CN107920487A

CN107920487A - 茉莉酸通路激活剂

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Publication number: CN107920487A
Application number: CN201680038538.9A
Authority: CN
Inventors: 马克-安德烈·道斯特; 斯蒂芬妮·罗伯特; 玛丽-克莱尔·古利特; 多米尼克·米考德; 弗兰克·塞恩斯伯里
Original assignee: UNIVERSITE LAVEL; Mo Di Kargo Inc
Current assignee: UNIVERSITE LAVEL; Mo Di Kargo Inc; Universite Laval; Medicago Inc
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-04-17
Also published as: CA2991139A1; ES2857741T3; EP3316677B1; RU2018102745A; US10907168B2; EP3316677A4; EP3316677A1; HK1254247A1; AU2016287799A1; MX2017016366A; RU2018102745A3; US20180195078A1; PH12017502389A1; IL256156A; ZA201800555B; KR20180088629A; WO2017000074A1; RU2728472C2; JP2018524345A

Abstract

提供增加植物或植物部分中目标异源蛋白的表达的方法。所述方法包括用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分，以及将可操作地连接至来源于DNA植物病毒的调控区并编码目标异源蛋白的核苷酸序列引入所述植物或植物部分。可选地，所述植物或植物部分可以包含编码目标异源蛋白的核酸，以及用所述茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分。在一定条件下培养处理的植物，以允许编码目标异源蛋白的核苷酸序列的表达。

Description

茉莉酸通路激活剂

发明领域

本发明涉及植物中蛋白的产生。本发明还涉及茉莉酸通路激活剂在增加植物或植物部分中异源蛋白的产生中的用途。

发明背景

植物逐渐被用作用于产生临床可用的重组蛋白的生物工厂。与植物产生的重组蛋白表达相关的优势包括，蛋白骨架的哺乳动物样翻译后成熟、较低的基础设施成本(与基于工业规模发酵罐的经典系统相比)和降低的关于产品的微生物毒素或人病原体污染的生物安全问题。

在植物提取物中富集重组蛋白的方法通常依赖合适的提取缓冲液pH或离子强度的选择，以优先移出宿主蛋白并促进进一步纯化。低pH下的硫酸铵沉淀和提取可用于绿色组织提取物，以沉淀污染物，如细胞碎片和光合色素。这些程序还可用于沉淀非常丰富的酶核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)(Peckham等人，2006)，其代表叶片中高至50％的总的可溶性蛋白(TSP)，并且通常使高度纯化的蛋白产物的制备复杂化(例如，Gaeda等人，2007)。

茉莉酸甲酯(MeJA)是应激激素茉莉酸的挥发性衍生物(Okada等人，2015)。报道了MeJA和茉莉酸诱导的信号如创伤、食草动物或昆虫口腔分泌物对光合作用相关基因的转录的下调作用(Hermsmeier等人，2001；Jung等人，2007；Bilgin等人，2010；Zubo等人，2011；Duceppe等人，2012)。MeJA还显示促进叶片中核糖体基因的升高的表达，推测可用于维持响应于茉莉酸类信号传导通路的细胞中蛋白生物合成机制的活跃(Noir等人，2013)。

发明概述

本发明涉及植物中蛋白的产生。本发明还涉及茉莉酸通路激活剂在增加植物或植物部分中蛋白的产生中的用途。

本发明的目标是提供在植物或植物部分中产生目标异源蛋白的改善的方法。

描述了增加植物或植物部分中目标异源蛋白的表达的方法(A)。所述方法包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

ii)将包含编码所述目标异源蛋白的核酸并可操作地连接至来源于DNA植物病毒的调控区的核苷酸序列引入所述植物或植物部分；以及

iii)在一定条件下培养所述植物或植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述植物或植物部分的所述目标异源蛋白的量与包含相同的核苷酸序列并且未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二植物或第二植物部分中产生的所述目标异源蛋白进行比较时，观察到表达增加。

以上概述的方法(A)中所述的DNA植物病毒可以是虫媒DNA植物病毒。此外，以上方法(A)中所述的茉莉酸类通路激活剂可以是茉莉酸甲酯，茉莉酸，冠菌素或者茉莉酸甲酯、茉莉酸或冠菌素的任何生物活性衍生物。

本文还描述了以上限定的方法(A)，其中在处理步骤(步骤i)中，将所述茉莉酸类通路激活剂作为气体应用于植物或植物部分，或者作为液体应用并喷涂到植物或植物部分上，或者添加至维持植物或植物部分的生长培养基中。可选地，可将处理步骤(步骤i)和引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列引入植物或植物部分。

以上所述的方法(A)中使用的茉莉酸类通路激活剂可以是气体或液体。

此外，提供如以上所限定的方法(A)，其中利用植物或植物部分所浸入的液体培养基，以瞬时方式将核苷酸序列引入植物或植物部分，并将茉莉酸类通路激活剂引入处理步骤(步骤i)中的液体培养基中。可选地，可将处理步骤(步骤i)和引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列引入液体培养基中，并将茉莉酸类通路激活剂和核苷酸序列共同引入植物或植物部分。

还提供降低植物或植物部分中总的宿主可溶性蛋白的方法(B)，其包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

ii)将包含编码目标异源蛋白的核酸并可操作地连接至来源于DNA植物病毒的调控区的核苷酸序列引入所述植物或植物部分；以及

iii)在一定条件下培养所述植物或植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述植物或植物部分的总的宿主蛋白的量与包含相同的核苷酸序列但是未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二植物或第二植物部分中产生的总的宿主蛋白进行比较时，观察到总的宿主蛋白降低。

以上概述的方法(B)中所述的DNA植物病毒可以是虫媒DNA植物病毒。此外，以上方法中所述的茉莉酸类通路激活剂可以是茉莉酸甲酯，茉莉酸，冠菌素或者茉莉酸甲酯、茉莉酸或冠菌素的任何生物活性衍生物。

本文还描述了以上限定的方法(B)，其中在处理步骤(步骤i)中，将所述茉莉酸类通路激活剂作为气体应用于植物或植物部分，或者作为液体应用并喷涂到植物或植物部分上，或者添加至维持植物或植物部分的生长培养基中。可选地，可将处理步骤(步骤i)和引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列引入植物或植物部分。

以上所述的方法(B)中使用的茉莉酸类通路激活剂可以是气体或液体。

此外，提供如以上所限定的方法(B)，其中利用植物或植物部分所浸入的液体培养基，以瞬时方式将核苷酸序列引入植物或植物部分，并将茉莉酸类通路激活剂引入处理步骤(步骤i)中的液体培养基中。可选地，可将处理步骤(步骤i)和引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列引入液体培养基中，并将茉莉酸类通路激活剂和核苷酸序列共同引入植物或植物部分。

此外，提供增加转基因植物或转基因植物部分中目标异源蛋白的表达的方法(C)，其包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述转基因植物或转基因植物部分，所述转基因植物或转基因植物部分包含可操作地连接至来源于DNA植物病毒的调控区的编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列；以及

ii)在一定条件下培养所述转基因植物或转基因植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述转基因植物或转基因植物部分的所述目标异源蛋白的量与包含相同的核苷酸序列并且未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二转基因植物或第二转基因植物部分中产生的所述目标异源蛋白进行比较时，观察到表达增加。

以上方法(C)中描述的茉莉酸类通路激活剂可以是茉莉酸甲酯，茉莉酸，冠菌素或者茉莉酸甲酯、茉莉酸或冠菌素的任何生物活性衍生物。

本文还描述了如以上所限定的方法(C)，其中在处理步骤(步骤i)中，将所述茉莉酸类通路激活剂作为气体应用于转基因植物或转基因植物部分，或者作为液体应用并喷涂至转基因植物或转基因植物部分上，或者添加至维持转基因植物或转基因植物部分的生长培养基中。

本文描述了茉莉酸类通路激活剂(例如茉莉酸甲酯(MeJA))在引发重组目标异源蛋白的富集中的用途。可以通过调整重组蛋白与宿主(天然)蛋白的比例来改善植物中表达的异源蛋白的下游处理的总效率，包括纯化收率和终产物被宿主蛋白或其蛋白水解碎片污染、降低粗提物或培养基中的蛋白降解以及优化用于蛋白富集的回收方案。如本文所述，发现茉莉酸类通路激活剂的应用改变了植物叶片中的蛋白质组。在不希望受理论束缚的情况下，这一改变可能影响植物组织中目标异源蛋白产生的具体和相对收率。MeJA处理诱导RuBisCO大亚基和小亚基池的消耗，并增加茉莉酸类可诱导的防御蛋白(例如硫素、Ser蛋白酶抑制剂和抗微生物水解酶)的水平。利用农杆菌浸润降低茉莉酸类可诱导的防御蛋白的增加。但是，在农杆菌浸润的叶片中维持RuBisCO消耗的细胞环境，这允许目标异源蛋白的有效富集。

与未用茉莉酸类通路激活剂处理的植物相比，利用茉莉酸类通路激活剂进行处理导致目标异源蛋白的表达增加。此外，利用茉莉酸类通路激活剂进行处理导致瞬时表达的目标异源蛋白相对于RuBisCO大约5倍的富集。目标异源蛋白的5倍的富集由基于鲜重，RuBisCO大于2倍的消耗和目标异源蛋白mRNA转录本大约2倍的增加以及目标异源蛋白水平大约2倍的增加导致。

因此，用茉莉酸类通路激活剂处理植物或植物部分导致目标异源蛋白收率的整体增加，和与RuBisCO水平相比，目标异源蛋白收率的相对增加。通过降低RuBisCO水平，还可以简化目标异源蛋白的提取和纯化，这是因为在提取过程期间，背景蛋白的污染降低。

该发明概述不一定描述了本发明的所有特征。

附图简述

根据参考附图的下述描述，本发明的这些以及其它特征将变得更加显而易见，其中：

图1a-1d显示了总的可溶性蛋白(TSP)，在感染之前用应激激发子MeJA处理24h的农杆菌浸润的和对照烟草本赛姆氏(N.benthamiana)叶片中的1-D蛋白质组图谱和RuBisCO亚基水平。图1a显示了基于鲜重用0、0.5、1或2mM MeJA处理的叶片中的TSP。图1b显示了SDS-PAGE之后，对照和用MeJA处理的叶片中考马斯亮蓝染色的蛋白图谱。Mr，市售的分子量标志物；PR，农杆菌浸润的叶片中上调的发病相关蛋白；RbcL和RbcS，分别为RuBisCO的大亚基和小亚基；A框、B框和C框，未浸润的植物中包含MeJA可诱导的蛋白的凝胶区域(对于蛋白身份，参见表2)。图1c和1d显示了用合适的抗体进行免疫检测之后，通过密度测定法测定的MeJA处理的叶片中RuBisCO大亚基(RbcL；图1c)和小亚基(RbsS；图1d)的相对量。在用Microtek ScanMaker II数字化装置(Microtek Laboratory，Torrance CA，U.S.A.)扫描硝化纤维膜之后，利用Phoretix 2-D表达软件v.2005(NonLinear USA，Durham NC，U.S.A.)定量免疫印迹上的蛋白信号。数据被表示为与指定任意水平为1.0的未处理的对照相比的相对水平。图(a)和(c)上的各柱条是三次独立的(叶片重复)数值的平均值±SE。在MeJA处理后24h，用根癌农杆菌(A.tumefaciens)转染浸润的叶片。在MeJA处理之后7天(即对于转染的植物，在农杆菌浸润之后6天)收获所有植物样品。

图2a-2c显示了MeJA处理对烟草本赛姆氏叶片中PR-2蛋白积累、农杆菌数目和两种根癌农杆菌毒力蛋白VirB1和VirE1的转录本数目的影响。图2a显示了在免疫检测之后，通过密度测定法分析的MeJA处理对对照和农杆菌浸润的叶片中33-kDa的病原体可诱导的PR-2蛋白的积累的影响。在用Microtek ScanMaker II数字化装置(Microtek Laboratory)扫描硝化纤维膜之后，利用Phoretix 2-D表达软件v.2005(NonLinear USA)定量免疫印迹信号。数据是三个叶片重复的平均值±SE。指定对照健康叶片中PR-2的水平的任意数值为1.0。图2b显示了农杆菌浸润之后0、2、4或6天，从烟草本赛姆氏获得的细菌。数据被表示为琼脂平板上克隆形成单位(CFU)的对数，并且各点是五次独立(叶片重复)数值的平均值±SE。图2c显示了利用合适的DNA引物，通过实时RT PCR分析的用0或1mM MeJA处理的农杆菌浸润的叶片中VirB1和VirE1 mRNA转录本的数目。各数值是五次生物(叶片重复)数值的平均值±SE。星号指示与对照叶片相比，MeJA处理的叶片中VirB1转录本显著较低的数值(学生t检验；P＜0.05)。

图3a-3c显示了在浸润之前用0、0.5、1或2mM MeJA处理24h的对照和农杆菌浸润的烟草本赛姆氏叶片粗蛋白提取物中的蛋白酶活性。利用组织蛋白酶L样(C1A)Cys蛋白酶(图3a)、胰蛋白酶样(S1)Ser蛋白酶(图3b)和组织蛋白酶D/E样(A1)Asp蛋白酶(图3c)特异的荧光生成性肽底物，体外进行蛋白酶分析。在MeJA处理后7天收获叶片样品。各柱条是三次独立的(叶片重复)数值的平均值±SE。

图4a-4d显示了用0、0.5、1或2mM MeJA处理的农杆菌浸润的烟草本赛姆氏叶片中C5-1抗体收率和表达。图4a显示了在非还原性条件中的SDS-PAGE之后，免疫检测的C5-1重链和轻链的完整(箭头)以及部分复合物。Mr，市售的分子量标志物。图4b显示了ELISA分析的MeJA处理的叶片中的C5-1。基于重量(二次曲线；r²＝0.885)或者基于与总的可溶性蛋白相比的相对重量(直方图)来表示数据。图4c显示了通过实时RT PCR分析的用0或1mM MeJA处理的叶片中C5-1轻链(LC)和重链(HC)的mRNA转录本。图4d显示了ELISA分析的，浸润之后24h用0、0.5或1mM MeJA处理的叶片中或者浸润之前或之后24h用1mM花生四烯酸处理的叶片中的C5-1。图(b)、(c)和(d)上的各柱条或点是五次独立的(叶片重复)数值的平均值±SE。

图5显示了农杆菌浸润之前(上图)或之后(下图)24h，用0、0.5或1mm MeJA或者用1mM花生四烯酸(AA)处理的对照和农杆菌感染的叶片粗蛋白提取物中烟草本赛姆氏33-kDaPR-2蛋白的免疫检测。Mr，分子量标志物。农杆菌浸润包括用包含pcambia2300‘空载体’或编码C5-1的载体的根癌农杆菌进行处理。

图6显示了用0或1mM MeJA处理的农杆菌浸润的烟草本赛姆氏叶片中的C5-1抗体收率。C5-1抗体轻链和重链的编码序列在苜蓿质体蓝素启动子(US 7,125,978，将其通过引用并入本文)的控制下表达。基于叶片重量呈现数据。各柱条是五次独立的(叶片重复)数值的平均值±se。

详细描述

下述描述是优选实施方案的描述。

本文使用的术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”及其语法变体是包含性的或者开放式的，并且不排除其它未叙述的元素和/或方法步骤。当在本文与用途或方法相关使用时，术语“基本由......组成”表示其它元素和/或方法步骤可以存在，但是这些添加项不会实质性影响所述方法或用途发挥功能的方式。当在本文与用途或方法相关使用时，术语“由......组成”排除了其它元素和/或方法步骤的存在。本文所述的包含某些元素和/或步骤的用途或方法还可以，在某些实施方案中，基本由那些元素和/或步骤组成，并且在其它实施方案中，由那些元素和/或步骤组成，不管这些实施方案是否明确提及。此外，单数的使用包括复数，并且“或”意为“和/或”，除非另外声明。本文使用的术语“多个/多种”意为多于一个/一种，例如两个或更多个/两种或更多种、三个或更多个/三种或更多种、四个或更多个/四种或更多种等。除非本文另外限定。否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所使用的，术语“约”指给定数值大约+/-10％的变化。应当理解，此类变化总是包含于本文提供的任何给定数值内，不管是否明确提及。当在本文与术语“包含”联合使用时，词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”可以意为“一个/一种(one)”，但是也适用下述含义：“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/一种”以及“一个或多于一个/一种或多于一种”。

如以下更加详细描述的，提供增加植物或植物部分中目标异源蛋白的表达的方法。该方法包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

iii)在一定条件下培养所述植物或植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述植物或植物部分的所述目标异源蛋白的量与包含相同的核苷酸序列并且用类似的方式处理，但是未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二植物或第二植物部分中产生的所述目标异源蛋白进行比较时，观察到表达增加。

可将处理步骤(步骤i)和引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列同时引入植物或植物部分。

此外，提供降低植物或植物部分中总的宿主可溶性蛋白，以减少背景宿主蛋白并简化目标异源蛋白的纯化的方法。该方法包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

iii)在一定条件下培养所述植物或植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述植物或植物部分的总的宿主蛋白的量与包含相同的核苷酸序列并且用类似的方式处理，但是未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二植物或第二植物部分中产生的总的宿主蛋白进行比较时，观察到总的宿主蛋白降低。

可将处理步骤(步骤i)与引入步骤(步骤ii)组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列同时引入植物或植物部分。

此外，提供增加转基因植物或转基因植物部分中目标异源蛋白的表达的方法。该方法包括：

ii)在一定条件下培养所述转基因植物或转基因植物部分，以允许编码所述目标异源蛋白的核苷酸序列的表达，当将提取自所述转基因植物或转基因植物部分的所述目标异源蛋白的量与包含相同的核苷酸序列并且用类似的方式处理，但是未用所述茉莉酸类通路激活剂处理的第二转基因植物或第二转基因植物部分中产生的所述目标异源蛋白进行比较时，观察到表达增加。

“可操作地连接”意为，具体的序列直接或间接相互作用，以执行预期功能，如核酸序列表达的调整或调节。可操作地连接的序列的相互作用可以，例如通过与可操作地连接的序列相互作用的蛋白来介导。

已知茉莉酸类信号传导分子调节植物针对多种环境应激的应答，例如创伤、干旱应激、病原体攻击或害虫攻击。茉莉酸类通路包含数个信号转导事件。在初级创伤或应激刺激之后，产生诱导茉莉酸类生物合成的局部和全身信号。茉莉酸类与来自水杨酸(降低水杨酸通路)、乙烯和其它信号传导通路的输出相互作用。茉莉酸类通路中的信号传导包括形成SCF^(COI1)复合物(E3泛素连接酶)和CSN(COP9信号小体)复合物的蛋白相互作用。SCF^(COI1)与CSN相互作用，以控制大多数表征良好的茉莉酸类应答。例如，CSN/SCF^(COI1)复合物靶向转录阻抑物(包括JAZ蛋白)，用于聚泛素化以及它们通过26S蛋白酶体的修饰或降解。

例如，已知MeJA和相关茉莉酸诱导信号(如创伤、食草动物或昆虫口腔分泌物)下调光合作用相关基因的转录(Hermsmeier等人，2001；Jung等人，2007；Bilgin等人，2010；Zubo等人，2011；Duceppe等人，2012)。这些阻抑作用可能与叶片中应激相关蛋白和碳代谢酶的积累相关，并且可能导致降低的RuBisCO水平(Giri等人，2006；Wei等人，2009；Duceppe等人，2012；Ullmann-Zeunert等人，2013；Mahajan等人，2014；Leuzinger等人，2013)。

“茉莉酸类通路激活剂”意为可以激活植物内的茉莉酸类通路的任何化合物。在不希望受理论束缚的情况下，茉莉酸类通路激活剂可以导致结合调节茉莉酸类应答基因的转录的转录因子并阻抑其活性的茉莉酸类ZIM结构域(JAZ)蛋白的降解。SCF^(COI1)与JAZ阻抑物之间的相互作用可以导致JAZ蛋白的降解以及随后转录因子(如MYC2)的去阻抑。

激活剂可以是液体或气体。例如茉莉酸类通路激活剂可以是茉莉酸甲酯，这不被认为具有限制性：

茉莉酸：

或冠菌素：

冠菌素是植物病原体丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)产生的植物毒素，其结构上与茉莉酸甲酯(MeJA)相关，并且当应用于植物时产生类似的作用(Feys等人，1994)。

茉莉酸类通路激活剂的其它实例包括MeJA的功能性等同物，例如但不限于茉莉酸的生物活性衍生物、类似物或前体，如茉莉酸(游离的)，冠菌素(微生物的)，多不饱和脂肪酸(PUFA)前体(例如α亚麻酸)或者它们的氧化产物，茉莉酸的衍生物(排除MeJA)，例如顺式-茉莉酮、茉莉酸异亮氨酸(jasmonoyl isoleucine)(JA-Ile)、茉莉酸ACC(jasmonoylACC)。此外，可以使用合成的茉莉酸类类似物，例如BLUSh^TM(茉莉酮(丙基-3-氧代-2-戊基-戊基乙酸酯；可获自Fine Agrochemicals Ltd.)和化合物I(茉莉酸甲酯的5，7，9，10-四溴衍生物，其是活性衍生物)。

在引入编码目标蛋白的核苷酸序列之前，可以通过将植物或植物部分暴露(或者预处理)于激活剂一段时间，例如约0小时至14天或者其之间的任何时间，而将茉莉酸类通路激活剂应用于植物或植物部分。例如，在将编码目标蛋白的核酸引入植物或植物部分之前，可以用激活剂化合物预处理植物或植物部分约0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、552、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84小时或者其之间的任何时间，或者可以应用激活剂约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或者其之间的任何时间。

在提取目标蛋白之前，还可以通过将转基因植物或转基因植物部分暴露于激活剂一段时间，例如约0小时至14天或者其之间的任何时间而将茉莉酸类通路激活剂应用于包含编码目标蛋白的核苷酸序列的转基因植物或转基因植物部分。例如，在从转基因植物或转基因植物部分提取目标蛋白之前，可以用激活剂化合物处理转基因植物或转基因植物部分约0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、552、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84小时或者其之间的任何时间，或者可以应用激活剂约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或者其之间的任何时间。

如果激活剂是液体形式，则可以根据需要将其喷涂至叶片上和植物的其它器官上，以在将编码目标蛋白的核苷酸序列引入植物或植物部分的步骤之前，或者在从包含编码目标异源蛋白的异源核苷酸序列的转基因植物或转基因植物部分提取目标蛋白之前，使激活剂可以与植物或植物部分相互作用。如果激活剂是气体，则可将植物或植物部分置于封闭的环境中，以在将编码目标蛋白的核苷酸序列引入植物或植物部分的步骤之前，或者在从表达目标异源蛋白的转基因植物或转基因植物部分提取目标蛋白之前，使气体可以与植物或植物部分相互作用。

可选地，如果在将编码目标蛋白的核酸引入植物或植物部分之前，利用植物或植物部分浸入一段时间液体培养基，以瞬时方式将核苷酸序列引入植物或植物部分，则可将茉莉酸类通路激活剂引入液体培养基。例如，可在将编码目标蛋白的核酸引入植物或植物部分之前，将植物或植物部分预处理约0小时至约24小时或者其之间的任何时间。可选地，可将暴露(处理)植物或植物部分的步骤与将编码目标蛋白的核苷酸序列引入植物或植物部分的步骤组合，以将茉莉酸类通路激活剂以及核苷酸序列引入液体培养基，从而将茉莉酸类通路激活剂和核苷酸序列共同引入植物或植物部分。

如本文所述，还可将茉莉酸类通路激活剂应用于包含可操作地连接至来源于DNA植物病毒的调控区并编码目标异源蛋白的异源核苷酸序列的转基因植物或转基因植物部分，以增加转基因植物或转基因植物部分中目标异源蛋白的表达。在该方法中，将表达异源核苷酸序列的转基因植物或转基因植物部分用茉莉酸类通路激活剂进行处理，并在一定条件下培养一段时间，以允许编码目标异源蛋白的异源核苷酸序列的表达。通过将提取自转基因植物或转基因植物部分的目标异源蛋白的收率与包含相同的核苷酸序列并且以类似的方式处理，但是未用茉莉酸类通路激活剂处理的第二转基因植物或第二转基因植物部分中产生的目标异源蛋白进行比较，可以观察到目标异源蛋白的表达增加。

在不希望受理论束缚的情况下，通过使用选择以用于诱导茉莉酸类通路的化合物(即茉莉酸类通路激活剂)，可以激活内源蛋白酶抑制剂，从而降低目标异源蛋白的体内降解。例如，参与茉莉酸类信号传导的转录因子MYC2正调控创伤应答中涉及的基因，但负调控病原体防御中涉及的基因(Lorenzo等人，2004)。此外，通过激活茉莉酸类通路，可以下调水杨酸通路。水杨酸通路的激活可以导致内源蛋白酶活性增加。因此，通过下调水杨酸通路，降低内源植物蛋白酶的活性。

利用本文所述的方法，可以通过调节目标异源蛋白与宿主(天然)蛋白的比例来改善纯化收率以及目标异源蛋白被宿主蛋白、其蛋白水解碎片或者宿主蛋白和其蛋白水解碎片这两者污染，并降低粗提物中的蛋白降解。发现应用茉莉酸类通路激活剂改变了植物叶片中的蛋白质组，并引发重组目标异源蛋白的富集。在不希望受理论束缚的情况下，这一改变可能影响植物组织中目标异源蛋白的产生的具体和相对收率。用茉莉酸类通路激活剂处理植物或植物部分诱导了RuBisCO大亚基和小亚基池的消耗，并增加了茉莉酸类可诱导的防御蛋白(例如硫素、Ser蛋白酶抑制剂和抗微生物水解酶)的水平。利用农杆菌浸润降低茉莉酸类可诱导的防御蛋白的增加。但是，在农杆菌浸润的叶片中维持RuBisCO消耗的细胞环境，这允许目标异源蛋白的有效富集。

与未用茉莉酸类通路激活剂处理(但是以类似的方式处理)的植物相比，利用茉莉酸类通路激活剂进行处理导致目标异源蛋白的表达增加。此外，利用茉莉酸类通路激活剂进行处理导致瞬时表达的目标异源蛋白相对于RuBisCO大约5倍的富集。目标异源蛋白的5倍的富集由基于鲜重，RuBisCO大于2倍的消耗和目标异源蛋白mRNA转录本的2倍的增加以及目标异源蛋白水平的2倍的增加导致。

因此，用茉莉酸类通路激活剂处理植物或植物部分导致目标异源蛋白收率的整体增加，和与RuBisCO水平相比目标异源蛋白收率的相对增加。通过降低RuBisCO水平，还可以简化目标异源蛋白的提取和纯化，这是因为在提取过程期间，背景蛋白的污染降低。

如本文所述，当编码目标蛋白的核酸可操作地连接至包含获自植物DNA病毒的启动子(例如35S启动子)的调控区时，观察到编码目标蛋白的异源核苷酸序列的表达增加。当使用光合基因的调控区(例如质体蓝素启动子)时，未观察到此类核苷酸序列表达的增加。在不希望受理论束缚的情况下，诱导茉莉酸类通路激活的条件、茉莉酸类通路激活剂或者诱导茉莉酸类通路激活的条件和茉莉酸酮通路激活剂这两者还可以有益于包含获自植物DNA病毒的启动子的调控区的活性。诱导茉莉酸类通路激活的条件、茉莉酸类通路激活剂或者诱导茉莉酸类通路激活的条件和茉莉酸类通路激活剂这两者可以包括应激条件或者病原体攻击，包括昆虫进食植物以及任何相关植物DNA病毒从昆虫向植物的传播。

用于本文所述的方法的包含启动子的调控区可以获自任何DNA植物病毒，包括花椰菜病毒科、双生病毒科和矮化病毒科的病毒。不认为具有限制性的启动子的实例包括获自花椰菜病毒科病毒的基因的启动子，包括花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子(Odell等人，1985，Nature，313：810-812)。类似地，来自双生病毒科和矮化病毒科的病毒的启动子的实例分别包括布雷瓦拉棉花曲叶病毒(cotton leaf curlBurewala virus)的Rep和CP基因的那些启动子(Khan等人，2015，PLoS ONE 10(3)：e0121656)以及紫云英矮缩病毒(Milk vetch dwarf virrus)的C1和C11的那些启动子(Shirasawa-Seo等人，2005，J Gen Virol 86：1851-1860)。

如本文所述，提供串联包含可操作地连接至目标核苷酸序列的获自植物DNA病毒的启动子或植物调控区以及3’UTR序列和终止子序列的表达盒。如本领域技术人员将会理解的，终止(终止子)序列可以是在植物宿主中具有活性的任何序列，例如终止序列可以是NOS终止子。“表达盒”指这样的核苷酸序列，其包含受合适的启动子或者其它调控元件控制并可操作地连接至该合适的启动子或其它调控元件的目标核酸，以在宿主细胞中转录该目标核酸。

调控区还可以包含其它调控元件，例如但不限于表达增强子。合适的表达增强子包括如Sainsbury等人，2008(Plant Physiol.148：1212-1218)；WO 2009/087391、PCT/CA2015/050009、PCT/CA2015/050240(将其各自通过引用并入本文)中所述获自CPMV 5’UTR的增强子。表达增强子可以在增强子序列的5’端与在植物中具有活性的调控区可操作地连接，以及在表达增强子序列的3’端可操作地连接至目标核苷酸序列，以在植物宿主内驱动目标核苷酸序列的表达。

“目标核苷酸(或核酸)序列”、“目标编码区”或者目标蛋白意为将在宿主有机体(例如植物)内表达以产生目标蛋白的任何核苷酸序列或编码区(这些术语可以互换使用)。此类目标核苷酸序列可以编码，但不限于：异源蛋白，修饰的异源蛋白，工业酶或修饰的工业酶，农作物蛋白或修饰的农作物蛋白，辅助蛋白，蛋白补充物，药学活性蛋白，营养物，增值产品或者其用于饲料、食物或饲料和食物用途的片段，工业酶例如纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、过氧化物酶、枯草杆菌蛋白酶。

目标核苷酸序列或目标编码区还可以包含编码药学活性蛋白的核苷酸序列，所述药学活性蛋白例如生长因子、生长调节剂、抗体、抗原及其片段或者其可用于免疫或疫苗接种等的衍生物。此类蛋白包括但不限于人病原体蛋白，病毒蛋白，例如但不限于来自下述病毒的一种或多种蛋白：呼吸道合胞体病毒(RSV)、轮状病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)、肠道病毒71(EV71)；或白介素，例如IL-1至IL-24、IL-26和IL-27中的一种或多种；细胞因子、红细胞生成素(EPO)、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它们的组合；干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ；凝血因子，例如因子VIII、因子IX或tPA hGH；受体、受体激动剂、抗体例如但不限于利妥昔单抗、神经多肽、胰岛素、疫苗、生长因子例如但不限于表皮生长因子、角化细胞生长因子、转化生长因子、生长调节剂、抗原、自身抗原、其片段、或其组合；单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、单链单克隆抗体、病毒样颗粒(VLP)或其组合。

目标蛋白还可以包括流感血凝素(HA；参见WO 2009/009876，将其通过引用并入本文)。HA是同源三聚体I型膜糖蛋白，其通常包含信号肽、HA1结构域以及在C端的包含跨膜锚定位点的HA2结构域和小的胞质尾区。编码HA的核苷酸序列众所周知，并且可以获得(参见例如，URL：biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator＝Influenza的生物防御和公共卫生数据库(流感病毒研究数据库；Squires等人，2008 Nucleic Acids Research 36：D497-D503)；或者美国国家生物技术信息中心维护的数据库(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov)，将这两者通过引用并入本文)。

HA蛋白可以是A型流感病毒、B型流感病毒或者是选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的A型流感病毒HA的亚型。在本发明的一些方面，HA可以来自A型流感病毒，其选自：H1、H2、H3、H5、H6、H7和H9。还可以将以上列出的HA片段作为目标蛋白。此外，可将来自以上列出的HA类型或亚型的结构域组合以产生嵌合HA(参见例如WO2009/076778，将其通过引用并入本文)。

包含HA蛋白的亚型的实例包括：A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥/DE/677/88(H2N8)、A/德克萨斯/32/2003、A/野鸭/MN/33/00、A/鸭/上海/1/2000、A/针尾鸭/TX/828189/02、A/土耳其/安大略/6118/68(H8N4)、A/琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56(H11N6)、A/鸭/阿尔伯塔/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、A/野鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/黑头鸥/瑞典/5/99(H16N3)、B/李/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56(H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2))。

HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亚型。例如，H1蛋白可以来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)或A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)毒株。H3蛋白还可以来自A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/德克萨斯/50/2012(H3N2)、A/夏威夷/22/2012(H3N2)、A/纽约/39/2012(H3N2)或A/珀斯/16/2009(H3N2)毒株。在本发明又一方面，H2蛋白可以来自A/新加坡/1/57(H2N2)毒株。H5蛋白可以来自A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印度尼西亚/5/2005毒株。在本发明的方面，H6蛋白可以来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)毒株。H7蛋白可以来自A/马/布拉格/56(H7N7)毒株或H7A/杭州/1/2013、A/安徽/1/2013(H7N9)或A/上海/2/2013(H7N9)毒株。在本发明的方面，H9蛋白来自A/香港/1073/99(H9N2)毒株。在本发明又一方面，HA蛋白可以来自B型病毒的流感病毒，包括B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/08、B/马萨诸塞/2/2012样病毒(山形(Yamagata)谱系)或B/威斯康星/1/2010(山形谱系)。来自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亚型的HA蛋白的氨基酸序列的非限制性实例包括如WO 2009/009876、WO 2009/076778、WO 2010/003225(将其通过引用并入本文)中所述的序列。流感病毒HA蛋白可以是H5印度尼西亚。

HA还可以是嵌合HA，其中用异源跨膜结构域替代HA的天然跨膜结构域。HA蛋白的跨膜结构域高度保守(参见例如WO 2010/148511的图1C；将其通过引用并入本文)。异源跨膜结构域可以获自任何HA跨膜结构域，例如但不限于来自下述的跨膜结构域：H1加利福尼亚、B/佛罗里达/4/2006(GenBank登录号ACA33493.1)、B/马来西亚/2506/2004(GenBank登录号ABU99194.1)、H1/Bri(GenBank登录号ADE28750.1)、H1A/所罗门群岛/3/2006(GenBank登录号ABU99109.1)、H1/NC(GenBank登录号AAP34324.1)、H2A/新加坡/1/1957(GenBank登录号AAA64366.1)、H3A/布里斯班/10/2007(GenBank登录号ACI26318.1)、H3A/威斯康星/67/2005(GenBank登录号ABO37599.1)、H5A/安徽/1/2005(GenBank登录号ABD28180.1)、H5A/越南/1194/2004(GenBank登录号ACR48874.1)、H5-Indo(GenBank登录号ABW06108.1)。还可以通过下述共有氨基酸序列限定跨膜结构域：

iLXiYystvAiSslXLXXmlagXsXwmcs(SEQ ID NO：1)

如果目标蛋白是VLP，则VLP可以包含HA0前体形式或者通过二硫桥形式保持在一起的HA1或HA2结构域。VLP的平均大小可以为约20nm至1μm或其之间的任何量，例如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm，或者其之间的任何量，例如100nm，并且可以包含脂膜。VLP可以是包膜的或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白或病毒外壳蛋白。VLP还可以包含脂质、磷脂、核酸、膜等中的一种或多种。

术语“病毒样颗粒(virus like particle)”(VLP)或“病毒样颗粒(virus-likeparticle)”或“VLP”指自我装配并包含诸如流感病毒HA蛋白的结构蛋白的结构。VLP通常与感染中产生的病毒粒子在形态上和抗原性上类似，但是缺乏足以复制的遗传信息，因此是非传染性的。在一些实例中，VLP可以包含单一蛋白种类或者多种蛋白种类。对于包含多种蛋白种类的VLP，蛋白种类可以来自同种病毒，或者可以包含来自不同种、属、亚科或科的病毒(如ICTV命名法所指定的)的蛋白。在其它实例中，可以根据天然存在的序列对包含VLP的一种或多种蛋白种类进行修饰。可以在合适的宿主细胞(包括植物和昆虫宿主细胞)中产生VLP。在从宿主细胞提取之后，以及在合适的条件下的分离和进一步纯化时，可以将VLP作为完整的结构进行纯化。

根据本发明，从流感病毒来源的蛋白产生的VLP不包含M1蛋白。已知M1蛋白结合VLP制备物的污染物RNA(Wakefield和Brownlee，1989)。当获得VLP产物的监管批准时，RNA的存在是非期望的，因此缺乏RNA的VLP制备物可能是有利的。

HA可以包含天然或非天然的信号肽；非天然的信号肽可以是植物来源。例如，信号肽可以是蛋白二硫键异构酶信号肽(PDI)。天然的信号肽可以与表达的血凝素的信号肽对应，或者可以与第二血凝素对应。

本发明还提供包含编码HA蛋白的序列的核酸分子。核酸分子还可以包含可操作地连接至编码HA蛋白的序列的一个或多个调控区。核酸分子可以包含编码H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或者来自B型流感病毒的HA的序列。例如，核酸分子编码的HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9亚型或者来自B型的HA。核酸编码的H1蛋白可以来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)或A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)毒株。核酸分子编码的H3蛋白可以来自A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/德克萨斯/50/2012(H3N2)、A/夏威夷/22/2012(H3N2)、A/纽约/39/2012(H3N2)或A/珀斯/16/2009(H3N2)毒株。核酸分子编码的H2蛋白可以来自A/新加坡/1/57(H2N2)毒株。核酸分子编码的H5蛋白可以来自A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印度尼西亚/5/2005毒株。核酸分子编码的H6蛋白可以来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)毒株。核酸分子编码的H7蛋白可以来自A/马/布拉格/56(H7N7)毒株或者H7A/杭州/1/2013、A/安徽/1/2013(H7N9)或A/上海/2/2013(H7N9)毒株。此外，核酸分子编码的H9蛋白可以来自A/香港/1073/99(H9N2)毒株。核酸分子编码的HA蛋白可以来自流感病毒B型病毒，包括B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/08、B/马萨诸塞州/2/2012样病毒(山形谱系)或B/威斯康星/1/2010(山形谱系)。来自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亚型的HA蛋白的氨基酸序列的非限制性实例包括如WO2009/009876、WO 2009/076778、WO 2010/003225(将其通过引用并入本文)中所述的序列。流感病毒HA蛋白可以是H5印度尼西亚。

目标蛋白(或目标编码区)可以包含天然或非天然的信号肽；非天然的信号肽可以是植物来源或者获自动物或细菌多肽。天然的信号肽可以与表达的目标蛋白的信号肽对应，此外，信号肽可以来自结构蛋白或除流感病毒之外的病毒的血凝素。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶的信号肽(PDI SP；登录号Z11499的核苷酸32-103)或马铃薯块茎贮藏蛋白(patatin)信号肽(PatA SP；GenBank登录号A08215位于1738-1806的核苷酸)。该登录号的PatASP的核苷酸序列是：ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTAGTTCAACATGTGCT(SEQ ID NO：2)；

马铃薯块茎贮藏蛋白A信号肽的氨基酸序列是：

MATTKTFLILFFMILATTSSTCA(SEQ ID NO：3)

可以在转化有或者包含本发明的核苷酸序列或核酸分子或遗传构建体或载体的任何合适的植物宿主中表达目标编码区或目标核苷酸序列。合适的植物宿主的实例包括但不限于：拟南芥，农作物，包括例如油菜(canola)、芸苔属植物(Brassica spp.)、玉蜀黍、烟草属植物(Nicotiana spp.)(烟草)(例如烟草本赛姆氏)、苜蓿、马铃薯、番薯(Ipomoeabatatus)、人参、豌豆、燕麦、大米、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花、玉米、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、红花(Carthamus tinctorius)。

本文使用的术语“生物质”、“植物物质”或“植物部分”指来源于植物的任何材料。生物质或植物物质可以包括整个植物或者植物部分，包括叶片、根、茎、花、种子，它还可以包括植物的任何组织，植物的任何细胞或者植物、植物部分、组织或细胞的任何碎片。此外，生物质或植物物质可以包括细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物或以上的组合。此外，生物质或植物物质可以包括植物，来自植物叶片、茎、果实、根或其组合的植物细胞、组织、液体提取物或其组合。植物部分可以包括植物物质或生物质。

可以利用已知的纯化技术，包括盐或PEG存在下的沉淀、色谱法(包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱或以上的组合)、过滤等，从植物或植物部分提取和纯化目标蛋白(参见Wilken，L.R.和Nikolov，Z.L.2012，Biotechnol.Adv.30，419-433)。4℃且具有7.0或更高pH的提取缓冲液的使用还可以降低提取期间的任何内源蛋白水解活性。

当提及具体序列时，术语“相似性百分比”或“同一性百分比”例如如威斯康星大学GCG软件程序中所示使用或者通过手动对齐和目测使用(参见例如Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人，eds.1995supplement)。用于比较的序列对齐的方法在本领域众所周知。可以利用例如Smith&Waterman的算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)，通过Needleman&Wunsch的对齐算法(1970，J.Mol.Biol.48：443)，通过Pearson&Lipman的相似性方法研究(1988，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444)，通过这些算法的计算机化实施(例如：威斯康星遗传学软件包，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)进行用于比较的序列的最佳对齐。

适用于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例是分别描述于Altschul等人(1977，Nuc.Acids Res.25：3389-3402)和Altschul等人(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)中的BLAST和BLAST 2.0算法。使用如本文所述的参数，利用BLAST和BLAST2.0来测定本发明的核酸和蛋白的序列同一性百分比。例如BLASTN程序(对于核苷酸序列)可以默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序可以默认使用字长为3和期望值(E)为10，以及BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)对齐(B)为50，期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链比较。用于进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

“调控区”、“调控元件”或“启动子”意为通常但不总是位于基因的蛋白编码区的上游的核酸部分，其可以由DNA或RNA或者DNA和RNA这两者组成。当调控区具有活性并与目标基因可操作地关联或者可操作地连接时，这可以导致目标基因的表达。调控元件可以能够介导器官特异性或者控制发育基因或时序基因的激活。“调控区”包含启动子元件、显示出基本启动子活性的核心启动子元件、响应外部刺激可诱导的元件、介导启动子活性的元件，如负调控元件或转录增强子。本文使用的“调控区”还包含在转录之后具有活性的元件，例如调节基因表达的调控元件，如翻译和转录增强子，翻译和转录阻抑物、上游激活序列和mRNA不稳定性决定因子。这些后面元件中的一些可以位于编码区附近。

在本公开的背景下，术语“调控元件”或“调控区”通常指常常但不总是位于结构基因编码序列的上游(5’)的DNA序列，其通过提供用于在特定位点起始转录所需的RNA聚合酶和/或其它因子的识别来控制编码区的表达。但是，应当理解，位于内含子内或序列3’的其它核苷酸序列也可能有助于调控目标编码区的表达。提供RNA聚合酶或其它转录因子的识别以确保在特定位点起始的调控元件的实例是启动子元件。大多数而并非所有真核启动子元件均包含TATA盒，其是通常位于转录起始位点上游大约25个碱基对处的由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列。启动子元件可以包括负责转录起始的基本启动子元件以及修饰基因表达的其它调控元件。

存在数种类型的调控区，包括那些发育调节的、可诱导的或者组成型调控区。发育调节的或者控制受其控制的基因的差异表达的调控区在某些器官或器官的组织发育期间的特定时间，在所述器官或组织内被激活。但是，一些发育调节的调控区在特定发育阶段，可能优先在某些器官或组织内具有活性，它们也可以以发育调节的方式具有活性，或者在植物的其它器官或组织内的基础水平也具有活性。组织特异性调控区，例如视觉特异性调控区的实例包括napin启动子和十字花科蛋白(cruciferin)启动子(Rask等人，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等人，1994，Plant Cell 14：125-130)。叶片特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(参见US7,125,978，将其通过引用并入本文)。

如果目标核酸序列编码对植物具有直接或间接毒性的产物，则可以通过在期望组织内或在植物发育的期望阶段选择性表达目标核苷酸序列来降低此类毒性。可选地，通过茉莉酸甲酯或者其它茉莉酸类通路激活剂的存在诱导的启动子还可以用于驱动如本文所述的目标核苷酸序列的表达。

可诱导的调控区是在针对诱导物的应答中，能够直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的调控区。在诱导物不存在的情况下，DNA序列或基因将不被转录。通常，特异性结合可诱导的调控区以激活转录的蛋白因子可以以失活的形式存在，其然后通过诱导物而直接或间接转变为活性形式。但是，也可能不存在蛋白因子。诱导物可以是化学试剂或者通过热、冷、盐或毒性元素直接施加的生理应激或者通过病原体或疾病物质(如病毒)的作用间接施加的生理应激，所述化学试剂如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物。可以通过向细胞或植物外部应用诱导物，如通过喷涂、浇水、加热或类似的方法将包含可诱导的调控区的植物细胞暴露于诱导物。可诱导的调控元件可以来源于植物或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358，将其通过引用并入)。可能的可诱导启动子的实例包括但不限于：四环素可诱导的启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108；将其通过引用并入)、类固醇可诱导的启动子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404；将其通过引用并入)和乙醇可诱导的启动子(Salter，M.G.等人，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick，M.X.等人，1998，Nature Biotech.16，177-180，将其通过引用并入)、细胞分裂素可诱导的IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和Kieber，J.J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274，982-985；将其通过引用并入)以及生长素可诱导的元件DR5(Ulmasov，T.，等人，1997，Plant Cell 9，1963-1971；将其通过引用并入)。

组成型调控区指导基因在植物各部分以持续在植物发育中的表达。已知的组成型调控元件的实例包括与CaMV 35S转录本相关的启动子(p35S；Odell等人，1985，Nature，313：810-812)或木薯叶脉花叶病毒(Cassava Vein Mosaic Virus)启动子pCAS，(Verdaguer等人，1996)。

本文使用的术语“组成型”不一定指示受组成型调控区控制的核苷酸序列在所有细胞类型中均以相同水平表达，而是序列在大范围的细胞类型中表达，尽管经常观察到丰度变化。

如本文所述的表达构建体可以存在于载体中。载体可以包含允许表达盒转移并整合进有机体或宿主基因组的边界序列。构建体可以是植物双元载体，例如基于pPZP的双元转化载体(Hajdukiewicz等人，1994)。其它示例性构建体包括pBin19(参见Frisch，D.A.，L.W.Harris-Haller等人，1995，Plant Molecular Biology 27：405-409)。

本发明的构建体还可以包含3’非翻译区(UTR)。3’非翻译区包含多腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其它调控信号。多腺苷酸化信号通常以实现多聚腺苷酸轨迹至mRNA前体3’端的添加为特征。尽管变异很常见，但多腺苷酸化信号通常由与典型形式5’AATAAA-3’(SEQ ID NO：4)的同源性的存在而被识别。合适的3’区的非限制性实例是包含下述的多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区：农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因如胭脂碱合酶(Nos基因)和植物基因，如大豆贮藏蛋白基因、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶基因的小亚基(ssRUBISCO；US 4,962,028，将其通过引用并入本文)、用于调节质体蓝素表达的启动子(Pwee和Gray 1993，将其通过引用并入本文)。终止(终止子)序列可以获自苜蓿质体蓝素基因的3’UTR。

如果需要，可以进一步操作本发明的构建体以包含选择标志物。但是，这可能不是必需的。可用的选择标志物包括提供针对化学物质的抗性的酶，所述化学物质如抗生素，例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素或者除草剂，如草丁膦(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等。类似地，可以使用提供用于产生可通过颜色改变(如GUS(β葡萄糖醛酸酶))或发光，如荧光素酶或GFP而鉴定的化合物的酶。

载体还可以包含如本文所述的表达增强子。表达增强子可以位于还包含基因沉默的抑制子和NPTII的T-DNA上。多聚接头还可以编码一组或两组6x组氨酸残基，以允许目标蛋白包含N-或C-端His-标签，从而促进蛋白纯化。

转录后基因沉默(PTGS)可能参与限制植物中转基因的表达，并且可将来自马铃薯病毒Y(HcPro)的沉默抑制子的共表达用于抵消转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等人，1998，EMBO J.17，6739-6746，将其通过引用并入本文)。可选的沉默抑制子在本领域众所周知，并且可以如本文所述使用(Chiba等人，2006，Virology 346：7-14；将其通过引用并入本文)，例如但不限于：TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSV p19；p19构建体描述于WO 2010/0003225中，将其通过引用并入本文)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b；CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25(PVX-p25)、马铃薯M病毒的p11(PVM-p11)、马铃薯S病毒的p11(PVS-p11)、蓝莓枯黄病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶相关病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄A病毒的p10(GVA-p10)、葡萄B病毒的p14(GVB-p14)、独活潜隐病毒的p10(HLV-p10)或者大蒜普通潜隐病毒的p16(GCLV-p16)。

因此，可将一种或多种沉默抑制子与基于豇豆花叶病毒的表达盒、双生病毒来源的扩增元件以及编码目标蛋白的核酸序列共表达，以进一步确保植物内高水平的蛋白产生，所述沉默抑制子例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、rgscam、来自FHV的B2蛋白、CPMV的小的外壳蛋白和来自TCV的外壳蛋白、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10。

可以利用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等将本发明的构建体引入植物细胞。对于此类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；Geierson和Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed.(1988)；以及Miki和Iyer，Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism，2d Ed.DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebrve，DB Layzell(eds)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London，pp.561-579(1997)。其它方法包括直接DNA摄取、脂质体的使用、电穿孔(例如利用原生质体)、微注射、微投射(microprojectiles)或须状物(whisker)以及真空浸润。参见例如，Bilang等人(1991，Gene 100：247-250)，Scheid等人(1991，Mol.Gen.Genet.228：104-112)，Guerche等人(1987，Plant Science 52：111-116)，Neuhause等人(1987，Theor.ApplGenet.75：30-36)，Klein等人(2987，Nature 327：70-73)，Freeman等人(1984，Plant CellPhysiol.29：1353)，Howell等人(1980，Science 208：1265)，Horsch等人(1985，Science227：1229-1231)，DeBlock等人(1989，Plant Physiology 91：694-701)，Methods forPlant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach，eds.，Academic Press Inc.，1988)，Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski，eds.，AcademicPress Inc.，1989)，WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP 175966，Liu和Lomonossoff(2002，J Virol Meth，105：343-348)，EP 290395；WO 8706614；美国专利第4,945,050号、第5,036,006号和第5,100,792号，于1995年5月10日提交的美国专利申请第08/438,666号以及于1992年9月25日提交的美国专利第07/951,715号(在此将其全部通过引用并入)。

可将瞬时表达方法用于表达本发明的构建体(参见D’Aoust等人，2009，Methodsin molecular biology，Vol 483，第41-50页；Liu和Lomonossoff，2002，Journal ofVirological Methods，105：343-348；将其通过引用并入本文)。可选地，可以使用如Kapila等人，(1997，Plant Sci.122，101-108；将其通过引用并入本文)或WO 00/063400、WO 00/037663(将其通过引用并入本文)中所述的基于真空的瞬时表达方法。这些方法可以包括，例如但不限于农杆菌接种或农杆菌浸润的方法、注射器浸润的方法，但是，如以上所示，也可以使用其它瞬时方法。利用农杆菌接种、农杆菌浸润或注射器浸润，包含期望核酸的农杆菌混合物进入组织例如植物的叶片、地上部分(包括茎、叶片和花)、植物其它部分(茎、根、花)或者整株植物的细胞间隙。穿过表皮之后，农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝转移进细胞内。t-DNA进行游离转录和mRNA翻译，导致感染的细胞中目标蛋白的产生，但是t-DNA在核内的穿行是瞬时的。

还考虑了本发明的一部分是包含本发明的基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子，其可以用作适用于本文所述的瞬时蛋白表达的平台植物。从植物细胞再生整株植物的方法在本领域也是已知的(例如参见Guerineau和Mullineaux(1993，Planttransformation and expression vectors.In：Plant Molecular Biology Labfax(CroyRRD ed)Oxford，BIOS Scientific Publishers，pp 121-148)。一般而言，在合适的培养基中培养转化的植物细胞，所述培养基可以包含选择试剂，如抗生素，其中将选择标志物用于促进转化的植物细胞的鉴定。一旦愈伤组织形成，则可以根据已知的方法通过采用合适的植物激素促进芽的形成，并且将芽转移至生根培养基用于植物再生。然后可以由种子或者利用无性繁殖技术将植物用于建立重复世代。在不利用组织培养的情况下也可以产生转基因植物。本领域已建立稳定转化和这些有机体再生的方法，并且其对于本领域技术人员而言是已知的。可用的技术在Vasil等人(Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，VoI I，I1and III，Laboratory Procedures and Their Applications，AcademicPress，1984)以及Weissbach和Weissbach，(Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989)中进行了综述。获得转化的和再生的植物的方法对于本发明而言不是关键的。

如果植物、植物部分或植物细胞将被两种或更多种核酸构建体转化或共转化，则可以在汇集核酸的单次感染事件中将核酸构建体引入农杆菌内，并且如所述转染细菌细胞。可选地，可以连续引入构建体。在这种情况下，如所述向农杆菌中引入第一构建体，使细胞在选择条件下(例如在抗生素的存在下)生长，其中仅单转化的细菌可以生长。在该第一选择步骤之后，如所述向农杆菌引入第二核酸构建体，并且使细胞在双重选择条件下生长，其中仅双转化的细菌可以生长。然后可以如本文所述将双转化的细菌用于转化植物、植物部分或植物细胞，或者可将其进行进一步转化步骤，以包含第三核酸构建体。

可选地，如果植物、植物部分或植物细胞将被两个或更多个核酸构建体转化或共转化，则可以通过共浸润农杆菌细胞和植物、植物部分或植物细胞的混合物而将核酸构建体引入植物，各农杆菌细胞可以包含待引入植物内的一个或多个构建体。为了在浸润步骤期间，改变植物、植物部分或植物细胞中构建体内的目标核苷酸序列的相对表达水平，可以改变包含期望的构建体的各农杆菌群体的浓度。

本公开提供产生目标蛋白的方法，其包括下述步骤：提供如本文所述表达表达系统的植物或植物部分，收获表达目标蛋白的组织、器官或植物，并且任选地，从组织、器官或植物分离目标蛋白。

在下述实施例中将进一步阐明本发明。

材料和方法

植物组织取样和激发子处理

将温室中生长的四十二天龄的烟草本赛姆氏植物用于实验。用50ml包含0.1％(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich，Mississauga ON，Canada)的0.5mM、1mM或2mM MeJA的水溶液或者用50ml在相同溶剂中的1mM花生四烯酸(Girard等人，2007)均匀喷涂各植物，并转移进Conviron生长室(Conviron，Winnipeg MB，Canada)中，保持7天。将用50ml 0.1％(v/v)Triton X-100的水溶液喷涂的植物平行用作阴性对照，以避免由实验条件导致的混淆效应。在七天之后，从第三主茎叶收获两片或三片1-cm²叶圆片(参见Robert等人，2013)，作为蛋白和RNA提取的原材料。将叶片样品立即在液氮中冷冻，并在-80℃下保存，直至蛋白或RAN提取。每次处理使用三至五个生物(植物)重复，以允许对数据进行统计学处理。

基因构建体和叶片农杆菌浸润

两种基因载体被用于农杆菌浸润分析：工程化的pcambia2300载体，其编码与用于细胞分泌的N端信号肽序列融合的C5-1的轻链和重链(对于基因构建体的细节，参见Goulet等人，2012)；和作为农杆菌感染的对照的原始(“空”)pcambia2300双元载体(CAMBIA，Canberra，Australia)。使两种双元载体电穿孔进入根癌农杆菌菌株LBA4404，并在补充有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的Luria-Bertani(LB)培养基中维持培养物。对于浸润，使细菌在28℃下生长至稳定期，至OD₆₀₀为1.0，并通过在2,000g下离心进行收集。将细菌团在pH5.8，包含100μM乙酰丁香酮和10mM MgCl₂的10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸](MES)缓冲液中重悬。在将C5-1抗体(或空载体)农杆菌悬液与等体积的携带蛋白沉默抑制子p19的双元载体(Voinnet等人，2003)的细菌悬液混合之后，利用之前所述的无针注射器进行叶片浸润(D’Aoust等人，2009)。在感染之后六天(即在MeJA或花生四烯酸处理之后七天)收集浸润的组织用于分子表征，除非另外指明。对于各实验，使用三至五个生物(植物)重复，以允许进行统计学分析。

蛋白提取、SDS-PAGE和免疫印迹

通过在Mini-Beadbeater装置(BioSpec，Bartlesville OK，USA)中用碳化钨珠子(Qiagen，Mississauga ON，Canada)破碎叶片样品，在400μl pH7.5，包含150mM NaCl的冰冷的50mM Tris-HCl中，从三个1-cm²叶圆片中提取全部叶片蛋白。除了专门用于蛋白酶活性监测的那些提取物之外，如供方所指明的，在组织破碎之前，向提取缓冲液中添加完整的‘蛋白酶抑制剂混合物’(Roche，Laval QC，Canada)。通过于4℃下，在20,000g离心30min来使粗制叶片提取物澄清，并根据Bradford(1976)，用牛血清白蛋白作为蛋白标准(Sigma-Aldrich)对总的可溶性蛋白进行分析。通过还原条件下的10％(w/v)SDS-PAGE进行蛋白的电泳分离(Laemmli，1970)，除非另外指明。将解析的蛋白用考马斯蓝进行染色，以使蛋白带型可视化，或者电转移至硝酸纤维素膜上，用于用合适的第一抗体和第二抗体进行免疫检测。利用针对合成的小亚基肽在兔中激发的多克隆IgG(Agrisera，Sweden)和碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG作为第二抗体(Sigma-Aldrich)检测RuBisCO小亚基。利用针对合成的大亚基肽在母鸡中激发的多克隆IgG(Agrisera)和碱性磷酸酶缀合的山羊抗鸡IgG作为第二抗体(Sigma-Aldrich)检测RuBisCO大亚基。利用兔多克隆IgY第一抗体(Agrisera)和碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG第二抗体(Sigma-Aldrich)检测33-kDa的病原体可诱导的PR-2蛋白。用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma-Aldrich)检测C5-1轻链和重链。

质谱法

从凝胶中手动切除用于MS鉴定的叶片蛋白(与图1b的框A、B和C中的蛋白凝胶区域相对应)，将其置于100μl Milli-Q水中，并送至东部魁北克蛋白质组学中心(Eastern Québec Proteomics Center)(Centre de Recherche du CHUL，Québec QC，Canada)，用于离子阱MS/MS分析。根据提供者的说明书，在MassPrep液体处理机器人(Waters，Milford MA，U.S.A.)中进行用测序级胰蛋白酶(Promega，Madison WI，U.S.A.)进行的凝胶内蛋白消化。通过在线反相纳米级毛细管液相色谱解析肽样品，并利用连接至配备有纳米级电喷雾离子源的LTQ线性离子阱质谱仪的Thermo Surveyor MS泵(ThermoFisher，San Jose CA，U.S.A.)，通过电喷雾质谱进行分析。将10μl肽等分试样加样至75-μm内径的BioBasicC18picofrit柱(New Objective，Woburn MA，U.S.A.)上。将肽沿水-乙腈/0.1(v/v)甲酸梯度，在通过分流获得的200nl/min的流速下进行洗脱。利用Xcalibur软件v.2.0，在数据依赖性采集模式下采集质谱。在各全MS扫描(400至2000m/z)之后，利用碰撞诱导解离进行七种最强烈的先驱离子的MS/MS扫描。将相对碰撞破碎能量设定为35％，并且动态排斥功能能够具有30-s的排斥持续时间。

蛋白鉴定

利用Thermo’s Bioworks应用程序包的ExtractMSn实用程序提取MS/MS光谱数据，其中无电荷状态去卷积或分离同位素(deisotoping)。利用Mascot程序v.2.3.02(MatrixScience，London，U.K.)和Open Source软件X！Tandem(Craig等人，2004)对蛋白身份进行评估。安装这两种软件，以探究包含所有已知茄科物种的蛋白序列(Taxonomy ID：4070，对于39，896种蛋白)、根癌农杆菌蛋白序列(12，554种蛋白)和胰蛋白酶消化物中常见的蛋白污染物的数据序列的自定义数据库。用0.50Da的碎片离子质量公差(fragment ion masstolerance)和2.0Da的母离子公差(parent ion tolerance)对数据库进行探究。在Mascot和X！Tandem中将Cys残基的碘乙酰胺衍生物指定为固定修饰；将Arg残基的瓜氨酸化和Met残基的氧化指定为可变修饰。利用Scaffold，v.3.4.9(Proteome Software，Portland OR，U.S.A.)验证基于MS/MS的肽和蛋白鉴定。如果鉴定包含至少四种肽并且能够如通过Peptide Prophet算法所指定的以高于95％的概率建立，则鉴定可以接受(Keller等人，2002)。通过如Nesvizhskii等人(2003)所述的Protein Prophet算法来指定蛋白概率。将包含类似的肽并且不能基于MS/MS数据进行区分的蛋白分组以满足简约性原则。

实时RT PCR

利用ABI PRISM 7500快速实时PCR装置2.0.1系统版本(Applied Biosystems，Carlsbad CA，U.S.A.)，通过实时RT PCR分析C5-1和根癌农杆菌毒力蛋白VirB1和VirE1的mRNA转录本。根据提供者的说明书，利用Qiagen RNeasy植物小试剂盒(Qiagen)，从在第三主茎叶上收集的两个1-cm²叶圆片提取总RNA(Robert等人，2013)。用DNase I(RocheDiagnostics)处理RNA样品，以移除污染物DNA，并利用NanodropND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington DE，USA)对质量和量进行评估。利用4单位的Omniscript逆转录酶(Qiagen)和1μM寡dT(15)核苷酸(Roche)，由500ng总RNA合成第一链cDNA。PCR反应包含10μl Fast SYBR Green PCR预混液(Applied Biosystems)、2μl cDNA模板以及2.5μl各合适的正向和反向引物，终浓度为625nM(表1)。各96孔板中包含无模板的混合物对照。扩增循环由下述组成：95℃下20s变性步骤，随后40个95℃ 3s以及60℃ 30s的两步循环。在用SYBR Green预混液扩增之后进行解离曲线分析，然后将各样品的循环阈值与针对各引物对设计的DNA标准曲线进行比较。根据NEB Taq聚合酶常规方案，用2μl cDNA模板产生标准曲线(New England Biolabs，Pickering ON，Canada)。利用Illustra GFX试剂盒(GE Healthcare)纯化扩增产物，并用在无核酸酶的水中系列稀释的纯化的PCR产物(10⁷至10²个拷贝/μl)设计DNA标准曲线。绘制针对对应的转录本拷贝数的C_t数据。所有扩增均以一式两份进行。

表1：用于实时RT PCR分析的正向和反向寡核苷酸引物

细菌计数

通过对涂布有在不同时间从第三主茎叶获得的细菌的LB琼脂平板上的CFU进行计数来测定叶片中的细菌载量。各重复由在农杆菌浸润之后0、2、4或6天收集的两个1-cm²叶圆片组成。将叶圆片在BioSpec Mini-Beadbeater中，在pH5.8，包含10mM MgCl₂的10mM MES缓冲液中进行均化(参见以上蛋白提取、SDS-PAGE和免疫印迹)。将得到的悬液稀释涂布在补充有卡那霉素(50mg/ml)的LB培养基上，并在28℃下培养直至两天后进行CFU计数。

蛋白酶分析

利用下述合成的荧光发生底物(Peptides International，Louisville KY，USA)，通过监测底物水解进程曲线(Goulet等人，2012)分析蛋白酶活性：对于组织蛋白酶L样C1ACys蛋白酶，Z-Phe-Arg-甲基香豆素(MCA)；对于胰蛋白酶样S1 Ser蛋白酶，Z-Arg-MCA；以及对于组织蛋白酶D/E样A1 Asp蛋白酶，MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH₂。允许于25℃下，在pH5.8，包含用于组织蛋白酶L底物的10mM L-Cys的50mM MES中进行通过叶片提取物蛋白酶的底物水解(36ng叶片蛋白/μl反应混合物)。利用Fluostar Galaxy微板荧光计(BMG，Offenburg，Germany)，对于MCA底物，分别用360和450nm的激发和发射滤光片；对于MOCAc底物，分别用340和400nm的激发和发射滤光片监测蛋白酶活性水平。对于各分析使用三次独立的(生物)重复。

C5-1定量

在4℃下，用在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.0)中的3.75μg/ml山羊抗鼠重链特异性IgG1(Sigma-Aldrich)包被用于C5-1抗体定量的ELISA板(Becton Dickinson，MississaugaON，Canada)，持续16-18h。将板在包含0.1％(v/v)Tween20(PBS-T)的10mM磷酸缓冲盐溶液中洗涤三次，通过于37℃下，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的1％(w/v)酪蛋白(Pierce，Rockford IL，USA)中进行1h孵育而封闭，并在PBS-T中洗涤三次。对于各板，用0、4、8、16、24、32、40和60ng/ml纯化的小鼠IgGl(Sigma-Aldrich)产生标准曲线。在获自用模拟接种物浸润的叶片组织的对照提取物中进行所有稀释(对照和样品)，以消除任何基质效应。将板与蛋白样品在37°下孵育1h，在PBS-T中洗涤三次，然后在37℃下，与过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(0.02μg/ml于封闭溶液中)(Jackson ImmunoResearch)孵育1h。在用PBS-T进行另外的洗涤之后，将板与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺Sure Blue过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg MD，USA)孵育。通过添加1N HCl停止反应，并读取450nm下的吸光度。对于各分析，使用三次独立的(生物)重复。

统计学分析

利用SAS程序v.9.1(SAS Institute，Cary NC，USA)进行统计学分析。利用ANOVAANOVA和PROC GLM程序来比较处理之间的C5-1收率、密度测定法数据和蛋白酶活性。当ANOVAANOVA显著时，利用5％的α数值阈值进行对比计算。进行学生t检验来比较对照和MeJA处理的植物中根癌农杆菌毒力蛋白和C5-1链的mRNA转录本数目。

实施例1：i)MeJA诱导烟草本赛姆氏中叶片蛋白质组再平衡

用0.5、1或2mM MeJA处理四十二天龄的烟草本赛姆氏，以测定茉莉酸信号传导对叶片组织中整体蛋白图谱的影响(图1)。七天之后，基于鲜重，与未处理的对照叶片相比，MeJA处理的植物的成熟叶片的TSP含量降低20至30％，这取决于激发子剂量(ANOVA；P＜0.001)(图1a)。如用其它茄科所观察的(Lawrence等人，2008；Duceppe等人，2012；Ullman-Zeunert等人，2013)，MeJA处理引起叶片提取物中RuBisCO大亚基和小亚基池的大量消耗(图1b)，估计对于0.5mM MeJA剂量，少于对照40％至对于2mM剂量，少于90％以上(ANOVA；对于RbcL，P＜0.05；对于RbcS，P＜0.001)(图1c)。如SDS-PAGE之后在考马斯蓝染色的凝胶上观察的，通过上调一些蛋白，尤其是分子量范围为～30-kDa、～25-kDa和～6-kDa的蛋白，抵消了RuBisCO消耗(图1b，框A、B和C)。进行鸟枪法蛋白质组分析，以基于获自图1b框A、B和C中蛋白条带的胰蛋白酶消化物的肽的串联质谱法(MS/MS)的光谱计数分析，鉴定这些质量范围内丰度最高的蛋白(表2)。大多数鉴定的蛋白是MeJA可诱导的应激相关(或防御)蛋白，尤其包括硫素、几丁质酶、Kunitz的Ser蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂II蛋白家族以及应激相关的酶(如超氧化物歧化酶、碳酸酐酶和硫氧还蛋白过氧化物酶(对于MS/MS肽序列的细节，参见表3)。

在MeJA处理之后24h，将许多植物用含有‘空’PCAMBIA 2300载体的根癌农杆菌细胞浸润(Goulet等人，2012)，以评估MeJA介导的叶片蛋白质组改变是否可以维持在用于重组蛋白表达的细菌感染之后留下的通常六至七天时间段。已知农杆菌浸润引发烟草本赛姆氏叶片质外体中活跃的PR蛋白分泌，包括PR-2(β-葡聚糖酶)和PR-3(几丁质酶)蛋白，推测涉及病原体可诱导的水杨酸信号传导通路(Goulet等人，2010)。在农杆菌浸润的叶片中，质量范围为25至33-kDa(与PR-2和PR-3蛋白对应)的三条蛋白条带强烈上调，不管应用的MeJA剂量为何(图1b)。由于茉莉酸类与水杨酸信号传导通路之间的拮抗相互作用(Derksen等人，2013)，浸润的叶片中的PR蛋白诱导与未感染的植物中检测的MeJA介导的应激蛋白诱导的强烈逆转相关，导致在感染之后六天在框A、B和C中非常弱的蛋白信号(图1b)。相对于未处理的植物，在用1或2mM MeJA处理的叶片中，发现RuBisCO的大亚基和小亚基均少于其最初含量的50％(图1b，c)。

这些数据证实了MeJA作为烟草本赛姆氏叶片中RuBisCO消耗的有效的感染前引发物的效力，以及其在回收后的富集和纯化之前，在降低RuBisCO负载同时增加粗蛋白提取物中的重组蛋白相对含量中的用途。

表2：MeJA处理之后七天，烟草本赛姆氏叶片中上调的应激相关蛋白^1，2

¹这些蛋白与图1b框A、B和C中通过LC-MS/MS鉴定的丰度最高的蛋白种类相对应。基于10个频谱的最小光谱计数的蛋白身份包含于列表中。

²关于MS/MS序列的其它信息可获自表3。

³来自美国国家生物技术信息中心/GenBank数据库的登录号(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov)。

表3：与MeJA处理之后七天，在烟草本赛姆氏叶片中上调的应激调节蛋白匹配的独特肽^1，2

表3(续)

¹这些蛋白与图1b框A、B和C中通过LC---MS/MS鉴定的丰度最高的蛋白种类相对应。

²来自美国国家生物技术信息中心/GenBank数据库的登录号(参见：ncbi.nlm.nih.gov)。

ii)MeJA对于烟草本赛姆氏-根癌农杆菌相互作用具有较小影响

在农杆菌浸润之后，观察到MeJA对防御蛋白上调影响的几乎完全逆转，指示茉莉酸类处理对植物增加针对细菌感染的基于PR蛋白的防御应答的能力以及细菌转染植物细胞并通常存留在叶片组织中的能力的有限影响。为了进一步检测植物-细菌相互作用，使用作为叶片中PR蛋白诱导的参照的PR-2蛋白的免疫印迹(Goulet等人，2010)，并且由水杨酸调控的两种农杆菌毒力基因mRNA转录本的数目作为转染过程的标志物(Yuan等人，2007)(图2)。一些研究已经报道了水杨酸或功能同系物对茉莉酸类信号传导的强烈拮抗作用以及在水杨酸或MeJA处理时，水杨酸可诱导的PR蛋白和茉莉酸类可诱导的防御蛋白的不同调控模式(Thaler等人，2012)。

与考马斯蓝染色的蛋白图谱一致(图1b)，以0.5或1mM喷涂的MeJA对于非浸润的叶片中组成型表达的33-kDa病原体可诱导的PR-2蛋白的表达无显著影响(ANOVA；P＞0.05；图2a)。

已知水杨酸经下调影响毒力基因表达和T-DNA整合进入宿主细胞的细菌vir调节子来减弱叶片中的农杆菌感染(Veena等人，2003；Yuan等人，2007；Anand等人，2008)(Yuan等人，2007)。水杨酸缺陷的植物显示更易受病原体的影响，而过度产生该代谢物的植物显示对感染的增加的抵抗(Yuan等人，2007)。此处进行细菌计数和实时RT PCR分析，以将在用或不用MeJA处理的情况下，浸润的叶片中农杆菌细胞的数目和毒力蛋白的mRNA转录本池进行比较，从而寻找促进农杆菌生长和毒力基因表达的茉莉酸类衍生物的可能的水杨酸阻抑作用(图2b、c)、

如通过浸润后长至两天1千万至1亿个克隆形成单位(CFU)/ml质外体提取物至四或六天之后少于一百万个CFU所测定的，从对照和MeJA处理的叶片的质外体中得到类似的细菌数目(图2b)。将T-DNA易位进受体宿主细胞并随后整合进核内所分别涉及的两种毒力蛋白VirB1和VirE1(Lacroix等人，2006)的DNA编码序列用作RT PCR分析的水杨酸应答细菌标志物。在MeJA处理的叶片中VirB1的表达负向改变，并且在MeJA处理之后七天未观察到对任一基因转录的正向影响，尽管茉莉酸类对水杨酸信号传导具有天然拮抗作用(图2c)。

这些数据全部证实了在农杆菌浸润后，MeJA处理的叶片和对照叶片中针对细菌感染的强的防御应答的起始，并且MeJA预处理对该应答和用于基因转染的细菌的效力均无积极影响。

iii)MeJA对于转染的叶片中的蛋白酶活性具有较小影响

用合成的肽底物进行酶促分析，以研究MeJA处理对叶片粗提物中的蛋白酶活性的影响(图3)。考虑到内源蛋白酶在表达期间的植物体内或者用于蛋白回收的组织破碎时的植物体外的蛋白转换中的直接作用，它们对于植物系统中重组蛋白产生具有强烈的影响(Benchabane等人，2008)。蛋白酶特征受烟草本赛姆氏中不同的发育因子或环境因子的影响，包括叶龄、农杆菌感染和重组蛋白表达(Robert等人，2013)。请记住防御相关的信号传导通路之间的复杂串扰(Robert-Seilaniantz等人，2011)，致病性感染时分泌的蛋白酶的重要性(和van der Hoom，2013；Ramirez等人，2013；等人，2014；Figueiredo等人，2014)以及能够影响粗提物中内源蛋白酶活性的MeJA介导的蛋白酶抑制剂的过表达(参见图1b和表2)，对MeJA处理对对照和农杆菌浸润的叶片中的主要内切蛋白酶活性的影响进行评估。

粗提物中测量的蛋白酶活性代表组织破碎时提取介质中反映蛋白酶和蛋白酶抑制剂分子的相对丰度的净值，以及释放的抑制剂对内源蛋白酶的抑制特异性(Benchabane等人，2009)。对在MeJA处理之后七天收获的对照和MeJA处理的叶片粗提物中组织蛋白酶L样Cys蛋白酶、胰蛋白酶样Ser蛋白酶和组织蛋白酶D/E样Asp蛋白酶活性进行分析，以记录茉莉酸类信号传导对叶片蛋白酶特征的基本长期影响。对于三种测试剂量，MeJA对组织蛋白酶L样活性无影响(ANOVA；P＞0.05)(图3a)。对于0.5和1mM剂量，胰蛋白酶样酶的活性显示出最小增加或无增加(P＜0.001)(图3b)，尽管叶片中Ser蛋白酶抑制剂相伴上调(参见表2)。在MeJA处理之后七天，未浸润的植物中组织蛋白酶D/E样活性显示剂量依赖的降低(P＜0.001)，这在农杆菌浸润的叶片中也观察到了(图3c)。在感染之后六天，浸润的叶片中组织蛋白酶L样(P＜0.05)和胰蛋白酶样(P＜0.001)活性上调，这不依赖MeJA预处理(图3a、b)。

这些数据表明在农杆菌浸润的叶片中，细菌感染后Cys和Ser蛋白酶的可能作用以及这些酶的特定表达模式的起始，其不依赖于MeJA介导的蛋白酶抑制剂诱导。数据还指出在呈现浸润之后六天MeJA处理的叶片中重新平衡的蛋白质组的建立，其中RuBisCO亚基池显著消耗；以及病原体可诱导的PR蛋白量的强烈增加。

iv)MeJA处理增加瞬时表达的重组蛋白的积累

进行农杆菌浸润分析，以确定MeJA处理对叶片组织中瞬时表达的临床可用的重组蛋白的表达和稳定状态水平的影响(图4)。考虑到植物系统中可获得的关于人血液分型单克隆抗体C5-1(Khoudi等人，1999)的蛋白表达、成熟和蛋白酶解加工的丰富信息，选择其作为模型(Khoudi等人，1999；Bardor等人，2003；Sainsbury等人，2008；Vézina等人，2009；D’Aoust等人，2009；Goulet等人，2012；Robert等人，2013)。在非还原性条件下进行SDS-PAGE之后，烟草本赛姆氏叶片中共表达的C5-1轻链和重链在免疫印迹上被检测为高分子量、多条带蛋白模式，包括～150-kDa的完全组装形式的抗体和多种较小但具有活性的片段(Goulet等人，2012；Robert等人，2013)。利用抗IgG第一抗体免疫检测到约150kDa的主要蛋白条带(图4a)。与对照植物相比，在MeJA处理的植物的叶片提取物中观察到具有增加强度的视觉上类似的蛋白条带模式。

进行定量酶联免疫吸附分析(ELISA)，以证实MeJA对抗体积累的明显积极作用，以及界定茉莉酸类介导的应答的可能的剂量曲线关系(图4b)。在MeJA处理的叶片中测量出显著较高的抗体量，其达到对照植物中测量的水平的约1.5至2.5倍的稳定状态水平(ANOVA；P＜0.05)。MeJA的上调作用符合二次曲线，其中与在2mM MeJA下测量的～325μg/g叶片组织或者在对照叶片中测量的少于200μg/g相比，在1mM MeJA下测量的最大产量数值是～425μg/g叶片组织(图4b)。还基于蛋白相对量证实了MeJA的影响，在用1mM MeJA处理的叶片中得到了70ng抗体/μg可溶性蛋白(或～7％TSP)的净产量，其是用对照叶片获得的产量的约两倍(P＜0.05)(图4b)。如从用1mM MeJA喷涂的植物的实时RT PCR数据所推断的，MeJA处理的叶片中较高的C5-1产量与较高的轻链和重链mRNA转录本数目相关，其数目是对照叶片提取物中测量的数目的大约两倍(图4c)。

当在浸润后24h喷涂MeJA时(图4d)或者在浸润之前24h用水杨酸的功能类似物花生四烯酸(Girard等人，2007)处理叶片时(图4d)，未观察到产量增加。

此外，当在苜蓿质体蓝素启动子(US 7,125,978，将其通过引用并入本文)的控制下表达重组抗体时，在浸润之前24h喷涂1mM MeJA的烟草本赛姆氏叶片中C5-1产量降低大于两倍。

转染有空PCAMBIA 2300载体的叶片中33-kDa PR-2蛋白的诱导(参见图2a)与转染有编码抗体的载体的叶片中的类似(图5)，表明C5-1抗体表达对宿主植物针对农杆菌浸润的应答的有限(如果非空)影响。我们的观察整体表明预浸润MeJA处理经尚未被理解的茉莉酸类通路的转录促进作用在促进烟草本赛姆氏叶片中重组蛋白的表达中的实际用途。

在此将所有引用通过引用并入。

已经关于一个或多个实施方案描述了本发明。但是，可在不脱离如权利要求中所限定的本发明的范围的情况下作出多种改变和改进对于本领域技术人员而言将是显而易见的。权利要求的范围不应受实施例中示出的优选实施方案的限制，而应给出与作为一个整体进行的描述相一致的最宽泛的解释。

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Claims

1.增加植物或植物部分中目标异源蛋白的表达的方法，其包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

2.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA植物病毒是虫媒DNA植物病毒。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是茉莉酸甲酯、茉莉酸、冠菌素或以上的任何生物活性衍生物。

4.如权利要求1所述的方法，其中在处理步骤中，将所述茉莉酸通路激活剂喷涂在所述植物或植物部分上，或者添加至维持所述植物或植物部分的生长培养基中。

5.如权利要求1所述的方法，其中将处理步骤和引入步骤组合，将所述茉莉酸类通路激活剂以及所述核苷酸序列引入所述植物或植物部分。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是气体。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是液体。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是气体。

9.如权利要求5所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是气体。

10.如权利要求1所述的方法，其中在处理步骤(步骤i)中，将所述茉莉酸类通路激活剂作为气体应用于所述植物或植物部分，或者将所述茉莉酸类通路激活剂作为液体应用并喷涂到所述植物或植物部分上。

11.如权利要求5所述的方法，其中将所述植物或植物部分浸入包含所述核苷酸序列和所述茉莉酸类通路激活剂的液体培养基中。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述目标异源蛋白是人病原体、病毒蛋白、白介素、细胞因子、红细胞生成素、胰岛素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF、干扰素、凝血因子、受体、受体激动剂、抗体、神经多肽、生长因子、生长调节剂、抗原、自身抗原、单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、单链单克隆抗体、病毒样颗粒(VLP)或其组合。

13.降低植物或植物部分中总的宿主可溶性蛋白的方法，其包括：

i)用茉莉酸类通路激活剂处理所述植物或植物部分；

14.如权利要求13所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是茉莉酸甲酯、茉莉酸、冠菌素或以上的任何生物活性衍生物。

15.如权利要求13所述的方法，其中在处理步骤中，将所述茉莉酸类通路激活剂喷涂到所述植物或植物部分上，或者添加至维持所述植物或植物部分的生长培养基中。

16.如权利要求13所述的方法，其中将处理步骤和引入步骤组合，并将所述茉莉酸类通路激活剂以及所述核苷酸序列引入所述植物或植物部分。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是气体。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是液体。

19.增加转基因植物或转基因植物部分中目标异源蛋白的表达的方法，其包括：

20.如权利要求19所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是茉莉酸甲酯、茉莉酸、冠菌素或以上的任何生物活性衍生物。

21.如权利要求19所述的方法，其中在处理步骤中，将所述茉莉酸类通路激活剂喷涂到所述植物或植物部分上，或者添加至维持所述植物或植物部分的生长培养基中。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是气体。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述茉莉酸类通路激活剂是液体。