의 열안정성을 나타낸다.

도 4는Aspergillussp. 5990에 의한 phytase의 생산에 미치는 배양시간의 영향을 나타낸다.

도 5는Aspergillussp. 5990에 의한 미강 중에 함유된 phytic acid의 가수분해에 미치는 배양시간의 영향을 나타낸다.

본 발명은 토양으로부터 phytase 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리하고 동정하여 신규한 균주를 규명하는 단계; 분리균주로부터 생산된 phytase의 특성을 조사하는 단계; 분리균주로부터 phytase를 대량 생산하는 배양방법을 확립하는 단계 및; 분리한 균주를 이용하여 사료원인 미강 및 대부박중에 함유된 phytic acid의 최적분해조건을 확립하는 단계로 구성되어 있다.

이하 본 발명의 방법을 실시예를 들어서 상세하게 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 토양으로부터 phytase 활성을 나타내는 신규한 균주의 분리 및 동정

본 발명의 균주분리용으로 사용한 시료는 1998년 9월 부산시 남구 대연동 일대의 토양에서 채취하였다. Phytase 생산균주의 검색배지로서는 PSM (phytase screening medium; 1% sucrose, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 0.3% trypton, 0.2% yeast extract, 0.005% KCl, 0.05% MgSO₄, 0.001% MnSO₄·5H₂O, 0.001% FeSO₄, pH 7.0)을 사용하였다. 균주의 배양에는 최소배지로 CD배지 (Czapek-Dox medium, 0.3% NaNO₃, 0.1% K₂HPO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 3% sucrose)를 상용하였고, 완전배지로서 CD배지에 0.2% casamino acid 및 yeast extract를 각각 첨가한 배지를 사용하였으며, 고체배지는 상기의 액체배지에 1.5%의 한천을 첨가하여 조제하였다.

균주의 분리를 위하여 토양시료 5 g에 멸균한 0.1% Tween 80용액을 100 ㎖ 첨가하고 초음파 세척기 (주파수 47 kHz, 5분)로 현탁시킨 후 glass filter (1G3)로 여과하였다. 여과액을 0.1% Triton X-100을 함유한 PSM 평판배지에 각각 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후 각 colony를 취하였다. 분리된 균주는 다시 PSM 액체배지에 각각 접종하고, 30℃에서 3일간 배양한 후에 원심분리하여 균체를 제거한 다음에 phytase 활성을 측정하여 비교하였다. Phytase 생산 미생물의 검색을 위하여 상기에서 분리한 균주를 30℃에서 7일간 배양한 사면배지에 0.1% Tween 80 용액 5 ㎖와 1 g의 CaCO₃를 첨가하여 교반하였다. 상기 용액을 무균적으로 흡인여과한 후, 여과액을 원심분리하고 잔사에 멸균된 증류수를 첨가하여 약 1 ×10⁶spore/㎖의 포자현탁액을 획득하였다. 획득한 포자현탁액 0.1 ㎖씩을 각각 취하여, PSM 배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양하여 각각의 균주를 획득하였다. 분리된 각 균주는 다시 PSM 액체배지에 접종하여 30℃에서 3일간 진탕배양하고, 원심분리한 후 균체를 제거한 배양액 중 phytase 활성이 가장 높은 균주를 선별하였다.

토양으로부터 분리된 20여종의 곰팡이를 PSM 배지로 phytase 생산균을 검색한 결과 5종의 곰팡이가 분리되었다. 분리된 균주를 완전 한천배지에서 배양하였을 경우, 외관상으로 곰팡이의 형태를 갖추었고, 흰색 colony의 분생자 색상이 초기에는 흰색에서 배양기간에 따라 진갈색으로 변하였다. 또한 균사체가 솜털뭉치 형태를 가지고 부드러운 분생자를 가짐으로써Aspergillus속의 전형적인 특성을 나타내었다. 분리된 균주 중에서 가장 높은 phytase 활성을 나타낸 균주를 생명공학연구소에 의뢰하여 동정한 결과,Aspergillus niger var. awamori(Aspergillussp. 5990)로 판명되었고, 이 균주를 1999년 5월 10일 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (미생물 수탁번호 : KCTC 8939P).

고상배지에서 phytase 활성이 있는 5종의Aspergillus속과 KTCC에서 분양받은A. ficuumNRRL 3135를 동일한 배양조건에서 4일간 배양하여 phytase 활성을 비교한 결과, 표 1에서 나타낸 바와 같이, NRRL 3135에 비하여 A. sp. 5990은 5배 정도 높은 phytase 활성을 나타내었다. A. sp. 5990을 발효조를 이용하여 대량 배양할 경우, 배양액 1 ㎖ 당 25-30 U (umpi/min/㎖)의 활성을 나타내었으며, 이러한 높은 활성은 축산사료 1 kg 제조시에 1.5 ㎖의 배양액을 첨가하여 배합사료 중의 인을 완전히 분해할 수 있으므로, 상업적인 가치가 충분하다고 고려되었다.

토양으로부터 분리된Aspergillus속 균주와A. ficuumNRRL 3135의 phytase 활성.

균주	활성도 (U/㎖)
균주	pH 2.5	pH 5.5
A. ficuumNRRL 3135	2.58 (1.43)	2.97 (1.27)
Aspergillussp. 5990	13.30 (2.14)	14.60 (1.22)
Aspergillussp. 5980	1.97 (0.22)	2.13 (0.22)
Aspergillussp. 5970	0.31 (0.12)	0.44 (0.11)
Aspergillussp. 5960	0.01 (0.01)	0.02 (0.01)
Aspergillussp. 5950	0.01 (0.01)	0.02 (0.01)
[주] Phytase 활성은 dextrose 배지에서 4일동안 35℃에서 배양한 배양액으로 측정하였다.괄호안은 표준편차를 나타낸다.

실시예 2 : Aspergillus sp. 5990으로부터 생산된 phytase의 특성

Phytase 활성은 Greiner 등의 방법을 참고하여 측정하였다. 즉, 원심분리된 배양액 50 ㎕를 50 mM Na-phytate 250 ㎕가 함유된 0.5 M Na-citrate buffer (pH 5.0)에 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후, 1.5 ㎖의 발색액 (acetone : 5 N sulfuric acid : 10 mM ammonium hexamolybdate = 2 : 1 : 1 (v/v/v))과 1.0 M citric acid 100 ㎕를 순차적으로 첨가하여 반응을 정지시킴과 동시에 발색시켰다. 반응혼합물을 2,500 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액의 흡광도를 파장 410 nm에서 측정하였으며, phytase 효소의 활성 (unit)은 분당 1 μmol의 무기인산을 유리시키는 효소의 양으로 나타내었다.

Aspergillussp. 5990으로부터 2종의 phytase가 생산되었으며, phytase A와 phytase B는 Q-Sepharose ionic exchange column chromatography을 이용하여 분리하였다. SDS-PAGE에 의한 phytase A와 B의 분자량은 각각 84, 74 kDa이었고, superose 6 gel filtration에 의한 phytase A와B의 분자량은 각각 98, 330 kDa이었다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, phytase A는 2개의 최적 pH 범위를 가지며, 최적범위인 pH 5.0-6.0에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 또 다른 최적범위인 pH 2.5-2.8에서는 pH 5.0-6.0에서의 활성보다 35% 정도 낮은 활성을 나타내었다. Phytase B는 pH 2.8-3.2에서 최대의 활성을 나타내었고, pH 4.5 이상에서는 불활성되었다.

도 2에서 나타낸 바와 같이, phytase A와 B 모두 65℃에서 최대의 활성을 나타내었고, 70℃에서 급격히 활성이 소멸되었다. 다른 acid phosphatase와는 달리,Aspergillussp. 5990으로부터 생산된 phytase는 고온인 65℃에서 최적의 활성을나타내는 것 이외에, 특히 열안정성이 우수한 것으로 나타났다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, phytase A는 65℃에서 30분간 동안 가열하여도 안정하였고, phytase B는 상용의 phytase보다도 내열성이 뛰어났다.

실시예 3 : 분리된 균주로부터 phytase를 대량 생산하기 위한 배양방법

Phosphatase의 활성은 Pasamontes 등의 방법을 참고하였고, p-nitrophenyl phosphate를 기질로서 사용하여 407 nm에서 측정하였다. 단백질의 농도는 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Bradford의 방법을 의해 측정하였다. 균체량은 배양액을 원심분리한 후, 증류수로 세척하고 감압여과하여 105℃에서 건조시킨 후 측정하였다. Phytase를 대량 생산하기 위하여, Ca의 농도, 무기인산의 농도, 배양시간, 배양온도, pH를 변화시켜서 최적의 배양조건을 확립하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, phytase와 phosphatase는 배양 4일째에 최대의 활성을 나타내었다. Phytase 생산에 미치는 염화칼슘 농도의 영향은 크지 않았으며, 무기인산의 농도가 0.05% 이상일 경우에는 phytase의 생산이 급격히 감소하였다. pH가 증가할수록 phytase 생산이 증가하였고 pH 7.0에서 최대의 활성을 나타내었다. 20℃에서 45℃의 범위에서 배양한 결과, 35℃에서 phytase의 생산이 최대로 나타났다. Phytase 생산의 최적 배양조건에 대한 상기의 결과를 표 2에 요약하였다.

Aspergillussp. 5990으로부터 phytase 생산의 최적 배양방법.

염화칼슘의 농도	무기인산의 농도	배양온도	배지 초기 pH	배양시간
0.1 mM	0.05%	35℃	pH 7.0	4일

실시예 4 : 미강과 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건

동결상태로 보관중인 미강, 대두박의 성분분석을 AOAC법에 따라, 수분은 상압 가열건조법으로, 단백질은 semimicro kjeldahl법으로, 지질은 Soxhlet법으로, 그리고 회분은 건식회화법으로 정량하였다. Phytic acid은 Latta와 Eskin의 방법에 의하여 정량하였으며, AG 1X8 컬럼 (Cl^-form, 200-400 mesh)을 통하여 흡착시킨 후, phytic acid 용출액에 Wade 시약 (0.03% FeCl₃·H₂O in 0.03% sulfosalicylic acid)을 첨가하고 500 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준용액으로는 sodium phytate를 사용하였다. 무기인은 Greiner 등의 방법을 참고하여 정량하였으며, phytase 활성 측정과 유사한 방법으로 410 nm에서 측정하였다. Inositol phosphates의 정량은 Heinonen와 Lahti의 방법에 의하여 HPLC로 분석하였다.

미강 중의 전체인의 함량은 5.81%이었으며, 이 중 97%가 phytic acid의 형태로 존재하였다. 도 5는Aspergillussp. 5990의 고체발효에 의한 미강의 phytic acid 분해에 대한 결과를 나타낸 것이다. 배양시간이 경과함에 따라 inositol phosphate의 양은 감소하였고, 반면에 유리인의 농도는 증가하였으며, phytase 최대생산 시점인 배양 4일만에 대부분의 phytic acid가 분해되었고, 배양 5일째에 최대의 분해율을 나타내었다. 온도가 증가함에 따라 phytic acid의 분해율은 감소하여 반비례의 경향을 나타내었으며, 25℃에서 최대의 분해율을 나타내었다. 상기의 결과를 표 3에 요약하였다.

Aspergillussp. 5990의 고체발효에 의한 미강의 phytic acid 최적분해조건.

배양시간	배양온도
5일	25℃
[주] 배양시간의 경우는 50% 미강으로 pH 6.8, 30℃에서 배양배양온도의 경우는 50% 미강으로 pH 6.8에서 5일간 배양

spergillussp. 5990의 액체발효에 의한 미강 중의 phytic acid의 분해를 조사한 결과, 미강의 농도가 10%일 때 최대의 분해율이 나타났다. 배양 4일만에 대부분의 phytic acid가 분해되었고, 배양온도와 pH의 영향은 거의 없었으며, 상기의 결과를 표 4에 요약하여 나타내었다.

Aspergillussp. 5990의 액체발효에 의한 미강 중의 phytic acid 최적분해조건.

미강농도	배양시간	배양온도	배지 초기 pH
10%	4일	40℃	pH 4
[주] 미강농도 10%, 배양시간 5일, 초기 pH 6.8, 30℃, 150 rpm을 기본조건으로 배양함.

대두박 중에 전체인의 함량은 2.77%이었으며, 이 중 66%가 phytic acid의 형태로 존재하였다.Aspergillussp. 5990의 액체발효에 의한 대두박 중의 phyticacid의 분해는 미박 중의 phytic acid의 분해와 유사한 경향을 나타내었다. 대두박의 농도가 10%일 때 분해율이 최대로 나타났으며, 배양 4일만에 대부분의 phytic acid가 분해되었고, 배양온도와 pH의 영향은 거의 없었으며, 상기의 결과를 표 5에 요약하였다.

Aspergillussp. 5990의 액체발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 최적분해조건.

대두박농도	배양시간	배양온도	배지 초기 pH
10%	4일	40℃	pH 4
[주] 대두박농도 10%, 배양시간 5일, 초기 pH 6.7, 30℃, 150 rpm을 기본조건으로 배양함.

Aspergillussp. 5990의 고체발효에 의한 대두박 중의 phytic acid의 분해를조사한 결과, 배양 2일만에 대부분의 phytic acid가 분해되었고, 배양온도와 phytic acid의 분해와는 반비례하였다. 상기의 결과를 표 6에 요약하였다.

Aspergillussp. 5990의 고체발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 최적분해조건.

배양시간	배양온도
2일	25℃
[주] 배양시간의 경우는 50% 대두박으로 pH 6.7, 30℃에서 배양배양온도의 경우는 50% 대두박으로 pH 6.7에서 5일간 배양

상기 실시예 및 실험예를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해토양에서 분리동정한 신규한 아스퍼질러스 속 균주는 활성이 높고, 산성의 pH 영역에서 안정한 내열성 phytase를 대량 생산하고, 또한 식품 및 사료첨가제로서 뛰어난 효과가 있으므로, 본 발명은 식품 및 사료산업상 유용한 발명인 것이다.

Claims

토양에서 분리한 피타제를 생산하는 신규한 아스페르길루스(Aspergillussp.) 5990 균주.
삭제
0.1 mM 염화칼슘, 0.05% 무기인산, 35℃, pH 7.0에서 4일간 배양하는 것을 특징으로 하는, 신규한 아스페르길루스(Aspergillussp.) 5990 균주로부터 내열성 피타제 효소를 대량으로 생산하는 방법.
신규한 아스페르길루스(Aspergillussp.) 5990 균주를 이용한 미강 및 대두박 등 사료원 성분 중에 함유된 피틱산의 최적분해 방법.
삭제