CN103814127B - 用于降解有机磷酸酯的酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够水解有机磷酸酯(OP)分子的酶。特别地，本发明涉及来自农杆菌属（Agrobacterium）的OpdA酶的变体，其与天然存在的OpdA相比时显示改进的活性。本发明也涉及对有机磷酸酯甲基毒死蜱、二嗪农和乙基对硫磷具有有机磷酸酯水解活性的多肽。

Description

用于降解有机磷酸酯的酶
技术领域
本发明涉及能够水解有机磷酸酯（organophosphate）（OP）分子的酶。
背景技术
有机磷酸酯（OP）杀虫剂残余物是环境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染（废水被下游的灌溉者使用或允许直接流出农场）、以及在农业和园艺出口商品中存在超出允许水平的残余物。有机磷酸酯中毒是暴露在此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于暴露在化学战中所用的有机磷酸酯的军事人员也是如此。此外，储备的有机磷神经毒剂也需要对这些储备进行解毒处理。因此，需要一些生物修复（bioremediation）策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。
提出的一个方案涉及使用能够固定或降解有机磷酸酯残余物的酶。例如，这些酶可用于生物反应器中，污染的水可能会流经所述生物反应器，或是在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫（disinfestation）后用在洗涤溶液中以便降低残余物的水平和存留时间（withholding time）。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry,1992；Mulbry和Kearney,1991；Cheng等，1999；US5,484,728；US5,589,386;Dong等，2005)、来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO95/19440和WO97/19176)。要求OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。
研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphatedihydrolase，称为OPD、OPH或PTE)，其由黄杆菌菌种（Flavobacterium sp.）ATCC27551和缺陷短波单胞菌MG（Brevundimonas diminuta MG）中的不同质粒上相同基因编码(Harper等，1988；Mulbry和Karns,1989)。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯（氧OP和硫OP均可）（Dumas等，1989a,b）。其反应机制直接或间接地涉及金属离子，优选为Co++、也包括Zn++、Cd++、Fe++和其它二价阳离子。OPD对于磷酸单酯或二酯没有可检测到的活性(Dumas等，1989a,b；1990)。
已经在大肠杆菌（Escherichia coli）(ePHP)、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）(mtPHP)和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物（磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP），不过仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid,1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未检测到对任何测试的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷（paraoxon）和p-硝基苯磷酸酯。已鉴定出一类相关性更远的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的内酯酶活性，同样OPD酶也具有非常低水平的内酯酶活性（小于针对OP底物活性的0.001%）（Afriat等人，2006）。
在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些生物中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不过mpPHP的相似性稍低。在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的所有成员中，参与Zn++结合的氨基酸残基都是保守的(Buchbinder等，1998)。
最近，从农杆菌中（Agrobacterium）分离出OP降解酶（WO02/092803;Horne等，2002;Jackson等，2009）。这种酶又称为OpdA，因其与OPD具有90%的氨基酸序列同一性。尽管OpdA与OPD在氨基酸水平上相关，它们已显示出针对不同OP的不同活性。
需要可用于生物修复策略中的其它OP降解酶。特别是，需要针对特定OP具有增强的活性的可用于生物修复领域的酶。
发明内容
本发明已鉴定的多肽与天然存在的OpdA相比具有改进的活性。
因此，在一方面，本发明提供一种多肽，其含有序列为如下的氨基酸：
i)如SEQ ID NO:1所示，
ii)与SEQ ID NO:1所示的序列至少95%相同，或
iii)i)或ii)的片段，其具有有机磷酸酯水解活性和/或其是至少270个氨基酸长，
其中，所述多肽包含下列中的一个或更多或全部；
a)在与SEQ ID NO:1的氨基酸51位相对应位置上的缬氨酸；
b)在与SEQ ID NO:1的氨基酸63位相对应位置上的丙氨酸；
c)在与SEQ ID NO:1的氨基酸156位相对应位置上的精氨酸；
d)在与SEQ ID NO:1的氨基酸203位相对应位置上的谷氨酸；以及
e)在与SEQ ID NO:1的氨基酸236位相对应位置上的天冬氨酸。
在一个实施方案中，所述多肽具有有机磷酸酯水解活性。
在另一个实施方案中，所述多肽与第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性，第二多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。更优选地，与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽以及氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽相比，所述多肽具有更强的有机磷酸酯水解活性。
在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二级速率常数(kcat/Km)。
在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对二嗪农具有高至少1.5倍或2倍的二级速率常数(kcat/Km)。
在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对乙基对硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二级速率常数(kcat/Km)。
在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对乙基毒死蜱具有高至少1.2倍、或1.5倍的催化常数(kcat)。
关于以上四个实施方案，优选地，相对于氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽、以及氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽，本发明的多肽具有限定的活性。
在一个实施方案中，有机磷酸酯是芳香族的非乙烯基（non-vinyl）有机磷酸酯。更优选地，所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。在一个实施方案中，有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。
在一个实施方案中，本发明的多肽具有对乙基毒死蜱至少约2x106sec-1.M-1、对甲基毒死蜱至少约3.5x105sec-1.M-1、对二嗪农至少约3.6x106sec-1.M-1、对乙基对硫磷至少约9x107sec-1.M-1、或对甲基对硫磷至少约3x106sec-1.M-1的二级速率常数(kcat/Km)，或者其两个或更多个、优选全部五个的组合。更优选地，本发明的多肽具有对甲基毒死蜱至少约3.5x105sec-1.M-1、对二嗪农至少约3.6x106sec-1.M-1、对乙基对硫磷至少约9x107sec-1.M-1的二级速率常数(kcat/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
在另一方面，本发明提供水解有机磷酸酯分子的多肽，其具有对甲基毒死蜱至少约3.5x105sec-1.M-1、对二嗪农至少约3.6x106sec-1.M-1、对乙基对硫磷至少约9x107sec-1.M-1的二级速率常数(kcat/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
在一个实施方案中，多肽包含a)至e)中的至少三个。在另一个实施方案中，多肽包含a)和c)、以及b)、d)和e)中的至少一个。在又一实施方案中，多肽包含b)、d)和e)。在还一个实施方案中，多肽包含a)至e)。
优选地，本发明的片段包含至少i)或ii)的氨基酸20至296，更优选至少i)或ii)的氨基酸15至325，以及甚至更优选至少i)或ii)的氨基酸10至350。
优选地，多肽由如SEQ ID NO:1所示氨基酸的序列所组成。
在一个实施方案中，多肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸的序列。
在另一个实施方案中，多肽包含或由如SEQ ID NO:5所示的氨基酸的序列所组成。
在另一方面，本发明提供水解有机磷酸酯分子的多肽，其具有对甲基毒死蜱至少约3.5x105sec-1.M-1、对二嗪农至少约3.6x106sec-1.M-1、对乙基对硫磷至少约9x107sec-1.M-1的二级速率常数(kcat/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
在一个实施方案中，本发明的多肽是基本纯化的和/或重组体。
在一个实施方案中，本发明的多肽是进一步含有至少一种其它多肽序列的融合蛋白。所示至少一个其它多肽可以是，例如，增强本发明多肽稳定性的多肽、促进融合蛋白从细胞（例如细菌细胞或酵母细胞）中分泌的多肽（如N端疏水信号肽）、或协助纯化融合蛋白的多肽（如麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶）。
在一个实施方案中，本发明的多肽固定在固体支持物（support）上。
在另一个实施方案中，所述多肽存在于微生物细胞或者在微生物细胞的提取物、优选粗提物中。
在又一方面，本发明提供分离的和/或外源的多核苷酸，其包含序列为如下的核苷酸：
i)如SEQ ID NO:6所示，
ii)编码本发明的多肽，或
iii)与i)或ii)的全长互补。
在一个实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接于能够指导多核苷酸在细胞中、优选微生物细胞中表达的启动子。
在又一方面，所提供的是含有本发明多核苷酸的载体。
在另一方面，所提供的是含有本发明多核苷酸和/或本发明载体的宿主细胞。本发明宿主细胞的实例包括、而非限制于植物细胞或微生物细胞。优选地，微生物细胞是细菌细胞或如酵母细胞的真菌细胞。在一个实施方案中，所述细胞适合发酵。
在另一方面，本发明提供含有至少一种本发明细胞的转基因非人类生物。
在一个实施方案中，所述转基因非人类生物是植物、微生物生物，优选细菌或真菌。
在再一方面，本发明提供本发明宿主细胞和/或本发明的生物的提取物，其中提取物包含本发明的多肽、以及任选的本发明的多核苷酸。
在又一方面，本发明提供组合物，其包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、和本发明的提取物中的一种或更多，以及一种或更多可接受的载体。
在一个实施方案中，所述组合物包含阳离子，例如，而并非必须限制于Zn2+、Fe 2+、Co 2+、Cd2+或者其两种或更多的组合。
在另一方面，本发明提供用于水解有机磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有机磷酸酯分子与本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物和本发明的组合物中的一种或更多种相接触。
在优选的实施方案中，以上各方面的方法包括
a)获得本发明的多肽，和
b)使有机磷酸酯分子与所述多肽接触。在这种实施方案中，所述多肽可形成例如本发明的宿主细胞、本发明的提取物、或本发明的组合物的部分。
在一个实施方案中，所述有机磷酸酯分子是在选自土壤、水、生物材料或其组合的样本中或在表面上。
在又一个实施方案中，所述方法包括将所述多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、提取物和组合物中的一种或多种应用至实地（in the field）土壤或液体中，如绵羊药浴液（sheep dip）、水坝或废水。
在另一方面，本发明提供在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物或本发明的组合物中的一种或更多种。
也提供本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的提取物以及本发明的组合物中的一种或更多种在制造药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性。
此外，提供本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的提取物以及本发明的组合物中的一种或更多种作为药物的用途，所述药物用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性。
在还一方面，本发明提供产生本发明多肽的方法，所述方法包括在允许表达编码所述多肽的多核苷酸的条件下培养本发明的宿主细胞、或本发明的载体，以及回收表达出的多肽。
在优选的实施方案中，所述方法包括
i)提供容器，其容纳含有适合发酵的本发明细胞（如大肠杆菌）的液体组合物、以及发酵所需的成分，和
ii)提供有益于所述容器中容纳的液体组合物发酵的条件。
在另一方面，本发明提供用于检测有机磷酸酯存在的生物传感器，所述生物传感器包含本发明的多肽、以及检测有机磷酸酯分子被所述多肽水解的手段。
在又一方面，本发明提供用于水解有机磷酸酯分子的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物和本发明的组合物中的一种或多种。
除非另有具体规定，本文的任何实施方案应加以必要的修改以适用于任何其它实施方案。
本发明并非局限于仅用于示例目的的本文所述的具体实施方案的范围。如本文所述，功能上同等的产物、组合物和方法明显在本发明范围内。
在本说明书全文中，除非另有具体规定或上下文另外要求，当提到单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组时，应当包括一个以及多个（即一个或更多个）这些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组。
在下文将通过下列非限制性的实施例以及参照附图描述本发明。
附图说明
图1：有机磷酸酯杀虫剂的化学分类。
图2：通过野生型OpdA（OPA）和改良的变体（含N端Met的A900）降解有机磷（organophosphorus）杀虫剂二嗪农。
图3：三小时后在模拟的绵羊药浴溶液中，A900（含N端Met）和OpdA（OPA）的剂量率对二嗪农降解程度的影响。
图4：通过压力计量的呼吸计量法（manometric respirometry）测试评估A900（含N端Met）（菱形）和苯甲酸钠（三角形）的生物降解能力。A900对细菌呼吸的抑制也通过在苯甲酸钠和A900两者(正方形)存在下测量呼吸速率得以评估。
序列表注释：
SEQ ID NO:1--A900的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2--OpdA的氨基酸序列（移除N端28个氨基酸并添加N端Met的天然OpdA）。
SEQ ID NO:3--OpdA变体M4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4--OPH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5--N端添加Met的A900的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6--编码A900的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7--TAT信号肽。
具体实施方式
通用技术和定义
除非另有特别定义，本文所用的所有技术和科学术语应认为具有与本领域（例如，在细胞培养、分子遗传、免疫、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学）普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。
除非另有说明，本发明所使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术均为本领域技术人员公知的标准过程。此类技术通篇描述并阐述于如下来源的文献中，例如J.Perbal的APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)、J.Sambrook等的Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(编)的Essential Molecular Biology:A Practical Approach第一和第二卷，IRL Press(1991)、D.M.Glover和B.D.Hames(编)的DNA Cloning:A PracticalApproach第一至第四卷，IRL Press(1995和1996)）、以及F.M.Ausubel等(编)的CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止所有的更新版)、Ed Harlow和David Lane(编)的Antibodies:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)和J.E.Coligan等（编）的Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons（包括迄今为止所有的更新版）。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意思是“X和Y”或者“X或Y”，并且应认为对两个意思或任一个意思提供明确的支持。
如本文所用，除非与所述的相反，所述术语大约指特定值的+/-20%，更优选+/-10%，甚至更优选+/-5%。
在本说明书全文中的“包含（comprise）”一词或诸如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”的变体，应理解为意图包括所述的元素、整数或步骤，或是一组元素、整数或步骤，但并不排除任何其它元素、整数或步骤，或是其它组元素、整数或步骤。
如本文所用，术语“水解（hydrolyses）”、“水解（hydrolysing）”、“水解活性”及其变体指本发明的多肽催化化学键水解的能力。在优选的实施方案中，所述多肽“降解”有机磷酸酯，以使得所述酶活性的产物对例如哺乳动物和/或鱼毒性减低，和/或不如有机磷酸酯底物稳定。
如本文所用，术语“更强的有机磷酸酯水解活性”指本发明的多肽与之前已知多肽相比，对有机磷酸酯具有更高的二级速率常数（kcat/Km），所述之前已知多肽例如而非限制于氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、优选全部三个所示的多肽。在优选的实施方案中，术语“更强的有机磷酸酯水解活性”指本发明的多肽，其具有下列中一个或更多个、优选全部三个：
i)与氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、优选全部三个所示的多肽相比，针对甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二级速率常数(kcat/Km)，
ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、优选全部三个所示的多肽相比，针对二嗪农具有高至少1.5倍或2倍的二级速率常数(kcat/Km)，以及
iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、优选全部三个所示的多肽相比，对乙基对硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二级速率常数(kcat/Km)。
如本文所用，短语“在与氨基酸位相对应位置上”指氨基酸参照确定的氨基酸序列相对于周围氨基酸而言的相对位置。例如，在某些实施方案中，本发明的多肽可具有附加的N端氨基酸以协助细胞内定位或细胞外分泌，当比对例如SEQ ID NO:1时其改变所述氨基酸的相对位置。在一个实例中，根据进行的蛋白质比对，技术人员很容易理解在SEQ ID NO:1的氨基酸位置14上的脯氨酸是与SEQ ID NO:1的氨基酸位置15上的脯氨酸相对应的氨基酸。在一个实施方案中，所述多肽包含在指定的残基位上确定的氨基酸。
如本文所用，术语“处理/治疗（treating）”、“处理/治疗（treat）”或“处理/治疗（treatment）”包括施用治疗有效量的例如本发明的多肽、或其编码多核苷酸，其足以减少或消除至少一个由有机磷酸酯所导致的毒性症状。
本文所用术语“生物材料”在其最广泛意义上包括生物起源的任何产物。这样的产物包括，而非限制于用于人类食品和动物饲料。所述产品包括液体介质，其包括水和如牛奶的液体食物，以及如酸奶的半固体食物，等等。本发明也延伸至固体食物，特别是动物饲料。在一个实施方案中，生物材料优选为植物材料例如，而非限制于水果、蔬菜、甘蔗、油菜种子、小麦种子、大麦种子、高粱种子、水稻、玉米、菠萝或棉花种子。
如本文所用，术语“提取物”指包含本发明的多肽、优选也包含本发明的多核苷酸或载体的本发明的宿主细胞或非人类转基因生物的任何部分。所述部分可以是整体，如植物的种子、水果、叶、茎或根，或是通过至少部分均质化和/或纯化所获得。所述术语包括从宿主细胞分泌的部分，并因此包括培养上清。优选地，所述提取物是相对粗的提取物，其未经历纯化步骤将本发明的多肽从与其共产生的其它多肽中纯化出来。提取物也可以是含有本发明多肽的组合物。
有机磷酸酯
有机磷酸酯是合成的有机磷酯和相关的化合物，例如磷酰胺酸酯（phosphoroamidate）。其具有通式(RR'X)P=O或(RR'X)P=S，其中R和R'是短链基团。在磷酰胺酸酯中，R'是伯胺或仲胺。对于杀虫的有机磷酸酯，X是良好的离去基团（leavinggroup），其对于乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制是必需的。
本发明的多肽水解有机磷酸酯的磷酸酯键。所述有机磷酸酯可以具有芳香族或脂肪族离去基团(X)以及也可含有乙烯基基团（图1）。
优选地，所述有机磷酸酯的离去基团具有小于8的电离常数（pKa）(Jackson等，2009)。
尽管有机磷酸酯作为杀虫剂的用途是众所周知的，然而其也用作针对哺乳动物的神经毒气。因此，本发明的多肽也能够用于水解不是杀虫剂的有机磷酸酯。在具体优选的实施方案中，本发明的多肽用于水解O-乙基S-(2-二异丙胺)乙基-甲基硫代磷酸酯(VX)。
多肽
术语“多肽”和“蛋白质”一般可互换使用，其指可或不可通过添加非氨基酸基团而修饰的单个多肽链。应当理解，这样的多肽链可与其它多肽或蛋白或如辅因子的其它分子相结合。本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”也包括本文所述的多肽的变体、突变体、生物活性片段、和/或修饰。
通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析确定多肽的%同一性（GCG程序），空位插入罚分=5，以及空位延伸罚分=0.3。查询序列至少250个氨基酸长，并且GAP分析在至少250个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列至少300个氨基酸长，并且GAP分析在至少300个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，查询序列至少350个氨基酸长，并且GAP分析在至少350个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，GAP分析在两个序列的全长对其进行比对。
如本文所用“生物活性片段”是本文所述的多肽的一部分，其保留全长多肽所定义的活性。只要生物活性片段保留所定义的活性，其可以是任意尺寸。优选地，生物活性片段是至少300，优选至少350个氨基酸长。此外，生物活性片段指具有“有机磷酸酯水解活性”的片段。
对于所定义的多肽，应了解，高于上面所提供的%同一性的数字将包括优选的实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小%同一性数字，优选所述多肽包括与相关指定的SEQID NO具有至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，更优选至少99%，更优选至少99.1%，更优选至少99.2%，更优选至少99.3%，更优选至少99.4%，更优选至少99.5%，更优选至少99.6%，更优选至少99.7%，更优选至少99.8%，以及甚至更优选至少99.9%同一性的氨基酸序列。
对“基本纯化的”或“纯化的”，我们指的是已经从其天然状态所关联的一种或多种脂质、核酸、其它多肽或其它污染分子中分离出的多肽。优选地，所述基本纯化的多肽是至少60%，更优选地至少75%，以及更优选地至少90%不含其它天然关联的成分。虽然目前没有证据证明本发明的多肽存在于天然中，术语天然状态或天然关联的也包括本发明的宿主细胞所产生的多肽。
在提及多肽的上下文中术语“重组的”指当被细胞产生或在无细胞表达系统中产生时，相比其天然状态，具有改变的量或改变的速率的多肽。在一个实施方案中，所述细胞不是天然产生所述多肽的细胞。本发明的重组多肽包括没有从产生该多肽的转基因（重组）细胞、或无细胞表达系统的其它成分中分离出的多肽，以及在这样的细胞或无细胞系统中产生的、随后从至少一些其它成分中纯化出来的多肽。
通过在本文定义的核酸中引入合适的核苷酸改变，或通过体外合成所需的多肽，可以制备本文所述多肽的氨基酸序列突变体。此类突变体包括，例如氨基酸序列中的残基的删除、插入或取代。只要最终的多肽产物具有所需的特征，就可进行删除、插入和取代的组合以得到最终的构建体。
突变的（改变的）多肽可以使用本领域任何已知的技术制备，例如使用定向进化或合理设计的策略（见下文）。源自突变/改变的DNA的产物可使用本文所述技术容易地进行筛选，以确定其是否具有有机磷酸酯水解活性（参见，例如实施例1和2）。在另一个实例中，通过将有机磷酸酯溶解于约5%的甲醇中并使其与酶在pH8.0的50mM Tris-HCl中在25℃反应以测量有机磷酸酯水解活性。使用标准过程根据实际的有机磷酸酯测量酶活性。例如，以分光光度法通过监测在276nm处的吸光度的增加以测量毒死蜱(Dumas等，1989b)，而用放射性标记的二嗪农(乙基-1-14C；14.8MBq/mmol)通过曾经用于放射性标记的OP底物的放射分区分析可监测二嗪农的水解(Campbell等，1998)。
在设计氨基酸序列的突变时，突变位点的定位以及突变的性质取决于待修饰特征。可对突变位点进行单个或系列修饰，例如，通过(1)首先以可供选择的保守氨基酸进行取代，然后根据得到的结果进行更多基团的选择、(2)删除靶残基、或(3)在定位的位点附近插入其它残基。
氨基酸序列的删除通常为约1至15个残基，更优选地为大约1至10个残基且典型地为大约1至5个连续的残基。
取代突变为多肽分子中的至少一个氨基酸残基被去掉并在其原来的位置上插入一个不同的残基。目的位点是在其位点上获自各种株或物种的特定残基都相同的那些。这些位置可能对生物学活性是重要的。优选以相对保守的方式取代这些位点，特别是落入至少3个其它相等保守位点的序列中的那些。保守取代的实例见表1。
在优选的实施方案中，与本文特别定义的多肽相比，突变/变体多肽仅具有保守取代。
在优选的实施方案中，与本文特别定义的多肽相比，突变/变体多肽具有1个或2个或3个或4个保守氨基酸改变。保守氨基酸改变详细提供在表1中。优选地，如果没有特别指出，所述多肽在给定的氨基酸位置上包含SEQ ID NO:1所提供多肽的对应位置上所发现的氨基酸。
关于其它可进行的取代突变的指南描述于Yang等(2003)、Cho等(2004)，Horne等(2006)和Jackson等(2009)。
如果在指定位点上的氨基酸不符合表1所提供的氨基酸取代，则优选该指定氨基酸。
表1.示例性的取代
原有残基 示例性取代
Ala(A) val;leu;ile;gly;ser
Arg(R) lys
Asn(N) gln;his;
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn;his
Glu(E) asp
Gly(G) pro,ala
His(H) asn;gln
Ile(I) leu;val;ala
Leu(L) ile;val;met;ala;phe
Lys(K) arg
Met(M) leu;phe;
Phe(F) leu;val;ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr;ala
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp;phe
Val(V) ile;leu;met;phe,ala
在优选的实施方案中，本发明的多肽包含下列中的一个或更多个、优选全部：
i)在与SEQ ID NO:1的氨基酸26位相对应位置上的组氨酸，
ii)在与SEQ ID NO:1的氨基酸28位相对应位置上的组氨酸，
iii)在与SEQ ID NO:1的氨基酸140位相对应位置上的赖氨酸，
iv)在与SEQ ID NO:1的氨基酸172位相对应位置上的组氨酸，
v)在与SEQ ID NO:1的氨基酸201位相对应位置上的组氨酸，
vi)在与SEQ ID NO:1的氨基酸225位相对应位置上的精氨酸，
vi)在与SEQ ID NO:1的氨基酸228位相对应位置上的酪氨酸，以及
vii)在与SEQ ID NO:1的氨基酸272位相对应位置上的天冬氨酸。
在合成期间或合成后经不同修饰的本发明的多肽同样包括在本发明范围内，例如，通过生物素化、苄化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解切割、连接至抗体分子或其它细胞配体等。这些修饰可用于增强多肽的稳定性和/或生物活性。优选地，存在与SEQ ID NO:1的140位氨基酸相对应的位置上的赖氨酸，并且所述赖氨酸是氨甲酰基化的。
本文所述多肽可以多种方式产生，包括重组多肽的产生和回收、多肽的化学合成。在一个实施方案中，通过在有效产生多肽的条件下培养能够表达所述多肽的细胞、并回收所述多肽以产生本发明的分离的多肽。优选的培养细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但不限于允许多肽产生的有效的介质、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效的介质是指细胞能在其中培养以产生本发明的多肽的任何介质。这样的介质典型地包含一种水性的介质，其具有可同化的碳、氮和磷源、以及适量的盐、矿物质、金属和其它如维生素的营养物。本发明的细胞可在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板以及培养皿中培养。可在适合重组细胞的温度、pH和氧气含量下进行培养。这样的培养条件在本领域普通技术人员的专业知识中。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含能够指导多肽从细胞中分泌的信号序列。技术人员应理解，在信号序列部分离开细胞时，其可或不可被切割或被部分切割。然而，当去除信号序列时，细胞可产生具有如N端序列轻微不同的异质性多肽群。因此，术语“由……组成”包括由去除信号序列所产生的这样的变体。已分离出大量这样的信号序列，其包括N端和C端信号序列。原核和真核N端信号序列相似，已证明真核N端信号序列能够在细菌中行使分泌序列的功能。这样的N端信号序列的一个实例是细菌β-内酰胺酶信号序列，其是经深入研究的序列并且已被广泛应用于促进多肽分泌至外部环境中。C端信号序列的一个实例是大肠杆菌的溶血素A（hlyA）信号序列。信号序列的其它实例包括，而非限制于气单胞菌溶素、碱性磷酸酶基因（phoA）、壳多糖酶、内切壳多糖酶、α-溶血素、MIpB、支链淀粉酶、Yops以及TAT信号肽。
在一个实施方案中，所述信号序列是TAT信号肽(MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA(SEQ ID NO:7))，其中在所述多肽重组表达和分泌时，所述信号序列的大部分（如果不是全部）未被切割。在这个实施方案中，本发明的多肽由在N端具有SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:1组成。
定向进化
在定向进化中，对蛋白质进行随机诱变，并使用选择机制以选出具有所需性质的变体，如增加的有机磷酸酯水解活性。可随后进行又一轮的突变和选择。典型的定向进化策略包括三个步骤：
1）多样化：对编码感兴趣蛋白的基因进行随机突变和/或重组以构建基因变体的大文库。可通过易错PCR（参见，例如Leung,1989;Cadwell和Joyce,1992)、由脱氧核糖核酸酶I消化亲本模板制备的片段的池（pool）（Stemmer,1994a;Stemmer,1994b;Crameri等,1998;Coco等,2001）、简并的寡核苷酸（Ness等,2002,Coco,2002）、或者通过两者的混合、或者甚至通过未消化的亲本模板（Zhao等,1998;Eggert等,2005;Jézéquek等,2008）可构建变体基因文库，其常通过PCR组装。也可以通过同源或非同源重组在体内或体外重组的亲本序列制备文库（Ostermeier等，1999；Volkov等，1999；Sieber等，2001）。通过将感兴趣基因亚克隆至合适的载体中、再将所述载体转化进如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)的“突变”株中、并使转化的细菌增殖合适的代数也可构建变体基因文库。通过使感兴趣的基因经由DNA重排（DNA shuffling）也可构建变体基因文库（即通过随机片段化和重组装使选择的突变基因池进行体外同源重组），如Harayama（1998）所广泛描述。
2）选择：使用筛选或选择测试文库中是否存在具有所需特性的突变体（变体）。筛选使得能够通过手工鉴定和分离高性能（high-performing）的突变体，而选择自动排除所有无功能的突变体。筛选可包括在宿主生物或其部分中表达突变的多核苷酸、并分析有机磷酸酯水解活性的水平。
3）扩增：将在选择或筛选中鉴定的变体复制多倍，使研究人员能测序其DNA以明白发生了什么突变。
总之，这三个步骤被称为定向进化的一“轮（round）”。大多数实验将需要多于一轮。在这些实验中，前轮的“优胜者（winner）”在下一轮中被多样化以构建新的文库。在这个实验的结束时，使用生物化学方法表征所有进化的蛋白或多核苷酸突变体。
合理设计
基于已知关于蛋白结构和折叠的信息可以合理设计蛋白质。这通过从头设计（from scratch）（全新设计）或基于天然支架的重新设计（参见，例如，Hellinga,1997;以及Lu和Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins2,1153-1157(2007)）可完成。蛋白质设计典型地涉及鉴定折叠成给定或靶结构的序列，其可使用计算机模型完成。计算蛋白设计算法为折叠成靶结构时能量低的序列搜索序列构象空间。计算蛋白设计算法使用蛋白能量学模型以评估突变怎样影响蛋白结构和功能。这些能量函数典型地包括分子力学、统计学（即，基于知识的）、和其它经验项的组合。合适可用的软件包括IPRO（相互作用的蛋白的重新设计和优化）（Interative Protein Redesign andOptimization）、EGAD（用于蛋白设计的遗传算法）、Rosetta Design、Sharpen、和Abalone。
通过如Jackson等(2009)和Wu等(2000)所描述的关于OPD相关酶的结构/功能关系的可用信息可促进其它变体的合理设计。这样的研究已经证明维持某些氨基酸对功能的重要性，例如与SEQ ID NO:1的氨基酸26位相对应位置上的组氨酸、与SEQ ID NO:1的氨基酸28位相对应位置上的组氨酸、与SEQ ID NO:1的氨基酸140位相对应位置上的赖氨酸、与SEQID NO:1的氨基酸172位相对应位置上的组氨酸、与SEQ ID NO:1的氨基酸201位相对应位置上的组氨酸、与SEQ ID NO:1的氨基酸225位相对应位置上的精氨酸、与SEQ ID NO:1的氨基酸228位相对应位置上的酪氨酸、以及与SEQ ID NO:1的氨基酸272位相对应位置上的天冬氨酸。
多核苷酸
如本文所用，“分离的多核苷酸”指一种多核苷酸，其至少部分地从与其在天然状态下有关联的或是连接的多核苷酸序列中分离出来。分离的多核苷酸包括DNA和RNA分子、以及DNA和RNA组合的分子。其可以是单链、双链或部分双链，以及相对于启动子可以是正义或反义方向。优选地，所述的分离的多核苷酸至少60%，优选至少75%，以及最优选至少90%脱离与其天然关联的其它成分。此外，术语“多核苷酸”在本文与术语“核酸”可相互替代。
在多核苷酸的背景下，术语“外源的”指当存在于细胞或无细胞表达系统时，与其天然状态相比改变的量的多核苷酸。在一个实施方案中，所述细胞是天然不含有多核苷酸的细胞。然而，所述细胞可以是包含导致所编码的多肽产量改变（优选提高）的非内源多核苷酸的细胞。本发明的外源多核苷酸包括没有从其所存在的转基因（重组）的细胞或无细胞表达系统的其它成分中分离出的多核苷酸、以及在这种细胞或无细胞系统所产生的并随后从至少某些其它成分中纯化出来的多核苷酸。
通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析确定多核苷酸的%同一性（GCG程序），其中空位插入罚分=5，以及空位延伸罚分=0.3。除非另有说明，查询序列至少45个核苷酸长，并且GAP分析在至少45个核苷酸的区域对两个序列进行比对。优选地，查询序列至少150个核苷酸长，并且GAP分析在至少150个核苷酸长的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列是至少300个核苷酸长，并且GAP分析在至少300个核苷酸长的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，GAP分析在两个序列的全长对其进行比对。
与本文提供的分子相比，本发明的多核苷酸可具有一个或多个突变，其可以是核苷酸残基的删除、插入或取代。突变体可以是天然存在的(也就是说，是自天然来源中分离的)或是合成的(例如，通过在核酸上进行定点诱变)。
通常，多核苷酸单体通过磷酸二酯键或其类似物相连接。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯（phosphorodiselenoate）、苯胺基硫代磷酸酯（phosphoroanilothioate）、苯胺基磷酸酯、以及氨基磷酸酯。
重组载体
本发明的一个实施方案包括重组载体，其包括至少一种本发明的分离/外源的多核苷酸，其被插入至任何能够将该多核苷酸分子递送至宿主细胞的载体。这种载体含有异源性多核苷酸序列，异源性多核苷酸序列是在天然不与本发明的多核苷酸分子邻近的多核苷酸序列，且优选地源自除了产生所述多核苷酸分子的物种之外的物种。所述载体可以是RNA或DNA、原核的或真核的，且典型地是转座子（如US5,792,294所述）、病毒或质粒。
一种类型的重组载体包含了可操作地连接于表达载体的多核苷酸。短语可操作地连接，指多核苷酸分子以使得所述分子在转化入宿主细胞时能够表达的方式插入表达载体。如本文所用，表达载体是能够转化宿主细胞并实现特定多核苷酸分子的表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体还能够在宿主细胞内进行复制。表达载体可以是原核的或真核的，且典型地是病毒或质粒。表达载体包括任何在重组细胞中起作用(即指导基因表达)的载体，所述的重组细胞包括细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、动物以及植物细胞。本发明的载体也可用于在无细胞表达系统中生产多肽，这样的系统为本领域所公知。
本文所用的“可操作地连接”指在两个或更多核酸（如DNA）区段之间的功能性关联。通常，其指转录调节元件与转录序列的功能性关联。例如，如果一个启动子促进或调节编码序列（例如本文所定义的多核苷酸）在合适的宿主细胞和/或在无细胞表达系统的转录，则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节元件与所述转录序列物理上连续的，即，其是顺式作用。然而，一些转录调节元件，例如增强子，不需要与其增强转录的编码序列物理上连续或紧密定位。
特别是，本发明的表达载体含有调节序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点、以及其它与该重组细胞相容并能对本发明的多核苷酸分子的表达进行控制的调节序列。具体地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。合适的转录控制序列包括能够在至少一种本发明的重组细胞内起作用的任何转录控制序列。各种这样的转录控制序列为本领域技术人员所公知。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物、线虫、植物或动物细胞中起作用的那些，例如，但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌体、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白（metallothionein）、α-结合因子、毕赤乙醇氧化酶、甲病毒属（alphavirus）亚基因组启动子(例如Sindbis病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾（Heliothis zea）昆虫病毒、痘病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间体早期启动子)、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复序列、Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）、热休克、磷酸酯/盐和硝酸酯/盐转录控制序列以及其它能够在原核或真核细胞中控制基因表达的序列。
宿主细胞
本发明的另一实施方案包括含有用一种或多种本文描述的重组分子转化的宿主细胞或其后代细胞。通过可将多核苷酸分子插入细胞的任何方法可实现将多核苷酸分子转化入细胞。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂质转染（lipofection）、吸附作用以及原生质体融合。重组细胞可保持为单细胞，或可长成组织、器官或多细胞生物。转化的本发明的多核苷酸分子可保持在染色体外、或以保留其能够被表达的方式整合入所述转化(即重组)细胞的染色体上的一个或多个位点。
适于进行转化的宿主细胞包括可用本发明的多核苷酸进行转化的任何细胞。本发明的宿主细胞既可以能够内源地(即天然地)产生本文所述的多肽，也可以能够在转化至少一种本文所述的多核苷酸分子后产生这样的多肽。本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本文所定义的蛋白的任何细胞，包括细菌、真菌（包括酵母）、寄生虫、线虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌属（Salmonella）、埃希氏菌属（Escherichia）、杆菌属（Bacillus）、利斯特氏菌属（Listeria）、酵母属（Saccharomyces）、夜蛾属（Spodoptera）、分枝杆菌属（Mycobacteria）、粉纹夜蛾属（Trichoplusia）、BHK(仓鼠幼崽肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(如COS-7)细胞、以及Vero细胞。宿主细胞的其它实例是大肠杆菌（E.coli），包括E.coli K-12衍生物；伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）；鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），包括减毒株；草地夜蛾（Spodopterafrugiperda）；粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）；以及非致瘤小鼠成肌细胞G8细胞(如ATCCCRL1246)。有用的酵母细胞包括毕赤酵母属（Pichia sp）、曲霉属（Aspergillus sp）、和酵母属（Saccharomyces sp）。特别优选的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞。
在一个实施方案中，所述细胞适于发酵。用于发酵的细菌细胞的实例包括，但不限于埃希氏菌属（Escherichia sp）（如大肠杆菌）、杆菌属（Bacillus sp）（如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis））、乳杆菌属（Lactobacillus sp）（如短乳杆菌（Lactobacillus brevis））、假单胞菌属（Pseudomonassp）（如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa））和链霉菌属（Streptomyces sp）（浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans））。用于发酵的真菌细胞的实例包括，但不限于，假丝酵母（Candida sp）（如白色念珠菌（Candida albicans））、汉森酵母属（Hansenula sp）（如多形汉森酵母（Hansenula polymorpha））、毕赤酵母属（Pichia sp.）（毕赤酵母（Pichiapastoris））、克鲁维酵母属（Kluveromyces sp）（例如马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus））和酵母属（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））。
重组DNA技术可用于改善所转化的多核苷酸分子的表达，例如，通过操控多核苷酸分子在宿主细胞内的拷贝数、那些多核苷酸分子转录的效率、其所得转录物的翻译的效率、以及翻译后修饰的效率。用于增强本发明的多核苷酸分子的表达的重组技术包括，但不限于将多核苷酸分子可操作地连接于高拷贝数的质粒、将多核苷酸分子整合进一个或多个宿主细胞染色体中、为质粒加入载体稳定序列、对转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)进行取代或修饰、对翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)进行取代或修饰、修饰本发明的多核苷酸分子以符合宿主细胞的密码子用法、以及删除使转录物不稳定的序列。
转基因植物
本文所用术语“植物”作为名词指的是全植物，比如例如生长在田间用于商用植物（commercial plant）或谷物生产的植物。“植物部分”指营养性（vegetative）结构（如叶、茎）、根、花器官/结构、种子（包括胚、胚乳和种皮）、植物组织（例如微管组织、基本组织等等）、细胞及其后代。
“转基因植物”指的是含有在相同的种、变种或品种的野生型植物中没有发现的基因构建体（“转基因”）的植物。本文所指的“转基因”在生物技术领域具有标准意义，其包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变的并被导入至植物细胞的遗传序列。所述转基因可包括源自植物细胞的遗传序列。通常，转基因通过人工操作导入植物，如例如通过转化，但是如本领域技术人员所承认的，任何方法都可以被使用。
本发明上下文中所限定的转基因植物包括植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代，其已经用重组技术进行遗传修饰以使得在所需的植物或植物器官中产生至少一种本发明的多肽。可使用本领域已知的技术生产转基因植物，例如通常描述于A.Slater等人，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford UniversityPress(2003)以及P.Christou和H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wileyand Sons(2004)的那些技术。
在优选的实施方案中，所述转基因植物对于每一个已被导入的基因（转基因）都是纯合的，以使得其后代在所需表型上不分离。所述转基因植物对于导入的转基因也可是杂合的，如例如在从杂交种子中长出的F1后代。这样的植物能提供本领域公知的优点，如杂种优势。
在本发明实施中预期使用的植物包括单子叶植物和双子叶植物两者。目标植物包括，但不限于下列：谷类（例如、小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米、高粱和相关作物）；甜菜（糖用甜菜和饲料甜菜）；梨果、核果和软果（苹果、梨、李子、桃子、杏、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓）；豆科植物（菜豆、小扁豆、豌豆、大豆）；油料植物（花生、油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生）；黄瓜属植物（西葫芦、黄瓜、甜瓜）；纤维植物（棉花、亚麻、大麻、黄麻）；柑橘类水果（橙、柠檬、葡萄柚、柑橘）；蔬菜（菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、马铃薯、辣椒）；樟科（鳄梨、肉桂、樟脑）；或植物如烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、藤本植物、蛇麻草（hops）、草坪（turf）、香蕉和天然橡胶植物、以及观赏植物（花卉、灌木、阔叶树和常绿植物、如针叶树）。常受曲霉属感染影响的作物是本发明的靶植物，包括但不限于谷类（玉米、高粱、珍珠粟、水稻、小麦），油料种子（花生、大豆、向日葵、棉花），香料（智利辣椒、黑胡椒、芫荽、姜黄、姜），以及木本坚果（杏仁、开心果、核桃、椰子）。在优选的实施方案中，所述植物选自糖、棉花、玉米、高粱、菠萝、针叶树（如圣诞树）、桉树、小麦、燕麦、大麦、水稻和芸苔。
本发明的多核苷酸可组成型地表达于转基因植物的所有发育阶段。依所用的植物或植物器官，多肽可以阶段特异性的方式表达。此外，多核苷酸可以组织特异性地表达。
已知的或发现的可使得植物表达一种编码目的蛋白的基因的调节序列可以用于本发明。依据目的靶植物和/或靶器官而选择所用的调节序列。这样的调节序列可获自植物或植物病毒中，或是通过化学合成。本领域技术人员公知此类调节序列。
许多适合稳定转染植物细胞或用于建立转基因植物的载体已描述于，例如Pouwels等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985，增刊，1987;Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；以及Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。通常，植物表达载体包括，例如在5’和3’调节序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因，以及显性的可选择标记。这样的植物表达载体也可包含启动子调节区（例如，控制可诱导的或组成型的、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性表达的调节区域）、转录起始的开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
许多在植物细胞中有活性的组成型启动子已得到描述。在植物中组成型表达的合适启动子包括，但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑病毒启动子、来自核酮糖-1,5-二-磷酸羧化酶小亚基的光诱导启动子、水稻细胞溶质磷酸丙糖异构酶启动子、拟南芥腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露碱合酶和章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合物启动子以及叶绿素α，β结合蛋白基因启动子。这些启动子已用于构建在植物中已表达的DNA载体，参见如WO84/02913。所有这些启动子已用于构建各种类型的植物可表达的重组DNA载体。
为在植物源组织（如叶、种子、根或茎）中表达，优选在本发明中使用的启动子在这些特异性组织中具有相对高的表达。为此目的，可以选择具有组织或细胞特异或增强表达的基因的一些启动子。文献中报道的这样的启动子的实例包括来自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、来自小麦的叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶启动子、来自马铃薯的核光合ST-LS1启动子、来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡糖淀粉酶（CHS）启动子。同样报道在光合活性组织中有活性的是来自落叶松(Larix laricina)的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶启动子、来自松树的Cab基因Cab6的启动子、来自小麦Cab-1基因的启动子、来自菠菜Cab-1基因的启动子、来自水稻Cab1R基因的启动子、来自玉米的丙酮酸、正磷酸双激酶(PPDK)启动子、烟草Lhcb1*2基因的启动子、拟南芥Suc2蔗糖-H30协同启动子、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白基因(PsaD、PsaF、PsaE、PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)启动子。
为在植物的库组织（sink tissue）中表达，例如马铃薯植株的块茎，番茄的果实，或大豆、芸苔、棉花、玉米、小麦、水稻和大麦的种子，优选本发明中使用的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。己知许多具有块茎特异或增强表达的基因启动子，包括I型马铃薯块茎储藏蛋白（palatin）启动子、马铃薯块茎ADPGPP基因的启动子、蔗糖合酶大小亚基的启动子、包括22kD蛋白复合物和蛋白酶抑制剂在内的主要块茎蛋白的启动子、颗粒结合淀粉合酶基因（GBSS）的启动子以及其它I型和II型马铃薯块茎储藏蛋白启动子。其它启动子也可以用于在特定的组织中表达蛋白质，例如种子或果实。可以使用β-伴大豆球蛋白启动子或其它种子特异性启动子，例如油菜籽蛋白（napin）和菜豆球蛋白启动子。用于玉米胚乳表达的特别优选的启动子是来自水稻谷蛋白基因的启动子，更尤其是Osgt-1启动子。
也可使用根特异性启动子。这样启动子的实例是酸壳多糖酶基因的启动子。通过使用已鉴定的CaMV35S启动子的根特异性亚结构域也可实现在根组织中的表达。
5’非翻译前导序列可以来源于所选用于表达本发明的多核苷酸异源基因序列的启动子，如果需要的话其可被特异性修饰以提高mRNA的翻译。对优化转基因表达的综述参见Koziel等(1996)。5’非翻译区也可以获自植物病毒RNA（其中烟草花叶病毒、烟草蚀纹病毒、玉米矮花叶病毒、苜蓿花叶病毒）、合适的真核基因、植物基因（小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导）、或获得自合成的基因序列。
通过在嵌合载体中将3’非翻译DNA序列可操纵地连接于感兴趣的多核苷酸而实现转录的终止。重组DNA分子的3’非翻译区包含在植物中有功能的多聚腺苷酸化信号，导致在RNA的3’末端添加腺苷酸核苷酸。3’非翻译区可以获自在植物细胞中表达的各种基因。在这方面通常使用胭脂碱合酶3’非翻译区、来自豌豆Rubisco基因小亚基的3’非翻译区、来自大豆7S种子贮藏蛋白基因的3’非翻译区。包含土壤农杆菌（Agrobacterium）肿瘤诱导（Ti）质粒基因的多聚腺苷酸化信号的3’转录、非翻译区也是合适的。
已描述四种将基因直接递送至细胞的通用方法：（1）化学方法(Graham等，1973)；（2）物理方法，如显微注射(Capecchi,1980)；电穿孔(参见，例如WO87/06614,US5,472,869、5,384,253、WO92/09696和WO93/21335)；以及基因枪（参见，例如US4,945,050和US5,141,131)；（3）病毒载体(Clapp,1993;Lu等，1993;Eglitis等，1988)；和（4）受体介导的机制(Curiel等，1992;Wagner等，1992)。
可使用的加速方法包括，例如微弹轰击（基因枪转化法，microprojectilebombardment）等。将核酸分子递送转化至植物细胞的方法的一个实例是微弹轰击。这种方法已综述于Yang等，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,OxfordPress,Oxford,英国(1994)。非生物颗粒（微弹）用核酸包被并通过推进力递送至细胞。示例性颗粒包括由钨、金、铂等组成的那些。除了作为可再生地转化单子叶植物的有效手段外，微弹轰击的一个特别优势是既不需要分离原生质体，也没有农杆菌感染的易感性。通过加速将DNA递送至玉米细胞的方法的说明性实施方案是基因枪α颗粒递送系统，其可以将DNA包被的颗粒推过格网（例如不锈钢或Nytex格网），到达覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤器表面。适于本发明使用的颗粒递送系统是可从Bio-Rad Laboratories获得的氦加速PDS-1000/He枪。
农杆菌介导的转运是广泛应用的将基因导入植物细胞的系统，因为DNA可被导入全植物组织，因此避免了需要从原生质体再生为完整植物。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞是本领域公知的（参见，例如US5,177,010、US5,104,310、US5,004,863、US5,159,135）。此外，T-DNA的整合是相对精确的过程，几乎不造成重排。待转运的DNA区域由边界序列限定，插入DNA（intervening DNA）通常插入植物基因组。
还可以理解，两种不同的转基因植物还可以交配产生含有两种独立分离的外源基因的后代。合适的后代自交可产生两个在外源基因上都纯合的植物。也考虑与亲本植物回交和与非转基因植物侧交（out-crossing）作为营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的说明可见于Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编,American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔、以及这些处理的组合的方法实现植物原生质体的转化。这些系统在不同植物品种的应用取决于具体植株从原生质体中再生的能力。谷物从原生质体中再生的说明性方法已有描述（Fujimura等,1985;Toriyama等,1986;Abdullah等,1986）。
也可以使用其它细胞转化的方法，包括但不限于通过直接DNA转运到花粉、通过将DNA直接注射进植物生殖器官、或通过将DNA直接注射进未成熟胚的细胞随后将干燥的胚再水化，将DNA导入植物。
含有外来的、异源基因的植物的发育或再生是本领域公知的。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。否则，将获得自再生植物的花粉杂交至农艺学上重要品系的从种子长出的植物。反过来，来自这些重要品系的植物的花粉用于对再生植物授粉。包含所需异源核酸的本发明的转基因植物使用本领域技术人员公知的方法培育。
为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在，可以使用本领域技术人员公知的方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。转基因的表达产物取决于产物的特性可以用多种方法中的任何一种检测，包括western印迹和酶分析。一个特别有用的定量蛋白质表达和检测在不同植物组织的复制的方法是使用报告基因，例如GUS。一旦获得转基因植物，就可以种植这些植物，产生具有所需表型的植物组织或部分。可以收获所述植物组织或植物部分，和/或收集种子。所述种子可以充当种植具有所需特性的组织或部分的额外植物的来源。
组合物
本发明的组合物包括赋形剂，在此也称为“可接受的载体”。赋形剂可以是待处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括土壤和水样本)能够耐受的任何材料。这种赋形剂的实例包括水、盐水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液、Hank氏溶液、以及其它的水性生理平衡的盐溶液。非水性载体，例如也可使用固定油（fixed oils）、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的制剂包括含有粘性增强剂（例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖）的悬液。赋形剂也可含有小量的添加剂，例如增强等渗性（isotonicity）和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、重碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的实例包括硫汞撒（thimerosal）或o-甲酚、福尔马林和苯甲基醇。赋形剂还可用来增加组合物的半衰期，例如，但不限于聚合的控释载体、生物可降解植入体、脂质体、细菌、病毒、其它细胞、油、酯、以及甘油。
在一个实施方案中，本发明的多肽固定在固体支持物上。这可提高有机磷酸酯的水解率和/或程度、和/或增加多肽的稳定性。例如，多肽可以固定在聚氨酯基质上（Gordon等,1999）或包囊到合适的脂质体中(Petrikovics等，2000a和b)。多肽也可加入到包含泡沫剂的组合物中，例如通常用于消防的泡沫剂(LeJeune等，1998)。本领域人员能够理解，本发明的多肽可以被轻易地用于海绵剂或泡沫剂，如WO00/64539中所公开。其它用于本发明的固体支持物包括具有丙烯酸型结构、具有环氧官能团的树脂，例如Sepabeads EC-EP(Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)和Eupergit C(Rohm-Degussa)，或者具有伯胺基团的树脂，例如Sepabeads EC-has和EC-EA(Resindion srl--MitsubishiChemical Corporation)。无论如何，通过官能团(环氧化合物)的高反应性、或使用如戊二醛的双功能试剂使树脂活化，使多肽与树脂接触并得以固定，以便酶结合在基质上。其它适合本发明的树脂是聚苯乙烯树脂、大孔型树脂和具有碱性官能团的树脂，例如SepabeadsEC-Q1A:多肽被吸在树脂上，并通过使用双功能试剂（戊二醛）的交联得以稳固。
本发明的酶为活性需要阳离子。因此，如果待处理样本没有足够水平的阳离子，则需要添加。合适的阳离子的实例包括，但不一定限于Zn2+、Fe2+、Co2+、Cd2+或其中两个或更多个的组合。
本发明的一个实施方案是一种控释制剂，其能够将本发明的组合物缓慢释放入动物、植物、动物或植物材料、或是环境中(包括土壤和水样本)。如本文所用，控释制剂包含在控释载体中的本发明的组合物。合适的控释载体包括、但不限于生物相容性聚合物、其它聚合基质、胶囊、微胶囊、微颗粒、弹丸制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球体（liposphere）、以及经皮递送系统。优选的控释制剂是可生物降解的(即生物可腐蚀的（bioerodible）)。缓释组合物在流动的水中使用特别有用。
本发明的优选的控释制剂能够将本发明的组合物释放入含有有机磷酸酯区域的土壤或水中。该制剂优选地在一段大约1到约12个月的时间内释放。本发明的优选的控释制剂能够实现处理优选至少约1个月，更优选至少约3个月，甚至更优选至少约6个月，甚至更优选至少约9个月，以及甚至更优选至少约12个月。
在替代的实施方案中，所述组合物是干燥的组合物。更优选地，表达本发明多肽的细胞（如细菌细胞）的干燥的提取物。优选地，所述细胞提取物在干燥前经部分纯化，例如实施例1所述。液体组合物可使用本领域所知的任何技术干燥，例如，而不限于冷冻干燥、喷雾干燥和滚筒干燥。所述干燥的组合物可用作液体的添加剂，所述液体含有至少部分将被净化的有机磷酸酯，例如水坝水、市政废水、动物药浴（dip）、产品(如蔬菜或水果)药浴、或用于机械/设备的清洗液。
使用本发明的多肽可以以一或多个废水处理单位处理废水，其可包括方法，例如筛选、沉淀、活性污泥法、表面曝气池、滤床、氧化床、曝气生物滤池、膜生物反应器、生物转盘接触器、过滤、曝气塘（lagooning）、去营养物、脱氮、除磷、消毒等等。在一个实施方案中，本发明的多肽固定在滤床中。
用于产生能水解有机磷酸酯的有效组合物所需的本发明的多肽、载体或宿主细胞等的浓度，将取决于待净化的样本的性质、样本中的有机磷酸酯的浓度、以及该组合物的制剂。组合物中的多肽、载体或宿主细胞等的有效浓度可通过使用本发明的方法经实验容易地确定。在优选的实施方案中，使用约6至20g/L，更优选地约8至15g/L，以及甚至更优选地约10g/L的多肽。
本发明的酶、和/或编码其的宿主细胞可用于包衣组合物，如通常描述于WO2004/112482和WO2005/26269。
生物传感器
生物传感器是分析装置，其典型地由一种生物学活性材料（例如酶）和一种将生化反应转化为可定量的电信号的传感器构成，所述电信号可被加工、传输和测量。Rekha等(2000)提供了用于检测有机磷化合物的生物传感器的综述。本发明的多肽可容易地适合用在此类生物传感器中。
实施例
实施例1--OpdA变体A900相较于OpdA具有增加的活性
酶生产
构建包含编码区的质粒，所述编码区含有编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SEQID NO:6核苷酸序列。将在甘油中储存的大肠杆菌BL21(DE3)培养物移出，并用编码所述酶的质粒DNA进行转化。从转移平皿上刮下一些大肠杆菌菌落，将其浸入营养介质中，并在37℃孵育（初级种（Primary seed））。将在某细胞浓度的小量加入至含有500mL介质的烧瓶中。相似地，孵育二级种，并将其在某个细胞浓度中合并，并用作发酵罐（1,000L）的接种物。
用定义的组合物的营养介质（600L）填充1,000L发酵罐，接着在121℃灭菌1小时。在灭菌后，将介质调至pH7并加入接种物以起始发酵。控制温度、pH、溶解氧（气流和搅拌）和碳水化合物添加的条件以促进介质组分转换成有用的生物质。
将收集的细胞稀释至2000L。使用持续的匀浆器将细胞破碎，并将酶释放至液体中。通过离心匀浆去除细胞碎片，并将上清收集在罐中。这在连续离心机中操作。澄清的上清从罐中抽出，经过过滤串（filtration train）再进入罐。所述串由三个深滤器和0.65μm标称额定值的Milligard滤器组成。在这个阶段的总体积是2,000L。
使用30kD分子截止（cut-off）膜将产物浓缩至150L。为确保无GMO的产物，通过0.2μm绝对过滤器将浓缩的产物过滤。将最终过滤产物收集在200L容器中，并冻干。在又一次发酵中，使用同样的程序以产生OpdA多肽(WO2002/92803)。每批产生大约20kg(OpdA)和25kg(A900)冻干物质。
酶活性
绵羊药浴
通过在模拟的绵羊药浴溶液中进行测试，将有机磷酸酯水解酶变体（A900）(SEQID NO:1)的效力与其母体(parent)(OpdA;OPA)(SEQ ID NO:2)进行比较。进行了两个实验。使用自来水、9g/L的绵羊粪便和14g/L的碱性粘土制备模拟的绵羊药浴溶液。在水中首先加入含有二嗪农的制剂再加入固体，这是其在实地发生的顺序。在这个实验中检测限是<0.05mg/L。
第一个实验（图2）测量以OPA和A900的两个剂量率(0.5g/100L和5g/100L)在16小时的时间段内二嗪农在模拟药浴溶液中的降解。在所述模拟溶液中起始二嗪农浓度是530mg/L。
在低剂量率，野生型OpdA在1、4和16小时后分别水解了11%、35%和94.7%，然而A900变体在相同时间段分别水解了35%、80%和99.96%。因为35%的水解作用通过低剂量率的野生型在4小时实现、而通过在相同剂量率的变体在1小时实现，其表明变体水解二嗪农比野生型至少快4倍。
在高剂量率(5g/100L)，野生型酶在1、4和16小时后分别水解了70%、99.3%和99.6%。A900变体在1、4和16小时后分别水解了95%、99.9%和99.99%。这个结果证实，A900变体相比野生型酶具有更好的二嗪农水解率。
在第二个实验中，A900和野生型酶的剂量率不同，并在3小时孵育后评估二嗪农降解的程度（图3）。二嗪农起始的浓度是100mg/L。在最低剂量率(1g/100L)时，野生型OpdA降解样本中90%的二嗪农，而A900变体降解>99%的二嗪农，这符合通过变体酶提高的水解率。随着剂量率的增加，变体酶相对野生型保持较大的对数水解率，证实与野生型相比提高的降解率。
废水处理
OP杀虫剂在农业和园艺作物中广泛用于减少虫害。在灌溉种植的情况下，显著比例的OP污染物常随着灌溉废水被冲进排水或拦截沟渠中，从其中各种二次污染的场景可接踵而来。
在2001，报告使用OpdA处理OP污染废水的第一个实地试验，其中仅在10分钟内实现＞90%的OP浓度减少（Russell等，2001）。在这个早期试验和也在随后的试验中，将OpdA的浓缩液以确定最终U/L剂量率的比率（正如其进入排水沟时的比率）“放”入流动的废水中。在Coleambally,NSW(2007)进行的实地试验中，使用7、35或70U/L OpdA处理55mg/L毒死蜱所污染的废水。全部三种剂量方案在最低剂量率时在2小时和在最高剂量率时在15分钟以内都实现了＞99%的OP降解。
在Gustine（加利福尼亚），使用低剂量率(0.59U/L)来处理在来自苜蓿作物的废水中的低水平的毒死蜱污染(2.24mg/L)。即使使用这种低剂量率，仅仅3小时就实现93%的毒死蜱降解。废水处理有严格时限（因为在这些情况下，通常有必要在有问题的水离开农田进入公共水道前实现实质的解毒作用），因此不可通过允许较长的反应时间而减少OpdA的剂量率。从实地试验数据来看，为在2小时以内实现大于99%的毒死蜱降解，似乎需要在0.59与7U/L之间的剂量率。
这些实地试验表明，使用OpdA可实现显著的废水净化。同样地，使用A900也将产生显著的废水净化。
土壤处理
使用OP处理农作物也可污染土壤，其可导致地下水的污染。因此，游离酶生物修复的潜在应用是处理污染的土壤。
已在澳大利亚(Nagambie,Victoria)进行在土壤处理中使用OpdA的试验。用二嗪农(Country Diazinon;500g/L)以2L/ha的比率处理杏树，从而导致在第一个1cm深的表层土中平均6.4mg/kg的二嗪农浓度。在应用杀虫剂后1小时，以250,500或1000g/ha(在1000L/ha的水体积中)应用OpdA。在OpdA应用后1小时所取的样本中，观察到二嗪农39%(250g/ha)、61%(500g/ha)和77%(1000g/ha)的减少。同样地，使用A900产生显著的土壤OP净化。在制剂中包含表面活性剂预计以允许在土壤中降解更多OP。
商品处理
商品的收获后污染也是一个问题。许多政府在国产和进口商品上实施严格的最大残余限量(MRL)。这些限制具有对种植者的严重经济影响，其可对商品交易构成显著约束。使用生物修复对商品进行收获后处理，可帮助减少污染。
在使用杀螟硫磷、二嗪农、毒死蜱和稻丰散处理的茄子、番茄和芒果中已进行了OpdA试验。处理茄子5分钟后，获得在毒死蜱水平上减少多达40%以及在二嗪农浓度上减少多达35%。在15分钟处理后，在茄子和番茄上的杀螟硫磷的残留分别减少了53%和12%，以及在茄子和番茄上的稻丰散残留分别减少了66%和53%。在芒果皮上的稻丰散和二嗪农残留分别减少了21%和24%。同样地，A900在减少商品的OP污染上是有用的。
实施例2-与OpdA、OPH以及在文献中具有最强甲基对氧磷降解能力的OpdA变体 （M4）相比，A900具有改善的稳态动力学
针对通过Jackson等(2006)所述的方法所纯化的酶(OPH、OpdA、OpdA900(进一步含有N端Met的SEQ ID NO:1)和OpdA M4)获得kcat/KM值。OPH是来自缺陷假单孢菌（Pseudomomas dimuta）的替代有机磷酸酯水解酶(Dumas等1989b)。OpdA900和OpdA M4是OpdA的变体。M4是OpdA的变体，其具有针对OP杀虫剂甲基对氧磷所测试的最大的报告活性(Jackson等，2009)。M4与野生型OpdA具有98.8%的同一性，A900与野生型OpdA具有98.5%的同一性，以及M4与A900具有98.8%的同一性（表2）。
表2.在本研究中调查的OpdA变体的百分比同一性
序列 OpdA M4 A900
OpdA 100.0 98.8 98.5
M4 98.8 100.0 98.5
A900 98.5 98.5 100.0
通过使用Nanodrop ND1000分光光度计(ThermoFisher Scientific)并利用29,280M-1.cm-1的摩尔消光系数在280nm处的紫外吸收测量蛋白质浓度(Jackson等，2006)。
在25℃，在含有100mM CoCl2的MOPS缓冲液(pH8.0)中使用紫外可见光谱在250nm(二嗪农)、330nm（乙基毒死蜱和甲基毒死蜱）和405nm（乙基对硫磷和甲基对硫磷）处确定水解率。使用SpectraMax M5分光光度计(Molecular Devices)监测产物的形成。针对每种酶在5、10、25、50、75、100和200μM浓度的各底物获得水解率，以及使用Lineweaver-Burke方法获得其KM和V最大值。通过将V最大值除以在分析中的酶浓度确定酶的kcat值（表3）。
表3.OPH、OpdA、A900和M4对工业相关的OP杀虫剂的稳态动力学。下划线表示每种杀虫剂的最高kcat/KM值
kcat，催化常数(sec-1)；KM，米氏常数(μM)；kcat/KM，二级速率常数(sec-1.M-1)。
表4.OpdA的生态毒性和哺乳动物毒性
A900具有针对二嗪农、甲基毒死蜱和乙基对硫磷所检测的最高的酶二级速率常数，同时维持针对乙基毒死蜱的76.2%的最快酶活性，以及针对甲基对硫磷的71.9%的最快酶活性。
实施例3-OpdA和OP代谢物的毒性
OpdA的毒性
在正式的毒性研究中使用Wistar大鼠确定OpdA对哺乳动物的毒性（表4）。将OpdA以50、200和1000mg/kg每天的剂量率喂饲动物28天（口服）或者以4mL/kg的500mg/mL溶液每天的剂量率经皮应用于动物15天（经皮）（表4）。活组织检查显示在大鼠中口服OpdA应用无明显有害效应，同时经皮应用产生无临床效应的轻微皮肤刺激。
通过将OpdA以1g/L应用至活性污泥、以及以100mg/L应用至藻淡水藻（Scenedesmus subspicatus）的培养物、节肢动物大型蚤（Daphnia magna）和鱼物种斑马鱼（Brachydanio rerio）以检验OpdA的环境毒性，未在任何这些指示物种中发现副作用（表4）。作为生物修复与许多成功实地试验中的酶功效相比，在这些毒性和生态毒性研究中所用的剂量率更高，表明其可用于环境应用中而无不良环境影响。
也用OpdA的生物降解能力的研究来补充其生态毒理学研究（图4）。在这个研究中，在压力计量的呼吸计量测试中评估OpdA的消化率，从而基于以OpdA提供为碳源的活性污泥的生物需氧量来计算消化的OpdA量。使用等量的碳作为阳性对照，所述碳以容易消化的化合物苯甲酸钠的形式提供。这个测试的结果是大于95%的OpdA和苯甲酸钠两者都在15天期间被消化，显示OpdA容易被降解。此外，当同时加入苯甲酸钠和OpdA时，生物需氧量没有减少，这表示当OpdA不是唯一碳源时，其对细菌生长无抑制性影响。通过使用甲基对硫磷的水解作用作为在样本中相对剩余量的指示，OpdA在天然水中的稳定性也得到监测（表5）。在这个实验中，OpdA的半衰期是79小时，其中在7天后具有少于百分之一的原始活性剩余。这些数据表示，OpdA是可生物降解的，并在天然体系中具有相对短的半衰期。使用A900的实验表明其与OpdA一样是可生物降解的。
表5.OpdA在天然水中的稳定性
*使用甲基对硫磷作为底物测量OpdA的活性(U/L)。一个单位的酶活性(U)等于每分钟水解1μmol的甲基对硫磷所需的酶量。所示的值是在每次读取中相差在5%以内两次重复的平均值。
代谢物毒性
通过将指示节肢动物种网纹水蚤（Ceriodaphnia dubia）暴露于未处理的二嗪农(50mg/L)或已用OpdA预处理的二嗪农(50mg/L)中确立杀虫剂的解毒作用（表6）。在暴露24和48小时后监测网纹水蚤的存活率。在两个时间点上，暴露在OpdA处理过的二嗪农中的网纹水蚤的EC50(对应50%存活率的有效浓度)比暴露在未处理的杀虫剂中的EC50高近200,000倍。在LOEC（观察到效应的最低浓度；表6）和NOEC（未观察到效应的最大浓度；表6）中也观察到同样的增加。二嗪农经OpdA水解的产物通过质谱确证为二乙基硫代磷酸（diethylthiophosphoric acid）和2-异丙基-4-甲基-嘧啶-6-醇（2-isopropyl-4methyl-pyrimidin-6-ol），与磷酸三酯酶（phosphotriesterases）的特征性机制相符合。这些数据表明，OpdA以可预见的方式发挥作用，并且其作用显著地为磷酸三酯杀虫剂解毒。考虑到A900与OpdA之间的关系，技术人员将会理解，A900将以类似的方式起作用。
表6.使用OpdA处理前后的二嗪农对网纹水蚤的毒性
*OpdA以0.05g/L的率给药。所示值是每次读取相差在10%以内的两次重复的平均值。
**EC50，对应50%存活的有效浓度；LOEC，观察到效应的最低浓度；NOEC，未观察到效应的最大浓度。
广泛的生态毒理学数据也可用于另一种OP杀虫剂毒死蜱及其水解产物（二乙基硫代磷酸和TCP；3、5、6三氯吡啶-2-醇）（Barron和Woodburn,1995）。在如蓝腮鱼（蓝腮太阳鱼）（Lepomis macrochiru）的指示物种中，与母体化合物相比两种产物是相当低毒的（Mayer和Ellersieck,1986），以及已证明TCP对水生和陆生生物具有低至中度毒性（Barron和Woodburn,1995）。因此，杀虫的磷酸三酯通过本发明酶的水解作用，表现在其哺乳动物毒性和生态毒性上的显著降低。
本领域技术人员将理解可对如具体实施方案所示的本发明进行多种的变化和/或修改而不脱离如广义描述的本发明的精神或范围。因此，本实施方案在各方面仅被视作说明性的而非限制性的。
本申请请求2011年7月20日提交的US61/509,810和2011年7月21日提交的US61/510,377的优先权，通过引用两者全部内容并入在此。
所有本文讨论和/或引用的出版物均以其整体并入本文。
纳入本说明书的任何文献、记录、材料、装置、文章等等中的讨论均仅用来提供本发明背景的目的。不应理解为承认，因为这些事物的任何或是全部存在于本申请的各项权利要求的优先权日之前，其便构成现有技术基础的部分或在本发明相关领域中成为公知常识。
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Claims (29)

1.一种多肽，其氨基酸序列是：
i)SEQ ID NO:1所示，或
ii)SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的多肽，其具有有机磷酸酯水解活性。
3.根据权利要求2所述的多肽，其与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4的第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的多肽，其具有下列中的两种或更多或全部：
i)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的二级速率常数(kcat/Km)，
ii)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的kcat/Km，
iii)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的kcat/Km，或者
iv)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对乙基毒死蜱高至少1.2倍的催化常数(kcat)。
5.根据权利要求4所述的多肽，其具有：
i)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的kcat/Km，
ii)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的kcat/Km，
iii)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的kcat/Km，和
iv)与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽相比，针对乙基毒死蜱高至少1.2倍的kcat。
6.根据权利要求2所述的多肽，其中所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。
7.根据权利要求2所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是芳香族非乙烯基有机磷酸酯。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。
9.根据权利要求2所述的多肽，其具有下列中的两个或更多：
i)对乙基毒死蜱至少2x106sec-1.M-1的kcat/Km，
ii)对甲基毒死蜱至少3.5x105sec-1.M-1的kcat/Km，
iii)对二嗪农至少3.6x106sec-1.M-1的kcat/Km，
iv)对乙基对硫磷至少9x107sec-1.M-1的kcat/Km，或
v)对甲基对硫磷至少3x106sec-1.M-1的kcat/Km。
10.根据权利要求9所述的多肽，其具有：
i)对乙基毒死蜱至少2x106sec-1.M-1的kcat/Km，
ii)对甲基毒死蜱至少3.5x105sec-1.M-1的kcat/Km，
iii)对二嗪农至少3.6x106sec-1.M-1的kcat/Km，
iv)对乙基对硫磷至少9x107sec-1.M-1的kcat/Km，以及
v)对甲基对硫磷至少3x106sec-1.M-1的kcat/Km。
11.根据权利要求1所述的多肽，其固定在固体支持物上。
12.根据权利要求1所述的多肽，其存在于微生物细胞或者在微生物细胞的提取物中。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述的提取物是粗提物。
14.一种分离的和/或外源的多核苷酸，其核苷酸序列为如下：
i)SEQ ID NO:6所示，
ii)编码权利要求1至13的任一项所述的多肽，或
iii)与i)或ii)的全长互补。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其可操作地连接于能够指导所述多核苷酸在细胞中表达的启动子。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述的细胞是微生物细胞。
17.一种载体，其包含权利要求14至16中任一项所述的多核苷酸。
18.一种微生物宿主细胞，其包含：
权利要求14至16中任一项所述的多核苷酸、和/或
权利要求17所述的载体。
19.根据权利要求18所述的微生物宿主细胞，其是细菌细胞或真菌细胞。
20.一种权利要求18或19所述的微生物宿主细胞的提取物，其中所述提取物包含权利要求1至13中任一项所述的多肽。
21.根据权利要求20所述的提取物，其还包含权利要求14至16中任一项所述的多核苷酸。
22.一种组合物，其含有：
可接受的载体；以及
选自以下的一种或更多：权利要求1至13的任一项所述的多肽、权利要求14至16中任一项所述的多核苷酸、权利要求17所述的载体、权利要求18或19所述的微生物宿主细胞、和权利要求20或21所述的提取物。
23.一种用于水解有机磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有机磷酸酯分子接触选自以下的一种或更多：权利要求1至13的任一项所述的多肽、权利要求18或19所述的微生物宿主细胞、权利要求20或21所述的提取物以及权利要求22所述的组合物，
其中所述方法不包括向动物施用所述多肽、微生物宿主细胞、提取物或组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有机磷酸酯分子在选自土壤、水、生物材料或其组合的样本中或在表面上。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其包括向实地土壤或液体中应用选自以下的一种或更多：所述多肽、微生物宿主细胞、提取物或组合物。
26.选自以下的一种或更多在制造用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的药物中的用途：
权利要求1至13的任一项所述的多肽、权利要求14至16中任一项所述的多核苷酸、权利要求17所述的载体、权利要求18或19所述的微生物宿主细胞、权利要求20或21所述的提取物以及权利要求22所述的组合物。
27.一种用于产生权利要求1至13的任一项所述的多肽的方法，所述方法包括：在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下，培养权利要求18或19所述的微生物宿主细胞，以及回收表达的多肽。
28.一种用于检测有机磷酸酯存在的生物传感器，所述生物传感器包含权利要求1至13的任一项所述的多肽以及检测有机磷酸酯分子被所述多肽水解的装置。
29.一种用于水解有机磷酸酯分子的试剂盒，所述试剂盒包含选自以下的一种或更多：
权利要求1至13的任一项所述的多肽、权利要求18或19所述的微生物宿主细胞、权利要求20或21所述的提取物以及权利要求22所述的组合物。
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