CN102164951A

CN102164951A - 用于水解苯脲、氨基甲酸酯和有机磷酸酯的酶和方法

Info

Publication number: CN102164951A
Application number: CN2009801350086A
Authority: CN
Inventors: J·L·库拉纳; C·J·杰克逊; C·斯科特; G·潘迪; R·J·鲁赛尔; J·G·奥克肖特
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-08-24
Also published as: IL210205A0; CA2730152A1; KR20110041511A; ZA201100070B; EP2297191A4; US20110314564A1; RU2011104503A; EP2297191A1; JP2011527179A; AU2009267799A1; WO2010003184A1

Abstract

本发明涉及能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的酶，以及编码这些酶的多核苷酸。本发明还涉及用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法。

Description

用于水解苯脲、氨基甲酸酯和有机磷酸酯的酶和方法

发明领域

发明背景

苯脲除草剂敌草隆(N′-3，4-二氯苯基N-二甲基脲)是广泛用于耕作和非耕作区的具有宽靶向范围的系统性光合作用抑制剂。作用方式是经由抑制光合作用中的Hill反应(Wessels和Van der Veen，1956)，通过结合于光系统II活性中心并阻断电子传递而防止氧产生(Stein等，1984；Sinning，1992)。

敌草隆是一种环境隐忧，原因在于其非现场(off-site)除草剂效应及其毒性，以及其初级代谢物3，4-二氯苯胺(DCA)的非现场除草剂效应及其毒性。敌草隆和DCA被怀疑具有遗传毒性(Osano等，2002；Canna-Michaelidou等，1996)。正常喷洒作业(Gooddy等，2002)可导致敌草隆渗至地面(Spliid和Koppen，1998；Field等，2003)、表面(Thurman等，2000；Gerecke等，2001a)，以及最终至海水(Gerecke等，2001b)。由于其缓慢的化学水解和光解速率(Salvestrini等，2002；Okamura，2002)，敌草隆是环境持久的。通过依据欧盟委员会水框架指令(2000/60/EC)(建议在2020年前逐步淘汰敌草隆使用)的No 2455/2001/EC决议审议，敌草隆被列为重点有害物质。随后欧盟委员会指导性提案(COM(2006)397)阐明敌草隆为欧洲主要水隐忧的重点物质，应当减少其传播、排放及损耗。

微生物降解被认为是敌草隆降解的主要途径，其在土壤中的半衰期估计少于一年(Okamura，2002；Wauchope等，1992)。除了微生物群落和真菌分离株外，显示许多细菌菌株催化分解代谢一系列苯脲除草剂，包括敌草隆(Sorensen等，2003；Giacomazzi和Cochet，2004)。例如，球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)D47降解若干苯脲，按利谷隆＞敌草隆＞单利谷隆＞甲氧隆＞异丙隆的速度排序(Cullington和Walker，1999；Turnbull等，2001a)。随后，发现节杆菌(Arthrobacter sp.)N2菌株降解敌草隆、绿麦隆和异丙隆(Widehem等，2002；Tixier等，2002)。两种节杆菌都不完全矿化敌草隆和积累敌草隆水解造成的DCA。相反，假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株BK8和贪噬菌(Variovorax sp.)SRS16完全矿化敌草隆(El-Deeb等，2000；Sorensen等，2008)。

第一个纯化的苯脲水解酶被发现是球形杆菌(Bacillus sphaericus)的75kDa的酶，已报道其催化许多N-甲氧基-N-甲基苯脲的分解，包括利谷隆、单利谷隆、溴谷隆和氯溴隆(Engelhardt等，1971；Engelhardt等，1973；

1969)。然而，没有观察到N-二甲基苯脲底物的代谢周转(turnover)，包括敌草隆。迄今为止，Turnbull等(2001b)的鉴定是敌草隆水解降解基因的唯一遗传鉴定，其中他们从球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)D47克隆并测序了叫做puhA的苯脲水解酶。序列分析显示PuhA具有与酰胺基水解酶超家族成员的低水平相似性(Turnbull等，2001b)。

酰胺基水解酶超家族中的酶在(β/α)₈-桶结构折叠中含有单或双核金属中心，并在碳或磷中心催化酰胺或酯功能团的水解。金属中心位于组成桶的八个β-链的C-末端，其突出环影响底物特异性。有几种酰胺基水解酶亚型，其通过充当直接金属配体的氨基酸的变异而定义(见Seibert和Raushel，2005)。

需要更多的能用来水解例如敌草隆的苯脲的酶。

发明概述

本发明的发明人鉴定了能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的细菌菌株。此外，发明人鉴定了能用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的酶。

因此，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其包括：

i)SEQ ID NO：1的氨基酸序列，

ii)与i)具有至少83％相同性的氨基酸序列，和/或

iii)i)或ii)的生物学活性片段，

其中所述多肽能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯。

在本发明的一个实施方案中，苯脲是N-二甲基取代的苯脲或N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。所述N-二甲基取代的苯脲可以是，例如，敌草隆、绿麦隆、优草隆、甲氧隆、异丙隆或非草隆。所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲可以是，例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或单利谷隆。

在本发明的另一个实施方案中，所述多肽对敌草隆、绿麦隆、优草隆、甲氧隆和/或非草隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽对敌草隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽至少2倍、更优选至少4倍。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽对绿麦隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽至少4倍、更优选至少8倍、更优选至少10倍。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽对优草隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽至少2倍、更优选至少5倍。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽对甲氧隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽至少2倍、更优选至少3倍。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽对非草隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽至少8倍、更优选至少12倍、更优选16倍。

在一个实施方案中，所述多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的酰胺键。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽包括与SEQ ID NO：1具有至少95％相同性的氨基酸序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述多肽可以从分枝杆菌(Mycobacterium sp.)纯化。优选地，所述分枝杆菌是在2008年5月16日以保藏号V08/013277保藏于澳大利亚国家计量研究院(National Measurement Institute)的Mycobacterium brisbanense JK1。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽与至少一种其它多肽融合。所述至少一种其它多肽可以是，例如，增强本发明中的多肽的稳定性的多肽，或帮助纯化所述融合蛋白的多肽。

在另一方面，本发明提供分离和/或外源的多核苷酸，其包括：

i)SEQ ID NO：2的核苷酸序列，

ii)编码本发明中的多肽的核苷酸序列，

iii)与i)具有至少80％相同性的核苷酸序列，

iv)在严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，和/或

v)与i)至iv)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，所述多核苷酸编码水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的多肽。

在另一方面，本发明提供载体，其包括本发明的多核苷酸。

优选地，所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。

在另一方面，本发明提供宿主细胞，其包括至少一种本发明的多核苷酸和/或至少一种本发明的载体。

该宿主细胞可以是任何类型的细胞。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是植物细胞。在本发明的另一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。

优选地，本发明中的多肽通过本发明的多核苷酸的表达而由所述细胞产生。

在另一方面，本发明提供产生本发明的多肽的方法，所述方法包括在使得编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养编码所述多肽的本发明的宿主细胞或编码所述多肽的本发明的载体，并回收表达的多肽。

还提供使用本发明的方法产生的多肽。

在另一方面，本发明提供分离的抗体，其特异地结合本发明的多肽。

在另一方面，本发明提供组合物，其包括至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的抗体。

在另一方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括本发明的多肽和/或本发明的宿主细胞。

优选地，本发明的组合物还包括一或多种可接受的承载体(carrier)。

优选地，本发明的组合物还包括金属离子。在本发明的一个优选的实施方案，所述金属离子是二价金属离子。更优选地，所述金属离子选自Mg²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺以及其组合。更优选地，所述金属离子选自Mg²⁺、Zn²⁺、Co²⁺以及其组合。在本发明的一个特别优选的实施方案，所述金属离子是Zn²⁺。

本发明的多肽可以用作可选择标记检测宿主细胞。因此，也提供本发明的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的用途，其用作检测和/或选择宿主细胞的可选择标记。

在另一个方面，本发明提供用于检测宿主细胞的方法，所述方法包括

i)在使得细胞可以摄取编码本发明的多肽的多核苷酸的条件下使细胞或一群细胞与所述多核苷酸接触，以及

ii)通过将来自步骤i)的细胞或其后代细胞暴露至苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯选择宿主细胞。

优选地，所述多核苷酸包括编码本发明的多肽的第一开放读框，以及不编码本发明的多肽的第二开放读框。

在一个实施方案中，所述第二开放读框编码多肽。在第二个实施方案中，所述第二开放读框编码不翻译的多核苷酸。在两个实例中，都优选第二开放读框可操纵地连接于合适的启动子。

所述不翻译的多核苷酸可以编码，例如，催化核酸、dsRNA分子或反义分子。

合适的细胞的实例包括但不限于植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。优选地，所述细胞是植物细胞。

在另一个方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与本发明的多肽接触。

在本发明的一个实施方案，所述多肽由本发明的宿主细胞产生。

本文提供的多肽可以在植物中产生，增强宿主植物暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯时的生长能力。

因此，在另一个方面，本发明提供转基因植物，其包括编码至少一种本发明的多肽的外源多核苷酸。

优选地，所述多核苷酸稳定地整合进植物的基因组。

在另一个方面，本发明提供本发明的转基因植物的部分。优选地，所述转基因植物的部分是种子。

在另一个方面，本发明提供用于水解样品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将样品与本发明的转基因植物接触。

优选地，所述样品是土壤。这样的土壤可以在田里。

在另一个方面，本发明提供转基因非人动物，其包括编码至少一种本发明的多肽的外源多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供在2008年5月16日以保藏号V08/013277保藏于澳大利亚国家计量研究院的分枝杆菌(Mycobacterium)分离菌株。

所述菌株可以是活的或死的(被杀死)。

在另一个方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括本发明的菌株以及任选地，一或多种可接受的承载体。

在另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞、本发明的转基因植物、本发明的转基因非人动物、本发明的菌株的提取物，其中所述提取物包括本发明的多肽。

在另一个方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括本发明的提取物，以及任选地，一或多种可接受的承载体。

在另一个方面，本发明提供水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与本发明的菌株、本发明的组合物和/或本发明的提取物接触。

在另一个方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的聚合海绵或泡沫，所述泡沫或海绵包括固定在聚合多孔支持物上的本发明的多肽。

优选地，所述多孔支持物包括聚氨酯。

在一个优选的实施方案中，所述海绵或泡沫还包括包埋或掺入多孔支持物之上或里面的碳。

在另一个方面，本发明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与本发明的海绵或泡沫接触。

可以突变本发明的多肽，并针对所获得的突变体的改变的活性，例如增强的酶活性，进行筛选。这样的突变体可以通过本领域公知的技术获得，包括但不限于体外诱变和DNA改组(DNA shuffling)。

因此，在另一个方面，本发明提供产生具有增强的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的能力，或对不同类型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯具有改变的底物特异性的多肽的方法，所述方法包括：

i)改变本发明的最初的多肽的一或多个氨基酸，

ii)测定获得自步骤i)的改变的多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的能力，以及

iii)选择改变的多肽，其与步骤i)中使用的多肽相比，具有增强的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的能力，或对不同类型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯具有改变的底物特异性。

步骤i)可以通过本领域公知的合适的技术进行，包括但不限于在编码核苷酸上的定点诱变、化学诱变和DNA改组(DNA shuffling)。

还提供通过本发明的方法产生的多肽。

在另一个方面，本发明提供用于筛选能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括：

i)在苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯作为单一氮源存在时培养候选微生物，以及

ii)测定微生物是否能够生长和/或分裂。

在另一个方面，本发明提供试剂盒，其包括至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的抗体、本发明的组合物、至少本发明的植物一个部分、至少一种本发明的菌株、至少一种本发明的提取物和/或至少一种本发明的聚合海绵或泡沫。

在另一个方面，本发明提供用于水解氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与基本纯化的和/或重组的多肽接触，该多肽包括：

i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，

ii)与i)具有至少40％相同性的氨基酸序列，和/或

iii)i)或ii)的生物学活性片段，

其中所述多肽水解氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯。

本领域技术人员应该清楚所述方法可以通过使氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯接触以下各项而实施：编码所述多肽的多核苷酸、包含编码所述多肽的多核苷酸的载体和/或宿主细胞、包含所述载体的宿主细胞、包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或其部分、包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因非人动物、在2008年5月16日以保藏号V08/013277保藏于澳大利亚国家计量研究院的分枝杆菌分离菌株、包括所述多肽的提取物(其中所述提取物是宿主细胞、转基因植物、转基因非人动物或菌株的提取物)和/或包括所述多肽的聚合海绵或泡沫。

在本说明书全文中，词语“包括”及其变形意指包含所述的元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组，而不排除任何其它元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组。

在本说明书全文中，除非另外具体规定或上下文另外要求，提到单个步骤、事物组合物、步骤的组或事物组合物的组应当包括包括一个以及多个这些步骤、事物组合物、步骤的组或事物组合物的组。

除非另外具体规定，本文描述的每个实施方案加以必要修订适用于每个其它实施方案。

在下文中通过下面非限制性实施例以及参照附图描述本发明。

附图简述

图1.分枝杆菌Mycobacterium brisbanense菌株JK1所造成的敌草隆水解和DCA积累。3个平行测定的瓶中的敌草隆浓度标为(△、□、○)，用闭合标志(▲、■、●)表示在相同的3个瓶中的DCA浓度。在仅为对照的培养基(×)中没有观察到敌草隆的消耗。

图2.puhA和puhB间的同线性以及假定的调控基因tetR。puhA和puhB基因用箭头表示，指示相对于保守的假定tetR家族转录调控子的转录方向。显示了puhA和puhB基因上游的预测的启动子区域(-10，-35)以及核糖体结合位点(RBS)。puhA上游的14bp回文序列(用反向箭头指示)与puhB上游的不完全回文序列类似。

图3.金属依赖水解酶组A(CD01299)分歧最大的32个成员当中的PuhA和B的邻接法系统发育树。节点的数字是来自1000次重复的自展再抽样频率。

图4.用于同源建模的2QS8和PuhB的序列比对。金属配体以黑体显示，第二层(shell)催化残基以黑体和下划线显示。

图5.基于2QS8的PuhB的同源模型。PuhB模型(左)与2GOK活性位点并排显示。该模型基于图4中显示的比对。

图6.在分枝杆菌M.smegmatis中表达的PuhA和PuhB的纯化。用含有大致等量的来自每一纯化步骤的靶蛋白样品上样的10％SDS-PAGE凝胶；无细胞提取物(CFE)、疏水作用层析(HIC)、阴离子交换层析(AEX)和尺寸排阻层析(SEC)。

图7.反应温度对PuhA(■)和B(▲)的活性的影响。测定在指定温度进行1小时。误差棒是三个平行测定的标准差。

图8.PuhA(■)和B(▲)的稳定性。暴露于(A)各种温度下10分钟以及(B)溶剂乙腈[PuhA(■)和B(▲)]和甲醇[PuhA(□)和B(△)](在25℃下1小时的测定)的残余活性。误差棒是三个平行测定的标准差。

图9.苯脲水解酶的动力学数据

图10.PuhA(■)和PuhB(▲)的pH依赖性。pH依赖性用恒定离子强度缓冲液中的底物敌草隆测量并通过LCMS分析。pH对log(k_cat)(A)、pH对log(k_cat/K_m)(B)和pH对K_m(C)作图证明这些酶具有宽最优pH范围。

图11.建议的苯脲水解酶催化机制。在活性位点第二层的H273结合苯脲底物。活性位点金属激活的氢氧化物对底物脲部分中心碳的攻击和K206对苯胺离去基团的稳定协同发生。

图12.PuhA(□)和PuhB(△)的

图。k_cat和图7中N-二甲基苯脲离去基团的pK_a显示出相关性。

序列列表关键字

SEQ ID NO：1-PuhB的氨基酸序列

SEQ ID NO：2-编码PuhB的核苷酸序列

SEQ ID NO：3-PuhA的氨基酸序列

SEQ ID NO：4-编码PuhA的核苷酸序列

SEQ ID NO：5-引物(PuhA-pet14b正向)

SEQ ID NO：6-引物(PuhA-pet14b反向)

SEQ ID NO：7-引物(PuhB-pET14b正向)

SEQ ID NO：8-引物(PuhB-pET14b反向)

SEQ ID NO：9-引物(His AB pMV正向)

SEQ ID NO：10-引物(PuhA-pMV261正向)

SEQ ID NO：11-引物(PuhB-pMV261正向)

SEQ ID NO：12-引物(PuhA pMV261反向)

SEQ ID NO：13-引物(PuhB pMV261反向)

SEQ ID NO：14-2QS8的氨基酸序列

优选实施方案详述

通用技术

除非另外具体定义，本文所用的所有技术和科学术语应当具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的意义(例如，在细胞培养、分子遗传学、植物生物学和/或植物化学、重组细胞生物学包括转基因植物、生物除污、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学以及生物化学)。除非另外指明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。这样的技术在文献中到处被描述和解释，例如：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)；F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)；J.E.Coligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括至今的所有更新)。

如本文所用，术语“水解酶”指的是本发明的多肽，其催化苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的水解。如本文所用，术语“水解(hydrolysis水解作用)”指的是分解的化学过程，包括键的裂开并添加来自水的氢阳离子和氢氧根阴离子。对于本文所用“水解(hydrolyse)”，是使遭受或遭受水解作用。

苯脲

苯脲除草剂一般具有通式结构：

其中，R₁可以是，例如，CH₃；R₂可以是，例如，CH₃或OCH₃；R₃可以是，例如，H、Cl或CF₃；以及R₄可以是，例如，H、CH₃、OCH₃、CH(CH₃)₂、Cl或Br。

大多当前可获得的苯脲除草剂或者是N-二甲基-取代的化合物(例如，敌草隆、绿麦隆、伏草隆、甲氧隆、异丙隆和非草隆)或者是N-甲氧基-N-甲基-化合物(例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆和单利谷隆)。苯脲除草剂一般具有相对高的水中溶解性和低的对土壤的吸附倾向，致使它们在土壤中可移动。

在一个优选的实施方案中，本发明的多肽和方法可用于水解N-二甲基脲和/或N-甲氧基-N-甲基脲。在本发明一个特别优选的实施方案中，本发明的多肽和方法可用于水解敌草隆(N′-3，4-二氯苯基N-二甲基脲)。

通常，本发明的多肽通过脲羰基的水解作用将苯脲转换成苯胺和氨基甲酸，或对于取代苯脲，转换成相应的取代苯胺(例如，敌草隆水解为3，4-二氯苯胺(DCA)而异丙隆水解为4-异丙苯胺)和N-二甲基或N-甲氧基、N-甲基氨基甲酸(其可以进一步降解为CO₂和二甲基或甲氧甲基胺(Engelhardt，1971))。

氨基甲酸酯

氨基甲酸酯具有酰胺键，其羰基基团也形成羧基酯键。氨基甲酸酯农药衍生自氨基甲酸(HOOC-NH₂)并具有通式结构：

化学侧链主要决定该农药的生物学活性。X表示的原子是O或S，而R₁和R₂可以是许多不同的有机侧链，不过很经常是CH₃基团或H。R₃通常是庞大的芳香基团或肟部分。

来自胺基团和羧基酯基团的不同组成决定了这些化合物的靶生物体。胺和羧基酯都具有芳香基团的氨基甲酸酯(例如，苯敌草)是除草的。具有来自羧基酯基团的芳香基团以及来自胺的小基团如CH₃的氨基甲酸酯(如胺甲萘)是杀虫的。

具有来自胺的苯并咪唑基团以及来自羧基酯键的小CH₃基团的氨基甲酸酯是杀真菌的。这样的氨基甲酸酯本文指的是苯并咪唑氨基甲酸酯杀菌剂，包括但不限于，苯菌灵，多菌灵，氰菌灵，咪菌威和苯并威。

在本发明一个特别优选的实施方案中，可以通过本发明中的方法水解的氨基甲酸酯包括利谷隆酯和DMNPC。

有机磷酸酯

有机磷酸酯是合成的有机磷酯及相关化合物例如氨基磷酸酯。它们具有通式(RR′X)P＝O或(RR′X)P＝S，其中R和R′是短链基团。对于杀虫的有机磷酸酯，X是良好的离去基团，其对于不可逆抑制乙酰胆碱酯酶是必要的。

本发明的多肽和方法可以水解有机磷酸酯的磷酸三酯键。

本发明的多肽和方法可以水解的有机磷酸酯包括，例如，对氧磷。

尽管其作为杀虫剂的用途众所周知，有机磷酸酯也可以用作对哺乳动物的神经毒气。因此，本发明的多肽和方法设想也将用于那些不是杀虫剂的有机磷酸酯的水解。

多肽

对“基本纯化的多肽”或“纯化的多肽”，我们指的是已经从其天然状态所伴随的脂质、核酸、其它多肽或其它污染分子中分离出来的多肽。优选所述基本上纯化的多肽至少60％，更优选地至少75％，以及更优选地至少90％没有搀杂其它天然伴随的成分。

描述多肽的术语“重组的”指的是当由细胞产生或在无细胞表达系统中产生时，相比于其天然状态，具有改变的量和速率的多肽。在本发明中一个优选的实施方案中，所述细胞是不天然产生所述多肽的细胞。在一个可选的实施方案中，所述细胞是包括外源多核苷酸的细胞，该外源多核苷酸使得要产生的多肽的量发生改变，优选是增加。本发明的重组多肽包括没有从表达该多肽的细胞或无细胞表达系统的其它组分中分离的多肽，以及在这样的细胞或无细胞系统中产生的、随后从至少一些其它组分纯化的多肽。

术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用并且指的是单个多肽链，其可以或不可以通过增加非氨基酸基团修饰。应当理解这样的多肽链可以结合其它多肽或蛋白质或其它分子例如辅助因子。本文所用术语“蛋白质”和“多肽”也包括本文描述的本发明的多肽的变体、突变体、修饰、类似物、生物学活性片段和/或衍生物。

多肽的％相同性通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，空位插入罚分＝5，以及空位延伸罚分＝0.3。查询序列至少长25个氨基酸，并且GAP分析在至少25个氨基酸的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列至少长50个氨基酸，并且GAP分析在至少50个氨基酸的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列至少长100个氨基酸并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，查询序列至少长250个氨基酸并且GAP分析在至少250个氨基酸的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，GAP分析在它们的全长对两个序列进行比对。

如本文所用，“生物学活性片段”是本发明的多肽的一部分，其保留了全长多肽的定义活性，即是能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯。只要保留定义活性，所述生物学活性片段可以是任何大小。优选地，生物学活性片段至少长100个氨基酸，更优选优选至少200个氨基酸，以及甚至更优选至少350个氨基酸。

对于定义的多肽，应了解，高于上面所提供的％相同性数字将包含优选的实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小％相同性数字，优选所述多肽包括与相关指定的SEQ ID NO具有至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％相同性的氨基酸序列。

本发明的多肽的氨基酸序列突变体可以通过向本发明的核酸导入合适的核苷酸改变或通过所需多肽体外合成而制备。这样的突变体包括，例如，在氨基酸序列缺失、插入或置换一或多个残基。可以进行一或多个缺失、插入和/或置换的组合以实现最终构建体，使得最终多肽产物具有所需特性。

突变体(改变的)多肽可以用本领域已知的任何技术制备。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这样的体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆至合适的载体，将该载体转化至增变株例如大肠杆菌XL-1red(Stratagene)并将转化的细菌增殖合适的代数。在另一个实施例中，本发明的多核苷酸使用Harayama(1998)清楚描述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可以包括涉及本发明基因的基因，如来自细菌的其它水解酶，例如编码PuhA和PuhB可以用于改组。来源于突变的/改变的DNA的产物可以使用本文描述的技术容易地筛选，确定它们是否具有所需表型例如增强的活性和/或改变的底物特异性。

在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的定位和突变的种类将依赖于待修饰的特性.突变的位点可以单独地或系列地修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸选择置换而后根据实现的结果用更基本的选择置换，(2)缺失靶残基，或(3)在紧邻定位位点插入其它残基。

氨基酸序列缺失通常从大约1至15个残基，更优选大约1至10个残基，典型地大约1至5个邻接的残基。

置换突变体的多肽中的至少一个氨基酸残基被去除而在其位置插入一个不同的残基。用于置换诱变的最大兴趣位点包括被鉴定为对功能重要的位点。其它兴趣位点是那些其特定残基在不同株或种中相同的位点。这些位置对于生物学活性可能是重要的。这些位点，特别在至少其它三个一致保守的位点序列中的位点，以相对保守的方式优选地置换。这样的保守性置换在表1中显示。

表1.示例性置换

原始残基	示例性置换
		Ala(A)	val；leu；ile；gly
Arg(R)	lys
		Asn(N)	gln；his
Asp(D)	glu
		Cys(C)	ser
Gln(Q)	asn；his
		Glu(E)	asp
Gly(G)	pro，ala
		His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala
		Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg

Met(M)	leu；phe
		Phe(F)	leu；val；ala
Pro(P)	gly
		Ser(S)	thr
Thr(T)	ser
		Trp(W)	tyr
Tyr(Y)	trp；phe
		Val(V)	ile；leu；met；phe；ala

在一个优选的实施方案中，本发明的多肽包括具有单核金属中心的(β/α)₈结构折叠。优选地，所述金属中心在多肽的催化位点内(本文中称作“单核活性位点”)。优选地，多肽的单核活性位点包括由β-链1的NxH基序、β-链5的H和β-链8的D配位的锌金属离子。优选地，所述单核活性位点也包括位于活性位点第二层的β-链6上的H。单核活性位点也可以包括不与金属离子配位的K残基。在一个实施方案中，所述多肽包括与SEQ ID NO：1比较，在对应氨基酸编号253位置的H、对应于氨基酸编号334位置的D和/或对应于氨基酸编号273位置的H。在另一个实施例中，所述多肽另外包括对应于SEQ ID NO：1的氨基酸编号206位置的K。此外，在设计SEQ ID NO：1的多肽的变体/突变体时，可以使用来自相关分子的序列信息。例如，在一个实施方案中，所述多肽包括PuhB和PuhA间保守的至少80％、至少90％、至少95％或全部氨基酸。

此外，如需要，非天然氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为置换或添加导入至本发明的多肽。这样的氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸环己酯、β-丙氨酸、氟-氨基酸、特制(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及一般而言的氨基酸类似物.

在合成中或合成后进行不同修饰的多肽也包含在本发明的范围内，所述修饰例如生物素化、苄化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、溶蛋白性裂解、连接至抗体分子或其它细胞配体等等。这些修饰可以用来增加本发明的多肽的稳定性和/或生物活性。

本发明的多肽由不同的方法产生，包括天然多肽的产生和回收、重组多肽的产生和回收以及多肽的化学合成。在一个实施方案中，本发明的分离多肽通过在有效产生该多肽的条件下培养能够表达该多肽的细胞并回收该多肽而产生。优选培养的细胞是本发明的宿主细胞。有效的培养条件包括但不限于允许多肽产生的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效的培养基指的是在其中培养细胞来产生本发明的多肽的任何培养基。这样的培养基一般包括具有可同化碳源、氮源和磷源的培养液，以及合适的盐、矿物质、金属和其它营养(例如维生素)。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和培养皿中培养。培养可以在合适于宿主细胞的温度、pH和氧气含量下进行。这样的培养条件属于本领域普通技术人员的专业知识。

多核苷酸和寡核苷酸

对于“分离的多核苷酸”，包括DNA、RNA或其组合，单或双链的，在正义或反义方向的或两者的组合，或其它。我们指的是从其以天然状态结合或连接的多核苷酸序列中至少部分地分离的多核苷酸。优选地，所述分离多核苷酸至少60％，优选至少75％，最优选至少90％没有掺入其天然结合的其它成分。此外，术语“多核苷酸”在本文和术语“核酸”可互换使用。

对多核苷酸的术语“外源的”指的是相比于其天然状态，以改变的量存在于细胞或无细胞表达系统的多核苷酸。优选地，所述细胞是没有天然地包括该多核苷酸的细胞。在一个可选的实施方案，所述细胞是包括外源多核苷酸的细胞，该外源多核苷酸使得要产生的多肽的量发生改变，优选是增加。本发明的外源多核苷酸包括从表达该多肽的细胞或无细胞表达系统的其它组分中没有分离到的多核苷酸，以及在这样的细胞或无细胞系统中产生的、随后从至少一些其它组分纯化的多核苷酸。所述外源多核苷酸可以是天然存在的邻接的核苷酸延伸，或者包括不同来源(天然存在的和/或合成的)的两个或更多邻接的核苷酸延伸结合形成单一的多核苷酸。典型地这样的嵌合的多核苷酸包括至少一个编码本发明的多肽的开放读框，其可操纵地连接于适于驱动该开放读框在感兴趣的细胞中表达的启动子。

多核苷酸的％相同性通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，空位插入罚分＝5，以及空位延伸罚分＝0.3。除非另外规定，查询序列至少长45个核苷酸，并且GAP分析在至少45个核苷酸的区域对两个序列进行比对。优选地，查询序列至少长150个核苷酸，并且GAP分析在至少150个核苷酸的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列至少长300个核苷酸并且GAP分析在至少300个核苷酸的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，GAP分析在它们的全长对两个序列进行比对。

对于定义的多核苷酸，应了解，高于上面所提供的％相同性数字将包括优选的实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小％相同性数字，优选所述多核苷酸包括与相关指定的SEQ ID NO具有至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％相同性的序列。

本发明的多核苷酸包括在严格条件下与编码SEQ ID NO：1的核酸杂交的多核苷酸。

如本文所用，术语“杂交”指的是两个单链核酸分子能够通过氢键形成至少部分双链的核酸的能力。

如本文所使用，短语“严格条件”指的是在此条件下多核苷酸、探针、引物和/或寡核苷酸将和其靶序列杂交。严格条件是序列依赖的并且在不同情况下会不同。与较短的序列相比，较长的序列在更高的温度特异性杂交。通常，在限定的离子强度和pH下，选择低于特异序列的热溶解点(Tm)5℃的严格条件。Tm是50％的和靶序列互补的探针与靶序列在平衡状态杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列通常过量存在，在Tm，50％的探针以平衡状态被占据。通常，严格条件会是盐浓度少于大约1.0M钠离子，通常大约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)，pH 7.0至8.3，以及对于短探针、引物或寡核苷酸(例如，10-50核苷酸)温度至少大约30℃，对长探针、引物或寡核苷酸温度至少大约60℃。严格条件也可以通过加入去稳定剂而实现，例如甲酰胺。

严格条件是本领域技术人员所熟知的并可以在Ausubel等(上述)，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。优选地，这样的条件使得相互间至少大约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源的序列典型地保持相互间杂交。非限制性的严格杂交条件的实施例是在高盐缓冲液(包括6xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％ Ficoll、0.02％BSA和500mg/ml变性鱼精DNA)中在65℃的杂交，接着在0.2.xSSC、0.01％BSA在50℃洗一次或更多次。

与天然存在的多核苷酸相比较，本发明的多核苷酸可以具有一或多个突变，其是核苷酸缺失、插入和/或置换。突变体可以是天然存在的(也就是说，从天然来源分离的)或者合成的(例如，通过在核酸上进行定点诱变)。

本发明包括寡核苷酸，其可以用作，例如，鉴定核酸分子的探针或产生核酸分子的引物。本发明用作探针的寡核苷酸通常与可检测标签缀合，例如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。探针和/或引物可用于克隆本发明的多核苷酸来自其他种或株的同源物。此外，本领域已知的杂交技术也可以用于在基因组或cDNA文库中筛选这样的同源物。

本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或它们的衍生物。尽管多核苷酸和寡核苷酸有重叠的意思，但寡核苷酸通常是相对短的单链分子。这样的寡核苷酸最小是在寡核苷酸和靶核酸分子上的互补序列间形成稳定杂交所要求的大小。优选地，所述寡核苷酸长度至少15个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，更优选至少19个核苷酸，更优选20个核苷酸，甚至更优选至少25个核苷酸。

通常，多核苷酸或寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键或其类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯。

重组载体

本发明的一个实施方案包括重组载体，其包括至少一种本发明的分离的多核苷酸，所述多核苷酸插入至能够将该多核苷酸运送至宿主细胞的任何载体。这样的载体含有异源多核苷酸序列，即该多核苷酸序列不与本发明的多核苷酸天然地邻接，以及优选地衍生自除本发明的多核苷酸所衍生自的物种之外的物种。所述载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，并且典型地是转座子(如在US 5792294中描述)、病毒或质粒。

一类重组载体包括可操纵地连接于表达载体的本发明的多核苷酸。短语“可操纵地连接”指的是多核苷酸插入至表达载体使得转化至宿主细胞时该多核苷酸能被表达。如本文所用，“表达载体”是能够转化宿主细胞和实现特定多核苷酸表达的DNA或RNA载体。优选地，所述表达载体还能够在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核的或真核的，典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞中起作用(即是指导基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、内寄生物、节肢动物、动物和植物细胞内。本发明的载体也可以用于在无细胞表达系统产生多肽，这样的系统在本领域众所周知。

本文所使用的“可操纵地连接”指的是两个或更多的核酸(如DNA)片段的功能性关联。一般地，其指的是转录调控元件与转录序列的功能性连接。例如，如果一个启动子促进或调节编码序列(例如本文定义的多核苷酸)在合适的宿主细胞和/或无细胞表达系统的转录，则其可操纵地连接于该编码序列。通常，可操纵地连接于转录序列的启动子转录调控元件与转录序列物理上邻接，即是，它们是顺式作用。然而，一些转录调控元件，例如增强子，不需要与其增强转录的编码序列物理上邻接或紧密定位。

特别地，本发明的重组载体包含调控序列例如转录调控序列、翻译调控序列、复制起始原点以及其它与宿主细胞相容的和控制本发明的多核苷酸表达的调控序列。特别地，本发明的重组载体包括转录调控序列。转录调控序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录调控序列是控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。合适的转录调控序列包括可以在至少一种本发明中的重组细胞起作用的任何转录调控序列。本领域技术人员已知许多种这样的转录调控序列。优选的转录调控序列包括在细菌、酵母、节肢动物、线虫、植物或哺乳动物细胞中起作用的序列，例如，但不限于，tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α-接合因子、比赤乙醇氧化酶、甲病毒属亚基因组启动子(例如Sindbis病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、棉铃虫(Heliothis zea)昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、洗熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间体早期启动子)、猴病毒40、反转录病毒、肌动蛋白、反转录病毒长末端重复序列、Rous肉瘤病毒、热激、磷酸和硝酸转录调控序列，以及其它能够在原核或真核细胞中控制基因表达的序列。

使用已知技术可以优化本发明的多肽的编码序列而使得在特定的宿主细胞中的表达最大化。

宿主和重组细胞

如本文所用，术语“宿主细胞”指的是能够转化本发明的外源核苷酸的细胞。一经转化，该宿主细胞可以被称为“重组细胞”。术语“重组细胞”包括包含所述多核苷酸的直接或间接的后代细胞。多核苷酸转化至宿主细胞可以通过能将多核苷酸插入至细胞的任何方法实现。转化技术包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附作用和原生质体融合。重组细胞可以保持为单细胞或可以生长成组织、器官或多细胞生物体。转化的本发明的多核苷酸可以保持在染色体外或者可以以保留其表达能力的方式整合至转化(即重组)细胞的染色体的一个或多个位点。

适合转化的宿主细胞包括可以用本发明的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的宿主细胞既可以能够内源(即天然地)产生本发明的多肽，也可以能够在转化至少一种本发明的多核苷酸后产生这样的多肽。本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本发明的蛋白质的任何细胞，包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、线虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的实施例包括沙门氏菌、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、利斯特菌属、酵母菌属、斜纹夜蛾属、分枝杆菌、粉纹夜蛾属(Trichoplusia)、BHK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(如COS-7)细胞以及Vero细胞。宿主细胞进一步的实施例是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生菌；伤寒沙门菌；鼠伤寒沙门菌，包括减弱株；草地贪夜蛾；粉纹夜蛾；以及非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞(如ATCC CRL 1246)。特别优选的宿主细胞是植物细胞。

可以使用重组DNA技术改善外源多核苷酸的表达，通过操纵例如宿主细胞内多核苷酸分子的拷贝数、那些多核苷酸转录的效率、所获得的转录本翻译的效率以及转录后修饰的效率。对增加本发明的多核苷酸表达有用的重组技术包括但不限于将多核苷酸可操纵地连接于高拷贝数质粒、将多核苷酸整合至一或多个宿主细胞染色体、向质粒增加载体稳定性序列、转录调控信号(如启动子、操纵子、增强子)的置换或修饰、翻译调控信号(如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)的置换或修饰、使本发明的多核苷酸符合宿主细胞的密码子使用的修饰以及缺失使转录本不稳定的序列。

转基因植物

本文所用术语“植物”指的是全植物，例如，生长在地里的植物；以及存在于、获得自、衍生自或涉及植物的任何物质，例如，营养性结构(如叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、胚乳和种皮)、植物组织(如维管组织、基本组织等等)、细胞(如花粉)以及相同物质的后代。

在本发明实施中预期使用的植物包括单子叶植物和双子叶植物。靶植物包括但不限于下列的：谷物(小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高粱、黑小麦及相关作物)；甜菜(糖用甜菜和饲料甜菜)；梨果(苹果、梨)、核果(李、桃、杏、樱桃)、热带水果(香蕉、菠萝、木瓜)和软皮小果(樱桃、草莓、覆盘子和黑莓)；豆科植物(菜豆、小扁豆、豌豆、大豆、苜蓿、羽扇豆)；油料植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；瓜类植物(西葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、棉花脱叶剂、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(橙、柠檬、葡萄柚、桔)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、马铃薯、红椒)；樟科(鳄梨、肉桂、樟脑)；或者例如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄、啤酒花、包括多年生草本和虉草的栽培品种sirolan和sirone的草地，和天然橡胶植物，以及观赏植物(花卉，例如水仙、剑兰和郁金香；灌木，例如澳洲毒茄；阔叶树和常绿植物，例如针叶树)。优选地，所述植物是被子植物。

如本文上下文所定义的转基因植物，包括植物(以及所述植物的部分和细胞)和他们的后代，其已经使用重组技术进行遗传修饰使得在所需植物或植物器官中产生至少一种本发明中的多肽。转基因植物可以使用本领域中已知的技术产生，例如通常描述于A.Slater等，Plant Biotechnology-TheGenetic Manipulation of Plants，Oxford University Press(2003)以及P.Christou和H.Klee，Handbook of Plant Biotechnology，John Wiley and Sons(2004)的技术。

“转基因植物”指的是含有在相同的种、变种或品种的野生植物中没有发现的基因构建体(“转基因”)的植物。本文所述的“转基因”，具有生物技术领域的标准含义，包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变并被导入植物细胞的外源多核苷酸序列。所述转基因可以包括来源于植物细胞的多核苷酸序列。典型地，转基因通过人工操作导入植物，例如，通过转化，但是如本领域技术人员所清楚认识的，任何方法都可以被使用。

在本发明的一个优选的实施方案中，转基因植物对每个已导入的基因(转基因)都是纯合的，使得它们的后代的所需表型不分离。转基因植物也可以是导入的基因的杂合体，例如，在从杂交种子长起来的F1代。这样的植物可以提供例如杂种优势的优点，如本领域所公知。

本发明的多核苷酸可以在转基因植物中在所有发育时期组成型表达。根据植物或植物器官的用途，多肽可以以阶段特异的方式表达。此外，所述多核苷酸可以组织特异地表达。

已知或已被发现的使得编码感兴趣多肽在植物中表达的调控序列可以在本发明中使用。使用的调控序列的选择依赖于感兴趣的靶植物和/或靶器官。这样的调控序列可以从植物或植物病毒获得，或可以化学合成。这样的调控序列为本领域技术人员所熟知。

许多适合稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体被描述于，例如，Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual(1985，supp.1987)；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press(1989)；Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers(1990)。通常，植物表达载体包括，例如，在5’和3’调控序列的转录控制下的一或多个克隆的植物基因，以及显性的可选择标记。这样的植物表达载体还可以包含启动子区域(如控制可诱导或组成型、环境或发育调控、细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

许多在植物细胞中有活性的组成型启动子已经被描述。在植物中组成型表达的合适的启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、来自核酮糖-1，5-二-磷酸羧化酶小亚单位的光诱导启动子、水稻细胞溶质磷酸丙糖异构酶启动子、拟南芥腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1启动子、甘露碱合酶和章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合物启动子以及叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子已经被用来创造已在植物中表达的DNA载体，例如参看PCT公开WO 84/02913。所有这些启动子被用于创造各种类型的植物可表达的重组DNA载体。

为了在植物的源组织(如叶、种子、根或茎)中表达，优选本发明中使用的启动子具有在这些特定组织中相对高的表达。为了达到这个目的，可以选择具有组织或细胞-特异或-增强表达的基因的启动子。文献中报道的这样的启动子的实例包括来自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、来自小麦的叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶启动子、来自马铃薯的核光合ST-LS1启动子、来自拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡糖淀粉酶(CHS)启动子。同样报道在光合活性组织中有活性的是来自落叶松(Larix laricina)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子、来自松树的Cab基因(Cab6)的启动子、来自小麦Cab-1基因的启动子、来自菠菜Cab 1R基因的启动子、来自水稻Cab 1R基因的启动子、来自玉米的丙酮酸磷酸双激酶启动子、烟草Lhcb1*2基因的启动子、拟南芥Suc2蔗糖-H³⁰协同载体启动子，以及来自菠菜的类囊体膜蛋白基因(PsaD，PsaF，PsaE，PC，FNR，AtpC，AtpD，Cab，RbcS)的启动子。

叶绿素α/β结合蛋白的其它启动子也可以在本发明中使用例如来自白芥(Sinapis alba)的LhcB基因和PsbP基因的启动子。许多应答于环境、激素、化学和/或发育信号被调控的植物基因启动子也可以用于在植物细胞表达RNA-结合蛋白基因，包括受到(1)热；(2)光(如豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子)；(3)激素，例如脱落酸；(4)伤害(如WunI)；(5)化学物质(例如甲基茉莉酸、水杨酸、类固醇激素、乙醇、安全剂(Safener)(见WO 97/06269))调控的启动子，或者使用(6)器官特异性的启动子也会是有益的。

为了在植物的库组织中表达(例如马铃薯植物的块茎，西红柿的果实，大豆、芸苔、棉花、玉米、小麦、水稻和大麦的种子)，优选本发明中使用的启动子在这些特定组织具有相对高的表达。已知许多具有块茎-特异或-增强表达的基因启动子，包括类别I马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子、马铃薯块茎ADPGPP基因的启动子、蔗糖合酶大小亚基的启动子、包括22kD蛋白质复合物和蛋白酶抑制剂在内的主要块茎蛋白的启动子、颗粒结合淀粉合酶基因(GBSS)启动子以及其它类别I和II马铃薯块茎储藏蛋白启动子。其它启动子也可以用于在特定的组织表达蛋白质，例如种子或果实。可以使用β-伴大豆球蛋白启动子或其它种子-特异启动子例如napin和菜豆球蛋白启动子。玉米胚乳表达的特别优选的启动子是来自水稻的谷蛋白基因启动子，更特别的是Osgt-1启动子。适合于在小麦中表达的启动子实例包括那些二磷酸腺苷葡萄糖pyrosynthase(ADPGPP)亚基、颗粒结合和其它淀粉合酶、分支和脱支酶、胚胎发生丰富蛋白、麦醇溶蛋白以及麦谷蛋白的启动子。用于大麦的这样的启动子的实例包括ADPGPP亚基、颗粒结合和其它淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶、大麦醇溶蛋白、胚球蛋白以及糊粉粒特异性蛋白的启动子。

也可以使用根特异性启动子。这样的启动子的一个实例是酸性几丁质酶基因的启动子。在根组织中的表达也可以通过使用已经鉴定的CaMV 35S启动子的根特异性亚结构域实现。

5’非翻译前导序列可以来源于选择来表达本发明多核苷酸的异源基因序列的启动子，而且如果需要可以进行特定修饰而增加mRNA的翻译。参看Koziel等(1996)对优化转基因表达的综述。5’非翻译区也可以获得自植物病毒RNA(其中烟草花叶病毒、烟草蚀纹病毒、玉米矮花叶病毒、苜蓿花叶病毒)；获得自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)；或获得自合成的基因序列。本发明不限于其中非翻译区来源于自伴随启动子序列的5’非翻译序列的构建体。前导序列也可以来源于不相关的启动子或编码序列。在本文上下文中有用的前导序列包括玉米Hsp70前导序列(见US5362865和US 5859347)以及TMV omega元件。

转录的终止通过在嵌合载体中将3’非翻译DNA序列可操纵地连接于感兴趣多核苷酸而实现。重组DNA分子的3’非翻译区包含在植物中起作用的多腺苷酸化信号，造成在RNA3’末端的腺嘌呤核苷酸的添加。3’非翻译区可以获得自在植物细胞中表达的各种基因。在这方面通常使用胭脂碱合酶3’非翻译区、来自豌豆Rubisco基因小亚基的3’非翻译区、来自大豆7S种子贮藏蛋白基因的3’非翻译区。包含土壤农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的多腺苷酸化信号的3’转录、非翻译区也是合适的。

四种用于将基因直接输送至细胞的一般方法已经被描述(1)化学方法(Graham等，1973)；(2)物理方法例如显微注射(Capecchi，1980)、电穿孔(见WO 87/06614、US 5472869、5384253、WO 92/09696和WO 93/21335)以及基因枪(见US 4945050和US 5141131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis等，1988)；以及(4)受体-介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。

可以使用的加速方法包括，例如，微粒轰击等等。将转化核酸输送至植物细胞的方法的一个实例是微粒轰击。该方法在Yang等，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)中被综述。非生物学颗粒(微粒)可以用核酸包被并由推进力输送至细胞内。示例性的颗粒包括钨、金、铂等等。除了作为可再生转化单子叶植物的有效手段外，微粒轰击的特别优势是既不需要分离原生质体，也不需要对农杆菌侵染的敏感性。通过加速将DNA输送至玉米细胞的方法的说明性实施方案是生物弹道α-颗粒输送系统，其可以推送DNA包被的颗粒通过一格网(例如不锈钢或Nytex格网)，到达覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤纸表面。适于本发明使用的颗粒输送系统是可从Bio-Rad Laboratories获得的氦加速PDS-1000/He枪。

对于该实施方案，悬浮的细胞可以浓缩于滤纸上。将待轰击的含有细胞的滤纸置于微粒停止板下面合适的距离。如需要，也可以在枪和待轰击的细胞之间放置一或多个格网。

可选地，未成熟胚或其它靶细胞可以排在固体培养基上。将待轰击的细胞置于微粒停止板下面合适的距离。如需要，也可以在加速装置和待轰击的细胞之间放置一或多个格网。通过使用本文阐明的技术，可以获得多达1000个或更多瞬时表达标记基因的细胞焦点。轰击48小时后表达外源基因的焦点内的细胞数目范围经常从1至10，平均1至3。

在轰击转化中，可以优化前轰击培养条件和轰击参数以获得最大的稳定转化体数目。在该技术中，物理和生物学参数对于轰击都是重要的。物理因素包括操作DNA/微粒沉淀的因素或影响宏-或微粒的飞行和速度的因素。生物学因素包括在轰击前和刚轰击完的细胞操作的所有步骤，帮助减轻轰击相关创伤的靶细胞渗透压调节，以及转化DNA的性质(例如线性DNA或完整超螺旋质粒)。据信前轰击操作对于未成熟胚的成功转化尤其重要。

在另一个可选的实施方案中，可以稳定地转化质粒。公开的高等植物质粒转化的方法包括含有可选择标记的DNA的颗粒枪输送以及通过同源性重组将DNA靶向质体(见US 5451513、US 5545818、US 5877402、US 5932479和WO 99/05265)。

因此，预期可能希望在小规模研究中调整多方面的轰击参数而全面优化条件。可能特别希望调整物理参数例如间隔距离、飞行距离、组织距离和氦压。通过修改影响受细胞的生理学状态以及因而影响转化和整合效率的条件，也可以使创伤衰减因素最小化。例如，为获得最优转化，可以调整渗透状态、组织水合作用以及传代培养时期或受体细胞的细胞周期。按照本发明的公开，本领域技术人员将知道执行其它常规调整。

农杆菌介导的转运是广泛应用的将基因导入植物细胞的系统，因为DNA可以导入全植物组织，由此避免了需要从原生质体再生为完整植物。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞是本领域公知的(见US 5177010、US 5104310、US 5004863、US 5159135)。另外，T-DNA的整合是相对精确地过程，几乎不造成重排。待转运的的DNA区域由边界序列限定，插入DNA通常插入植物基因组。

现代的农杆菌转化载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制，使得操作方便，如Klee等，Plant DNA Infectious Agents，Hohn and Schell(编辑)，Springer-Verlag，New York(1985)，pp.179-203所描述。此外，用于农杆菌介导的基因转运的载体的技术进步改良了载体中的基因排列和限制性酶切位点，方便构建能够表达多种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有方便的多接头区域，侧翼连接用于直接表达插入多肽编码基因的启动子和多腺苷酸化位点，适合于本发明的目的。另外，含有武装的(armed)和解除武装的(disarmed)Ti基因的农杆菌可以用于转化。在农杆菌介导转化有效的植物种类中，因为其基因转移的温和和限定的特性，农杆菌介导转化是很好的方法。

使用农杆菌转化方法形成的转基因植物通常在一个染色体含有单一的遗传位点。这样的转基因植物可以称作加入的基因的半合子。更优选的是对加入的基因是纯合的转基因植物，即是，转基因植物含有两个加入的基因，在一个染色体对的每个染色体相同位点上含有一个基因。获得纯合的转基因植物可以通过将含有单一加入基因的独立分离的转基因植物进行两性间的交配(自交)，使部分产生的种子萌发并分析获得的感兴趣基因的植物。

也应当理解两种不同的转基因植物也可以交配产生含有两个独立分离的外源基因的后代。合适的后代自交可以产生对两个外源基因都是纯合的植物。也考虑对母本植物的回交以及与非转基因植物的异系杂交，以及营养性繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的说明可以在Fehr，Breeding Methods for Cultivar Development，J.Wilcox(editor)，American Society of Agronomy，Madison WI(1987)中找到。

可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合的方法实现植物原生质体的转化。对不同的植物种类，这些系统的应用基于具体的植物株系从原生质体再生的能力。用于从原生质体再生谷物的说明性方法已被描述(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Abdullah等，1986)。

也可以使用其它细胞转化的方法将DNA导入植物，包括但不限于将DNA直接转入花粉，直接将DNA注射进植物生殖器官，或将DNA直接注射进未成熟胚的细胞随后将干燥的胚再水化。

来自单一植物原生质体或来自多种转化外植体的植物的再生、发育和培育是本领域所公知的(Weissbach等，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，CA.(1988))。该再生和生长过程通常包括以下步骤：选择转化细胞，在从胚胎发育至生根小植株的时期培养那些表现出区别的细胞。类似地再生转基因胚和种子。然后将获得的生根苗种植于合适的植物培养基例如土壤。

含有外来的、异源的基因的植物的发育或再生是本领域公知的。优选地，再生植物自花授粉产生纯合的转基因植物。否则，将获得自再生植物的花粉杂交至农艺学上重要品系的从种子生长的植物。反过来，来自这些重要品系的花粉用于对再生植物授粉。包含所需外源核酸的本发明的转基因植物使用本领域技术人员熟知的方法培育。

主要通过使用根瘤农杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法已经被发表，用于棉花(US 5004863、US 5159135、US 5518908)；用于大豆(US5569834、US 5416011)；用于芸苔(US 5463174)；用于花生(Cheng等，1996)；用于豌豆(Grant等，1995)。

通过导入外源核酸向植物导入遗传变异的对谷物植物(如小麦和大麦)的转化方法，以及从原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法是本领域公知的。参见例如CA 2092588、AU 61781/94、AU 667939、US 6100447、PCT/US97/10621、US 5589617、US 6541257，其它方法展示于WO 99/14314。优选地，转基因小麦或大麦植物通过根瘤农杆菌介导的转化程序产生。携带所需核酸构建体的载体可以被导入可再生的组培植物或外植体的小麦细胞，或合适的植物系统例如原生质体。

可再生的小麦细胞优选来自未成熟胚的盾片、成熟胚、来源子这些的愈伤，或分生组织。

为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在，可以使用本领域技术人员熟知的方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。转基因表达产物基于产物的特性可以用多种方法中的任何一种检测，包括Western印迹和酶测定。一个特别有用的定量蛋白质表达和检测在不同植物组织的复制的方法是使用报告基因，例如GUS。一旦已经获得转基因植物，就可以种植这些植物，产生具有所需表型的植物组织或部分。可以收获所述植物组织或植物部分，和/或收集种子。种子可以充当种植更多植物的来源，所述植物拥有具有所需特性的组织或部分。

除了那些本发明中增强植物对苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的耐受性/抗性的转基因外，本发明的转基因植物可以包括更多的转基因。

转基因非人动物

“转基因非人动物”指的是除了人之外的动物，其含有自同类或同品种野生动物中没有发现的基因构建体(“转基因”)。本文所述的“转基因”，具有生物技术领域的标准含义，包括通过重组DNA或RNA技术产生或改变并被导入动物细胞的外源多核苷酸序列。所述转基因可以包括来源于动物细胞的多核苷酸序列。通常，转基因通过人工操作导入动物，例如，通过转化，但是如本领域技术人员所清楚认识的，任何方法都可以被使用。

产生转基因动物的技术是本领域公知的。在这个主题上一本有用的教科书是Houdebine，Transgenic animals-Generation and Use，HarwoodAcademic(1997)。

异源DNA可以被导入至例如受精的哺乳动物卵子中。例如，全能或多能干细胞可以由显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、反转录病毒侵染或其它手段转化。转化的细胞然后被导入胚胎，然后该胚胎发育成转基因动物。在高度优选的方法中，用包含所需DNA的反转录病毒侵染发育中的胚胎，并从被侵染的胚胎产生转基因动物。

然而，在最优选的方法中，合适的DNA被共注射至胚胎的前核或细胞质中，优选在单细胞时期，使得胚胎发育成成熟的转基因动物。

另一个用于产生转基因动物的方法包括通过标准方法将核酸显微注射至前核时期的卵中。然后培养注射了的卵直到转移至假孕受体的输卵管中。

转基因动物也可以通过核移植技术产生。使用该方法，来自供体动物的成纤维细胞用质粒稳定地转染，所述质粒掺入在调控序列控制下的感兴趣的结合结构域或结合配偶体的编码序列。然后使稳定转染子与无核的卵母细胞融合，培养并转移至雌性受体。

组合物

本发明的组合物可以包括辅药，本文也称作“可接受的承载体”。辅药可以是处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括土壤和水样)可耐受的任何材料。这样的辅药的实例包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液以及其它水性生理学平衡的盐溶液。也可以使用非水赋形剂，如非挥发油、麻油、油酸乙酯或甘油三酯类。其它有用的制剂包括含有粘性增强剂(例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖)的悬液。辅药也可以包括较少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。而防腐剂的实例包括硫柳汞、邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。辅药还可以用于增加组合物的半衰期，例如但不限于，聚合的释放控制赋形剂、生物可分解的植入物、脂质体、细菌、病毒、其它细胞、油、酯和二醇。

此外，本文描述的多肽可以在组合物中提供，其增强苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的水解速率和程度，或增强多肽的稳定性。例如，所述多肽可以固定于聚氨酯基质(Gordon等，1999)，或包裹于合适的脂质体(Petrikovics等，2000a and b)。多肽也可以掺入包括泡沫的组合物中，例如常规用于消防的泡沫(LeJeune等，1998)。

本发明的一个实施方案是释放控制制剂，其能够将本发明的组合物缓慢释放至动物、植物、动物或植物材料、或环境(包括土壤和水样)。如本文所用，“释放控制制剂”包括在释放控制赋形剂中的本发明的组合物。合适的释放控制赋形剂包括但不限于生物相容的聚合物、其它聚合基质、胶囊、微胶囊、微粒、丸药制品、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球(liposphere)和穿皮给药系统。优选的释放控制制剂是生物可降解的(即是生物蚀解的)。

本发明优选的释放控制制剂能够将本发明的组合物释放至土壤或水中，其所在区域含有苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯，特别是敌草隆。该制剂优选地在从大约1至大约12个月的时间范围释放。本发明优选的释放控制制剂能够实现处理优选至少大约1个月，更优选至少大约3个月，甚至更优选至少大约6个月，甚至更优选至少大约9个月，以及甚至更优选至少大约12个月。

产生水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的有效组合物所需的多肽、载体、细菌、提取物或宿主细胞等的浓度将依赖于待净化的样品的性质、样品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的浓度以及组合物的配方。技术人员将了解，组合物中的多肽、载体、细菌、提取物或宿主细胞等的浓度可以用实验容易地确定。

本发明的酶和/或其编码微生物，如在WO 2004/112482和WO 2005/26269中所一般描述，可以在包被组合物中使用，。

抗体

本发明中所用术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双体、三体、复共轭(heteroconjugate)抗体、嵌合抗体(包括完整分子及其片段，例如能够结合表位决定簇的Fab、F(ab′)₂和Fv)以及其它抗体样分子。

抗体片段保持一些选择性地和其抗原或受体结合的能力，并如下定义：

(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体产生，获得完整轻链和重链的一部分；

(2)Fab′，抗体分子的片段，可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，接着还原获得，获得完整轻链和重链的一部分；酶个抗体分子可以获得两个Fab′片段；

(3)(Fab′)₂，抗体分子的片段，可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后不还原而获得；F(ab)2是两个Fab′片段通过两个二硫键结合的二聚体；

(4)Fv，定义为遗传工程改造的片段，其含有以两条链表达的轻链可变区和重链可变区；以及

(5)单链抗体(“SCA”)，定义为遗传工程改造的片段，其含有轻链可变区，重链可变区，通过合适的多肽接头连接为遗传融合的单链分子。

制造这些片段的方法为本领域公知(见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988))。

(6)单域抗体，通常是没有轻链的可变重结构域。

术语“特异地结合”指的是抗体结合至少一种本发明的多肽而不结合其它已知蛋白质的能力，特别不结合SEQ ID NO：3的PuhA。

如本文所用，术语“表位”指的是本发明的多肽由抗体结合的一个区域。可以将表位给予动物而产生针对该表位的抗体。然而，本发明的抗体优选特异地结合整个多肽中的表位区域。

如果需要多克隆抗体，用本发明的免疫原性多肽免疫所选择的动物(如小鼠、兔、羊、马等)。按照已知程序收集并处理来自免疫的动物的血清。如果含有多克隆抗体的血清含有其它抗原的抗体，可以通过免疫亲和层析纯化多克隆抗体。产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域公知的。为了可以制造这样的抗体，本发明也提供了与其它多肽半抗原化的本发明的多肽及其片段，用作在动物中的抗原。

针对本发明的多肽的单克隆抗体也可以由本领域技术人员容易地产生。通过杂交瘤制造单克隆抗体的一般方法学是众所周知的。永生抗体-产生细胞系可以通过细胞融合以及其它技术(例如用致癌基因DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染)创造。可以筛选产生的大量单克隆抗体的不同特性，即同种型和表位亲和力。

可选的技术包括筛选噬菌体展示文库，例如其中噬菌体在它们的外壳表面表达scFv片段和大量不同的互补决定区(CDR)。该技术是本领域公知的。

其它产生本发明的抗体的技术是本领域公知的。

本发明的抗体可以结合于固体支持物和/或在合适的容器中与合适的试剂、对照、说明等一起包装进试剂盒。

在一个实施方案中，可检测地标记本发明的抗体。允许直接测量抗体结合的示例性可检测标签包括放射性标签、荧光团、染料、磁珠、化学发光体(chemiluminescer)、胶粒等等。允许间接测量结合的标签实例包括其底物可以提供有色或荧光产物的酶。另外的示例性可检测标签包括在加入合适底物后能够提供可检测的产物信号的共价结合酶。在缀合物使用的合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。如果不能商业购得，通过本领域技术人员熟知的技术容易产生这样的抗体-酶缀合物。另外，示例性可检测标签包括生物素，其高亲和结合抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素；荧光染剂(如藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和德克萨斯红)，其可以和荧光激活细胞分检器一起使用；半抗原等。优选地，可检测标签允许在平板光度计中直接测量，例如生物素。这样的标记的抗体可用于本领域已知的检测本发明多肽的技术。

微生物保藏细节

分枝杆菌Mycobacterium brisbanense JK1以保藏号V08/013277在2008年5月16日保藏于澳大利亚国家计量研究院，克拉克街51-65号，南墨尔本，维多利亚3205。

该保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》及其细则的规定而作出。这确保从保藏日起维持存活培养物30年。根据布达佩斯条约确保在相关专利授予后公众可永久和无限制的可用性的条款，该生物体可以自国家计量研究院获取。

本申请的受让人同意如果在合适条件下培养时所述培养物保藏死亡或丢失或毁坏，将迅速用相同培养物的可存活样本通知替换。保藏株系的可获得性不解释为对违反任何政府当局根据其专利法律授予的权利而实施本专利的许可。

实施例

实施例1：材料和方法

细菌株系和培养基

Difco^TM营养肉汤、假单胞菌琼脂和营养琼脂购自Becton、Dickinson and Co。Luria肉汤(LB)、LB琼脂、tris-醋酸-EDTA(TAE)、tris-EDTA(TE)和抗生素(潮霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素)如Sambrook等(1989)所描述制备。基本培养基(MM)如Sorensen和Aamand(2003)所描述制备。所有农药及其代谢物是能获得的最高纯度(＞97％)。胺甲萘和对硫磷获得自Chem Service，其它农药购自Sigma。N，N-二甲基，O-4-硝基苯基氨基甲酸酯是Timothy Bugg博士(沃威克大学，英国)的馈赠。利谷隆酯和2-二甲基氨基-5，6-二甲基-4-羟基嘧啶(DDHP)的合成细节在下面显示。

来自施用敌草隆的昆士兰甘蔗种植区的土壤样品由John Reghenzani(BSES Ltd.)提供。土壤样品(1g)在250mL锥形瓶里悬浮子50mLMM，添加10-50ppm敌草隆，以葡萄糖、甘油和丁二酸(各10mM)混合物作为必需碳源。所有富集培养物在28℃黑暗培养。传代培养包括将培养体积0.2-4％转移至新鲜的适当添加的MM。通过用500μL乙腈从500μL培养物中提取代谢物，然后用高效液相色谱法(HPLC)分析观察降解。一旦建立了稳定的敌草隆降解培养物，通过在LB琼脂、营养琼脂(Difco^TM)和假单胞菌琼脂(Difco^TM)上稀释涂板分离单独的细菌菌株。挑取单菌落并用来接种更多瓶适当添加的MM。

大肠杆菌(Escherichia coli)LE392MP(Epicentre)，JM109(Promega)或Electro-10 blue(Stratagene)和分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2在使用合适抗生素的LB琼脂或液体培养基中在37℃下生长。如别处(Jacobs等，1991)所描述制备电感受态M.smegmatis mc2细胞。使用Biorad genepulser II在200Ω、2500V和2.5μF用一次性电穿孔杯(BTX-Harvard apparatus)用0.1-1μgDNA电穿孔转化大肠杆菌和分枝杆菌M.smegmatis。电穿孔后的细胞在500μL LB中37℃生长刚好不超过倍增时间，接着在含有合适抗生素的固体培养基上涂板。在M.smegmatis转化中加入tween 80(0.05％v/v)以确保细胞不结块。球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)D47，含有赋予其敌草隆降解表型的pHRIM620质粒，在含有添加了0.05mg.mL^-1磺胺甲基异恶唑和0.001mg.mL^-1甲氧苄啶的LB的1L瓶中28℃培养23个小时。分枝杆菌M.brisbanense JK1在含有0.05％tween 80的3乘1L的LB中28℃培养2天。

3，4-二氯苯基N-甲氧基-N-甲基氨基甲酸酯(利谷隆酯)的合成

下面是在Wustner等(1978)中用于3-二甲基氨基苯基N-甲氧基-N-甲基氨基甲酸酯(化合物XIV)的方法：

将1.63g的3，4-二氯苯酚(10mmol，Aldrich)称至圆底、膜封口的烧瓶，用氮冲洗并溶解于15ml苯(AR)。加入1.53ml(11mmol)蒸馏三乙胺并将获得的溶液在冰浴冷却。将1.36gN-甲氧基-N-甲基氨基甲酰氯(11mmol，Acros Organics)称入10ml圆底、膜封口的烧瓶，用氮冲洗并溶解于5ml苯。持续10分钟将该溶液加入冰上冷却的二氯苯酚/三乙胺溶液，在加入时将观察到分离出白色沉淀(三乙胺盐酸盐)。1个小时后去掉水浴，反应混合物在室温再搅拌5个小时。然后加入20ml冰水结束反应，分离有机相并用5ml 0.5M盐酸水溶液接着三个5ml饱和盐水洗涤。苯溶液用无水硫酸钠干燥，过滤并且干燥剂用5份苯洗涤。合并滤出液和洗出液并旋转蒸发获得2.53g的浅黄色流动油。

粗产物在5cm直径、10cm柱床的230-400目硅胶(Carlo Erba SDS)急骤层析，蒸馏的氯仿洗脱，收集二十个50ml馏分。合并馏分4-14并旋转蒸发。残留的油溶解于蒸馏氯仿，用直径25mm的0.45μm孔PVDF膜注射器式滤器过滤至已称重的100ml圆底烧瓶。通过旋转蒸发将溶剂除去，得到无色的油，将其置于高真空中过夜。

产率2.36g 94％。

¹H NMR(CDCl₃ 300MHz)：3.28ppm，s，3H，CH₃N；3.59ppm，s，3H，CH₃O；7.04ppm，dd J 8.8，2.8Hz，1H，H-6；7.31ppm，d，J2.8Hz，1H，H-2；7.44ppm，d，J8.8Hz，1H，H-5。

¹³CNMR(CDCl₃，75MHz)：35.4ppm CH₃N；61.7ppm，CH₃O；121.2，123.8，129.3，130.5，132.6，149.4ppm，芳香C；154.0ppm，C＝O。

EIMS：m/z，强度：253，5，M⁺(³⁷Cl₂)；251，28 M⁺(³⁷Cl³⁵Cl)；249，42M⁺(³⁵Cl₂)；162，6M⁺-C₃H₅NO₂；145，9，M⁺-C₃H₆NO₃；133，13；88，100，C₃H₆NO₂；60，56。

微量分析：C₉H₉NO₃Cl₂计算的，C 43.2％、H 3.6％、N 5.6％、Cl 28.4％；得到的C 43.3％，H 3.8％，N 5.4％，Cl 28.8％。

DDHP(抗蚜威代谢物)的制备

在3mL甲醇和2.5mL 2M氢氧化钠水溶液中的119mg(0.5mmol)抗蚜威(Sigma-Aldrich)溶液在油浴120℃回流加热1.5小时。反应混合物在冰上冷却，加入2M的盐酸水溶液将pH从14调至6并冻干溶液。获得的固体用乙酸乙酯提取3次。将合并的提取物蒸发得到97mg的白色结晶物质，通过在120mmx20mm硅胶柱上的急骤层析对其纯化，用3∶2乙酸乙酯∶异丙醇洗脱得到57mg的DDHP，产率68％。

¹H NMR(CDCl₃)：1.88，s，3H；2.15，s，3H，3.12，s，6H，11.95，br，1H。

¹³C NMR(CDCl₃)：10.0，22.3，37.3，105.7，152.0，162.7，165.7。

EIMS，m/z：168，(M⁺+1)，167，M⁺，166，(M⁺-1)，152，138(基峰)，124，123，110，97，83，71，69，55，53。

分枝杆菌M.brisbanense JK1的鉴定和特征描述

用0.2％新鲜培养的M.brisbanense菌株JK1细胞(OD₆₀₀＝～10)的均质悬浮液接种添加10mM葡萄糖、0.13mM敌草隆和18.7mM氯化铵(如需要)的MM(50mL)。培养物在黑暗中28℃以200rpm摇动孵育。以～24小时间隔取样品，用50％乙腈提取代谢物，过滤并用HPLC分析。

进行常规的革兰氏染色和光学显微镜来检查细菌的形态学。用通用引物27f和1492r(Lane，1999)使用菌落PCR扩增M.brisbanense株系JK1的16S rDNA基因，使用高保真聚合酶Pwo(Roche，Mannheim，Germany)以及Eppindorf Mastercycler

，退火温度55℃以及延伸温度72℃。扩增子用QIApick试剂盒(Qiagen)纯化并测序。

pYUB415粘粒文库的构建和筛选

使用酚∶氯仿提取方法(Moore and Dowhan，2002)从M.brisbanense菌株JK1提取基因组DNA并用Sau3AI部分消化获得大约40kb的片段。这些片段经0.8％低熔点琼脂糖TAE凝胶电泳后被纯化，DNA通过稀释和融化琼脂糖提取，琼脂糖可以通过冷冻后的离心及其后的乙醇-盐沉淀除去。所述片段被克隆至已经用BamHI消化和用SAP(Promega)去磷酸化的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pYUB415。按照厂家说明，使用MaxPlax Lambda包装提取物，将pYUB415文库包装至噬菌体颗粒用于侵染大肠杆菌LE392MP细胞。

粘粒DNA用QIAquick(Qiagen)提取自合并的(10个克隆/组)大肠杆菌粘粒克隆的培养物。合并的粘粒DNA通过电穿孔转化至M.smegmatis并在固体培养基上生长细胞。所有长在板上的细胞被洗至含有附加86μM敌草隆的MM的McCartney瓶中并在37℃孵育2-10天，检测敌草隆降解。含有没有插入的pYUB415的M.smegmatis用作负对照。粘粒158用BamHI和BglII(Fermentas，NEB)消化并将片段克隆至pYUB415，转化至M.smegmatis并筛选敌草隆水解酶活性。

常规DNA测序通过Micromon DNA Sequencing Facility(Monash University，Melbourne)进行，而大的DNA片段(20-40kb)测序通过Australian Genome Research Facility(AGRF，University of Queensland，Brisbane)用8倍序列覆盖的鸟枪法测序。通过使用溴化乙锭(Amresco)的在TAE缓冲液的0.5-1.5％琼脂糖(Promega)凝胶电泳，DNA常规地显像。

表达构建体和条件

PuhA和PuhB作为N-六-组氨酸标签融合蛋白从大肠杆菌rosetta II(Novagen)细胞的pET14b(Novagen)和M.smegmatis mc2的pMV261(Stover等，1991)扩增。没有六-组氨酸标签的蛋白质随后在M.smegmatis mc2中表达。用于这些克隆程序的PCR引物记录在表2(SEQ ID NO：5至13)。

表2：用于重组构建体的引物，下划线表示限制性酶切位点。

Pwo聚合酶(Roche)和限制性内切酶NdeI、BamHI和HindIII(Fermentas)按照制造商说明使用。电感受态大肠杆菌菌株JM109(Promega)用于连接反应(使用Promega连接酶)的转化。在大肠杆菌中的蛋白质表达用过夜培养的LB种子培养液接种，然后20℃摇动孵育11个小时随后用0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导3小时。M.smegmatis表达用0.05％tween 80修正并在LB中28℃不诱导生长2-4天。在25mM Tris(pH 8)中重悬细菌随后3次通过弗氏压碎器(Thermo)并在27000g离心(Beckman Avanti)，获得澄清无细胞提取物。

蛋白质定量、纯化和显像

蛋白质浓度使用Bio-rad蛋白质测定法(Bradford)估算，牛血清白蛋白用作标准。蛋白质纯度使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用考马斯亮蓝染色监测。如果在半纯化提取物中估算PuhA和B浓度，SDS-PAGE凝胶用Labscan v5(Amersham Biosciences)扫描并用Total lab TL100(Nonlinear dynamics)进行条带光密度测定。Talon钴树脂(BDBiosciences)用于纯化六-组氨酸标记的蛋白质。非标记蛋白质通过硫酸铵(AS)沉淀，之后疏水作用层析(HIC；Phenylsepharose)、阴离子交换层析(AEX；Macro Q)以及尺寸排阻层析(SEC；Superose 6或Sephadex 200)纯化。所有的柱都购自GE Healthcare。疏水作用柱用Tris(pH 8)/1M硫酸铵平衡，结合的蛋白质然后用超过400mL的Tris(pH 8)洗脱。蛋白质和Tris(pH 8)被结合至阴离子交换柱并用超过500mL的Tris(pH 8)/1M NaCl梯度洗脱。缓冲液在SEC中被交换为25mM HEPES/50mM KCl(pH 8)，蛋白质在该缓冲液中在4℃稳定几周。低聚物结构用Superose 6尺寸排阻柱估计，用下列蛋白质标准(kDa)校正：甲状腺球蛋白(669)、铁蛋白(440)、过氧化氢酶(232)和醛缩酶(158)。按照Campbell等(2008)的方法，通过液相色谱电喷雾离子化质谱/质谱离子阱使用标准胰蛋白酶肽质量指纹图谱确认从聚丙烯酰胺凝胶切下的蛋白质的身份。

酶测定方法的开发

来自生长培养物的的代谢物和酶的测定使用HPLC和液相色谱质谱(LCMS)分析。HPLC用Beckman Gold进行，其用Gold Noveau软件版本分析数据。也使用具有相同说明书的Phenomenex Aqua C18(5μ，

250x4.60mm)反相柱或Phenomenex Synergi反相柱。保护柱是Alltech Adsorbosil C18(5μ，7.5x4.6mm)或Phenomenex C18 Octadecyl(4mm Lx3mm ID)。分析一般使用等度方法用1∶1的乙腈和水(用0.1％磷酸改性)进行。流速从1-1.5mL.min^-1，UV检测器设在250nm。LCMS系统包括一个具有飞行时间检测器的Agilent 1100系列LC系统，其安装了电喷雾离子化进样器。使用甲酸(0.1％)作为LCMS的改性剂。质谱分析一般用默认参数在阳离子模式完成，扫描120V和225V两个电压伏特数。3，4-二氯苯酚和DDHP的分析需要阴离子模式。

开发了高通量的测定方法来帮助描述蛋白质的动力学特征。该方法基于和试剂邻联茴香胺双(重氮)锌复盐(固蓝B盐；FBBS；Sigma)形成有色产物。该方法基于Van Asperen(1962)报道的用于检测α-萘酚(A_max＝600nm)的方法。在当前实例中，和苯脲的苯胺代谢物形成重氮产物产生Abs_max～450nm的黄色，尽管吸收幅度以及该测定方法的灵敏度在苯胺之间各有不同。FBBS(9mg)溶解子MilliQ(MQ)水(9.75mL)中，接着加入5.25mL的10％SDS。在酶测定加入1/6，试剂的加入停止反应。用在丁醇浸泡的吸头除去任何气泡，之后在Spectra MAX190分光光度计(Molecular Devices)上读取A₄₅₀nm。除非另外规定，所有酶测定在25℃在含有0.4％乙腈的25mMMOPS、50mM KCl(pH 6.9)中进行，并对任何非酶水解或背景吸收进行校正。

对氧磷和N-二甲基，O-4-硝基苯基氨基甲酸酯(DMNPC)水解产生的P-硝基酚在A₄₀₀nm下测量，而利谷隆酯和抗蚜威的动力学测定通过LCMS分析。

酶特性描述

通过使用从0.4-18.2％的7个浓度在1个小时中重复测定77μM敌草隆而检测溶剂(乙腈和甲醇)的影响，其通过LCMS监测。温度对酶活性的影响用两种方法确定：第一，催化反应的温度用154μM敌草隆在2-60℃的12个温度做对照；第二，酶在30-55℃的6个温度下预孵育10分钟然后在25℃进行1个小时的测定。残余活性数据通过LCMS获得并拟合至波尔兹曼函数(方程1)

(1) - - - y = y^{\min} + \frac{(y^{\max} - y^{\min})}{1 + e^{\frac{(T - T_{m})}{λ}}}

其中活性(y)通过y^min和y^max(上下渐近线)、T(预孵育温度)、Tm(在Δy/2的溶解温度)以及λ(描述渐近线间的曲线形状的参数)预测。为了监测pH的影响，制备了5-9.5的10个pH值的具有50mM醋酸、50mM MES和100mM Tris(Ellis and Morrison，1982)的恒定离子强度的缓冲液。在每个pH值获得重复的动力学曲线。所有的测定使用负对照对出现的任何非酶水解进行校正。标准品每个注射三次，用于构建3，4-二氯苯胺(DCA)的定量曲线(线性)。酶的数据都拟合至米氏方程(Michaelis-Menten equation)或下面的底物抑制方程：ν＝V_max/(1+I/K_is+K_m/S)。在一些实例中，化合物的溶解度限制阻止了任何超过K_m的速度测量；如果不能进行回归分析，记录的v/[S]斜率或k_cat/K_m。钟形模型(方程2)

(2) - - - {(y)}^{H} = \frac{{(y)}^{\max}}{(\frac{10^{- pH}}{10^{- {pK}_{a} 1}}) + (\frac{10^{- {pK}_{a} 2}}{10^{- pH}}) + 1}

用于对pH拟合活性y，或log(k_cat)和log(k_cat/K_m)。(y)^max是平台值而pK_a ¹和pK_a ²分别是酸和碱基团的表观pK_a值。使用Kaleidagraph v3.6(Synergy Software)拟合方程和数据。底物pK_a值由在线数据库获得www.syrres.com/esc/physdemo.htm(Syracuse Research Corporation)。

基因组和系统进化分析

使用FGENESB(http://www.softberry.com)显示开放读框(ORF)并手动确认。核苷酸和翻译的氨基酸序列使用局部对比基本检索工具(Basic Local Alignment Search Tools，BLAST；Altschul等，1997；and Schaffer等，2001)分析。启动子的鉴定利用BPROM(www.softberry.com)程序。BioEdit v7.0.5.2(Hall，1999)用来鉴定限制性内切酶识别位点，分析启动子区和计算核苷酸相同性得分。

PuhB氨基酸序列的分析使用NCBI保守结构域搜索进行，其显示33个序列与查询序列最不同(由BLAST确定)并分享相似的结构域架构。在除去一个用ClustalW比对不好的序列(gi|28926800)后，构建系统发育树。在Dayhoff(PAM)打分矩阵应用完全缺失选项并使用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)软件4.0版(Tamura等，2007)构建邻接(neighbour joining)树，其自展1000次。

为寻找其它具有NxH基序的序列，应用搜索工具BLASTp和tBLASTn搜索在03/01/2008的NCBI数据库：nr、专利、Env样品(蛋白质)、nr/nt、GSS、WGSS、HTGS、env样品(DNA)和基因组参考序列。

使用和最接近的结构同系物2QS8做出了PuhB活性位点的同源模型(图4)。使用Swiss-PDB Viewer程序(Kaplan和Littlejohn，2001)将保守的金属配体和第二层残基装在2QS8的结构上，在活性位点的单个差异(由N65置换H65)使用COOT程序(Emsley和Cowtan，2004)手动调整。

金属分析

纯化的酶用100kDa的Amicon离心柱(Millipore)浓缩，并用Nanodrop分光光度计测量A₂₈₀定量。理论上的A₂₈₀消光系数值调整为，对PuhA，1A₂₈₀＝1.03mg.mL^-1；对PuhB，1A₂₈₀＝0.98mg.mL^-1。由国家计量研究院使用用于食品样品的内部方法(NATA认可)分析这些样品。简要地，0.2mL样品在聚丙烯管中用2mL浓硝酸通过蒸气浴加热消化2小时，然后用高纯度水稀释至30mL，通过电感耦合原子发射光谱法(ICP-AES)以及电感耦合质谱法(ICP-MS)分析。

实施例2：分离敌草隆降解细菌

从四个暴露于敌草隆的土壤样品建立富集培养物，其中敌草隆是单一氮源。HPLC检测出有一个培养物矿化敌草隆，该培养物连续继代培养8次，活性没有丢失。通过稀释涂板从第四次继代培养物中分离出一个革兰氏阳性细菌的纯菌株。对16S rRNA测序并发现其与分枝杆菌M.brisbanense ATCC 49938T(AY012577)具有99.7％的相同性，该菌是快速生长的分枝杆菌的M.fortuitum第三生物变种(biovariant)复合体的一个成员。该分离菌命名为M.brisbanese JK1，其对敌草隆的降解通过监测在替代氮源存在下使用敌草隆的液体培养中的敌草隆消耗和代谢物DCA的积累而确以。

实施例3：PuhB克隆

使用大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pYUB415从M.brisbanense JK1的总DNA制备粘粒文库。由于在大肠杆菌LE 392MP中筛选的600个粘粒克隆都没有检测到敌草隆水解(数据没有显示)，在M.smegmatis mc2中筛选了320个粘粒克隆(以10个为一组表示)。一个单一组被鉴定出具有敌草隆水解活性。在单独筛选该组合的粘粒时，发现单一粘粒(158)赋予M.smegmatis mc2敌草隆水解活性。

使用限制性酶切消化，大约40kb的插入片段被减至15kb的BglI酶切活性片段，然后减至2kb的BamHI酶切活性片段。使用引物步移法对该2kb的片段进行测序，显示出一个完整的ORF。找到一个1386bp的ORF，其具有和已知的敌草隆水解酶编码基因puhA 79％的核苷酸相同性，而其编码的蛋白质与PuhA具有82％相同性。新鉴定的基因命名为puhB。

对含有puhA的质粒(pHRIM622；(Turnbull等，2001b))和含有puhB的粘粒进行测序并比较。鉴定出启动子区-10、-35、核糖体结合位点(RBS)和回文序列的相似性(图2)。在两个序列中都鉴定出同线性的tetR调控基因(78％的氨基酸相同性)，尽管没有更多的相同性。存在保守的调控基因以及在启动子区存在潜在的转录因子结合位点(回文序列)暗示这些水解酶基因可能位于它们的调控蛋白的基因附近。

实施例4：序列分析

NCBI保守结构域搜索显示PubA和B聚类在金属依赖水解酶A(CD01299)亚家族，其属于酰胺基水解酶超家族。使用32个分歧最大的序列构建了邻接法系统发育树(图3)。与PubA和B最近的枝包含来自节杆菌(Arthrobacter sp.)B-5菌株的有机磷酸水解酶(Ohshiro等，1999)。一般来说，酰胺基水解酶链1上的HxH基序是保守的，并认为是金属结合所必需的(Seibert and Raushel，2005)。然而，苯脲水解酶在该位置具有不同的NxH基序。实际上，当用BLSAT将PuhB与整个非冗余数据库(NCBI)比对时，只鉴定出四个分享NxH基序的短DNA序列，证实其稀有性。

Seibert and Raushel(2005)全面的综述基于其金属结合配体将酰胺基水解酶超家族分为7个亚类。具有已知结构的苯脲水解酶的最近亲缘蛋白是2QS8(来自互生平胞菌属(Alteromonas macleodii)的Xaa-Pro二肽酶)、2P9B(来自长双歧杆菌的假定氨酰基脯氨酸二肽酶)和2GOK(来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的咪唑酮丙酸酶)，所有这些都属于亚类III。该亚类的酶含有单核活性位点，其包含由来自β-链1的HxH基序、β-链5的H和β-链8的D配位的锌或铁。β-链6上的保守的H位于活性位点的第二层，被认为以氢键结合至催化的水分子或底物。有趣的是，这些结构在活性位点还具有一个赖氨酸残基，尽管其不与金属离子配位。在PuhA和B中，HxH基序的第一个H被N替换，暗示这个天冬酰胺参与金属配位。天冬酰胺已知在其它金属酶中参与金属配位(Jackson等，2007)。要证实活性位点的结构，晶体结构是必要的，但用天冬酰胺置换苯脲水解酶(PUH)的组氨酸金属配体使它们区别于其它酰胺基水解酶亚类，并因此形成一个新的结构亚类(VIII；表3)。

图5显示了苯脲水解酶活性位点一部分的同源性模型，所述模型基于2QS8的结构。2QS8活性位点中唯一一个在苯脲水解酶中不保守的残基是第一个组氨酸，其在模型中被天冬酰胺替换。与2GOK的活性位点结构比较，最大的差异是β-链5的组氨酸金属配体的位置；在2QS8他不与金属离子配位并由水分子替换，而在2GOK它与活性位点金属离子配位。不清楚这是功能显著的还是结晶人为假象。除此之外，所述结构都在活性位点包含不是金属配体的组氨酸和赖氨酸残基，尽管该赖氨酸残基不在类似的位置上。最后，显示了紧密配位于活性位点金属离子的水分子。苯脲水解酶中金属结合的水和第二层的组氨酸和赖氨酸残基的催化作用在下面讨论。

表3.酰胺基水解酶亚类I-VIII，修改自Seibert and Raushel(2005)，苯脲水解酶形成新亚类VIII。

^a存在于活性位点，这些残基似乎不连接金属或在某些情况下可以接纳第二个不是催化必需的金属离子。

^b氢键将这些残基连接至水解的水分子。

实施例5：表达和纯化

最初，PuhA和B分别从球形节杆菌(A.globiformis)D47和分枝杆菌M.brisbanense JK1天然表达。通过首先获得30-50％AS分级分离的可溶部分接着通过HIC最后通过SEC纯化这些组成型表达的酶。PuhA达到51的纯化系数(表4)。SDS-PAGE一个与PuhA分子量一致的～50kDa条带的身份通过胰蛋白酶消化肽指纹图谱确认，其得出包括预测的N和C末端的58％的序列覆盖度。N末端片段缺少起始甲硫氨酸，与普通细菌外肽酶加工一致(Giglione等，2004)。不幸的是，天然的PuhB在纯化中失去活性。然而，通过用DMNPC监测活性，使用标定SEC计算得到PuhA和PuhB的天然分子量都是～310kDa，与由6个～50kDa亚基组成的300kDa的六聚体一致。预测的PuhA和PuhB的单体质量(N末端甲硫氨酸除外)分别是48.752和49.546kDa。

表4.天然PuhA和PuhB的纯化

对于重组表达，PuhA和B克隆至pET14b表达载体，并在大肠杆菌Rosetta 2DE3细胞中表达(20℃ 11小时接着用0.1mM IPTG诱导3小时)。通过SDS-PAGE鉴定，在正确分子量处观察到过量表达的条带。然而，与天然表达相比，可溶部分的PuhA比活性低了～10倍，而没有检测到PuhB的活性(数据没有显示)。然后将这些蛋白质克隆至分枝杆菌表达载体(pMV261)并在M.smegmatis中表达。在该实例中，表达PuhA的细胞可溶部分的比活性与天然表达中测量到的相当，而表达PuhB的细胞可溶部分也显示出敌草隆水解酶活性。

然后通过AS沉淀、HIC、AEX和SEC将两个蛋白质都纯化至同质(图6；表5)。纯化的重组蛋白质具有催化活性；经SDS-PAGE鉴定，其具有预测的单体分子量；并经SEC鉴定，其寡聚化成大约～300kDa复合物，最可能是六聚物。

表5.在M.smegmatis表达的PuhA和PuhB的纯化。

胰蛋白酶消化

将SDS-PAGE上的条带切下并切成～1mm的方块。在50μL 1∶1的乙腈/25mM碳酸氢铵中洗2-3次除去考马斯染色，然后用100％乙腈洗一次。样品真空干燥，重溶于1/30稀释的Promega测序级胰蛋白酶溶液和25mM碳酸氢铵(pH7.并通过8)。在37℃过夜孵育达到干燥。样品重溶于0.1％甲酸并通过0.22μm膜(Millipore)过滤，用于MS-TRAP分析。分析由P.Campbell按照Campbell等，2008中的描述进行，使用配有Zorbax SB-C18(5μm，150x0.5mm)柱的Agilent 1100液相色谱仪，联合Agilent XCT离子阱质谱仪(使用具有微喷雾器的电喷雾离子源)。胰蛋白酶消化数据通过Spectrum Mill MS Proteomics Workbench Rev A.03.02.060a Agilent Technologies使用默认设定进行分析。数据首先针对污染物(包括胰蛋白酶、角蛋白和丙烯酰胺)数据库自动验证，然后针对PuhA筛选，最后使用NCBI Eubacteria非冗余蛋白质数据库(11.06)筛选。同样筛选反向数据库以排除假匹配(来自其片段似乎与正向和反向数据库都匹配的大的多肽)。

实施例6：金属分析

序列分析将PuhA和B置于金属依赖的酰胺基水解酶超家族。因此，本发明的发明人通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和电感耦合等离子体原子质谱(ICP-MS)确定了活性位点金属的身份。该分析显示，在测试的第二行过渡金属(Co、Cu、Fe、Mn、Ni和Zn)中，Zn是最冗余的，化学计算得到在PuhA和PuhB中都是每个活性位点0.6个Zn离子。推测是由于过量表达产生一部分的脱辅基酶，另外由于低水平(～5-10％)的无选择性掺入其它金属离子。该结果强烈暗示苯脲水解酶是单核锌酶。

实施例7：酶稳定性

通过在2-35℃之间的温度测定PuhA和PuhB对敌草隆的活性而测试这些酶的亲热性(thermophilicity)(图7)。两种酶的活性最大值在30和35℃之间。然后通过测量在许多温度下孵育后的残余活性而测试两种酶的热稳定性。同样，两种酶表现几乎一致，在40℃孵育10分钟后保持显著活性，超过此条件开始丧失活性。对这些结果作图并拟合波尔兹曼衰减方程，Tm指PuhA在46.6℃、PuhB在46.0℃保持50％活性(图8A)。最后，测定了在溶剂乙腈和甲醇(在1-18％v/v范围内)存在下的稳定性。与PuhA相比，PuhB对使用这些溶剂的弹性似乎略微增加，尽管两种酶在甲醇和乙腈存在下都被显著抑制(图8B)。

实施例8：底物范围和动力学性质

两种酶对15种苯脲除草剂的代谢周转使用LCMS监测(图9)。5种苯脲(恶唑隆、草不隆、环草隆、丁唑隆和噻苯隆)没有可检测的水解，其比其他10种底物显著更庞大，暗示了其对催化抗性的可能的基础。剩余的10种苯脲底物可以通过其侧链不同而分组，如N-二甲基或N-甲氧基-N-甲基化合物，以1和526min^-1的速率(k_cat)周转。N-甲氧基-N-甲基底物利谷隆的周转率(k_cat)比N-二甲基底物敌草隆的高大约9倍，其在其它方面结构一致。实际上，尽管PuhA和B是从选择用于降解敌草隆的细菌中分离出，这两种酶却显示出对利谷隆的最大催化效率(分别37.5和33.9μM^-1.min^-1的k_cat/K_m值)。这两种酶也具有对其它N-甲氧基-N-甲基底物的显著更高的k_cat值。N-甲氧基-N-甲基底物的氧取代基更高的电子吸引特性可能促成所观察到的这些化合物的更快的周转率。

PuhA催化低浓度N-甲氧基-N-甲基苯脲利谷隆的周转比N-二甲基苯脲敌草隆效率更高(K_m 6.8μM对55.0μM)。相反，PuhB具有催化利谷隆和敌草隆的可比的K_m值(7.6μM对11.0μM)。实际上，PuhB显示出比PuhA对N-二甲基底物总体较低的K_m值，异丙隆除外。因此，很可能PuhA和B序列之间的一些序列差异导致底物结合口袋的结构差异，造成PuhB对N-二甲基苯脲水解更有效率的催化。此外，苯脲底物N′-苯基基团的取代似乎显著影响两种酶能有效催化反应的浓度(K_m)。

中性缓冲液中的敌草隆k_non值从Salvestrini等(2002)的工作中估计为2.8x10^-10sec^-1。因此，对敌草隆k_cat为0.48sec^-1的PuhB提供k_cat/k_non1.7x10⁹的速率增强。与相关单核锌或铁亚型III酶相比，腺苷脱氨酶(ADA)和胞嘧啶脱氨酶(CDA)更有优势(k_cat370sec^-1的ADA具有2.1x10¹²的速率增强，k_cat300sec^-1的CDA具有1.1x10¹²的速率增强)(Frick等，1987；Snider等，2000)。

除了苯脲的周转，PuhA和PuhB都显示显著的不严格活性，催化氨基甲酸酯和有机磷酸酯化合物的水解(图9)。对对氧磷的周转率仅稍低于异丙隆，然而苯脲底物抗蚜威是两种酶所检测的最弱的底物，PuhA和PuhB对其的催化效率比敌草隆分别低10⁴和10³倍。合成了利谷隆的氨基甲酸酯类似物(其结合离去基团的酰胺被酯键替换)以比较这些酶对其它部分相似的底物中的酯和酰胺的水解。发现纯化的PuhA和PuhB都水解该底物，和苯脲一样有效(图9)，暗示这些酶是通用水解酶，以及它们水解苯脲酰胺键(与酯键和磷酸脂键相对)的催化特异性是由底物结合口袋形状造成的。

之前显示了节杆菌(A.globiformis)D47的天然可溶提取物水解氨基甲酸酯DMNPC(Robinson，2003)，在本研究中使用纯化的酶确证(图9)。DMNPC周转比弱苯脲底物如甲氧隆效率更高。氨基甲酸酯抗蚜威也被PuhA和PuhB缓慢地周转，不过这两种酶都不催化所测试的另外两种氨基甲酸酯(胺甲萘和禾草丹)的水解。有趣的是，两种蛋白质也都周转有机磷酸酯乙基对氧磷，而不周转硫代磷酸甲基对硫磷。考虑到苯脲水解酶和来自节杆菌(Arthrobacter sp.)菌株B-5的有机磷酸水解酶的序列同源性(Ohshiro等，1999)，这就很有意思。

实施例9：催化机制

进行了pH-活性分析来详细调查苯脲水解酶的苯脲水解机制。如图10所示，两种酶都显示对k_cat/K_m和k_cat在6.5至8.5之间的宽最优pH范围。logk_cat和log k_cat/K_m的作图提供了关于PuhA和B的一些有趣的机制信息。首先，两种酶在pH4至6之间有显著的催化率的增加，可能是由于活性位点金属离子和D344以及可能的H273(PuhB编号)配合产生亲核的氢氧化物。pH 6以下K_m值也有巨大增长。这与活性中心第二层的组氨酸残基(H273)参与底物结合/配位相一致。两种酶在大约为10的pK_e催化效率下降(表6)，可能是由于在活性位点邻近的赖氨酸残基(K206)的去质子化。水解酶活性位点赖氨酸的胺基基团可能作用会是稳定在离去基团上出现的负电荷。基于这些数据，在图11提出了一个催化机制。最后，k_cat和k_cat/K_m都受pH影响，暗示N-C键的水解是速率限制的。PuhA在碱性pH显示K_m的小量增加，而PuhB则没有，暗示这些酶的底物结合口袋可能是不一样的。

表6.酸性和碱性肩(shoulder)

为了研究N′-苯基基团对周转率的动力学影响，制作了N-二甲基底物的

图(pK_a苯基/log k_cat)(图12)。该实验的目的是定量离去基团电学特性对催化率的影响。尽管范围相对小(pK_a在3-5之间)，但这可能是这些酶活性谱的最大范围。log k_cat和pK_a之间的关系是非线性地：在pK_a 4-5之间的斜率是负的，使得PuhA的β_1g值为-1.6而PuhB为-1.1，表明了在过渡状态很大程度的键断裂。该部分数据进行线性拟合(两种酶r²都是0.98)，而pH值在4以下时粗线变平。离去基团相关性的斜率变化通常是由于催化机制或限速步骤的改变(Hong and Raushel，1996；McCain等，2002)。这暗示着对pK_a低于4的高度吸引电子的离去基团，N-C键的断裂可能不再是限速步骤。

对于本领域的技术人员来说，可以对具体实施方案中所显示的本发明做出大量的变形和修改，而不脱离本发明广泛描述的精神和范围。因此，本发明的实施方案应认为在任何一方面都是说明性而不是限制性的。

本文中所讨论和/或引用的多有出版物在此处以其整体一并引入。

本申请请求2008年7月9日提交的US 61/134442的优先权，通过引用将其全部内容并入本申请。

本发明说明书中包括的对文献、法案、材料、装置、物品等等的任何讨论只为了提供本发明的背景。不应该认为是承认这些事物由于其存在于本申请的每个权利要求的优先权日之前便构成现有技术基础或本发明相关的本领域常规技术。

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Claims

1.基本上纯化的和/或重组的多肽，其包括：

i)SEQ ID NO：1的氨基酸序列，

ii)与i)具有至少83％相同性的氨基酸序列，和/或

iii)i)或ii)的生物学活性片段，

其中所述多肽能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯。

2.权利要求1的多肽，其中所述苯脲是N-二甲基取代的苯脲或者N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。

3.权利要求2的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敌草隆、绿麦隆、优草隆、甲氧隆、异丙隆或非草隆。

4.权利要求3的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敌草隆。

5.权利要求3或权利要求4的多肽，其对敌草隆、绿麦隆、优草隆、甲氧隆和/或非草隆的K_m低于包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。

6.权利要求2的多肽，其中所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲是利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或单利谷隆。

7.权利要求1的多肽，其中所述氨基甲酸酯是利谷隆酯或DMNPC。

8.权利要求1的多肽，其中所述有机磷酸酯是对氧磷。

9.权利要求1至8中任一项的多肽，其包括与SEQ ID NO：1具有至少95％相同性的氨基酸序列。

10.权利要求1至9中任一项的多肽，其中所述多肽可以从分枝杆菌纯化。

11.权利要求10的多肽，其中所述分枝杆菌是在2008年5月16日以保藏号V08/013277保藏于澳大利亚国家计量研究院的Mycobacterium brisbanense JK1。

12.权利要求1至11中任一项的多肽，其与至少一种其它多肽融合。

13.分离的和/或外源多核苷酸，其包括：

i)SEQ ID NO：2的核苷酸序列，

ii)编码根据权利要求1至12中任一项的多肽的核苷酸序列，

iii)与i)具有至少80％相同性的核苷酸序列，

iv)在严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，和/或

v)与i)至iv)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

14.权利要求13的多核苷酸，其编码水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的多肽。

15.载体，其包括权利要求13或权利要求14的多核苷酸。

16.权利要求15的载体，其中所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。

17.宿主细胞，其包括权利要求13或权利要求14的至少一种多核苷酸和/或包括权利要求15或权利要求16的至少一种载体。

18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞或细菌细胞。

19.产生权利要求1至12中任一项的多肽的方法，所述方法包括在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养权利要求17或权利要求18的编码所述多肽的宿主细胞、或权利要求15或权利要求16的编码所述多肽的载体，并回收表达的多肽。

20.使用权利要求19的方法产生的多肽。

21.分离的抗体，其特异地结合权利要求1至12中任一项的多肽。

22.组合物，其包括权利要求1至12中任一项或权利要求20的至少一种多肽、权利要求13或权利要求14的至少一种多核苷酸、权利要求15或权利要求16的载体、权利要求17和权利要求18的宿主细胞、和/或权利要求21的抗体。

23.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括权利要求1至12中任一项或权利要求20的多肽和/或权利要求17和权利要求18的宿主细胞。

24.权利要求22或权利要求23的组合物，其包括一或多种可接受的承载体。

25.权利要求22至24中任一项的组合物，其包括金属离子。

26.权利要求25的组合物，其中所述金属离子是Co²⁺、Zn²⁺和/或Mg²⁺。

27.权利要求1至12中任一项的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的用途，其用作检测和/或选择宿主细胞的可选择标记。

28.检测宿主细胞方法，所述方法包括

i)在使得细胞可以摄取编码权利要求1至12中任一项的多肽的多核苷酸的条件下将细胞或一群细胞与所述多核苷酸接触，以及

ii)通过将来自步骤i)的细胞、或其后代细胞暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯选择宿主细胞。

29.权利要求28的方法，其中所述多核苷酸包括编码权利要求1至12中任一项的多肽的第一开放读框，以及不编码权利要求1至12中任一项的多肽的第二开放读框。

30.权利要求29的方法，其中所述第二开放读框编码多肽。

31.权利要求29的方法，其中所述第二开放读框编码不翻译的多核苷酸。

32.权利要求31的方法，其中所述不翻译的多核苷酸编码催化核酸、dsRNA分子或反义分子。

33.权利要求28至32中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。

34.权利要求33的方法，其中所述细胞是植物细胞。

35.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与权利要求1至12中任一项的多肽接触。

36.权利要求35的方法，其中所述多肽由权利要求17或权利要求18的宿主细胞产生。

37.转基因植物，其包括编码权利要求1至12中任一项的至少一种多肽的外源多核苷酸。

38.权利要求37的转基因植物，其中所述多核苷酸稳定整合入植物基因组。

39.权利要求37或权利要求38的植物的部分。

40.权利要求39的植物的部分，其是种子。

41.用于水解样品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将样品与权利要求37或权利要求38的转基因植物接触。

42.权利要求41的方法，其中所述样品是土壤。

43.转基因非人动物，其包括编码权利要求1至12中任一项的至少一种多肽的外源多核苷酸。

44.分枝杆菌的分离菌株，其在2008年5月16日以保藏号V08/013277保藏于澳大利亚国家计量研究院。

45.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括权利要求44的菌株。

46.权利要求17或权利要求18的宿主细胞、权利要求37或权利要求38的转基因植物、权利要求43的转基因非人动物或权利要求44的菌株的提取物，其中所述提取物包括权利要求1至12中任一项的多肽。

47.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的组合物，所述组合物包括权利要求46的提取物。

48.水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与权利要求44的菌株、权利要求45或权利要求47的组合物和/或权利要求46的提取物接触。

49.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的聚合的海绵或泡沫，所述泡沫或海绵包括固定于聚合多孔支持物上的权利要求1至12中任一项的多肽。

50.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与权利要求49的海绵或泡沫接触。

51.产生多肽的方法，所述多肽具有增强的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的能力，或对不同类型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯具有改变的底物特异性，所述方法包括：

i)改变权利要求1至12中任一项的最初多肽的一或多个氨基酸，

52.多肽，其通过权利要求51的方法产生。

53.用于筛选能够水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括：

ii)测定微生物是否能够生长和/或分裂。

54.试剂盒，其包括权利要求1至12中任一项、权利要求20或权利要求52的至少一种多肽，权利要求13或权利要求14的至少一种多核苷酸，权利要求15或权利要求16的载体，权利要求17或权利要求18的宿主细胞，权利要求21的抗体，权利要求22至26中任一项、权利要求45或权利要求47的组合物，至少权利要求39或权利要求40的植物的至少一部分，权利要求44的至少一种菌株，权利要求46的至少一种提取物，和/或权利要求49的至少一种聚合海绵或泡沫。

55.用于水解氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯的方法，所述方法包括将氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯与基本上纯化的和/或重组的多肽接触，所述多肽包括：

i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，

ii)与i)具有至少40％相同性的氨基酸序列，和/或

iii)i)或ii)的生物学活性片段，

其中所述多肽能够水解氨基甲酸酯和/或有机磷酸酯。