WO2014183483A1 - 一种提高线粒体代谢机能的方法及应用 - Google Patents

一种提高线粒体代谢机能的方法及应用 Download PDF

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WO2014183483A1
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mitochondrial
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曾嘉
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Zeng Jia
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    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • Mitochondria is a semi-autonomous organelle with a bilayer membrane structure that has its own genetic system. Mitochondria are the ultimate site for the oxidation of fatty acids, sugars and amino acids. By the free energy released during oxidative phosphorylation, adenosine diphosphate (ADP) and phosphoric acid are converted to adenosine triphosphate (ATP), providing direct energy for cell life activities. The main pathway by which cells gain energy. In addition, mitochondria are the main source of intracellular reactive oxygen species (ROS) and one of the important hubs for regulating apoptosis.
  • ROS reactive oxygen species
  • Peroxisome is an important organelle with a monolayer membrane structure in the cell. Its main function is to catalyze the oxidation of long-chain and very long-chain fatty acids, to form short-chain fatty acids and then return to the mitochondria to complete the oxidation process. Eliminate intracellular reactive oxygen species (ROS) and the like. Peroxidase body contains a large number of oxidase, a substrate reaction catalyzed hydrogen peroxide (H 2 0 2), and then the 3 ⁇ 40 2 decomposed into water and oxygen by catalase (Catalase). Peroxisomes are very sensitive to external signals and prone to proliferation.
  • ROS reactive oxygen species
  • AOX catalyzes the dehydrogenation of the acyl-CoA carbon chain at position 2-3 to form 2-enyl acyl-CoA (2-en 0 yl-C 0 A), and the desorbed hydrogen atom directly combines with molecular oxygen to form H 2 0
  • the expression of the 2 gene in cells is regulated by PPARa.
  • the object of the present invention is to provide a method for improving mitochondrial metabolism, the use of a fatty acyl-CoA oxidase inhibitor as a mitochondrial metabolism promoting agent, a acyl-CoA oxidase inhibitor or a acyl-CoA oxidase inhibitor Use of a body for the preparation of a composition for treating a disease caused by mitochondrial metabolic dysfunction.
  • a fatty acyl-CoA oxidase inhibitor for the preparation of a composition for promoting mitochondrial fatty acid oxidation and mitochondrial regeneration, for improving mitochondrial metabolism, and for inhibiting peroxisome proliferation;
  • the international enzymatic classification number for acyl-CoA oxidase is EC 1.3.3.6.
  • the fatty acyl-CoA oxidase inhibitor reduces the level of oxidative stress in the target organ or tissue by inhibiting the acyl-CoA oxidase, and reduces the content of oxidative free radicals (ROS) in the target tissue of insulin. Insulin resistance, thereby preventing, ameliorating or treating diseases associated with mitochondrial metabolic dysfunction.
  • ROS oxidative free radicals
  • ROS oxidative free radicals
  • the fatty acyl-CoA oxidase inhibitor is a substance which inhibits the activity or expression of a fatty acyl-CoA oxidase.
  • the fatty acyl-CoA oxidase inhibitor includes, but is not limited to, an anti-acyl-CoA oxidase antibody, which specifically binds to a acyl-CoA oxidase and inhibits its activity. Nucleic acid fragments and polypeptides, small molecule organics, small molecule inorganics.
  • the composition comprises: a pharmaceutical composition, a dietary supplement, a health care composition.
  • the fatty acyl-CoA oxidase inhibitor further comprises an inhibitor precursor; preferably comprising
  • 10,12-pentacosadiynoic acid LH-919 or 10,12-pentacosadiynoyl-CoA
  • the method for inhibiting the activity or expression of the acyl-CoA oxidase is: administering an effective amount of a acyl-CoA oxidase inhibitor or acyl-CoA to a patient in need of prevention, amelioration or treatment.
  • Enzyme inhibitor precursor is: administering an effective amount of a acyl-CoA oxidase inhibitor or acyl-CoA to a patient in need of prevention, amelioration or treatment.
  • AOX inhibitor precursor LH-919 (concentration see abscissa) inhibits AOX activity in Wistar rat liver in vivo.
  • Figure 21 Effect of AOX inhibitor precursor on CPOX-induced AOX activity in rat liver. Number of samples per group n
  • Figure 29 Effect of AOX inhibitor precursor on CPIB drug-induced PEX1 mRNA expression in rat liver.
  • Figure 32 Effect of AOX inhibitor precursor treatment on serum triglycerides in alloxan-induced diabetic rats.
  • Figure 33 Effect of AOX inhibitor precursor treatment on serum free fatty acids in alloxan-induced diabetic rats.
  • Figure 34 Effect of AOX inhibitor precursor treatment on AOX activity in liver of alloxan-induced diabetic rats.
  • Figure 35 Effect of AOX inhibitor precursor treatment on serum MDA in alloxan-induced diabetic rats.
  • Figure 42 Effect of AOX inhibitor precursor treatment on liver MDA in ob/ob mice.
  • the liver or skeletal muscle is used as a target organ for the action of AOX inhibitors, and the inhibition of AOX inhibitors on liver AOX in vitro, and AOX inhibitors or AOX inhibitor precursors (precursor) are tested. Inhibition of liver AOX in vivo.
  • the LH-919-CoA refers to 10,12-pentacosadiynoyl-CoA (10,12-Pentacosadiynoyl-CoA).
  • LH-919 is administered to Wistar rats by intragastric administration, and is sacrificed 3 hours after gavage, the rats are rapidly dissected, the liver is removed, peroxisomes are separated, and AOX activity is measured, and the results are compared with the control group.
  • the AOX activity in the liver of Wistar rats in the medicated group was significantly reduced, and the intensity of inhibition was directly proportional to the amount of the drug.
  • liver and skeletal muscle AOX activity is relatively good
  • liver peroxidase fatty acid oxidation was also significantly reduced, these results indicate that by inhibiting the body's AOX activity, that is, peroxisome fatty acid oxidation, can promote mitochondrial fatty acid oxidation in vivo, improve mitochondrial oxidative phosphorylation.
  • the present invention also compares the citrate synthase activity of each group of liver and skeletal muscle by biochemical analysis method, and the mtDNA copy number is a characteristic index for measuring the number of mitochondria in the cell. The citrate synthase activity and mtDNA copy number of each experimental group were determined. The results showed that the citrate synthase activity and mtDNA copy number of liver and skeletal muscle were significantly higher than those of the control group, indicating that AOX inhibitor can promote mitochondrial regeneration and significantly increase the number of mitochondria in rat liver and skeletal muscle.
  • RNA kinase by inhibiting AOX activity, activating target organs or tissues such as skeletal tendons, thereby inhibiting mammalian target of rapamycin, reducing phosphorylation of ribosomal S6 protein kinase (Thr389), and reducing ribosomes
  • the expression of S6 protein kinase significantly reduces ribosomal S6 protein kinase activity and delays cell senescence.
  • the serum ⁇ -hydroxybutyrate of the AOX inhibitor group was significantly higher than that of the control group, indicating that the liver fatty acid oxidation level of the inhibitor group was higher than that of the control group.
  • the COX activity of liver and skeletal muscle in the AOX inhibitor group was significantly higher than that in the control group, indicating that the mitochondrial oxidative phosphorylation level of liver and skeletal muscle can be increased by inhibiting AOX activity.
  • a significant feature of CPIB-induced peroxisome proliferation was a significant increase in hepatic weight coefficient (hepatic weight/body weight ratio). In the example, the hepatic weight coefficient of the AOX inhibitor group was significantly lower than that of the CPIB control group (p ⁇ 0.01), indicating that AOX inhibitors can inhibit CPIB-induced peroxisome proliferation in vivo.
  • CPIB By activating PPARa, CPIB significantly increases liver AOX activity and induces peroxisome proliferation.
  • AOX inhibitors reduce the production of 3 ⁇ 40 2 by inhibiting AOX activity in vivo, significantly reducing liver gene list Levels (p ⁇ 0.01) inhibited peroxisome proliferation and decreased liver weight coefficient.
  • insulin therapy is the main treatment for type 1 diabetes, but type 1 diabetes is often accompanied by insulin resistance, and blood glucose is still unstable after insulin treatment.
  • oral hypoglycemic agents are often used.
  • the first is insulin secretion promoters, such as sulfonyl. Urea drugs, etc., the main side effects of these drugs are easy to cause hypoglycemia, and liver and kidney toxicity;
  • the second type is insulin sensitizers, mainly thiazolidinediones (TZDs) drugs such as pioglitazone and Biguanide drugs such as metformin.
  • TGDs thiazolidinediones
  • Thiazolidinediones are widely used in the early stage, but they are prone to obesity, heart failure and increased risk of bladder cancer. They have been used less and less in recent years. The use of bismuth drugs is prone to nausea and diarrhea. side effect.
  • NEFA non-esterified fatty acid
  • the physiological activity of the AOX inhibitor and the AOX inhibitor precursor in the mammal or human body is the same, i.e., inhibits the target organ or tissue AOX activity.
  • an AOX inhibitor precursor LH-919 is taken as an example to carry out an animal efficacy test.
  • LH-919 in vivo transformant LH-919-CoA is an AOX inhibitor that rapidly and significantly inhibits AOX activity in vivo.
  • the blood glucose of the treatment group was significantly lower than that of the control group ( ⁇ 0.01), the oral glucose tolerance (OGTT) ability was significantly enhanced, and the serum triglyceride and free fatty acid (NEFA) levels were significantly decreased ( ⁇ 0. 01).
  • the AOX activity in the liver of diabetic rats was significantly decreased (p ⁇ 0.01), and the level of oxidative stress in the body was significantly decreased, which was marked by a significant decrease in serum malondialdeyde (MDA) content (p ⁇ 0.01), liver 3 ⁇ 40 2 and MDA levels were significantly reduced (p ⁇ 0.01).
  • MDA serum malondialdeyde
  • the invention finds for the first time, by inhibiting the activity of AOX in the body, promoting liver fatty acid oxidation, inhibiting fatty acid synthesis in the liver, reducing liver oxidative stress level, improving liver insulin resistance, and significantly reducing liver glycerol in ob/ob mice and db/db mice. Triester content.
  • a rat model of obesity induced by a high-fat diet having pathological features such as obesity, insulin resistance, hyperlipemia, and fatty liver is used.
  • the invention also provides a composition comprising an effective amount of the AOX inhibitor or AOX inhibitor precursor, and a pharmaceutically or food acceptable carrier.
  • the composition of the invention can be used for improving the mitochondrial metabolism of target organs or tissues by inhibiting AOX activity, improving insulin resistance of the body, including diabetes, obesity, nonalcoholic fatty liver disease, hypertriglyceridemia, neurodegenerative diseases All diseases caused by mitochondrial metabolic dysfunction, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and aging.
  • the present invention uses recombinant rat liver AOX as a target protein to screen its inhibitors. It should be understood that recombinant AOX has the same physiological activity as natural AOX. Recombinant expression and affinity purification of rat liver AOX in E.co/ was carried out by reference method (Zeng J. et. al., Protein Expression and Purification. 2004, 37, 472-478), highly purified AOX enzyme The activity was 1.89 U/mg and the protein purity was >95%. (3) In vitro inhibition of purified recombinant rat liver AOX by LH-919-CoA
  • liver tissue was prepared by cutting another liver tissue from the fixed part of the right lobe of the liver, and the liver triglyceride content was determined by a kit.
  • the fatty acid oxidation activity of liver tissue cells was determined by the method reported in the literature (Zhang D., et al., Cell Metab., 2010, 11, 402-411). The measurement of the rate of peroxidase fatty acid oxidation in liver tissue cells was carried out according to the literature reporting method. COsmundsen H., et al., Biochem J., 1989, 260, 215-220).
  • Twenty-four SPF Wistar rats weighing 200-220 g were divided into 3 groups, normal control group, CPIB control group and CPIB drug group, with 8 rats in each group.
  • the normal control group was given olive oil by 0.2 mL/head;
  • CPIB control group dissolved CPIB in the corresponding volume of olive oil, and given rats with CPIBCTCI, Tokyo, Japan) 100 mg/kg/d ;
  • AOX inhibition 100 mg/kg/d was administered to CPIB, and LH-919 was administered to 500 g/kg/d, and the rats were intragastrically administered once a day for 12 days.
  • the cytochrome c oxidase activity of the skeletal muscle of the CPIB inhibitor group was significantly increased as compared with the control group, as shown in Fig. 22, which showed that the mitochondrial oxidative phosphorylation level of the target organ or tissue cell was significantly increased by inhibiting the AOX activity in vivo.
  • liver triglyceride content was determined by an insulin ELISA kit (Millipore, Billerica, MA., USA). The kit measures serum triglyceride content. All the rats were sacrificed, the liver was harvested and weighed. A piece of liver tissue was quickly removed from the fixed part of the right lobe of the liver. It was quickly fixed with formaldehyde to prepare a paraffin section, which was hematoxylin-eosin' HE. Dyeing, liver fat lesions were observed by light microscopy, and 4 liver samples were taken from each group for analysis. Another liver tissue was cut from the fixed part of the right lobe of the liver to prepare liver pulp, and the liver triglyceride content was determined by a kit.
  • Non-alcoholic fatty liver disease is the most important pathological marker with massive deposition of liver triglycerides.
  • the liver weight coefficient and triglyceride content of the high-fat diet inhibitor group were significantly lower in the high-fat diet control group, as shown in Table 4.
  • Liver sections were observed by light microscopy. The results showed that the distribution of liver fat droplets in the high-fat diet inhibitor group was significantly lower than that in the control group, while the fat deposition in the high-fat diet control group was dominated by macrovesicular fat droplets, while the inhibitor group had liver fat deposition.
  • the vesicular fat droplets are predominant, as shown in Figure 30. Therefore, treatment with AOX inhibitors can significantly reduce liver triglyceride deposition caused by a high-fat diet.
  • AOX inhibitors or AOX inhibitor precursors act as mitochondrial metabolic function enhancers, improve liver insulin metabolism by improving liver and muscle fatty acid metabolism, and can treat obesity and hypertriglyceridemia, as well as nonalcoholic fatty liver disease.
  • Example 5 AOX inhibitor precursor on hypoxemia induced by alloxan in diabetic rats, blood lipid lowering test 50 SPF Wistar rats, weighing 180-200 g, were fed with ordinary rat vocabulary, free to enter the water. One week after the rats were fed for feeding, 20 rats were used as the normal group, and the remaining 30 rats were modeled. Thirty rats were fasted for 18 hours and then intraperitoneally injected with tetraoxypyrimidine (Sigma, St.
  • the serum triglyceride content was determined and determined by the triglyceride test kit (Beijing Beihua Kangtai Clinical Diagnostics Co., Ltd., Beijing).
  • the serum free fatty acid content was determined by the free fatty acid test kit (Nanjing Institute of Bioengineering, Nanjing).
  • the hepatocyte peroxisomes were isolated, and the AOX activity of each group of hepatocytes was measured and determined by using IP-CoA as a substrate.
  • the H 2 0 2 content in each group of hepatocytes was determined using a 3 ⁇ 40 2 test kit (Beyotime Biotech., Haimen). Serum and The liver lipid peroxide content was determined by a micro malondialdehyde (MDA) test kit (Nanjing Institute of Bioengineering, Nanjing).
  • MDA micro malondialdehyde
  • the hepatocyte peroxisomes were isolated, and the AOX activity of each group of hepatocytes was measured and determined by using IP-CoA as a substrate.
  • the level of lipid peroxidation in the liver was determined using a micromalonaldehyde detection kit (Nanjing Institute of Bioengineering, Nanjing).

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Abstract

一种提高线粒体代谢机能的方法及应用，其通过抑制体内酯酰辅酶A氧化酶活性，活化单磷酸腺苷活化蛋白激酶，促进靶器官或组织细胞线粒体脂肪酸化及线粒体再生，提高线粒体代谢机能，增强机体胰岛素敏感性，延缓细胞衰老。脂酰辅酶A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶A氧化酶抑制剂前体在制备用于治疗线粒体代谢机能障碍相关疾病如糖尿病的药物中的用途。

Description

一种提高线粒体代谢机能的方法及应用
技术领域
本发明属于生物化学和药学领域， 具体而言， 本发明涉及通过抑制体内脂酰辅酶 A 氧化酶活性， 促进线粒体脂肪酸氧化和线粒体再生， 提高线粒体代谢机能的方法。 本发 明还涉及脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂前体在制备用于治疗线 粒体代谢机能障碍相关疾病如糖尿病的药物中的用途。 背景技术
线粒体 (mitochondria)是一种半自主性的具有双层膜结构的细胞器， 自身有独立的遗 传系统。 线粒体是脂肪酸、 糖类和氨基酸氧化的最终场所， 通过氧化磷酸化过程中释放 的自由能， 将二磷酸腺苷 (ADP)和磷酸转化为三磷酸腺苷 (ATP)， 为细胞生命活动提供直 接能量， 是细胞获得能量的主要途径。 此外， 线粒体是细胞内活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS)产生的主要源头， 以及调控细胞凋亡的重要枢纽之一。
线粒体是细胞内最容易受损伤的细胞器之一， 当线粒体数量减少， 线粒体 DNA发 生突变或缺失， 或呼吸链受到抑制引起线粒体氧化磷酸化异常， 以及脂肪酸代谢酶活性 降低等原因都能引起线粒体 ATP合成减少， 导致线粒体代谢能力下降， ROS产生显著 增加， 引起线粒体功能障碍 (mitochondrial dysfunction)。线粒体功能障碍影响整个细胞正 常的生理功能， 导致疾病的发生（Nunnar J and Suomalainen A., Cell, 2012, 148, 1 145-1 159)。
线粒体代谢功能障碍是引起胰岛素抵抗的直接原因。 线粒体脂肪酸氧化活性下降将 导致肝脏和肌肉等胰岛素靶组织内甘油三酯（triacylglycerol, TG)、 甘油二酯 diacylglyCerol, DG)等脂质大量积累， 其中 DG作为信号分子， 激活 PKCe/ε等激酶， 进 而磷酸化胰岛素受体底物 - l(IRS-l)并使其失活， 并降低 PI3激酶 (PI3K)和 AKT酶活性， 导致葡萄糖转运子 4(GLUT4)向膜上转位减少， 细胞对葡萄糖摄入显著下降， 形成胰岛 素抵抗 (Lowell BB. and Shulman GL, Science, 2005, 307, 384-387; Erion DM. and Shulman GL, Nat. Med., 2010, 16, 400-402; Samuel VT., et. al" Lancet, 2010, 375, 2267-2277)。 另一 方面， 线粒体代谢机能下降导致细胞内积累大量 ROS， 激活一系列蛋白激酶如 protein kinase C(PKC0/s), p38-MAPK, c-jun N terminal kinase (JNK) , S6 kinasel(S6Kl)等信号 蛋白， 引起胰岛素受体底物 IRS-1 磷酸化失活 （Boura-Halfon S. and Zick Y.， Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , 2009， 296， E581-E591), 继而引起下游信号蛋白如磷脂酰 肌醇 -3激酶 (PI3K)和蛋白激酶 B (PKB/Akt)等活性下降， 导致肌肉细胞胞浆内葡萄糖转 运蛋白 4(GLUT4)向细胞膜转位减少， 肝脏肝糖原合成酶 (glycogen synthase)活性显著降 低， 进一步加剧体内胰岛素抵抗 (Houstis N" et. al" Nature, 2006, 440, 944-948; Styktal J. et. al. , Free Radic. Biol. Med. , 2012， 52， 46-58； Rains JL and Jain SK.， Free Radic. Biol. Med. , 201 1， 50， 567-575)。 此外， 胰岛 β细胞线粒体功能障碍导致胰岛 β细胞凋亡及 坏死， 严重影响胰岛素的正常分泌 (Trends Endocrinol. Metab. 2012, 23, 477-487)。
胰岛素抵抗是 2型糖尿病、 肥胖症、 非酒精性脂肪肝病、 高甘油三酯血症等代谢性 疾病共同的病理特征。 促进胰岛素靶器官或组织如肝脏、 肌肉以及胰岛 β细胞等细胞内 线粒体脂肪酸氧化， 促进线粒体再生， 提高线粒体代谢机能， 减少这些器官或组织内脂 质和 ROS积累， 能显著改善体内胰岛素抵抗， 是治疗 2型糖尿病、 肥胖症和非酒精性 脂肪肝病等代谢性疾病的重要途径 (Tseng YH., el. al.， Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9, 465-482; Serra D., et. al" Antioxid. Redox Signal., 2013,19,269-284)。
线粒体功能退变是导致细胞衰老， 引起神经退行性疾病的中心环节， 也是衰老和神 经退行性疾病重要的病理标志（Beal MF., Ann. Neurol., 2005, 58, 495-505; Lin MT. and Beal MF., Nature, 2006, 443, 787-795; Karbowski M and Neutzner A., Acta Neuropathol., 2012, 123, 157-171)。 由于线粒体 DNA缺陷， 氧化磷酸化发生异常， 导致线粒体能量代 谢障碍， 产生并积累大量 ROS， 进一步损害线粒体自身代谢机能， 生成更多 ROS， 对细 胞核 DNA造成损伤， 激活与细胞衰老相关信号蛋白， 引发细胞老化。 线粒体已成为延 缓细胞衰老和治疗神经退行性疾病的新靶点， 提高线粒体代谢机能， 是延缓衰老及治疗 神经退行性疾病的有效手段 (Reddy PH and Reddy TP., Curr. Alzheimer Res., 2011, 8, 393-409; Guarente L.， Cell, 2008, 132, 171-176)。
单磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK)是一种异源三聚体 蛋白， 由 α， β， γ三个亚基组成， 在肝脏， 骨骼肌， 心脏和肾脏等器官或组织均有大量 表达。 ΑΜΡΚ作为一种重要的蛋白激酶参与生物体内多种代谢过程， 被称为细胞 "能量 感受器" ， 当细胞受到任何引起 ΑΤΡ生成减少与消耗增加的应激信号时， ΑΜΡ/ΑΤΡ比 值增加， ΑΜΡΚα亚基内 Thrl72位点磷酸化， 从而活化 AMPK， 调节细胞内能量代谢。 活 化 AMPK是提高线粒体代谢机能的重要手段。 AMPK可以通过磷酸化乙酰辅酶 A羧化酶 (Acetyl-CoA carboxylase, ACC)Ser79位点抑制 ACC活性， 提高肉碱棕榈酰基转移酶 l(Carnitine palmitoyltransferase 1, CPT1)活性， 促进线粒体脂肪酸 β氧化， 抑制脂肪酸合 成； 同时活化 AMPK能显著提高线粒体生成转录因子 PGC-la的转录活性， 促进线粒体再 生 (Biogenesis)。 Metformin, resveratrol, dinitrophenol等小分子化合物可活化 ΑΜΡΚ, 另外 通过限制热量摄入 (Caloric restriction)和经常锻炼也能活化骨骼肌和肝脏 ΑΜΡΚ， 促进线 粒体能量代谢 （Zhang BB., et. al., Cell Metab., 2009, 9, 407-416; Steinberg GR and Kemp BE., Physiol. Rev., 2009, 89, 1025-1078)。 通过活化 AMPK， 提高线粒体代谢机能， 是增 强机体胰岛素敏感性并治疗代谢性疾病的重要途径。 此外， 通过活化 AMPK， 能抑制哺 乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)活性， 进而调控下游核糖体 S6蛋白激酶 (ribosomal S6 kinase)和转译抑制因子 4EBP等蛋白活性， 延缓细胞老化， 是延长生物体寿命及治疗衰老 相关疾病的重要途径 (Gwinn DM et al" Mol. Cell, 2008, 30, 214-226; Johnson SC., et al" Nature, 2013, 493, 338-345; Laplante M and Sabatini DM., Cell, 149, 274-293; Sshin E and Depinho RA., Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 2012, 13, 397-404; Selman C, et al" Science, 2009, 326, 140-144; Kapahi P., et al, Cell Metab., 2010, 11, 453-465)。
过氧化物酶体 (Peroxisome)是细胞内一种重要的具有单层膜结构的细胞器， 其主要 功能是催化长链和极长链脂肪酸氧化， 生成短链脂肪酸再返回线粒体完成全部氧化过 程， 以及清除细胞内活性氧自由基 (ROS)等。 过氧化物酶体内含有大量氧化酶， 催化底 物反应生成过氧化氢 (H202)， 再通过过氧化氢酶 (Catalase)将 ¾02分解成水和氧气。 过 氧化物酶体对外部信号非常敏感， 容易发生增殖 (Proliferation), 高脂饮食、 长时间空腹、 降脂药如贝特类药物以及一些除草剂和杀虫剂等都能诱导过氧化物酶体增殖 （Reddy JK. and Hashimoto T. , Annu. Rev. Nutr. , 2001 , 21， 193-230)。 另外， 在线粒体代谢功能障 碍的病理状态下， 过氧化物酶体通常发生代偿性增殖。 过氧化物酶体增殖通过过氧化物 酶体增殖受体 a(peroxisome proliferator-activated receptor a, PPARa)进行调控。 H202作为 信号分子，在细胞内诱导参与过氧化物酶体生成的 PEX系列基因表达，调控过氧化物酶 体再生 (Lopez-Huertas E., et al., EMBO J., 2000, 19, 6770-6777) o
脂酰辅酶 A氧化酶 (acyl-CoA oxidase， AOX， EC 1.3.3.6), 是过氧化物酶体脂肪酸 β 氧化过程中催化第一步反应的酶， 也是过氧化物酶体脂肪酸 β-氧化过程的限速酶， 分子 量约 72 kDa, 每分子 AOX含有一分子黄素腺嘌吟二核苷酸 (Flavin adenine dinucleotide, FAD)。 AOX催化脂酰辅酶 A碳链 2-3位脱氢， 形成 2-烯脂酰辅酶 A(2-en0yl-C0A)， 脱 下的氢原子直接与分子氧结合，形成 H202 基因在细胞内的表达通过 PPARa调控。
目前没有关于脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂前体应用于提 高线粒体代谢机能的任何报道， 也没有脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶 A氧化酶 抑制剂前体作为制备用于治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病如糖尿病的药物的用途的 任何报道。 发明内容
本发明的目的在于提供一种提高线粒体代谢机能的方法，脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 作为线粒体代谢机能促进剂的用途， 脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶 A氧化酶抑 制剂前体在制备用于治疗因线粒体代谢机能障碍所致疾病的组合物中的用途。
在本发明的第一方面， 提供脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂的用途， 用于制备促进线粒 体脂肪酸氧化和线粒体再生， 提高线粒体代谢机能， 抑制过氧化物酶体增殖的组合物； 所述脂酰辅酶 A氧化酶的国际酶学分类编号为 EC 1.3.3.6。
在一个优选例中， 所述的靶器官或组织是表达脂酰辅酶 A氧化酶的器官或组织； 较佳地， 包括： 肝脏， 骨骼肌， 脂肪组织， 心脏， 肾脏。
在另一优选例中， 所述的组合物还用于预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关 疾病。 较佳地， 所述的线粒体代谢功能障碍相关疾病包括 (但不限于)： 代谢综合征， 衰 老或神经退行性疾病； 较佳地， 所述的代谢综合征包括： 胰岛素抵抗， 糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病， 高甘油三酯血症； 较佳地， 所述的神经退行性疾病包括： 阿尔茨海 默症或帕金森症； 较佳地， 所述的糖尿病包括 2型糖尿病， 伴胰岛素抵抗 1型糖尿病 (与 胰岛素联合治疗)。
在一个优选例中， 所述脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂通过抑制脂酰辅酶 A氧化酶降低 靶器官或组织内氧化应激水平， 减少胰岛素作用靶组织内氧化自由基 (ROS)含量， 改善 胰岛素抵抗， 从而预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病。
在另一优选例中， 所述 1型糖尿病特征为体内胰岛素分泌绝对缺乏伴胰岛素抵抗， 给予胰岛素治疗后不能有效控制血糖； 所述 2型糖尿病特征为胰岛素抵抗伴胰岛素相对 缺乏， 或胰岛素分泌不足伴胰岛素抵抗。
在另一优选例中， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂为抑制脂酰辅酶 A氧化酶活性 或表达的物质。
在另一优选例中，所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂包括 (但不限于)：小分子有机物， 小分子无机物， 抗脂酰辅酶 A氧化酶抗体， 能与脂酰辅酶 A氧化酶特异性结合并抑制 其活性的核酸片段和多肽。
在另一优选例中， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂还包括抑制剂前体。
在另一优选例中， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或抑制剂前体包括 (但不限于)： 10,12-二十五碳二炔酸 (Pentacosadiynoic acid; CAS编码： 66990-32-7, LH-919)或 10,12- 二十五碳二炔酰辅酶 A(10,12-Pentacosadiynoyl-CoA， LH-919-CoA)。
在另一优选例中， 所述的组合物还用于：
抑制体内靶器官或组织脂酰辅酶 A氧化酶活性；
抑制体内靶器官或组织过氧化物酶体增殖；
活化体内靶器官或组织单磷酸腺苷活化蛋白激酶；
降低体内靶器官或组织内氧化应激水平； 或
减少体内胰岛素作用靶器官或组织内氧化自由基 (ROS)含量；
提高体内靶器官或组织细胞内线粒体氧化磷酸化水平；
增加体内靶器官或组织细胞 PGC-la基因表达；
抑制体内靶器官或组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白或核糖体 S6蛋白激酶活性。
在本发明的另一方面， 提供一种用于预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾 病的组合物， 所述组合物包括： 脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 （较佳地， 为治疗有效量的抑 制剂)； 以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个优选例中， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂为抑制脂酰辅酶 A氧化酶活性 或表达的物质。
在另一优选例中， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂包括 (但不限于)： 抗脂酰辅酶 A 氧化酶抗体， 能与脂酰辅酶 A氧化酶特异性结合并抑制其活性的核酸片段和多肽， 小分 子有机物， 小分子无机物。 在另一优选例中， 所述的组合物包括： 药物组合物、 饮食补充剂、 保健品组合物。 在另一优选例中，所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂还包括抑制剂前体； 较佳地包括
(但不限于）： 10,12-二十五碳二炔酸（LH-919)或 10,12-二十五碳二炔酰辅酶 A
(LH-919-CoA)。
在本发明的另一方面， 提供一种制备预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾 病的组合物的方法， 所述方法包括： 将脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂与药学上可接受的载体 或赋形剂混合， 获得所述的药物组合物。
在本发明的另一方面， 提供一种预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病的 方法， 所述方法包括： 抑制需要预防、 改善或治疗的患者体内的脂酰辅酶 A氧化酶活性 或表达。
在一个优选例中， 所述的抑制脂酰辅酶 A氧化酶活性或表达的方法是： 给需要预 防、 改善或治疗的患者施用有效量的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或脂酰辅酶 A氧化酶抑 制剂前体。
在另一优选例中， 所述脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂作用的靶器官或组织为哺乳动物 或人体内表达脂酰辅酶 A氧化酶的器官组织， 包括肝脏组织、 肌肉组织、 脂肪组织、 胰 岛 β细胞和肾脏组织等。
在另一优选例中， 所述脂酰辅酶 Α氧化酶抑制剂是 LH-919-CoA或其前体 LH-919。 较佳地选择 LH-919实施，其施用剂量为 0.1-3000 g/kg/d， 较佳剂量为 0.1-100( g/kg/d， 更佳剂量为 l-100( g/kg/d， 更佳剂量为 10-100( g/kg/d。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明
图 1 AOX抑制剂在细胞内提高线粒体代谢机能， 抑制过氧化物酶体增殖的作用原 理。 N=细胞核 (nuclei); M=线粒体 (mitochondria); P=过氧化物酶体 (peroxisome); MFAO= 线粒体脂肪酸氧化（mitochondrial fatty acid oxidation)； MB=线粒体再生（mitochondria biogenesis); PB=过氧化物酶体再生 (peroxisome biogenesis)。
图 2. LH-919-CoA抑制纯化的 AOX活性分析。 AOX溶于 20mM PBS 缓冲液中 (pH7.4),浓度 80nM， 向酶溶液中分别加入 80ηΜ( Τ)、 240ηΜ(Δ) 480 ηΜ(·)、 960ηΜ (口） LH-919-CoA, 以及 800nM(o) LH-919游离酸， 对照组加相同体积蒸馏水 (·）， 于 25 °C下 分别孵育不同时间后， 测定 AOX残余酶活性。
图 3. LH-919-CoA抑制 AOX动力学参数测定。
图 4. LH-919-CoA体外抑制大鼠肝脏过氧化物酶体 AOX活性分析。
图 5. 不同浓度 LH-919-CoA (浓度见横坐标)体外抑制大鼠肝脏过氧化物酶体 AOX 活性分析。
图 6. AOX抑制剂前体 LH-919(浓度见横坐标)体内抑制 C57BL小鼠肝脏 AOX活性 分析。
图 Ί. AOX抑制剂前体 LH-919(浓度见横坐标)体内抑制 Wistar大鼠肝脏 AOX活性 分析。
图 8. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏脂肪酸氧化活性的影响。每组样本数 n=6。 图 9. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏和骨骼肌 AOX活性的影响。 每组样本数 n=8。
图 10. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏过氧化物酶体脂肪酸氧化活性的影响。 每组样本数 n=8。
图 1 1. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌细胞色素 c氧化酶活性的影响。 每组 样本数 n=8。
图 12. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏和骨骼肌柠檬酸合成酶活性的影响。 每 组样本数 n=8。
图 13. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌线粒体 DNA拷贝数的影响。每组样本 数 n
图 14. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌 PGC-la mRNA表达的影响。 每组样 本数 n=6。
图 15. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏 AMPKCThrl72)磷酸化 水平的影响。 每组样本数 n=6。
图 16. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠肝脏 ACC(Ser79)磷酸化水 平的影响。 每组样本数 n=6。
图 17. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌 AMPKCThrl 72)磷酸 化水平的影响。 每组样本数 n=6。
图 18. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌 ACC(Ser79)磷酸化 水平的影响。 每组样本数 n=6。
图 19. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌 p70S6K蛋白表达和 p70S6KCThr389)磷酸化水平 (p-p70S6K)的影响。 每组样本数 n=6。
图 20. AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠骨骼肌 PEJH mRNA表达的影响。 每组样本 数 n
图 21. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏 AOX活性的影响。 每组样本数 n
图 22. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠骨骼肌细胞色素 c氧化酶活性的影响。 每组样本数 n=7。
图 23. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏柠檬酸合成酶活性的影响。每组 样本数 n=7。
图 24. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠骨骼肌柠檬酸合成酶活性的影响。每 组样本数 n=7。
图 25. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏线粒体 DNA拷贝数的影响。 每 组样本数 n=7。
图 26. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏 ΑΜΡΚ(Τ1η·172) 磷酸化水平的影响。 每组样本数 η=6。
图 27. Western blot检测 AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏 ACC(Ser79) 磷酸化水平的影响。 每组样本数 n=6。
图 28. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏线粒体 PGC- mRNA表达的影 响。 每组样本数 n=7。
图 29. AOX抑制剂前体对 CPIB药物诱导大鼠肝脏 PEX1 mRNA表达的影响。每组 样本数 n=7。
图 30. AOX抑制剂前体治疗对高脂饮食诱导肥胖大鼠肝脏组织学的改变。
图 31A. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠口服糖耐受 (OGTT)的影 响。
图 31B. AOX抑制剂前体治疗后四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠口服糖耐受血糖下线面积
(AUC)比较。
图 32. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血清甘油三酯的影响。 图 33. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血清游离脂肪酸的影响。 图 34. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠肝脏 AOX活性的影响。 图 35. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血清 MDA的影响。
图 36. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠肝脏 ¾02含量的影响。 图 37. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠肝脏甘油三酯含量的影响。 图 38. AOX抑制剂前体治疗对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠肝脏 MDA的影响。
图 39A. AOX抑制剂前体治疗对 ob/ob小鼠口服糖耐受 (OGTT)的影响。
图 39B. AOX抑制剂前体治疗对 ob/ob小鼠口服糖耐受血糖下线面积 (AUC)影响。 图 40. AOX抑制剂前体治疗对 ob/ob小鼠肝脏 AOX活性的影响。
图 41. AOX抑制剂前体治疗对 ob/ob小鼠肝脏组织学的改变。
图 42. AOX抑制剂前体治疗对 ob/ob小鼠肝脏 MDA的影响。
图 43. AOX抑制剂前体治疗对 db/db小鼠肝脏 AOX活性的影响。
图 44. AOX抑制剂前体治疗对 db/db小鼠肝脏 MDA的影响。 具体实施方式
本发明首次揭示脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 (或抑制剂前体)在制备用于预防、 缓解或 治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病的组合物中的用途。 具体而言， 本发明中揭示了通过 给予脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 (或抑制剂前体)， 抑制体内脂酰辅酶 A氧化酶活性， 进而 显著提高靶器官或组织内线粒体代谢功能， 并降低细胞内氧化应激水平， 改善体内胰岛 素抵抗， 延缓细胞衰老， 治疗线粒体功能障碍引起的疾病。
本发明的具体实施方案中， 以肝脏或骨骼肌为例， 作为 AOX抑制剂作用的靶器官， 测试 AOX抑制剂在体外对肝脏 AOX的抑制作用， 以及 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前 体 (precursor)在体内对肝脏 AOX的抑制作用。但需要特别指出的是， AOX抑制剂或 AOX 抑制剂前体在体内作用的靶器官或组织不限于肝脏和骨骼肌， 包括哺乳动物或人体内任 何表达 AOX蛋白的器官， 例如肌肉组织、 心脏、 脂肪组织、 胰岛 β细胞、 肾脏组织等， 因为体内这些不同器官表达的 ΑΟΧ蛋白为同一基因转录产物， 氨基酸序列一致， 且具 有相同的生理活性。
如本文所用， 所述的 LH-919 指代 10,12-二十五碳二炔酸（10,12-Pentacosadiynoic acid), 其 CAS编码： 66990-32-7。 LH-919为 LH-919-CoA的前体， LH-919在体内能够 转化为 LH-919-CoA。
如本文所用， 所述的 LH-919-CoA 指代 10,12-二十五碳二炔酰辅酶 A (10,12-Pentacosadiynoyl-CoA)。
具体而言， 本发明具体实施例中包括以下 3个方面内容：
1. AOX抑制剂的制备及对 AOX的抑制作用
本发明人制备了 LH-919-CoA。 以 LH-919酸为原料， 制备了高纯度 LH-919-CoA， 测试其对 AOX的抑制作用。 由游离脂肪酸制备脂酰辅酶 A的合成方法参照文献实施 (Li D. et. al.， J. Am. Chem. Soc , 2001 , 121， 9034-9042)。
本发明分别从体外和动物体内测试了 AOX抑制剂对 AOX的抑制作用。
本发明人首次发现， LH-919-CoA在体外能显著抑制肝脏 AOX活性。首先采用重组 表达并高度纯化的大鼠肝 AOX作为靶蛋白， 测定 LH-919-CoA对 AOX的抑制效果， 结 果 LH-919-CoA能迅速抑制 AOX活性， 且这种抑制作用是不可逆的。 游离 LH-919酸对 AOX没有抑制作用。
采用大鼠肝脏完整过氧化物酶体作为测定对象， 测试 LH-919-CoA在体外对过氧化 物酶体中 AOX抑制作用， 结果 LH-919-CoA能迅速且显著地抑制大鼠肝脏过氧化物酶 体 AOX活性。
本发明测试了 AOX抑制剂前体在动物体内对 AOX的抑制作用。
本发明首先确定了 LH-919-CoA是 LH-919在体内转化物。 本发明一实施例中， 将 一定剂量 LH-919给予 Wistar大鼠灌胃， 经完全吸收后处死， 迅速解剖大鼠， 摘取肝脏， 分离肝脏过氧化物酶体， 通过对大鼠肝脏过氧化物酶体内含物分析， 检测到过氧化物酶 体中存在 LH-919-CoA。 因此 LH-919在体内吸收后， 在肝脏转化为 LH-919-CoA。
事实上， 游离脂肪酸在细胞内活化为脂酰辅酶 A的机制已经非常清楚， 以过氧化物 酶体为例， 在过氧化物酶体膜上存在长链 /极长链脂酰辅酶 A 合成酶 (acyl-CoA synthetase), 将游离脂肪酸 (NEFA)活化为脂酰辅酶 A( cyl-CoA)， 后进入过氧化物酶体， 作为催化底物进入 AOX蛋白活性中心 (Reddy JK. and Hashimoto T.， Annu. Rev. Nutr. , 2001 , 21， 193-230)。
本发明一实施例中， 将 LH-919给予 C57BL小鼠灌胃， 于灌胃 3h后处死， 迅速解 剖小鼠， 摘取肝脏， 分离过氧化物酶体， 测定 AOX酶活性， 结果与对照组相比， 灌药 组 C57BL小鼠肝脏 AOX活性显著降低， 且抑制作用强度与灌药剂量成正比关系。
本发明另一实施例中， 将 LH-919给予 Wistar大鼠灌胃， 于灌胃 3h后处死， 迅速解 剖大鼠， 摘取肝脏， 分离过氧化物酶体， 测定 AOX活性， 结果与对照组相比， 灌药组 Wistar大鼠肝脏 AOX活性显著降低， 且抑制作用强度与灌药剂量成正比关系。
通过体外抑制实验得知， 游离 LH-919对 AOX无抑制作用。 LH-919在体内吸收后， 转化为 LH-919-CoA抑制 AOX活性。
因此， LH-919 是 AOX 抑制剂 LH-919-CoA 的前体， LH-919 在体内代谢产物 LH-919-CoA能快速且不可逆地抑制 AOX活性。
2. AOX抑制剂提高靶器官或组织细胞内线粒体代谢机能的原理
本发明人首次发现， 通过抑制体内靶器官或组织 AOX 活性， 可以增加
AMPK(Thrl72)磷酸化水平， 活化 ΑΜΡΚ, 抑制 ACC活性， 提高 CPT1活性， 促进线粒 体脂肪酸 β氧化， 提高线粒体生成转录因子 PGC-la基因表达， 促进线粒体再生， 从而 提高线粒体代谢机能， 增强机体胰岛素敏感性。 此外， AOX 抑制剂在体内通过活化 AMPK, 能抑制 mTOR及下游靶蛋白如核糖体 S6蛋白激酶活性， 延缓细胞衰老。
另一方面， AOX催化底物反应将产生大量 ¾02，通过抑制体内靶器官或组织 AOX 活性， 减少 AOX催化反应产生的 H202， 能显著降低参与过氧化物酶体生成的 系列 基因的表达水平，降低靶器官或组织细胞内过氧化物酶体数量，抑制过氧化物酶体增殖， 并减少 ROS的产生。 AOX抑制剂在细胞内提高线粒体代谢机能， 抑制过氧化物酶体增 殖的作用原理如图 1所示。
AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体作为线粒体代谢机能促进剂的用途，其中所述 AOX 抑制剂前体在哺乳动物或人体内转化为 AOX抑制剂， 并抑制 AOX活性。
本发明一实施例中， 将 LH-919给予 Wistar大鼠灌胃连续 6周， 后处死大鼠， 并对 大鼠血清和肝脏及骨骼肌组织进行生化分析， 结果 LH-919药物组体重增重较对照组显 著减少， 表明 AOX抑制剂具有减轻大鼠体重的作用。 药物组血糖、 血清胰岛素和血清 甘油三酯含量较对照组显著降低。 同时， 血清 β-hydroxybutyrate较对照组显著升高， 表 明 AOX抑制剂能显著促进大鼠肝脏脂肪酸氧化。 通过测定大鼠肝脏脂肪酸氧化速率， 结果表明， AOX抑制剂组肝脏脂肪酸氧化速率较对照组显著升高。 细胞色素 c氧化酶 (Cytochrome c oxidase, COX)是衡量线粒体氧化磷酸化水平的标志酶，实施例中 AOX抑 制剂组肝脏和骨骼肌细胞色素氧化酶活性较对照组显著增加，表明通过抑制 AOX活性， 能提高大鼠肝脏和骨骼肌线粒体氧化磷酸化水平。 同时， 肝脏和骨骼肌 AOX活性较对 照组显著降低， 肝脏过氧化物酶体脂肪酸氧化也显著降低， 这些结果表明， 通过抑制体 内 AOX活性即过氧化物酶体脂肪酸氧化， 能促进体内线粒体脂肪酸氧化， 提高线粒体 氧化磷酸化水平。 本发明还通过生化分析方法比较了各组肝脏和骨骼肌 citrate synthase 活性， mtDNA 拷贝数均为衡量细胞内线粒体数量的特征指标， 本实验分别测定了实验 各组的 citrate synthase活性和 mtDNA拷贝数， 结果表明， 肝脏和骨骼肌 citrate synthase 活性和 mtDNA拷贝数较对照组显著升高， 表明 AOX抑制剂能促进线粒体再生， 显著提 高大鼠肝脏和骨骼肌线粒体数量。
通过对大鼠肝脏和骨骼肌组织蛋白 western blot分析， AOX抑制剂组大鼠肝脏和骨 骼肌 AMPKCThrl72)和 ACCCSer79)磷酸化水平均较对照组显著提高 (ρ<0.01)， 表明 ΑΟΧ 抑制剂通过活化 ΑΜΡΚ，抑制 ACC活性，促进肝脏和骨骼肌线粒体脂肪酸代谢。 RT-PCR 分析结果表明， ΑΟΧ 抑制剂组大鼠骨骼肌 PGC-la 基因表达水平较对照组显著升高 (p<0.01) , 参与过氧化物酶体生成的关键基因 表达水平较对照组显著下降， 表明 AOX抑制剂在体内促进线粒体生成， 抑制过氧化物酶体增殖。
本发明一实施例中， 通过抑制 AOX活性， 活化靶器官或组织如骨骼肌 ΑΜΡΚ, 进 而抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活性， 降低核糖体 S6蛋白激酶 (Thr389)磷酸化水平， 减 少核糖体 S6蛋白激酶的表达， 从而显著降低核糖体 S6蛋白激酶活性， 延缓细胞衰老。
本发明另一个实施例中， 采用氯苯丁酯 (dofibrate, CPIB)药物诱导大鼠模型， 进一 步通过实例阐释 AOX抑制剂抑制过氧化物酶体增殖， 促进线粒体再生的原理。 氯苯丁 酯是一种常用的降脂药， 其通过激活 PPARa , 促进过氧化物酶体增殖。 将低剂量 CPIB(100mg/kg/d)和 LH-919同时给予 Wistar大鼠灌胃，对照组只给予相同剂量 CPIB灌 胃， 连续灌胃 12天后处死大鼠， 对血清和肝脏组织生化分析， 结果 AOX抑制剂组血 清 TG较对照组显著降低， AOX抑制剂组血清 β-hydroxybutyrate较对照组显著升高， 表 明抑制剂组肝脏脂肪酸氧化水平较对照组升高。 AOX抑制剂组肝脏和骨骼肌 COX活性 较对照组显著增加， 表明通过抑制 AOX活性， 能提高肝脏和骨骼肌线粒体氧化磷酸化 水平。 CPIB 诱导过氧化物酶体增殖的一个显著特征是肝重系数 (；肝重 /体重比值)明显增 力口， 实施例中 AOX抑制剂组大鼠肝重系数较 CPIB对照组显著降低 (p<0.01)， 表明 AOX 抑制剂能在体内能抑制 CPIB诱导的过氧化物酶体增殖。
AOX抑制剂组肝脏和骨骼肌 citrate synthase活性和 mtDNA数量较对照组显著升 高，肝脏 PGC- 基因表达水平也较对照组显著提高 (p<0.01)， 表明抑制剂组肝脏和骨骼 肌线粒体数量较对照组显著增加。
通过对肝脏组织蛋白 western blot 分析， AOX 抑制剂组大鼠肝脏和骨骼肌 AMPKCThrl72)和 ACCCSer79)磷酸化水平均较对照组显著上升 (ρ<0.01)， 表明 ΑΟΧ抑制 剂通过活化 ΑΜΡΚ， 促进体内线粒体脂肪酸氧化和线粒体生成， 提高线粒体代谢机能。
CPIB通过激活 PPARa, 显著提高肝脏 AOX活性， 诱导过氧化物酶体增殖。 AOX 抑制剂在体内通过抑制 AOX活性， 减少 ¾02的生成， 显著降低肝脏 系列基因表 达水平 (p<0.01)， 抑制过氧化物酶体增殖， 降低肝重系数。
3. AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体在制备用于治疗线粒体代谢功能障碍所致疾病 的组合物中的用途
本发明首次报道通过抑制体内 AOX活性， 促进线粒体脂肪酸氧化和线粒体再生， 提高线粒体代谢机能的原理。 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体作为线粒体代谢机能促进 剂， 作为治疗线粒体代谢机能障碍性疾病的药物的应用。
具体而言， 本发明从两个应用方面分别举例进行说明。
第一方面， AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体在制备作为治疗包括糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病等以胰岛素抵抗为病理标志的疾病的药物中的应用。 线粒体代谢机能 障碍是机体产生胰岛素抵抗的直接原因， 也是这些代谢性疾病重要的病理特征。 提高线 粒体代谢机能是改善体内胰岛素抵抗， 治疗糖尿病等代谢性疾病的主要途径。
糖尿病是一种由于遗传和环境因素相互作用， 胰岛素相对或绝对缺乏以及靶组织胰 岛素抵抗引起的碳水化合物、 脂肪及蛋白质代谢紊乱的综合征， 是一种持续高血糖为特 征的， 慢性、 全身性代谢疾病。 糖尿病发病后若未得到有效治疗， 可出现广泛的微血管 及大血管病变， 出现神经、 泌尿、 循环等多系统的病理改变。 糖尿病主要有 2种类型： (1) 1型糖尿病， 胰岛 β细胞破坏， 通常导致胰岛素绝对缺乏； （2) 2型糖尿病， 又称为 非胰岛素依赖型糖尿病， 表现为全身胰岛素抵抗伴胰岛素相对缺乏， 或胰岛素分泌不足 伴胰岛素抵抗。 2012年全世界的糖尿病患者达 3.5亿人，其潜在的最大增长人群在亚洲， 约占总增长数的 65%以上。 中国糖尿病患者近 10年增长了 2倍， 患病总人数接近 1亿 人， 居全球第一位。
目前针对 1型糖尿病治疗以胰岛素治疗为主，但 1型糖尿病患者常伴有胰岛素抵抗， 经胰岛素治疗后血糖仍控制不稳定。 针对 2型糖尿病治疗， 在控制体重和运动均未能有 效控制血糖时， 常以口服降糖药治疗， 目前有两大类常用口服降糖药物， 第一类为胰岛 素分泌促进剂， 如磺酰脲类药物等， 这类药物主要副作用在于容易引起低血糖， 以及对 肝肾毒性较大； 第二类为胰岛素增敏剂， 主要有噻唑烷二酮类 (TZDs)药物如吡咯列酮等 和双胍类药物如二甲双胍等。 噻唑烷二酮类药物早期使用较多， 但容易引起肥胖， 心衰 以及增加患膀胱癌的风险等明显副作用， 近年来使用越来越少； 双胍类药物使用过程中 容易出现恶心、 腹泻等不良副作用。
在线粒体代谢功能障碍的病理状态下， 由于机体胰岛素抵抗引起葡萄糖利用障碍， 因此组织更多地利用体内脂肪氧化提供能量， 血液中游离脂肪酸 (non-esterified fatty acid, NEFA)含量显著升高， 进入肝脏、 肌肉、 胰岛 β细胞等组织的 NEFA也随之增多， 导致这些组织过氧化物酶体内参与脂肪酸 β-氧化的代谢酶活性及脂肪酸 β-氧化水平均 代偿性显著升高 (Horie S. et. al.， J. Biochem. , 1981， 90， 1691-1696； Asayama K. et al. , Mol. Cell. Biochem. , 1999， 194， 227-234)。 本发明实施例中， 因线粒体代谢功能障碍 的各种模型动物如糖尿病大 /小鼠肝脏 AOX活性均较正常组显著升高。
本发明人首次发现， 通过抑制体内靶器官或组织 AOX活性， 提高线粒体代谢功能， 降低这些器官或组织内氧化应激水平， 显著改善体内胰岛素抵抗， 获得意想不到的治疗 糖尿病、 肥胖症、 非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血症等代谢性疾病的效果。
本发明还包括 AOX抑制剂前体在制备用于治疗糖尿病、 肥胖症、 非酒精性脂肪肝 病和高甘油三酯血症的组合物中的用途， 所述 AOX抑制剂前体在哺乳动物或人体内转 化为 AOX抑制剂， 并抑制 AOX活性。 例如本发明实施例中， LH-919是 AOX抑制剂前 体， LH-919经体内吸收后， 在肝脏转化为 LH-919-CoA， 能快速显著抑制 AOX活性。
应当理解， AOX抑制剂和 AOX抑制剂前体在哺乳动物或人体内的生理活性是相同 的， 即抑制靶器官或组织 AOX活性。
AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体可以治疗 1型糖尿病和 2型糖尿病。
其中所述 1型糖尿病特征为体内胰岛素分泌绝对缺乏伴胰岛素抵抗， 给予胰岛素治 疗后不能有效控制血糖； 所述 2型糖尿病特征为胰岛素抵抗伴胰岛素相对缺乏， 或胰岛 素分泌不足伴胰岛素抵抗。
具体而言， 本发明实施方案中， 针对一种 1型糖尿病动物模型和二种 2型糖尿病动 物模型进行了药效试验。
本发明实施方案以一种 AOX抑制剂前体 LH-919为例，进行动物药效试验。 LH-919 在体内转化物 LH-919-CoA是 AOX抑制剂， 在体内能快速显著地抑制 AOX活性。
药效试验中， LH-919 治疗的有效剂量为 0.1-3000 g/kg/d， 较佳剂量为 0.1-100( g/kg/d， 更佳剂量为 l-100( g/kg/d， 更佳剂量为 10-100( g/kg/d。
本发明一实施方案， 首先针对 1型糖尿病， 采用四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠模型， 由 于四氧嘧啶选择性破坏胰岛 β细胞， 引起胰岛素绝对缺乏， 血糖急剧升高， 因此给予四 氧嘧啶糖尿病大鼠皮下注射低剂量长效胰岛素， 防止由于血糖过高引起的酮症酸中毒。 成模后， 糖尿病大鼠空腹血糖显著升高且伴有胰岛素抵抗， 血清甘油三酯和游离脂肪酸 显著升高， 肝脏 ΑΟΧ活性和体内氧化应激水平均显著升高。
给予不同剂量 ΑΟΧ抑制剂前体治疗后， 治疗组血糖较对照组显著降低 (ρ<0.01)， 口 服糖耐受 (OGTT)能力显著增强， 血清甘油三酯和游离脂肪酸 (NEFA)含量显著降低 (ρ<0. 01)。 经 AOX抑制剂前体治疗后， 糖尿病大鼠肝脏 AOX活性显著降低 (p<0.01)， 体内氧 化应激水平随之显著降低， 表现在血清丙二醛 (malondialdeyde , MDA)含量显著降低 (p<0.01), 肝脏 ¾02和 MDA含量显著降低 (p<0.01)。
因此， 对于 1型糖尿病伴胰岛素抵抗动物模型， 给予胰岛素治疗后， 因体内胰岛素 抵抗， 不能有效控制血糖。 经 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体治疗后， 通过抑制体内 AOX活性， 能显著减轻体内氧化应激水平， 改善胰岛素抵抗， 降低血糖， 提高机体糖耐 受能力， 从而治疗 1型糖尿病 (与胰岛素联合治疗)。
本发明另 2个实施方案， 针对 2型糖尿病， 选用 ob/ob小鼠、 db/db小鼠两种动物模 型， 这 2种动物模型均为自发性 2型糖尿病动物模型， 具有胰岛素抵抗、 高血糖、 高胰 岛素血和高血脂等特征。 同时肝脏 AOX活性也显著升高， 体内氧化应激水平较正常组 显著升高。
分别给这两种 2型糖尿病动物以 AOX抑制剂前体治疗后， 治疗组血糖和血清胰岛 素水平较对照组显著降低 (p<0. 01)， 胰岛素抵抗指数 HOMA-IR显著下降， 口服糖耐受 (OGTT)显著增强。血清甘油三酯和游离脂肪酸 (NEFA)含量也显著降低 (p<0. 01)。经 AOX 抑制剂前体治疗后， ob/ob小鼠和 db/db小鼠肝脏 AOX酶活性显著降低 (p<0. 01), 从而 体内氧化应激水平显著降低， 表现在肝脏 ¾02含量和 MDA含量均显著降低 (p<0. 01)。 经 AOX抑制剂前体治疗后， ob/ob小鼠抑制剂组体重增加较对照组显著减少，表明 AOX 抑制剂在体内通过提高肝脏和骨骼肌等靶器官线粒体代谢机能， 具有减轻体重， 治疗肥 胖症的作用。 本发明首次发现， 通过抑制体内 AOX酶活性， 促进肝脏脂肪酸氧化， 抑 制肝脏脂肪酸合成， 降低肝脏氧化应激水平， 改善肝脏胰岛素抵抗， 显著降低 ob/ob小 鼠、 db/db小鼠体内肝脏甘油三酯含量。
因此， 对于 2型糖尿病动物模型， 给予 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体治疗， 抑制 体内 AOX活性， 能显著减轻体内氧化应激水平， 减轻体重， 降低血糖， 提高机体糖耐 受能力， 降低血清和肝脏甘油三酯含量。 因此 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体可以治疗 2型糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病， 高甘油三酯血症等代谢性疾病。
本发明另一实施方案， 采用高脂饮食诱导肥胖大鼠模型进行试验， 这种大鼠模型具 有肥胖， 胰岛素抵抗， 高血脂， 脂肪肝等病理特征。
给予高脂饮食诱导肥胖大鼠 AOX抑制剂前体治疗后， AOX抑制剂组体重增加较对 照组显著减少， 治疗组空腹血糖和血清胰岛素水平较对照组显著降低 (p<0.01)， 胰岛素 抵抗指数 HOMA-IR显著下降。 血清甘油三酯含量也显著降低 (p<0.01)。 经 AOX抑制剂 前体治疗后抑制剂组大鼠肝脏甘油三酯含量也显著降低 (p<0.01)。 因此， AOX抑制剂通 过提高体内线粒体代谢机能， 能改善体内胰岛素抵抗， 治疗肥胖症， 非酒精性脂肪肝病， 高甘油三酯血症等代谢性疾病。
第二方面， AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体在制备作为延缓衰老和治疗神经退行性 疾病的药物中的用途。 线粒体在衰老和神经退行性疾病的病理进程中处于核心地位， 线 粒体代谢机能障碍是导致细胞衰老， 引起神经退行性疾病的直接原因， 也是这些疾病重 要的病理标志， 提高线粒体代谢机能是延缓衰老和治疗神经退行性疾病的重要途径， 这 些结论都是公知的。
本发明一实施例， 通过抑制 Wistar 大鼠体内靶器官 AOX 活性， 可以增加 AMPK(Thrl72)磷酸化水平， 活化 AMPK， 抑制 ACC活性， 促进线粒体脂肪酸 β氧化， 提高线粒体生成转录因子 PGC-la基因表达水平， 促进线粒体再生， 从而提高线粒体代 谢机能， 减少线粒体 ROS产生的效率， 提高细胞的抗氧化能力， 降低线粒体 DNA和细 胞核 DNA发生突变的几率。另一方面，本发明实施例通过抑制靶器官或组织 AOX活性， 活化 AMPK， 能抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)活性， 进而抑制下游核糖体 S6蛋 白激酶活性， 延缓细胞老化， 治疗衰老相关疾病。 大量实验报道证实， 提高线粒体代谢 机能， 抑制 mTOR 或下游核糖体 S6蛋白激酶活性， 能延长动物寿命， 治疗退行性疾病， 尽管本发明没有进行动物寿命药效实验， 但本发明的实施例提供的大量实验数据充分证 明了 AOX抑制剂延缓细胞衰老， 治疗神经退行性疾病的有效性。 因此， AOX抑制剂作 为线粒体代谢机能促进剂， 能延长哺乳动物或人的寿命， 治疗神经退行性疾病。
基于本发明人的上述新发现， 本发明提供了一种 AOX 的抑制剂的用途， 用于促进 线粒体脂肪酸氧化和线粒体再生， 提高线粒体的代谢机能， 抑制过氧化物酶体增殖， 并 基于此用途制备用于预防、 改善或治疗包括代谢性疾病如糖尿病、 肥胖症、 非酒精性脂 肪肝病、 高甘油三酯血症等， 衰老， 神经退行性疾病等在内的线粒体功能障碍相关疾病 的药物。
如本文所用， 所述的 AOX抑制剂包括了下调剂、 阻滞剂、 拮抗剂、 阻断剂等。 所述的 AOX抑制剂是指任何可降低 AOX蛋白的活性、降低 AOX基因或蛋白的稳 定性、 下调 AOX蛋白的表达、 减少 AOX蛋白有效作用时间、 或抑制 AOX基因的转录 和翻译的物质， 这些物质均可用于本发明， 作为对于下调 AOX有用的物质， 从而可用 于本发明。 例如， 所述的抑制剂包括： 小分子有机物、 小分子无机物、 小分子化合物、 特异性与 AOX结合的抗体或配体、能与 AOX特异性结合并抑制其活性的核酸片段和多 肽等， 特异性干扰 AOX基因表达的小干扰 RNA分子或反义核苷酸等。
作为本发明的优选方式， 所述的 AOX 抑制剂是化合物 LH-919-CoA 或其前体 LH-919。 本发明还包括上述化合物的异构体、 外消旋体、 药学上可接受的盐、 水合物。 所述的 "药学上可接受的盐" 是指所述化合物与无机酸、 有机酸、 碱金属或碱土金属等 反应生成的盐。 化合物具有一个或多个不对称中心。 所以， 这些化合物可以作为外消旋 的混合物、 单独的对映异构体、 单独的非对映异构体、 非对映异构体混合物、 顺式或反 式异构体存在。 所述的 "前体"指当用适当的方法服用后， 该化合物的前体在病人体内 进行代谢或化学反应而转变成该化合物， 或由该化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的另一种可选方式， 所述的 AOX抑制剂可以是一种特异性与 AOX结 合的抗体。 所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。 可用 AOX蛋白免疫动物， 如 家兔， 小鼠， 大鼠等来生产多克隆抗体； 多种佐剂可用于增强免疫反应， 包括但不限于 弗氏佐剂等。 与之相似的， 表达 AOX或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来 生产抗体。 所述的抗体也可以是单克隆抗体， 此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制 备（见 Kohler等人， Nature 256； 495， 1975； Kohler等人， Eur.J.Immunol. 6： 51 1， 1976； Kohler等人， Eur.J.Immunol. 6： 292， 1976； Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. , 1981)。
作为本发明的另一种可选方式， 所述的 AOX抑制剂可以是一种 AOX特异性的小 干扰 RNA分子 （siRNA) 。 如本文所用， 所述的 "小干扰 RNA (small interfering RNA， siRNA) "是指一种短片段双链 RNA分子， 能够以同源互补序列的 mRNA为靶目标降解 特定的 mRNA， 这个过程就是 RNA干扰 （RNA interference) 过程。 小干扰 RNA可以制 备成双链核酸的形式， 它含有一个正义链和一个反义链， 这两条链仅在杂交的条件下形 成双链。 一个双链 RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。 因此， 举例 来讲， 互补的正义链和反义链是化学合成的， 其后可通过退火杂交， 产生合成的双链 RNA复合物。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体， 以及药学上或食品学上可接受的载体。 本发明的组合物可用于通过抑制 AOX活性， 提 高靶器官或组织线粒体代谢机能， 改善机体胰岛素抵抗， 治疗包括糖尿病、 肥胖症、 非 酒精性脂肪肝病、 高甘油三酯血症、 神经退行性疾病如阿尔茨海默症和帕金森症等、 衰 老等在内的一切因线粒体代谢功能障碍引起的疾病的药物。
如本文所用， "药学上或食品学上可接受的" 的成分是适用于人和哺乳动物而无不 良副作用 (如毒性、 剌激和变态反应)的， 即具有合理的效益 /风险比的物质。 术语 "药学 上或食品学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药或用于保健品服用的载体， 包括各种赋 形剂和稀释剂。
如本文所用， 术语 "组合物 " 包括 (但不限于)： 药物组合物、 饮食补充剂、 保健品 组合物， 只要它们含有本发明的 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体， 作为预防、 改善或治 疗哺乳动物和人线粒体代谢功能障碍相关疾病的活性成分。
本发明中， 术语 "含有" 表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。 因此， 术语 "主要由…组成" 和 "由…组成"包含在术语 "含有" 中。
本发明的组合物中药学上或食品学上可接受的载体， 包括 (但并不限于)： 橄榄油、 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油及其组合。 通常药物制剂应与给药方式相匹配。 药物 组合物宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量。
本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的， 只要是能够使活性成分有效地到达 哺乳动物或人体内的剂型都是可以的。 比如可选自： 片剂、 胶囊、 粉末、 颗粒、 糖浆、 溶液、 悬浮液、 或气雾剂。
在需要的情况下， 本发明的药物组合物还可以与其它一种或多种对于代谢综合征有 效的物质联合应用。 例如， 所述的组合物中还可含有选自以下的一种或多种的药物： 其 它种类的抗糖尿病药物、 降脂药物、 减肥药物、 抗高血压药物、 或抗凝血药物。 当两种 或两种以上的药物联合给药时， 一般具有优于单独给药的效果。 例如， 其它种类的抗糖 尿病药物选自： 双胍类、 磺酰脲类、 格列奈类降糖药物， α-葡萄糖苷酶抑制剂、 胰岛素 增敏剂 (如噻唑烷二酮类药物)、 aP2抑制剂、 DPPIV抑制剂、 SGLT2抑制剂、 胰岛素、 胰高血糖样肽 -1(GLP-1)、 或它们的类似物。
应当理解， 本发明不限于这里描述的具体方法， 包括采用的试验方案， 分析测试方 法和试剂等， 这些都是可以变化的。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 J.萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 第三版， 科学出版社， 2002中所述的 条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1、 AOX抑制剂的制备及体外抑制实验
(1) AOX抑制剂 LH-919-CoA的制备
LH-919-CoA的制备方法参照文献进行 (Li D. et. al.， J. Am. Chem. Soc , 2001 , 121， 9034-9042) o 具体操作： LH-919 20 mg (Sigma, St. Louis, MO) , 加入 5 mL无水四氢呋 喃 (tetrahydroforan, THF)(Acros , Geel， Belgium)中，在氮气保护下向溶液中添加 0.1 mmol 三乙胺 (triethylamine)(Sigma， St. Louis , MO) , 混合搅拌 10分钟后， 在 0 °C下向溶液中 逐滴加入 0.1 mmol氯甲酸异丁酯（isobutyl chloroformate)(Acros， Geel， Belgium) , 室温 搅拌 l h。 后将 50mg辅酶 A钠盐 (Coenzyme A)(USB， Cleveland, OH)溶于蒸馏水中， 加 l mol/L NaOH调 pH至 8.0， 在氮气保护下滴加到反应液中， 继续搅拌 20分钟后， 缓慢 滴加 1 M盐酸， 将溶液 pH调至 5.5〜6.0。 在负压下使有机溶剂挥发掉， 剩下的水溶液用 乙醚萃取两次去除残留的有机溶剂， 收集下层水相， 经离心超滤管 (Millipore , Billerica, MA)过滤后通过反相高效液相色谱 (RP-HPLC)分离纯化 LH-919-CoA。 RP-HPLC分离条 件：色谱柱 hypersil C 18 柱（ 250 mm x 4. 6 mm, 5 μηι)，采用梯度洗脱，流动相 Α为 25mM 磷酸钾缓冲液 (pH 5.9)， 流动相 B为 85%(v/v)甲醇水溶液， 洗脱程序流动相 B占流动相 总体积比为: 0-5 min 0% B， 5-24 min 0%- 100% B， 24-35 min 100% B，流速： 0.8 mL-rnin"1， 检测波长 260 nm， 柱温 30 °C， 进样量： 100 μί。 LH-919-CoA出峰时间约在 27min， 收 集 LH-919-CoA组分， 然后经真空冷冻干燥除去溶剂， 得到 LH-919-CoA冻干粉末。
(2) 表达纯化重组 AOX
本发明采用重组大鼠肝 AOX作为靶蛋白筛选其抑制剂， 应当理解， 重组 AOX与天 然 AOX具有相同的生理活性。大鼠肝 AOX在 E.co/ 中的重组表达及亲和纯化参照文献 方法实施（Zeng J. et. al.， Protein Expression and Purification. 2004 , 37 , 472-478) , 高度 纯化后的 AOX酶活性为 1.89U/mg， 蛋白纯度>95%。 (3) LH-919-CoA对纯化的重组大鼠肝 AOX体外抑制作用分析
将上述高度纯化的重组大鼠肝 AOX溶于 20mM PBS缓冲液中 (pH7.4)， 浓度 80nM， 再向酶溶液中分别加入不同浓度 LH-919-CoA (抑制剂组)， 对照组加相同体积蒸馏水， 于 25 °C下分别孵育不同时间后， 测定抑制剂组和对照组脂酰辅酶 A氧化酶残余活性。脂酰 辅酶 A氧化酶活性测定方法根据文献 (Luo Y. et al.， Arch. Biochem. Biophys. , 2000， 384， 1 -8)， 通过 Shimadzu UV- 1800紫外 /可见分光光度仪测定 263nm吸光度变化， 即 2-烯脂 酰辅酶 A产物的生成 (ε ^ηη^ ό.Υ ηιΜ^ηι·1),来测定 ΑΟΧ活性。反应体系包含 50 mmol/L PBS 缓冲液， H 7.4, 30 μΜ palmitoyl-CoA (Sigma, St. Louis, MO), Ά 500ng AOX, 总体积 500μί
结果见图 2 LH-919-CoA能快速抑制 ΑΟΧ活性， 且抑制作用随 LH-919-CoA浓度 增加而增强。 游离 LH-919酸对 ΑΟΧ没有抑制作用， LH-919游离酸必须活化为脂酰辅 酶 Α即底物形式后才能抑制 AOX活性。
LH-919-CoA对 AOX的抑制作用是不可逆的，实验步骤如下： AOX溶于 20mM PBS 缓冲液中， pH7.4， 终浓度 ΙΟΟηΜ, 再向酶溶液中加入 2μΜ LH-919-CoA, 于 25 °C下孵 育 60 min, 以保证酶与抑制剂充分作用， 然后将 AOX 与抑制剂混合物装入透析袋中 (MWCO 5000) , 再放入 2L 20 mM PBS缓冲液中 (pH 7.4)， 于 4 °C对缓冲液透析 24h， 期 间每隔 4小时更换一次透析液， 以充分除去游离 LH-919-CoA。 对照组将 100nM AOX 加相应体积蒸馏水， 其余操作与抑制剂组相同。 透析后将抑制剂组和对照组分别测定 AOX酶活性， 结果如表 1所示， 抑制剂组通过透析除去游离 LH-919-CoA后， 其 AOX 活性不能恢复， 对照组酶活性没有显著变化， 因此， LH-919-CoA对 AOX的抑制作用是 不可逆的。
表 1 LH-919-CoA抑制 AOX透析前后 o 活性比较
对照组 抑制剂组
酶活性 (U/mg) 相对活性 (％) 酶活性 (U/mg) 相对活性 (％) 透析前 1.93 100%
透析后
Figure imgf000018_0001
0.062 3.2% 注： 相对活性表示各组测定的活性值与透析前对照组活性的百分比值。 由于 LH-919-CoA对 AOX的抑制作用是不可逆的， 因此采用 和 kmact来表征抑制 动力学， 参照文献方法进行 (Li D. et. al. J. Am. Chem. Soc. 2001 1 19 1 1 1-133)。 实 验步骤如下：50 nM AOX溶于 20mM PBS缓冲液中， pH 7.4，再向酶溶液分别加入 0.5 μΜ Ι μΜ, 3μΜ 5μΜ ΙΟμΜ, 15μΜ Z-919-CoA, 于 25 °C下孵育 0min 5 min, lOmin, 15 min 和 20min后， 分别测定各剂量组 AOX活性， 在各 LH-919-CoA浓度下， 以相对残余活 性取对数对孵育时间作图， 采用 Sigmaplotl2.0 软件进行线性拟合， 计算得到各抑制剂 浓度下表观抑制速率 k。bs， 将各浓度下 k。bs对抑制剂浓度双倒数作图， 如图 3所示， 计 算 LH-919-CoA对 AOX酶抑制动力学参数 值为 810 nM, k t值为 3.08 min"1 0
(4) LH-919-CoA对大鼠肝脏过氧化物酶体 AOX体外抑制作用分析
大鼠肝脏过氧化物酶体分离参照文献实施 (Small GL. et. al. Biochem. J. 1985 227 205-210)。 操作步骤如下： 准确称取大鼠新鲜肝脏组织 0.5g， 于冰浴上剪碎， 悬浮于 9 倍体积勾浆缓冲液中 C 10%Cw/v)蔗糖， 3mM咪唑， 20mM PBS缓冲液， pH 7.4)， 冰浴上 电动勾浆后， 4 °C下 5000xg离心 10分钟， 吸取上清。 下层沉淀再悬浮于少量勾浆缓冲 液中再 5000xg离心 10分钟， 合并上清液于 35000xg离心 30分钟， 下层沉淀即为过氧 化物酶体。
取 200μ§过氧化物酶体（以蛋白计)悬浮于 20mM PBS缓冲液中 (pH 7.4)，再向溶液中 加入 5 μΜ LH-919-CoAC抑制剂组）， 对照组加相应体积蒸馏水， 于 25 °C下孵育 0 min， 2 min, 5 min, 10 min和 20 min后， 分别测定抑制剂组和对照组 AOX活性。
过氧化物酶体 AOX活性参照文献测定 (Johnson JK. et.al.， Biochemstry, 1992， 31， 10564-10575； Luo Y. et al , Arch. Biochem. Biophys. , 2000, 384， 1-8)， 采用分光光度 法 ， 测 定 AOX 催 化 底 物 3-indolepropionyl-CoA(IP-CoA) 氧 化 所 生 成 的 trans-3-indoleacryloyl-CoA(IA-CoA)量来反映 AOX活性， IA-CoA的消光系数 ε367 nm为 26.5 mM^cm^反应液含 50 mmol/L PBS 缓冲液， pH 7.4, 30 μηιοΙ/L IP-CoA (纯度 >95%)， 30 μηιοΙ/L FAD (Sigma, St. Louis, MO), 0.5 g/L BSA(Sangon Biotech. , Shanghai), 0.02% TritonX-100(Sangon Biotech. , Shanghai) , 以及 20(^g 过氧化物酶体（以蛋白计）。 采用 Shimadzu UV-1800紫外 /可见光谱仪， 测定 367nm吸光值变化， 分析条件下， 每分钟生 成 1 μηιοΙ ΙΑ-CoA所需的过氧化物酶体蛋白量为 1个酶活性单位 (U)。
结果如图 4所示， 以大鼠过氧化物酶体为测活对象， LH-919-CoA能快速抑制大鼠 过氧化物酶体 AOX活性。
另一实验， 取 200μ§过氧化物酶体（以蛋白计)悬浮于 20mM PBS缓冲液中 (pH7.4)， 向溶液中分别加入不同浓度 LH-919-CoA (抑制剂组)，对照组加相应体积蒸馏水，于 25 °C 下孵育 2min后，分别测定抑制剂各组和对照组 AOX活性，结果如图 5所示， LH-919-CoA 体外抑制过氧化物酶体 AOX活性与所加入抑制剂量呈正相关关系。 实施例 2、 AOX抑制剂前体抑制大 /小鼠体内 AOX作用分析
(1) LH-919在动物体内转化为 LH-919-CoA的实验测定
SPF级 Wistar大鼠 6只， 雄性， 体重 220-250g， 禁食 12h后， 6只大鼠分为 2组， 对照组和药物组， 每组 3只， 对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只， 药物组将 LH-919溶于 相应体积橄榄油中， 灌胃 LH-919 100 g/kg， 于 3h后将全部大鼠处死， 迅速解剖摘取肝 脏， 立即放入液氮中保存。
肝脏细胞内亚细胞单元内含物脂酰辅酶 A的测定参考文献实施 (Melde K. et. al.， Biochem. J. , 1991， 274， 395-400)。 操作步骤如下： 准确称取肝脏组织 0.3g， 于冰浴 上剪碎， 悬浮于 9倍体积勾浆缓冲液中（10%蔗糖， 3mM咪唑， 20mM PBS)冰浴上电动 勾浆后，4°C 5000xg离心 10分钟，吸取上清。下层再悬浮于少量勾浆缓冲液中再 5000xg 离心 10分钟， 合并上清液于 30000xg离心 30分钟， 得到的沉淀即为过氧化物酶体。 将过氧化物酶体首先悬浮于 2 mL超纯水中 (4 °C)， 然后加入 200μί 5mM HC104沉淀蛋 白质，以及 20nM Lignoceryl-CoA(C24:0)作为参照样，蛋白质沉淀于 16000xg离心分离， 上清液用 K2C03调节 pH至 7.0， 离心去除 KC104沉淀， 上清液经冷冻干燥去除溶剂， 剩余固体物溶于 200 μ 超纯水中， 通过 RP-HPLC 检测对照组和药物组各样品 LH-919-CoA含量， 最后通过质谱 (MS)确认。 RP-HPLC操作条件， 色谱柱 hypersil C18 柱（ 250 mm X 4. 6 mm, 5 μηι)， 流动相 Α为 25mM磷酸钾缓冲液 (pH 5.9)， 流动相 B为 85%甲醇水溶液，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序流动相 B占流动相总体积比为： 0-5 min 0% B， 5-24 min 0%-100% B， 24-35 min 100% B，流速： 0.8 mL-rnin"1 ,检测波长 260 nm， 柱温： 30 °C， 进样量： 25 μL o
结果显示， 药物组各样本肝脏过氧化物酶体中均检测到 LH-919-CoA， 对照组肝脏 过氧化物酶体中没有检测到 LH-919-CoA。
因此， LH-919经体内吸收进入肝脏后， 转化为 LH-919-CoA， 进入过氧化物酶体， 作为底物与 AOX相互作用。
(2) AOX抑制剂前体对 C57BL小鼠体内肝脏 AOX抑制作用分析
SPF级 C57BL小鼠 16只， 雄雌各 8只， 体重 20-25g， 小鼠禁食 12h后， 16只小鼠 分为 2组， 对照组和药物组， 每组 8只， 雄雌各半。 对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只； 药物组将 LH-919溶于相应体积橄榄油中， 灌胃 LH-919 20-80 g/kg。 于灌胃 3h后将全 部小鼠处死， 迅速解剖摘取肝脏， 立即放入液氮中保存。 准确称取肝脏 0.3g， 勾浆分离 得到过氧化物酶体后， 分别测定对照组和药物组各样品 AOX活性。
数据以 X±SEM表示， 用 SPSS17.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采用 独立样本 t检验。 与对照组比较， * P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。
结果如图 6所示， 药物组其肝脏组织内 AOX酶活性较对照组显著降低， 表明 AOX 抑制剂前体 LH-919在体内转化为 LH-919-CoA，能显著抑制 C57BL小鼠肝脏 AOX酶活 性， 与体外实验结果一致。 AOX抑制剂前体 LH-919在 C57BL小鼠体内抑制肝脏 AOX 酶活性具有良好的剂量依赖性。
(3) AOX抑制剂前体对 Wistar大鼠体内肝脏 AOX抑制作用分析
SPF级 Wistar大鼠 12只， 雄雌各 6只， 体重 220-250g， 大鼠禁食 5h后， 分为 2组， 对照组和药物组， 每组 6 只， 雄雌各半。 对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只； 药物组将 LH-919溶于相应体积橄榄油中， 灌胃 LH-919 10-80 g/kg， 于 3h后将全部大鼠处死， 迅速解剖摘取肝脏， 立即放入液氮中保存。 准确称取肝脏 0.3g， 勾浆分离得到过氧化物 酶体后， 分别测定对照组和药物组各样品 AOX酶活性。
数据以 X±SEM表示， 用 SPSS17.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采用 独立样本 t检验。 与对照组比较， * P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。
结果如图 7所示， 药物组其肝脏组织内 AOX酶活性较对照组显著降低， 表明 AOX 抑制剂前体 LH-919在体内转化为 LH-919-CoA， 能显著抑制肝脏 AOX活性， 与体外实 验结果一致。 A0X抑制剂前体 LH-919抑制大鼠肝脏 A0X酶活性具有良好的剂量依赖 性。 实施例 3、 通过抑制体内 AOX活性， 活化肝脏和骨骼肌 AMPK, 提高肝脏和骨骼 肌线粒体代谢机能
(l)AOX抑制剂前体提高 Wistar大鼠肝脏和骨骼肌线粒体代谢机能实验
SPF级 Wistar大鼠 16只， 雄性， 体重 260-280g， 分为 2组， 对照组和 AOX抑制剂 组， 每组 8只。 对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只； AOX抑制剂组将 LH-919溶于相应体 积橄榄油中， 灌胃 LH-919 50 g/kg， 灌胃 1次 /天， 连续灌胃 21天。 期间每 7天测定大 鼠体重。
于灌胃后第 22天 5:00am禁食， 3h后从大鼠尾静脉采血测空腹血糖， 血糖测定采用 血糖仪及配套试纸测定 (OneTouch UltraVue, Johnson and Johnson, NJ., USA)。后摘眼球取 血， 分离血清。 胰岛素 ELISA试剂盒 (Millipore, Billerica, MA., USA)测定血清胰岛素， 血清甘油三酯含量采用甘油三酯检测试剂盒测定 (北京北化康泰临床诊断有限公司， 北 京）， 血清 β-hydroxybutyrate含量采用试剂盒测定（Sigma, St. Louis, MO, USA)。
随后处死所有大鼠， 摘取肝脏， 称量肝脏湿重。 从肝右叶固定部位切取另 1块肝组 织制备肝勾浆， 试剂盒测定肝脏甘油三酯含量。 肝组织细胞脂肪酸氧化活性， 参照文献 报道方法进行测定 (Zhang D.， et al., Cell Metab., 2010, 11, 402-411)。肝组织细胞过氧化物 酶体脂肪酸氧化速率测定参照文献报道方法实施 COsmundsen H., et al., Biochem J., 1989, 260, 215-220)。
肝细胞蛋白通过 CelLytic组织细胞裂解抽提试剂提取 (Sigma, St. Louis. MO. USA), 分别测定抽提液 AOX 活性， 柠檬酸合成酶 (citrate synthase)和细胞色素 c 氧化酶 (cytochrome c oxidase)活性。柠檬酸合成酶活性测定参照 Lopez-Lluch et al.报道方法实施 (Lopez-Lluch G" et al" PNAS, 2006, 103, 1768-1773)。细胞色素 c氧化酶活性参照 Zid et al. 报道方法实施 (Zid BM. et al., Cell, 139, 149-160)。
大鼠骨骼肌线粒体 DNA拷贝数 (mtDNA copy number)通过 RT-PCR测定， 参照文献 报道方法实施 (He L.， et al., Nucleic Acids Res., 2002, 30, e68)。
Western blot检测大鼠肝脏或骨骼肌 AMPK、 ACC和 p70S6K磷酸化水平。 取液氮 冻存的肝脏或骨骼肌组织 100 mg， 剪碎， 加入 RIPA组织细胞裂解液勾浆， 同时分别加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 （complete Protease Inhibitor Cocktail)和 磷 酸 酶 抑 制 剂 (PhosSTOP)(Roche, Mannheim, Germany), Bio-Rad DC protein assay kit测定蛋白质浓度 (Bio-Rad, Hercules, CA., USA)。 SDS-PAGE分离蛋白后，用电转移法将蛋白转移至 PVDF 膜。 用 5%BSA 室温封闭 2h。 分别加入 ΑΜΡΚα、 磷酸化 AMPKa Thrl72)、 磷酸化 ACC(Ser79)、p70S6K和磷酸化 p70S6K(Thr389)—抗 (Cell Signaling, Danvers, MA., USA), 以 β-actin Sigma, St. Louis, MO, USA)作为内参。 4°C振荡过夜， 洗膜后加第二抗体常温 振荡孵浴 l h，ECL显影，凝胶影像分析仪测定蛋白条带灰度。 AMPK磷酸化水平 (p-AMPK) 以磷酸化 AMPKCThr 172)/ AMPK条带灰度比值表示， ACC磷酸化水平 (p-ACC)以磷酸化 ACC(Ser79)/p-actin 条带灰度比值表示， p70S6K 磷酸化水平（p-p70S6K)以磷酸化 p70S6K(Thr389)/ p70S6K条带灰度比值表示， p70S6K蛋白表达水平以 p70S6K/p-actin 条带灰度比值表示。
荧光实时定量 PCR(real-time PCR)检测肝脏 PGC-la, PEX1基因表达水平。 大鼠肝 脏和骨骼肌总 RNA通过 RNeasy试剂盒提取 CQiagen, Valenca, CA.， USA)。采用反转录试 剂盒合成 cDNA第一链 (Strategene, La Jo 11a, CA.， USA)。 使用 SYBRGreen荧光染料进行 荧光实时定量 PCR(7500 Fast Real-time PCR System, Applied Biosystems)。 反应体系为 cDNA 80ng, 上游引物 200 nM， 下游引物 200nM， 2xSYBRGreen Supermix ΙΟμί, 加纯 水至终浓度 20μί.。 PEX1 上游引物 5 '-GTGTTCCCATGTGGTCTCAT-3 '， 下游引物 5 '-ATGTGCTCTCTTTGGCTTGG-3 ' ； PGC-la 上 游 弓 | 物
5 '-CAGCAAAAGCCACAAAGACG-3 '， 下游引物 5 '-AGTTCCAGAGAGTTCCACAC-3 '。 以 18S rRNA作为内参。通过 Ct 值来测定 RNA的表达量，每个基因测定通过 5个样本， 每个样本重复 3次。
数据以 X士 SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用 t检验， 与对照组比较， *P < 0.05， ** P< 0.01。
经过 21天 AOX抑制剂干预后， 抑制剂组大鼠体重增重量较对照组显著减少， 表明 AOX抑制剂治疗具有减轻体重的效果。血糖和血清胰岛素含量较对照组显著下降， AOX 抑制剂组血清甘油三酯和肝脏甘油三酯含量也较对照组显著下降， 如表 2所示。
表 2 各组大鼠的代谢相关参数
Figure imgf000022_0001
抑制剂组血清 β-hydroxybutyrate含量较对照组显著升高 (表 2)， 表明抑制剂组肝脏 脂肪酸氧化水平较对照组显著增加， AOX抑制剂能提高体内肝脏脂肪酸代谢水平。进一 步通过测定大鼠肝脏脂肪酸氧化速率， 结果 AOX抑制剂组肝脏脂肪酸氧化速率较对照 组显著升高， 如图 8所示。 同时， 大鼠肝脏 AOX活性较对照组显著降低（图 9)， 肝脏过 氧化物酶体脂肪酸氧化也显著降低 (图 10)， 这些结果表明， 大鼠肝脏脂肪酸氧化活性的 提高是通过提高线粒体脂肪酸氧化水平实现的。 因此， 通过抑制 AOX活性， 能促进线 粒体脂肪酸氧化， 提高大鼠肝脏脂肪酸氧化水平。此外， AOX抑制剂组骨骼肌细胞色素 c氧化酶活性较对照组显著增加， 如图 11所示， 表明通过抑制体内 AOX活性， 能显著 提高靶器官或组织细胞内线粒体氧化磷酸化水平。
通过对表征线粒体数量的特征指标 citrate synthase活性和线粒体 DNA拷贝数测定， 结果表明， AOX抑制剂组肝脏和骨骼肌 citrate synthase活性显著高于对照组（图 12)， 抑 制剂组骨骼肌线粒体 DNA拷贝数也显著高于对照组 (图 13)。 荧光实时定量 PCR分析结 果表明， AOX抑制剂组大鼠骨骼肌 PGC- 基因表达水平显著高于对照组 (图 14)， 这些 结果表明， AOX抑制剂治疗可以增加 PGC- 基因表达， 促进线粒体再生， 显著提高大 鼠肝脏和骨骼肌线粒体数量。
通过 Western blot分析， AOX抑制剂组大鼠肝脏和骨骼肌 AMPK(Thrl72)磷酸化水 平和 ACC(Ser79)磷酸化水平均显著高于对照组， 如图 15-18所示， 因此通过抑制 AOX 活性， 能活化 AMPK， 抑制 ACC活性， 促进线粒体脂肪酸氧化。
Western blot分析结果还显示， AOX抑制剂组大鼠骨骼肌 p70S6K蛋白的表达水平 显著低于对照组， 抑制剂组 p70S6K (Thr389)磷酸化水平也显著低于对照组， 如图 19所 示。 这些结果表明， 通过抑制体内靶器官或组织 AOX活性， 活化 AMPK， 能抑制哺乳 动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)活性， 进而降低核糖体 S6蛋白激酶 (Thr389)磷酸化水平， 同时核糖体 S6蛋白激酶的表达水平也显著下调， 从而降低核糖体 S6蛋白激酶活性， 延 缓细胞衰老。
大鼠骨骼肌参与过氧化物酶体生成的基因 的表达水平显著低于对照组 (图 20)， 因此通过抑制体内 AOX活性， 能抑制过氧化物酶体增殖。
上述结果表明， 经 AOX抑制剂前体干预后， 通过抑制体内 AOX活性， 降低肝脏过 氧化物酶体脂肪酸氧化， 同时促进线粒体脂肪酸氧化， 促进线粒体生物再生， 显著提高 线粒体代谢机能。 因此 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体是线粒体代谢机能促进剂。
此外， AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体还可作为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白或核糖体 S6蛋白激酶活性抑制剂。
(2)AOX抑制剂抑制 CPIB药物大鼠肝脏过氧化物酶体增殖， 提高线粒体代谢机能 实验
SPF级 Wistar大鼠 24只， 体重 200-220g， 分为 3组， 正常对照组， CPIB对照组和 CPIB药物组， 每组 8只。 正常对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只； CPIB对照组将 CPIB 溶于相应体积橄榄油中， 给予大鼠灌胃 CPIBCTCI, Tokyo, Japan) 100mg/kg/d; AOX抑制 剂组在给予 CPIB灌胃 100mg/kg/d同时， 给予 LH-919灌胃 500 g/kg/d， 灌胃 1次 /天， 连续灌胃 12天。
于灌胃后第 13天 6:00am禁食， 3h后从大鼠尾静脉采血测空腹血糖， 血糖测定采用 血糖仪及配套试纸测定 。 后摘眼球取血， 分离血清， 分别测定血清 p-hydroxybutyrate(Sigma, St Louis, MO, USA)和血清甘油三酯含量（北京北化康泰临床诊 断有限公司， 北京)。
随后处死所有大鼠， 摘取肝脏， 称量肝脏湿重。 从肝右叶固定部位切取另 1块肝组 织制备肝勾浆， 试剂盒测定肝脏甘油三酯含量。
肝组织蛋白采用 CelLytic组织细胞裂解抽提试剂提取 (Sigma, St. Louis. MO. USA), 分别测定 AOX活性， 柠檬酸合成酶和细胞色素 c氧化酶活性。
Western blot法检测肝脏 AMPKCThrl 72)磷酸化和 ACC(Ser79)磷酸化水平， 实施方 法与前述相同。
荧光实时定量 PCR检测大鼠肝脏 PGC-la， PEX1基因表达水平， 实施方法与前述 相同。
数据以 X士 SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用 t检验。 CPIB大鼠抑制剂组与 CPIB大鼠对照组比较， *P < 0.05， **P < 0.01。
Figure imgf000024_0001
经过 12天 AOX抑制剂干预后， CPIB抑制剂组大鼠血糖和血清胰岛素含量较 CPIB 对照组显著下降， 抑制剂组血清甘油三酯和肝脏甘油三酯含量也显著下降 (表 3)。 CPIB 药物组血清 β-hydroxybutyrate含量较对照组显著升高 (表 3)， 表明药物组肝脏脂肪酸氧 化水平较对照组显著增加， AOX 抑制剂干预能提高肝脏脂肪酸代谢水平。 同时， 肝脏 AOX活性较对照组显著降低 (图 21)， 这些结果表明， 大鼠肝脏脂肪酸氧化活性的提高是 通过提高线粒体脂肪酸氧化水平实现的。 因此， 通过抑制 AOX活性， 过氧化物酶体脂 肪酸氧化水平下降， 同时， 能促进线粒体脂肪酸氧化， 提高肝脏整体脂肪酸氧化水平。
此外， CPIB抑制剂组大鼠骨骼肌细胞色素 c氧化酶活性较对照组显著增加， 如图 22所示， 表明通过抑制体内 AOX活性， 能显著提高靶器官或组织细胞线粒体氧化磷酸 化水平。
通过对表征线粒体数量的特征指标 citrate synthase活性和线粒体 DNA拷贝数测定， 结果表明， CPIB抑制剂组肝脏和骨骼肌 citrate synthase活性显著高于对照组 (图 23， 24)， 抑制剂组肝脏线粒体 DNA拷贝数也显著高于对照组 (图 25)。 这些结果表明， AOX抑制 剂干预能显著提高大鼠肝脏和骨骼肌线粒体数量。
通过 Western blot分析， AOX抑制剂组肝脏 AMPKCThrl72)磷酸化水平和 ACC(Ser79) 磷酸化水平显著高于对照组， 如图 26， 27所示， 因此通过抑制 AOX活性， 能活化靶器 官如肝脏或骨骼肌 AMPK， 并抑制 ACC活性， 促进靶器官线粒体脂肪酸氧化。
通过对 CPIB抑制剂组和 CPIB对照组肝脏 RT-PCR分析， AOX抑制剂组肝脏 PGC-la 基因表达水平显著高于对照组 (图 28)， 因此， 通过抑制 AOX活性， 活化肝脏和骨骼肌 AMPK, 能显著提高 PGC-7ot基因表达水平， 促进肝脏和骨骼肌线粒体生成。
通过对 CPIB抑制剂组和 CPIB对照组肝脏 RT-PCR分析， 参与过氧化物酶体生成 的基因 PEX1的表达水平显著低于对照组 (图 29)。因此通过抑制 AOX活性， 能抑制过氧 化物酶体生成。
上述结果表明， 经 AOX抑制剂前体干预后， 通过抑制体内 AOX活性， 降低肝脏 过氧化物酶体脂肪酸氧化， 同时活化肝脏和骨骼肌 AMPK， 促进线粒体脂肪酸氧化， 促 进线粒体生物再生， 显著提高线粒体代谢机能。 因此 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体是 线粒体代谢机能促进剂。 实施例 4、 AOX抑制剂前体对高脂饮食诱导的肥胖大鼠降体重、 降血脂、 降肝脂 实验
SPF级 Wistar大鼠 24只， 雄性， 体重 220-250g， 按体重平均分为 3组， 即正常对 照组， 高脂饮食 (High fat diet, HFD)对照组和高脂饮食药物组， 每组 8只。 正常对照组予 以普通大鼠词料喂养 (脂肪热卡比例为 12%)， 高脂饮食组予以高脂词料喂养 (脂肪热卡比 例为 58%)。 正常对照组和高脂饮食对照组给予橄榄油灌胃 0.2mL/只； 高脂饮食抑制剂 组将 AOX抑制剂前体 LH-919溶于相应体积橄榄油中， 给予 LH-919灌胃 40 g/kg， 灌 胃 1次 /天， 连续灌药 8周， 期间每 2周称量各组大鼠体重。
第 57天禁食 3h， 尾静脉取血， 血糖仪测定各组空腹血糖。 后摘眼球取血， 分离血 清。 胰岛素 ELISA试剂盒 (Millipore, Billerica, MA., USA)测定血清胰岛素。 试剂盒测定 血清甘油三酯含量。 随后处死所有大鼠， 摘取肝脏并称重， 迅速从肝右叶固定部位切取 1块肝组织， 迅 速以甲醛固定， 制备成石蜡切片， 经苏木精 -伊红（Hematoxylin-eosin' HE)染色， 通过光 学显微镜观察肝脏脂肪病变情况， 每组取 4份肝脏样本进行分析。 另从肝右叶固定部位 切取另 1块肝组织制备肝勾浆， 试剂盒测定肝脏甘油三酯含量。
数据以 X士 SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用 t检验。 各组样本数 n=8。 高脂饮食药物组与高脂饮食对照组比较， * P<0.05， ** P <0.01。
经过 8周 LH-919干预后， 高脂饮食抑制剂组血糖和血清胰岛素含量较高脂饮食对 照组显著下降 (表 4)， 胰岛素抵抗指数 HOMA-IR较对照组显著降低。高脂抑制剂组血清 甘油三酯含量较对照组显著下降， 如表 4所示。 表 4. 各组大鼠的代谢相关参数
Figure imgf000026_0001
非酒精性脂肪肝病以肝脏甘油三酯的大量沉积为最主要病理标志。 实施例中高脂饮 食抑制剂组肝脏肝重系数和甘油三酯含量均较高脂饮食对照组显著降低， 如表 4所示。 光学显微镜观察肝脏切片， 结果表明， 高脂饮食抑制剂组肝脏脂肪滴分布量显著低于对 照组， 而高脂饮食对照组脂肪沉积以大泡性脂肪滴为主， 而抑制剂组肝脏脂肪沉积以小 泡性脂肪滴为主， 如图 30所示， 因此， 经 AOX抑制剂治疗能显著减少高脂饮食引起的 肝脏甘油三酯沉积。
经过 AOX抑制剂前体 LH-919治疗后，高脂饮食药物组大鼠体重增加较高脂饮食对 照组显著下降 (表 5)， 说明 AOX抑制剂具有减轻体重的作用， 能预防和治疗高脂饮食诱 导的肥胖。
表 5 各组大鼠的体重增加随时间的变化
组别 体重增加量 (g)
2周 4周 6周 8周
普食对照组 55.4±2.1 102.6±3.3 146.1±3.7 183.7±4.5 高脂对照组 69.2±3.9 132.8±5.7 191.5±5.9 248.4±7.9 高脂抑制剂组 58.3±3.1 * 106.5±4.7* 147.9±4.8** 184.7±5.4 上述结果表明， AOX抑制剂前体治疗可以减轻高脂饮食诱导肥胖大鼠体内胰岛素抵 抗， 促进体内脂肪酸代谢， 从而减轻体重， 降低血清甘油三酯， 减少肝脏甘油三酯含量。
因此， AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体作为线粒体代谢机能促进剂， 通过促进肝脏 和肌肉脂肪酸代谢， 改善体内胰岛素抵抗， 可以治疗肥胖症和高甘油三酯血症， 以及的 非酒精性脂肪肝病。 实施例 5、 AOX抑制剂前体对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠降血糖， 降血脂实验 SPF级 Wistar大鼠 50只， 体重 180-200g， 喂以普通大鼠词料， 自由进水进食。 大 鼠适应喂养一周后， 20只大鼠作为正常组， 其余 30只大鼠造模。 30只大鼠禁食 18h后 腹腔注射四氧嘧啶 (Sigma, St. Louis, MO)200mg/kg, 48h后， 每只大鼠皮下注射地特长 效胰岛素 (Determir, Novo Nordisk, Denmark)4-6U/只， 连续 7d， 给药时间 16:00- 16:30， 以维持其基本的生理功能， 防止酮症酸中毒。 第 8天晨 5:00am禁食， 3h后从大鼠尾静 脉采血测空腹血糖，血糖测定采用血糖仪 (OneTouch UltraVue, Johnson and Johnson, New Brunswick, NJ)及配套试纸测定， 下同。 给四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠皮下注射长效胰岛 素连续 7d后， 空腹血糖升高到 22-25 mmol/L, 血糖趋于稳定， 胰岛素抵抗已形成， 共 24只成模。
成模后糖尿病大鼠按血糖水平均勾分成 3组， 每组 8只： 糖尿病大鼠对照组， 给予 橄榄油灌胃 0.2 mL/只 /天； 糖尿病大鼠低剂量 AOX抑制剂前体治疗组， 将 LH-919溶于 相应体积橄榄油中， 给予 LH-919灌胃 l(^g/kg/d; 糖尿病大鼠高剂量 AOX抑制剂前体 治疗组， 将 LH-919溶于相应体积橄榄油中， 给予 LH-919灌胃 2(^g/kg/d。 另外设正常 大鼠对照组 8只， 给予橄榄油灌胃 0.2ml/只 /天； 正常大鼠药物组 8只， 将 LH-919溶于 相应体积橄榄油中， 给予 LH-919灌胃 2(^g/kg/d。 糖尿病大鼠模型组和治疗组给药同时 组继续皮下注射长效胰岛素， 连续 13天。 期间分别于 d4， d8， dl2 5:00am禁食， 3h后 尾静脉采血测定空腹血糖。 dl l 行 OGTT实验， 5:00am禁食， 3h后尾静脉采血测定空 腹血糖， 作为基础对照 (0 min), 然后糖尿病大鼠各组动物给予葡萄糖 2.5g/kg灌胃， 分 别在此之后 30 min, 60 min, 禾 B 120 min尾静脉采血测定各组血糖， 绘制 0-120min的血 糖 -时间曲线， 并计算血糖曲线下面积 AUCQ_12Qmm。
药物治疗后第 13天 5:00am禁食， 3h后摘眼球取血， 分离血清。 测定血清甘油三酯 含量， 采用甘油三酯检测试剂盒测定 (北京北化康泰临床诊断有限公司， 北京)， 血清游 离脂肪酸含量采用游离脂肪酸检测试剂盒测定 (南京建成生物工程研究所， 南京）。
分离肝细胞过氧化物酶体， 测定各组肝细胞 AOX活性， 以 IP-CoA为底物测定。 各 组肝细胞内 H202含量采用 ¾02检测试剂盒测定 (Beyotime Biotech. , Haimen)。 血清和 肝脏脂质过氧化物含量采用微量丙二醛 (MDA)检测试剂盒测定 (南京建成生物工程研究 所， 南京）。
数据以 X±SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用独立样本 t检验。 与正常大鼠对照组比较， #P<0.05， ##P<0.01， ###P<0.001。 与 糖尿病大鼠模型组比较， * P<0.05， ** P<0.01， *** P<0.001。
糖尿病大鼠在给予 AOX抑制剂前体 LH-919治疗 4天后， 血糖较给药前显著下降， 下降水平一直维持稳定。 血糖下降水平与给药剂量呈正相关关系， 如表 6所示。 OGTT 实验结果表明， AOX抑制剂前体 LH-919能显著改善四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠的口服糖 耐受， 见图 31A， 与模型对照组比较， LH-919高、 低剂量组的 AUCQ_12Qmm面积均显著 下降（p<0.01 )， 且 AUCQ_12Qmm面积下降程度与给药剂量呈正相关关系， 如图 31B所示。 表 6、 AOX抑制剂前体 LH-919对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠降血糖作用
Figure imgf000028_0001
各组之间差异性比较采用独立样本 t检验。 与糖尿病大鼠对照组比较， * P<0.05， ** P<0.01, *** P<0.001。 经过 12天治疗后，糖尿病大鼠血清甘油三酯 (图 32)和游离脂肪酸 (；图 33)含量显著下 降。 测定肝细胞过氧化物酶体 AOX 活性， 结果如图 34所示， 糖尿病大鼠对照组肝脏 AOX活性较正常组显著上升， 经 AOX抑制剂前体治疗后， 治疗组肝细胞 AOX活性较 对照组显著降低。 同时血清 MDA含量显著下降 (图 35)， 肝细胞内 ¾02含量较对照组显 著下降 (图 36)。
通过测定各组大鼠肝脏甘油三酯含量， 结果糖尿病大鼠治疗组肝脏甘油三酯含量较 对照组显著降低，如图 37所示。糖尿病大鼠治疗组肝脏 MDA含量较对照组也显著下降， 如图 38所示。
上述结果表明， 通过 AOX抑制剂前体治疗， 提高糖尿病大鼠肝脏和肌肉线粒体代 谢机能， 减少糖尿病大鼠肝脏甘油三酯和 ROS 含量， 能显著改善糖尿病大鼠体内胰岛 素抵抗， 降低血糖。 因此 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体可以治疗伴胰岛素抵抗的 1 型糖尿病 (与胰岛素联合治疗)。 实施例 6、 AOX抑制剂前体对 ob/ob小鼠降血糖、 降体重、 降血脂和降肝脂实验
SPF级雄性 ob/ob小鼠 16只， 体重 42-45 g， 作为糖尿病组； C57BL小鼠 16只， 体 重 20-22g， 作为正常组。 ob/ob小鼠和 C57BL小鼠均喂以普通小鼠词料， 自由进水进食。 ob/ob小鼠适应喂养 1周后， 禁食 3h， 尾静脉取血， 血糖仪测定空腹血糖， 按血糖水平 均分为两组， 每组 8只： ob/ob小鼠对照组， 给予 O. lmL橄榄油灌胃； AOX抑制剂治疗 组， 将 AOX抑制剂前体 LH-919溶于相应体积橄榄油中， 给予 LH-919灌胃 5(^g/kg/d。 C57BL小鼠随机分为 2组， 每组 8只： C57BL小鼠正常组， 给予橄榄油灌胃 0.1ml/只 / 天； C57BL药物组， LH-919溶于相应体积橄榄油中， 给予 LH-919 灌胃 5(^g/kg/d。 各 组持续灌胃 16天。
于喂药后第 4、 8、 12、 16d禁食 3h， 尾静脉取血血糖仪测定空腹血糖。 灌胃后第 13天行 OGTT实验， 5:00am禁食，3h后尾静脉采血测定空腹血糖，作为基础对照 (0 min), 然后 ob/ob小鼠各组动物给予葡萄糖 2.0g/kg灌胃， 分别在此之后 30 min, 60 min, 和 120 min尾静脉采血测定各组血糖， 绘制 0-120min的血糖 -时间曲线， 并计算血糖曲线下 面积 AUCQ -120min °
第 16 天测完血糖后， 摘眼球取血， 分离血清。 胰岛素 ELISA试剂盒 (Millipore, Billerica, MA)测定血清胰岛素， 并计算胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR)(Mattews DR. et. al.， Diabetologia, 1985， 28， 412-419)。 试剂盒测定血清甘油三酯、 游离脂肪酸含量。
随后处死所有 ob/ob小鼠， 摘取肝脏， 迅速从肝右叶固定部位切取 1块肝组织， 迅 速以甲醛固定， 制备成石蜡切片， 通过 HE染色， 光学显微镜观察肝脏脂肪病变情况， 每组取 4份肝脏样本进行分析。 同时从肝右叶相同部位切取另 1块肝组织， 试剂盒测定 肝脏甘油三酯含量。
分离肝细胞过氧化物酶体， 测定各组肝细胞 AOX活性， 以 IP-CoA为底物测定。 肝 脏脂质过氧化水平采用微量丙二醛检测试剂盒测定 (南京建成生物工程研究所， 南京）。
数据以 X±SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用独立样本 t检验。 与 C57BL小鼠对照组比较， # P<0.05， ## P<0.01， ### P<0.001。 与 ob/ob小鼠对照组比较， * P< 0.05， ** P<0.01， *** P< 0.001。
ob/ob小鼠在给予 AOX抑制剂前体 LH-919治疗 4天后， 治疗组血糖较 ob/ob小鼠 对照组显著下降， 下降水平一直维持稳定， 如表 7所示。 OGTT实验结果表明， 经 AOX 抑制剂前体 LH-919治疗能显著改善 ob/ob小鼠的口服糖耐受， 见图 39A， 与 ob/ob小鼠 对照组比较， AOX抑制剂组 AUC(M 2Q mm面积显著下降 (p<0.01)， 如图 39B所示。 表 7、 AOX抑制剂前体 LH-919对 ob/ob糖尿病小鼠降血糖作用
空腹血糖 (mmol/L) 0天 4天 8天 12天 16天
C57BL小鼠对照组 6.9±0.3 7.1±0.3 7.0±0.2 6.9±0.3 7.0±0.1
C57BL小鼠抑制剂组 6.9±0.4 6.8±0.1 6.7±0.3 6.6±0.2 6.6±0.2 ob/ob小鼠对照组 13.1±0.3 13.5±0.6 13.0±0.5 12.9±0.6 13.2±0.5 ob/ob小鼠抑制剂组 13.0±0.3 8.6±0.4** 7.8±0.4*** η y_|_Q ^^^ 7.3±0.2*** 经过 16天治疗后， ob/ob小鼠药物组血清胰岛素含量显著下降 (表 8)， HOMA-IR较 对照组显著下降。 ob/ob小鼠治疗组血清甘油三酯含量较对照组显著下降 (表 8)。 测定肝 细胞过氧化物酶体 AOX活性， 结果如图 40所示， 经 AOX抑制剂前体治疗后， ob/ob 小鼠治疗组肝脏 AOX活性较对照组显著降低。
ob/ob小鼠治疗组肝脏肝重系数和甘油三酯含量较对照组均显著下降 (表 8)。 光学显 微镜下观察 ob/ob小鼠各组肝脏病理切片， 结果显示， 抑制剂组 ob/ob小鼠肝脏脂肪滴 分布较对照组显著减少，呈零星状分布，如图 41所示， AOX抑制剂治疗能显著减少 ob/ob 小鼠肝脏脂肪沉积。抑制剂组 ob/ob小鼠肝脏 MDA含量较 ob/ob小鼠对照组也显著下降 (图 42)。
表 8. 各组小鼠的代谢相关参数
Figure imgf000030_0001
上述结果表明， 给予 ob/ob小鼠 AOX抑制剂前体治疗， 通过提高肝脏和骨骼肌线 粒体代谢机能， 增强 ob/ob小鼠体内胰岛素敏感性， 能显著降低 ob/ob小鼠血糖， 减轻 体重， 降低 ob/ob小鼠血清和肝脏甘油三酯含量。 因此 AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体 可以治疗 2型糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血症等代谢性疾病。 实施例 7、 AOX抑制剂前体对 db/db小鼠降血糖、 降血脂和降肝脂实验
SPF级雄性 db/db小鼠 16只， 体重 38-42g; C57BL小鼠 8只， 体重 20-23g， 均喂 以普通小鼠词料， 自由进水进食。 db/db小鼠适应喂养 1周后， 禁食 3h， 尾静脉取血， 血糖仪测定空腹血糖， 按血糖水平均勾分为两组， 每组 8只： db/db小鼠对照组， 给予 O. lmL橄榄油灌胃； AOX抑制剂前体治疗组， LH-919溶于相应体积橄榄油中，给予 db/db 小鼠 LH-919灌胃 5(^g/kg/d。 另设 C57BL小鼠正常组 8只， 给予橄榄油灌胃 0.1ml/只 / 天。 各组持续灌胃 16天。
于喂药后第 4、 8、 12、 16天禁食 3h， 尾静脉取血， 血糖仪测定空腹血糖。 第 16天 测完血糖后， 摘眼球取血， 分离血清。 胰岛素 ELISA试剂盒 (Millipore, Billerica, MA) 测定血清胰岛素， 并计算胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR)。 试剂盒测定血清甘油三酯、 游离 脂肪酸含量。
随后处死所有 db/db小鼠， 摘取肝脏， 从肝右叶相同部位切取 1块肝组织， 试剂盒 测定肝脏甘油三酯含量。制备肝勾浆， 分离肝细胞过氧化物酶体， 测定各组肝细胞 AOX 活性， 以 IP-CoA为底物测定。 肝脏脂质过氧化水平采用微量丙二醛 (MDA)测定试剂盒 检测 (南京建成生物工程研究所， 南京）。
数据以 X±SEM表示， 用 SPSS 18.0软件进行统计学处理， 各组之间差异性比较采 用独立样本 t检验。 与 db/db小鼠对照组比较， * P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。
db/db小鼠在给予 AOX抑制剂前体 LH-919治疗后， 治疗组血糖较 db/db小鼠对照 组显著降低， 且血糖维持在较平稳水平， 如表 9所示。 表 9、 AOX抑制剂前体对 db/db小鼠降血糖作用
Figure imgf000031_0001
经过 16 天治疗后， db/db 小鼠治疗组血清胰岛素水平较对照组显著下降 (表 10)， HOMA-IR较对照组显著降低。 db/db小鼠抑制剂组血清甘油三酯 (表 10)含量也较对照组 显著降低。 测定肝细胞过氧化物酶体 AOX活性， 结果如图 43所示， 经 AOX抑制剂前 体治疗后， db/db小鼠治疗组肝脏 AOX活性较对照组显著下降。 同时， db/db小鼠抑制 剂组肝脏甘油三酯含量 （表 10) 和肝脏 MDA含量 (图 44)均较 db/db小鼠对照组显著降 低。 表 10. 各组小鼠的代谢相关参数
C57BL对照组 db/db对照组 db/db抑制剂组 曰进食量 (g/d) 3.2±0.1 5.5±0.3 5.3±0.2 血清甘油三酯 (mmol/L) 1.05±0.05 2.01±0.1 1 1.37±0.10** 血清胰岛素 (ng/mL) 1.06±0.1 1 13.15±0.48 7.95±0.45** 肝脏甘油三酯 (μηιοΐ/ g肝） 8.98±0.40 33.06±1.44 27.33±1.15** 上述结果表明， 给予 db/db小鼠 AOX抑制剂前体治疗， 通过提高肝脏和骨骼肌线 粒体代谢机能， 能改善 db/db小鼠体内胰岛素抵抗， 显著降低血糖， 降低血清和肝脏甘 油三酯含量。 因此， AOX抑制剂或 AOX抑制剂前体作为线粒体代谢机能促进剂， 可以 治疗 2型糖尿病， 非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血症等代谢性疾病。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。

Claims

禾 Ή
1. 脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂在制备促进线粒体脂肪酸氧化和线粒体再生， 提高线 粒体代谢机能或抑制过氧化物酶体增殖的组合物中的用途；所述脂酰辅酶 A氧化酶的国 际酶学分类编号为 EC 1.3.3.6。
2. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述的线粒体是靶器官、 组织或细胞 的线粒体。
3. 如权利要求 2所述的用途，其特征在于，所述的靶器官或组织是表达脂酰辅酶 A 氧化酶的器官或组织； 较佳地， 包括： 肝脏， 骨骼肌， 脂肪组织， 心脏， 肾脏。
4. 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述的组合物还用于预防、 改善或治 疗线粒体代谢功能障碍相关疾病。
5. 如权利要求 4所述的用途， 其特征在于， 所述的线粒体代谢功能障碍相关疾病 包括： 代谢综合征， 衰老或神经退行性疾病； 较佳地， 所述的代谢综合征包括： 胰岛素 抵抗， 糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病， 高甘油三酯血症； 较佳地， 所述的神经退 行性疾病包括： 阿尔茨海默症或帕金森症； 较佳地， 所述的糖尿病包括 2型糖尿病， 伴 胰岛素抵抗 1型糖尿病。
6. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂为抑 制脂酰辅酶 A氧化酶活性或表达的物质。
7. 如权利要求 6所述的用途， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂包括： 小分子有机物， 小分子无机物， 抗脂酰辅酶 A氧化酶抗体， 能与脂酰辅酶 A氧化酶特 异性结合并抑制其活性的核酸片段和多肽。
8. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂还包 括抑制剂前体。
9. 如权利要求 8所述的用途， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂或抑 制剂前体包括： 10,12-二十五碳二炔酸， 其 CAS编码为 66990-32-7。
10. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的组合物还用于：
抑制体内靶器官或组织脂酰辅酶 A氧化酶活性；
抑制体内靶器官或组织过氧化物酶体增殖；
活化体内靶器官或组织单磷酸腺苷活化蛋白激酶；
降低靶器官或组织内氧化应激水平；
减少胰岛素作用靶器官或组织内氧化自由基含量；
提高体内靶器官或组织细胞内线粒体氧化磷酸化水平；
增加体内靶器官或组织 PGC- 基因表达；
抑制体内靶器官或组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白或核糖体 S6蛋白激酶活性。
11. 一种用于预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病的组合物， 其特征在 于， 所述组合物包括：
脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂； 以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
12. 如权利要求 11 所述的组合物， 其特征在于， 所述的线粒体代谢功能障碍相关 疾病包括： 代谢综合征， 衰老或神经退行性疾病； 较佳地， 所述的代谢综合征包括： 胰 岛素抵抗， 糖尿病， 肥胖症， 非酒精性脂肪肝病， 高甘油三酯血症； 较佳地， 所述的糖 尿病包括 2型糖尿病， 伴胰岛素抵抗 1型糖尿病； 较佳地， 所述的神经退行性疾病包括： 阿尔茨海默症或帕金森症。
13. 如权利要求 1 1所述的组合物， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 为抑制脂酰辅酶 A氧化酶活性或表达的物质。
14. 如权利要求 1 1所述的组合物， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 包括： 抗脂酰辅酶 A氧化酶抗体， 能与脂酰辅酶 A氧化酶特异性结合并抑制其活性的 核酸片段和多肽， 小分子有机物， 小分子无机物。
15. 如权利要求 1 1所述的组合物， 其特征在于， 所述的脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂 还包括抑制剂前体； 较佳地包括： 10,12-二十五碳二炔酸， 其 CAS编码为 66990-32-7。
16. 一种制备预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病的组合物的方法， 其 特征在于， 所述方法包括： 将脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂与药学上可接受的载体或赋形剂 混合， 获得所述的药物组合物。
17. 一种预防、 改善或治疗线粒体代谢功能障碍相关疾病的方法， 其特征在于， 所 述方法包括： 抑制需要预防、 改善或治疗的患者体内的脂酰辅酶 A氧化酶活性或表达。
18. 如权利要求 17所述的方法， 其特征在于， 所述的抑制脂酰辅酶 A氧化酶活性 或表达的方法是： 给需要预防、 改善或治疗的患者施用有效量的脂酰辅酶 A氧化酶抑制 剂或脂酰辅酶 A氧化酶抑制剂前体。
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