KR20110051267A - Ｓ-트리아진 및 디아진을 분해하기 위한 효소 및 방법 - Google Patents

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KR20110051267A
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로빈 제이. 러셀
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존 쥐. 오아케쇼트
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커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
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Abstract

본 발명은 s-트리아진, 예컨대 아트라진, 뿐만 아니라 디아진을 분해하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 s-트리아진 및 디아진의 생물학적 복원 (bioremediation)에서의 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｓ-트리아진 및 디아진을 분해하기 위한 효소 및 방법 {Enzymes and methods for degrading s-triazines and diazines}
본 발명은 s-트리아진, 예컨대 아트라진, 뿐만 아니라 디아진을 분해하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 s-트리아진 및 디아진의 생물학적 복원 (bioremediation)에서의 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
현행의 집약 농업 실무는 효과적인 화학 해충 방제제, 예컨대 트리아진 제초제의 사용에 의해 촉진된다. 예를 들어, 아트라진 (6-클로로-N2-에틸-N4-이소프로필-1,3,5-트리아진-2,4-디아민)은 1958년에 최초로 소개된 이래로 (문헌 [Tomlin, 2006]) 광엽 잡초종의 제어를 위해 광범위하게 사용되어 온, 매우 효과적인 발아 전 및 발아 후 사용하는 트리아진 제초제이다.
환경적으로 적절한 농도에서의 아트라진은 척추동물 종에서 내분비 기능장애 (예를 들어, 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis)의 남성성징소실)에 원인이 되어 관련되어 왔으며 (문헌 [Hayes et al., 2002, 2003 and 2006]), 이는 아트라진이 발암성일 수 있음을 시사하여 왔다 (문헌 [Huff, 2002; Huff and Sass, 2007]). 또한, 그의 광범위한 특이성으로 인해, 아트라진 및 관련된 트리아진 제초제는 비표적 (non-target) 광합성 종에 대한 그들의 독성 작용을 통해 환경 피해를 야기할 가능성이 있다.
아트라진은 환경에서 이동하면서 동시에 잔류한다. 아트라진의 환경 반감기는 4주 내지 57주로 측정되었으며 (문헌 [Belluck et al., 1991]), 아트라진은 수개 국에서 지표수 및 지하수 둘 다에서 검출되었다 (문헌 [Thurman and Meyer, 1996; van der Meer, 2006; Gavrilescu, 2005]).
수개의 유전자/효소계가 탄소 및 질소를 공급원으로서 트리아진 살충제의 이화작용을 허용하는 원핵생물에서 진화해왔다. 이들 경로의 가장 완전한 특성화는 본래 슈도모나스 (Pseudomonas sp. ADP)로부터 단리된 전달성 pADP1 플라스미드 (문헌 [Martinez et al., 2001])로부터의 atzABCDEF 유전자에 의해 인코딩된다 (문헌 [Mandelbaum et al., 1995; de Souza et al., 1995]). 아트라진 및 시마진 (6-클로로-N2,N4-디에틸-1,3,5-트리아진-2,4-디아민)(문헌 [de Souza et al., 1996])은 atzA, atzB 및 atzC에 의해 인코딩된 아미도히드로라아제 족 효소에 의해 연속적으로 탈염소화 및 탈알킬화되어 시아누르산을 생성하며 (문헌 [de Souza et al., 1996; Boundy-Mills et al., 1997; Sadowsky et al., 1998]), 이는 이후에 atzD, atzE 및 atzF에 의해 인코딩된, 경로에서 잔류하는 가수분해효소에 의해 암모니아 및 이산화탄소로 광화된다 (문헌 [Fruchey et al., 2003; Cheng et al., 2005; Shapir et al., 2005a]).
AtzABCDEF 아트라진 분해 이화작용 경로의 AtzA 효소는 25.4% 만이 동일함에도 불구하고, AtzA (문헌 [Shapir et al., 2005b])와 활성에서 중복되는 TrzN 트리아진-분해 효소 (문헌 [Sajjaphan et al., 2004])로 흔히 대체된다. TrzN은, 트리아진 화합물로부터의 클로라이드, 플루오라이드, S-메틸, S(O)-메틸 및 시아노기의 가수분해 치환의 원인이 되는 (문헌 [Shapir et al., 2005b]), 아연-의존성 아미도히드로라아제-족 효소이다 (문헌 [Shapir et al., 2006]). 이는 TrzN이 넓은 범위의 s-트리아진을 표적으로 하며, 반면에 AtzA는 할로겐화 s-트리아진을 해독하는 데에만 사용될 수 있다는 것을 의미한다. TrzN은 클로로-s-트리아진 (예를 들어, 아트라진, 프로파진 및 시마진), 메틸옥시-s-트리아진 (예를 들어, 아트라톤 (atraton), 시메톤 (simeton) 및 프로메톤 (prometon)) 및 메틸티오-s-트리아진 (예를 들어, 아메트린, 프로메트린 및 시메트린) 제초제를 표적으로 한다.
TrzN은 또한 AtzA에 대해 비교할만한 촉매 상수 (2.1 sec-1, AtzA는 5 sec-1임과 비교됨)를 가지나, 아트라진에 대해 훨씬 낮은 Km을 갖는 것으로 보고되었다 (20 μM, AtzA는 100 μM임과 비교됨) (문헌 [Shapir et al., 2006]). 따라서 AtzA는 아트라진에 대해 3.3 x 104의 k cat/Km을 갖는 한편, TrzN은 아트라진에 대해 1 x 105의 k cat/Km을 갖는데, 이는 TrzN이 AtzA보다 촉매적으로 더 효율적인 효소임을 입증한다.
그러나, AtzA와 달리, TrzN은 이종 숙주, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에서 유의한 양으로 발현시키기 어렵다고 판명되었다. TrzN이 분자 샤페론 (chaperone) GroEL과 동시발현될 때 10 mg.mL-1 미만의 최대 수율이 이. 콜라이로부터 얻어지며 (문헌 [Shapir et al., 2006]), 샤페론의 부재 시엔 단지 560 μg.mL-1의 최대 수율이 얻어진다 (문헌 [Shapir et al., 2005b]).
생물학적 복원은 잠재적으로 피해를 줄 살충제 잔류물의 환경 영향을 개선하기 위한 최근 생겨난 접근법이다 (문헌 [Alcalde et al., 2007]). 성공적인 생물학적 복원 전략 중 하나는, 단리된 또는 반-정제된 효소가 그의 독성을 상당히 감소시키는 방식으로 독성 살충제를 이화하거나 변경시키기 위해 사용되는 효소의 생물학적 복원 전략이다 (문헌 [Parales et al., 2002; Sutherland et al., 2004]). 효소의 생물학적 복원은 생존 미생물의 사용보다 많은 이점을 갖는데; GM 유기체 또는 온전한 DNA가 환경으로 방출되면, 사용된 효소는 일반적으로 빠르며 (단지 수 시간의 적용시간이 요구됨), 적용 후에 제한된, 예측가능한 지속성을 갖는다 (문헌 [Alcalde et al., 2007]).
그러나, 생물학적 복원에서 사용될 효소의 요건은 다소 엄격한데, 높은 촉매 활성, 낮은 Km, 확산성 보조인자(co-factor)에 대한 비의존성, 및 환경 조건 (pH, 온도, 염 농도 등)의 범위에 대해 일반적으로 강력한 단백질이 요구된다. 효소는 또한 전형적인 발효 유기체, 예컨대 이. 콜라이에서 높은 가용성, 활성 단백질로 발현되어야 하며, 이러한 관점에서, TrzN은 부적합하다.
아트라진의 잠재적으로 큰 환경적 족적이 우려됨에도 불구하고, 농업에서는 그의 지속적인 사용이 바람직하다. 따라서, 아트라진, 및 다른 s-트리아진 뿐만 아니라 디아진의 환경 피해 가능성을 제거 또는 감소시키기 위한 추가적 방법에 대한 요구가 존재한다.
<발명의 요약>
본 발명자들은 향상된 특성을 갖는 TrzN, 또는 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 40% 이상 동일하고,
i) 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 생성되고/되거나,
ii) 폴리펩티드가 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 가용성 생물학적 활성 형태로 생성된다.
보다 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하고, ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신을 포함하는 폴리펩티드를 추가적으로 인코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 하나의 치환을 갖는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다: T5C, C39A, C76A, C84A, T87C, C101A, T108A, T108A, G112A, A127G, C135T, A157T, C165T, G168A, C180T, C189T, A200T, C207T, G210A, G225T, A228G, C229T, T240C, A250C, C268A, G270A, A271T, T273A, C279T, A296G, A302G, A303G, A314G, C315A, T317C, T320C, A326C, A333G, T336C, C346T, G357A, A367G, C372T, C375A, C381T, T384C, C391A, C391G, C391T, T392C, T392A, T392G, G393C, T399C, C410T, C411A, C411T, A414G, A418C, T423C, T426A, A432T, C438T, C449G, C454T, T466C, T468C, T471C, C474T, G475A, C476T, A481G, C483T, G489A, G489T, T498C, T531A, A537G, A540G, A545G, T546G, G548A, T555C, T555C, C564T, G567A, G567A, G568A, G569A, G573C, T579C, A584T, G589A, A600G, T618C, T618C, T627C, C628G, G630A, C633T, G637A, T639C, T639C, A654G, G660A, G660T, T663C, C675A, G681T, C686T, C690A, C696T, G705A, A723G, C727G, T728C, T728G, G729C, G736A, G737C, G737A, G737T, T738G, T738C, T738C, G745A, G753C, G768A, T774A, C807A, T840A, A843G, A852T, A855G, C867T, T879C, G880A, G880T, G880C, C881T, G882T, C885T, G897A, T900C, T906A, A928G, A938T, T941C, C957A, T959A, C972T, T978A, C981T, C993T, C999T, C1003A, C1003T, T1011C, G1048A, G1048T, G1048C, A1049T, A1049G, G1053A, A1059G, A1086G, G1094A, T1101C, T1101G, C1128T, A1152G, G1176T, C1186A, C1186T, T1196C, C1203T, G1221A, C1223T, C1236T, G1248T, G1270A, C1278T, T1286A, T1305C, G1309A, C1321T, A1326G, C1329T, C1329T, C1332T, C1344A, C1351A 및 G1353T.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 아미노산 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치에서 하나의 치환을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다: I2T, F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, I107T, E109A, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 및 L451M.
추가적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 아미노산들 중 하나 이상에서, 또는 이에 상응하는 하나의 아미노산 위치에서 치환을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다: M82, W85, L86, M92, L131, M163, L172, C211, Y215, H238, E241, L243, M247, H274, P299, D300, M303, W305, T325 및 S329.
또다른 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 번호 468에 상응하는 위치에서 시토신을 포함한다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다:
i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 67에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 91에 상응하는 위치에서 세린, 및/또는
iii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신, 및/또는
iv) 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는
v) 서열 번호 1의 아미노산 번호 161에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는
vi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 210에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는
vii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 243에 상응하는 위치에서 프롤린 또는 글리신, 및/또는
viii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 246에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 리신, 발린 또는 알라닌, 및/또는
ix) 서열 번호 1의 아미노산 번호 294에 상응하는 위치에서 트레오닌, 세린 또는 류신, 및/또는
x) 서열 번호 1의 아미노산 번호 335에 상응하는 위치에서 메티오닌, 및/또는
xi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 350에 상응하는 위치에서 티로신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘, 및/또는
xii) i) 내지 xi) 중 어느 하나의 생물학적 활성 단편.
또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 아미노산 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다:
i) Y313F
ii) Y67F
iii) A159V
iv) A159V, L243P
v) D350Y
vi) G190D, M227I
vii) A159T
viii) A408V
ix) L26M, S161G
x) F13L, A34D, G246A, D350Y
xi) T137I, S140R
xii) L335M
xiii) P210A
xiv) A294T
xv) I123V
xvi) Y67F, V437I
xvii) M163I, D249N
xviii) T137I
xix) G246S
xx) L90M
xxi) A159V, L243P, L451M
xxii) T150S, A159V, A229V, D230E, L243P
xxiii) Y67F, L335M
xxiv) Y67F, K101R, A294T
xxv) L335M
xxvi) V106A, S161G, F177L, L335M
xxvii) S43G, I107T, A159V, D350Y
xxviii) M53L, T137I, S140R, D182G, G190S, D350Y
xxix) A159V, L335M, D350Y
xxx) D28E, A294T, D350N
xxxi) P210A, V424I
xxxii) A159V, G190D
xxxiii) P210A, A294T, R365H, D350Y
xxxiv) I123V, S161G, A294T
xxxv) Y67F, A159V, D350Y
xxxvi) T91S, A159V, A294T
xxxvii) Y67F, A159V, L243P
xxxviii) A159V, P210A
xxxix) A159V, I310V, L335M, L396M, L243P
xl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335M
xli) A159V, L335M
xlii) S84R, D105G, A159V
xliii) Y67F, A294T
xliv) A159V, D182E, L335M, D350Y
xlv) Y67F, A159V, L243P
xlvi) D38N, A159V
xlvii) A159V, M163I, Y195F, D350Y
xlviii) F156L, P210A, D350Y
xlix) Y67F, D350Y
l) A159V, D350Y
li) Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M
lii) E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D
Iiii) A159V, L335M
liv) Y67F, A159V, L335M, D350Y
lv) D38N, L131P, A159V
lvi) T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y
lvii) R183H, P210A, D350Y
lviii) Y67F, A159V, D350Y
lix) A159V, P210A, A294T, D350N
lx) Y67F, A159V, D350N
lxi) A159V, L335M, D350Y
lxii) P210A, A294T, D350Y
lxiii) T91S, A159V, A294T
lxiv) P210A, A294T, L335M, 또는
lxv) Y67F, L335M.
또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 뉴클레오티드 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
i) T468C,
ii) T468C, A938T,
iii) A200T, G210A, T468C,
iv) T468C, C476T, G753C,
v) T468C, C476T, T728C,
vi) T468C, 1048T,
vii) T384C, T468C, G569A, G681T,
viii) T468C, G475A,
ix) C279T, T468C, C1223T, C1329T,
x) C76A, T468C, A481G,
xi) C39A, C101A, T468C, T639C, G737C, G1048T,
xii) C410T, A418C, T468C, A600G,
xiii) T468C, G705A, C1003A,
xiv) T468C, G573C,
xv) T468C, C474T, C628G, C1278T,
xvi) T399C, T468C, G880A, T900C,
xvii) T468C, C1236T,
xviii) T87C, A367G, T468C,
xix) T468C, G1176T,
xx) C135T, T468C, C1344A,
xxi) T468C, A852T,
xxii) T468C, T738C,
xxiii) C454T, T468C,
xxiv) A200T, T468C, G1309A,
xxv) T468C, G489T, G745A,
xxvi) C410T, T468C,
xxvii) T468C, G736A,
xxviii) G225T, C268A, A414G, T468C, T627C, C1321T,
xxix) A432T, T468C, T471C, C476T, T728C, G1053A, C1351A,
xxx) A303G, C449G, T468C, C476T, C686T, C690A, T728C, C1128T,
xxxi) A200T, G210A, C372T, T468C, A654G, C1003A,
xxxii) C180T, A200T, A302G, C375A, T399C, C411T, T468C, A540G,
G880A, T900C,
xxxiii) C229T, T468C, G705A, C1003A,
xxxiv) T317C, T468C, A481G, T531A, G753C, T906A, T978A, C1003A, A1326G,
xxxv) A127G, T320C, T468C, C476T, G753C, G1048T,
xxxvi) A157T, C410T, A418C, T468C, A545G, G568A, A600G, C628G, G630A, G1048T, C1332T,
xxxvii) T468C, C476T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,
xxxviii) C84A, T399C, T468C, C483T, G880A, T900C, G1048A,
xxxix) T468C, T498C, C628G, C885T, A1086G, G1270A,
xl) T384C, T468C, C476T, G569A, G753C, A1152G,
xli) T336C, T468C, C476T, A537G, C564T,
xlii) A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, G1048T, G1094A,
xliii) T273A, A367G, C381T, T399C, T468C, A481G, G880A, T900C,
xliv) A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, G1048T, A1059G,
xlv) A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1236T,
xlvi) A200T, G210A, C346T, T468C, C476T, T579C, T728C, C1278T,
xlvii) C438T, T468C, C476T, A855G,
xlviii) G168A, T426A, T468C, C476T, C628G, C1203T, T1305C,
xlix) T468C, C476T, T663C, C1236T,
l) T384C, T468C, C476T, T728C, A928G, C1003A, C1186A,
li) T5C, C315A, T468C, C476T, G589A, G681T, T728C, G897A, C1003A,
lii) C279T, T468C, C476T, C1003A,
liii) A250C, A314G, T468C, C476T,
liv) A200T, G210A, T468C, T555C, G880A, T900C,
lv) T468C, C476T, T546G, C696T, C1003A, G1048T,
lvi) A200T, G210A, T468C, C476T, T728C, T1101G,
lvii) G112A, C165T, T468C, C476T, T618C, G753C, C999T, T1101C,
lviii) T423C, T468C, C476T, G489A, A584T, G753C, G1048T,
lix) T466C, T468C, C474T, C628G, G1048T,
lx) T108A, A200T, G210A, G357A, T468C, G1048T, A1059G, C1278T,
lxi) T468C, C476T, G567A, G753C, G1048T,
lxii) A200T, G210A, A296G, T468C, C476T, G637A, T728C, C1003A,
lxiii) C189T, A326C, T468C, C476T, T941C, T959A, A1059G, C1186T, T1196C, G1248T, T1286A,
lxiv) T468C, C476T, C1003A,
lxv) A200T, G210A, C279T, T468C, C476T, T879C, C1003A, G1048T,
lxvi) G112A, C165T, T392C, T468C, C476T, T618C, G660A, C675A, G753C, C807A, C993T, C999T, T1101C, T1305C,
lxvii) A271T, T392C, T468C, C476T, G753C, G880A, G1048T, G1094A, C1186A, G1221A,
lxviii) A228G, T240C, T468C, G548A, C628G, G1048T, C1332T,
lxix) T108A, A200T, G210A, T423C, T468C, C476T, G567A, G1048T,
lxx) T384C, T468C, C476T, C628G, C867T, G880A, T900C, C981T, G1048A, A1326G,
lxxi) A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, T840A, T900C, G1048A,
lxxii) T468C, C476T, C633T, G660T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,
lxxiii) A228G, T240C, G270A, T468C, C628G, 880A, G1048T,
lxxiv) A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1003T, C1236T,
lxxv) A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, C957A, C1003A, 또는
lxxvi) A200T, G210A, C411A, T468C, T555C, T639C, A654G, G768A, T774A, C972T, C1003A, T1011C, G1353T.
한 실시양태에서, 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 폴리펩티드의 양이 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상 생성된다.
추가적 실시양태에서, 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 가용성 생물학적 활성 폴리펩티드의 양이 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상 생성된다.
대체적 실시양태에서, 이. 콜라이 균주 BL21 λDE3에서 발현시키고, 200 μg.mL-1 앰피실린, 1 μM IPTG로 보충되고, 1 mg.mL-1 아트라진 (90% 아트라진 w/w)으로 함침시킨 LB 아가 플레이트 상에서 배양시킬 때, 콜로니 부근에서 배지의 정화는 배양시킨지 약 8일 이내, 보다 바람직하게는 약 6일 이내, 보다 더 바람직하게는 약 2일 이내에 검출될 수 있다. 그러한 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 발현은 실시예 부분에서 추가로 상세하게 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 2배 이상 더 큰, 보다 바람직하게는 5배 이상 더 큰, 보다 더 바람직하게는 7배 더 큰 아트라진 가수분해 활성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 2배 이상 더 큰, 보다 바람직하게는 5배 이상 더 큰 시마진 가수분해 활성을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 의해 가수분해될 수 있는 s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 또는 시아노진이 포함된다.
박테리아 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생성할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 박테리아 세포는 이. 콜라이이다. 이. 콜라이의 적합한 균주의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, BL21 λDE3 (ATCC 수탁 번호 PTA-2657), JM109 및 DH10β가 포함된다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 다른 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 하나 이상의 다른 폴리펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성을 증진시키는 폴리펩티드, 예컨대 박테리아 세포 또는 효모 세포와 같은 세포로부터 융합 단백질의 분비를 촉진하는 폴리펩티드, 또는 융합 단백질의 정제를 돕는 폴리펩티드일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 샤페론을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 숙주 세포의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포가 포함된다.
추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 세포를 포함하는 형질전환 식물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 세포를 포함하는 형질전환 인간 이외의 동물을 제공한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해하는, 실질적으로 정제된 또는 정제되지 않은 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 40% 이상 동일하고, 여기서
i) 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 1과 같이 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 생성되고/되거나,
ii) 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1과 같이 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 가용성 생물학적 활성 형태로 생성된다.
보다 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴, 및 ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 가수분해될 수 있는 s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 또는 시아노진이 포함된다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 다른 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질이다. 하나 이상의 다른 폴리펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성을 증진시키는 폴리펩티드, 박테리아 세포 또는 효모 세포와 같은 세포로부터의 융합 단백질의 분비를 촉진시키는 폴리펩티드, 또는 융합 단백질의 정제를 돕는 폴리펩티드일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 고체 지지체 상에서 고정된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 식물 및/또는 본 발명의 동물의 추출물을 제공하며, 여기서 추출물은 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 추출물, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 s-트리아진 또는 디아진을 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 추출물 및/또는 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, s-트리아진 또는 디아진을 가수분해하기 위한 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 샘플은 토양, 물, 생물학적 물질 또는 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 추출물 및/또는 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 s-트리아진 또는 디아진에 의해 야기된 독성을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 s-트리아진 또는 디아진에 의해 야기된 독성을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 추출물 및/또는 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해할 수 있는 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건 하에, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 숙주 세포, 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 벡터를 배양하고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 방법을 포함한다.
또다른 추가적 측면에서, 본 발명은,
i) 세포(들)에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 허용하는 조건 하에 세포 또는 세포군을 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및
ii) i) 단계로부터의 세포, 또는 그의 자손 세포를 s-트리아진 또는 디아진에 노출시킴으로써 숙주 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 숙주 세포를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 오픈 리딩 프레임 (open reading frame), 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
한 실시양태에서, 제2 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 인코딩한다. 제2 실시양태에서, 제2 오픈 리딩 프레임은 번역되지 않은 폴리뉴클레오티드를 인코딩한다. 두 경우에서, 제2 오픈 리딩 프레임이 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이 바람직하다.
바람직하게는, 번역되지 않은 폴리뉴클레오티드는 촉매 핵산, dsRNA 분자, 또는 안티센스 분자를 인코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 식물 세포이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명의 추출물 및/또는 본 발명의 조성물을 포함하는, s-트리아진 또는 디아진을 가수분해하기 위한 키트를 제공한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 결정을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 s-트리아진 또는 디아진의 후보 폴리펩티드와의 결합 능력을 산출적으로 평가하기 위해 본 발명의 결정의 원자 동등물을 사용하고, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 선택하는 것을 포함하는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 고안하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면의 바람직한 특징 및 특성은 본 발명의 다수의 다른 측면에 적용될 수 있음이 명백할 것이다.
본원에서 단어 "포함한다", 또는 그의 변형, 예컨대 "포함하고" 또는 "포함하는"은 언급된 인자, 정수 또는 단계, 또는 인자들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하되, 임의의 다른 인자, 정수 또는 단계, 또는 인자들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예 및 첨부한 도면을 참고하여 이하에 기재되어 있다.
본 발명은 환경적으로 피해를 야기함에도 불구하고 농업에서 지속적으로 사용되고 있는 제초제 성분인 s-트리아진, 예컨대 아트라진, 뿐만 아니라 디아진을 분해하기 위한 폴리펩티드, 및 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 s-트리아진 및 디아진의 생물학적 복원에서의 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도를 제공함으로써 아트라진, 및 다른 s-트리아진 뿐만 아니라 디아진의 환경 피해 가능성을 제거 또는 감소시키는 데 기여한다.
도 1. 본 발명의 효소에 의해 분해되는 다양한 s-트리아진의 구조.
도 2. pETcc2::egfp의 도식적 표현.
도 3. 야생형 TrzN, TrzN cc3.2 및 중간 돌연변이체 형태의 부분적 정제. 야생형 TrzN에 대한 수치는 문헌 [Shapir et al. (2005)]을 참조하였으며, 5리터에서 2.8 mg의 수율로 얻었다. 분자량 마커는 (레인 M)에 포함되며, 그의 분자량 (kDa)이 제시되어 있다. TrzN 및 그의 변이체의 위치는 화살표로 나타내었다. TrzN 및 그의 변이체의 동일한 정제로부터 동등한 부피 (5 μl)를 각각의 레인에 첨가하였다.
도 4. TrzN 구조의 도식 및 그림. TrzN은 99.6 kDa의 호모다이머 (homodimer)를 형성한다. 각각의 모노머는 2개의 도메인: β-샌드위치 도메인 및 β/α8 바렐(barrel) 도메인으로 나뉜다. β/α8 바렐은 활성부 입장을 변형시키거나, 또는 다이머 접점을 추가적으로 형성하는 데 기여하는 수개의 루프 삽입부를 상부 표면에 갖는다.
도 5. TrzNcc3.2의 기질 결합 포켓을 구성하는 잔기를 나타내는 도식. 아트라진, Zn2 + 중심 및 수산화 이온 (OH-)이 중심부에 제시되었다. 기질 결합 포켓을 포함하는 아미노산의 동일성 및 서열 위치를 나타낸다.
도 6. Apo-TrzNcc3.2의 Zn2 +과의 포화도. 최대 활성의 반은 2.6 μM ZnCl2에서 회수되었다.
도 7. 활성 부위 아미노산 잔기 및 금속 동등 아미노산 잔기의 도식. 아트라진, Zn2 + 및 수산화 이온 (OH-)이 중심부에 제시되었고, 관련된 잔기의 동일성 및 서열 위치가 제시되어 있다.
도 8. TrzN의 제안된 반응 메카니즘을 기술하는 도식.
도 9. TrzN과 아메트린의 속도 상수 (k cat)와 반응 완충제의 pH의 관계.
도 10. TrzNcc3.2로 시행한 실지 시험 결과. TrzNcc3.2의 첨가 후에 10.5시간 경과시 댐에 보유된 1.5 ML에서 아트라진의 소모. 샘플은 QHFSS (Squares), 및 CSIRO 곤충학 (Entomology) (Circles)에 의해 분석하였다.
<서열 목록의 핵심>
서열 번호 1 - 야생형 TrzN의 아미노산 서열.
서열 번호 2 - TrzN (TrzNco)을 인코딩하는 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임.
서열 번호 3 - TTT에서 TTC로 156번째 코돈 변화된 TrzN (Trz L1)을 인코딩하는 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임.
서열 번호 4 - 야생형 TrzN을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임.
서열 번호 5 내지 30 - 올리고뉴클레오티드 프라이머.
<발명의 상세한 설명>
일반적인 기술 및 정의
별도로 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 생물학적 복원, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학 분야의) 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는것으로 받아들여져야 한다.
다르게 제시되지 않는 한, 본 발명에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 당업자에게 익히 공지된 표준 절차이다. 그러한 기술은 출처인 문헌, 예컨대 문헌 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 [F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 갱신된 최근 정보를 모두 포함함)], [Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 갱신된 최근 정보를 모두 포함함)]를 통해 기재되거나 설명되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "가수분해하다", "가수분해하는", "가수분해 활성" 및 그의 변형은 화학 결합의 가수분해를 촉진시키기 위한 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 효소는 하나 이상의 하기 효소이다: 데할로게나아제 (예를 들어, 클로로히드로라아제, 플루오로히드로라아제, 할로히드로라아제, 가수분해 데클로리나아제, 가수분해 데플루오로나아제 및/또는 가수분해 데할로게나아제), 메톡시히드로라아제 및 메틸티오히드로라아제. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 효소 활성의 생성물이 s-트리아진 또는 디아진 기질보다, 예를 들어 포유동물 및/또는 어류에게 덜 독성이고/이거나, 덜 안정하도록 s-트리아진 또는 디아진을 "분해한다".
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "보다 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성"은 서열 번호 1과 같이 제시된 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 s-트리아진 또는 디아진에 대한 보다 높은 특이적 활성, 촉매 상수 (k cat), 기질 특이성 (Km) 및/또는 2차 속도 상수 (second order rate constant) (k cat/Km)를 갖거나, 또는 보다 큰 안정성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 나타낸다. 특이적 활성은 실시예에 약술된 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 어구 "하기에 상응하는 아미노산 위치에서" 및 "아미노산 번호에 상응하는 위치에서"는 주변 아미노산과 비교하여 아미노산의 상대적인 위치를 나타낸다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열 번호 1에 대해 정렬된 아미노산의 상대적 위치결정을 변경하는 결실 또는 치환 돌연변이를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 지명된 잔기 번호에서 정의된 아미노산을 포함한다.
비슷하게는, 어구 "하기에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서" 및 "뉴클레오티드 번호에 상응하는 위치에서"는 주변 뉴클레오티드와 비교하여 뉴클레오티드의 상대적 위치를 나타낸다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 대해 정렬된 아미노산의 상대적 위치결정을 변경하는 결실 또는 치환 돌연변이를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 지명된 뉴클레오티드 번호에서 정의된 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 s-트리아진 또는 디아진에 의해 야기된 독성의 하나 이상의 징후를 감소 또는 제거하기에 충분한, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다.
용어 "생물학적 물질"은 생물학적 기원의 임의의 생성물을 포함하는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 그러한 생성물에는, 여기에 제한되지 않지만, 인간을 위한 식품 및 동물 사료가 포함된다. 그러한 생성물에는 물 및 액체 식료품, 예컨대 우유, 뿐만 아니라 반고체 식료품, 예컨대 요거트 등이 포함된다. 본 발명은 또한 고체 식료품, 특히 동물 사료도 포함한다. 한 실시양태에서, 생물학적 물질은 식물 물질, 예컨대, 비제한적으로, 사탕수수, 캐놀라 씨, 밀 씨, 보리 씨, 수수 씨, 벼, 옥수수, 파인애플, 또는 목화씨인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "추출물"은 본 발명의 숙주 세포, 식물 또는 인간 이외의 형질전환 동물의 임의의 부분을 나타낸다. 부분은 온전한 독립체, 예컨대 식물의 씨이거나, 또는 적어도 부분 균질화 및/또는 정제에 의해 얻어질 수 있다. 이 용어는 숙주 세포로 분비된 부분을 포함하므로, 따라서 배양 상청액을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "샤페론"은 세포로부터 단백질의 배출 (exportation)을 변경시키기 위해 다른 단백질이 적절한 폴딩, 또는 언폴딩을 달성하는 것을 돕는 기능을 하는 단백질을 나타낸다. 샤페론은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 여기에 제한되지는 않지만, 리보좀 결합 단백질, 예컨대 유발 인자 (trigger factor: TF): 샤페론의 Hsp7O 족, 예컨대 Hsp70, DnaK, Hsp40, DnaJ, GrpE 및 샤페론의 샤퍼로닌 족, 예컨대 GroEL, GroES, Hsp60, Hsp10이 포함된다. 비제한적인 예로, 이. 콜라이로부터의 샤페론 GroEL은 샤페론의 열 충격 (heat shock) 단백질 60 (Hsp60) 클래스의 구성원이며, 이. 콜라이 GroE 오페론 (operon)으로부터 GroES와 함께 발현된다. GroEL은 응집하기 쉬운 폴리펩티드 중간체의 농도 및 탈경로 (off-pathway) 응집의 속도를 감소시키는 언폴딩된 단백질과 결합하여 본래 형태로의 분배를 도움으로써 단백질 폴딩 반응을 돕는다. 보조-샤퍼로닌 GroES 및 보조인자, 예컨대 ATP, K+ 및 Mg2 +은 GroEL 매개된 폴리펩티드 폴딩 반응의 수율을 추가로 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 당업자는 샤페론 매개된 (또는 보조된) 단백질 폴딩을 개선하거나 증진시키기 위해 당업계에 공지된 성분, 보조인자, 부가적 샤페론 단백질 등을 포함할 것이다. GroEL을 인코딩하는 데 사용될 수 있는 벡터의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, dnaK-dnaJ-grpE-groES-groEL을 함유하는 pG-KJE8, groES-groEL을 함유하는 pGro7 및 groES-groEL-tig를 함유하는 pG-Tf2가 포함된다 (문헌 [Nishihara et al, 1998 and 2000]).
s- 트리아진 및 디아진
본원에서 사용된 바와 같은, "s-트리아진"은 3개의 탄소 원자 및 3개의 질소 원자로 이루어진 6원 헤테로사이클 방향족을 갖는 화학 구조를 포함하는 유기 화학 화합물이다. 트리아진 고리 중 원자는 벤젠 고리 중의 원자와 유사하다. 본 발명의 효소에 의해 가수분해(분해)되는 s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 클로로-s-트리아진, 플루오로-s-트리아진, 메틸티오-s-트리아진 및 메틸옥시-s-트리아진이 포함된다. 본 발명의 효소에 의해 가수분해(분해)되는 특정 s-트리아진의 화학 구조는 도 1에 제시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, s-트리아진은 -2-Rl-4-R2-6-R3-1,3,5-트리아진의 구조를 갖는데; 여기서 Rl은 Cl, Fl, OCH3, SCH3, S(O)CH3, 또는 N3일 수 있고, 여기서 R2 또는 R3은 OCH3, NHCH2CH2OH, NH(CH2)2CH3, NH(CH2)3CH3, NHCH2CH(CH3)2, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC(CH3)2CN, NHC(CH3)3, NH2, 또는 OH일 수 있다.
염소화 (클로로) s-트리아진은 하나 이상의 클로라이드를 포함한다. 염소화 s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 아트라진 (6-클로로-N-에틸-N'-(1-메틸에틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민) (도 1 참조), 클로라진 (6-클로로-N,N,N',N'-테트라에틸-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 시아나진 (2-[[4-클로로-6-(에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노]-2-메틸프로판니트릴), 시프라진 (6-클로로-N-시클로프로필-N'-(1-메틸에틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 에글리나진 (N-[4-클로로-6-(에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]글리신), 이파진 (6-클로로-N,N-디에틸-N'-(1-메틸에틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 메소프라진 (6-클로로-N-(3-메톡시프로필)-N-(1-메틸에틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 프로시아진 (2-[[4-클로로-6-(시클로프로필아미노)-1,3,5-트리아진-2-일]아미노]-2-메틸프로판니트릴), 프로글리나진 N-[4-클로로-6-[(1-메틸에틸)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일]글리신), 프로파진 (6-클로로-N,N'-비스(1-메틸에틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 세부틸라진 (6-클로로-N-에틸-N'-(1-메틸프로필)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민, 시마진 (6-클로로-N,N'-디에틸-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 테르부틸라진 (6-클로로-N-(1,1-디메틸에틸)-N'-에틸-1,3,5-트리아진-2,4-디아민) 및 트리에타진 (6-클로로-N,N,N'-트리에틸-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 뿐만 아니라 (아트라진 탈알킬기, 예컨대 데스에틸 아트라진 및 데스이소프로필 아트라진을 비롯한) 클로로-s-트리아진 탈알킬화의 생성물이 포함된다.
메틸티오-s-트리아진은 하나 이상의 티올기를 포함한다. 메틸티오-s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 아메트린 (Ν2-에틸-Ν4-이소프로필-6-메틸티오-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 프로메트린 (N2,N4-디이소프로필-6-메틸티오-1,3,5-트리아진-2,4-디아민) 및 시메트린 (N2,N4-디에틸-6-메틸티오-1,3,5-트리아진-2,4-디아민)이 포함된다.
메톡시-s-트리아진은 하나 이상의 메톡시기를 포함한다. 메톡시-s-트리아진의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 아트라톤 (N2-에틸-N4-이소프로필-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2,4-디아민), 시메톤 (N2,N4-디에틸-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2,4-디아민) 및 프로메톤 (N2,N4-디이소프로필-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2,4-디아민)이 포함된다.
플루오로-s-트리아진은 하나 이상의 불소를 포함한다. 플루오로-s-트리아진의 예는 플루오르아트라진 (2-플루오로-4-N-에틸아미노-6-N-이소프로필아미노-1,3,5-트리아진)이다.
한 실시양태에서, s-트리아진은 하나 이상의 N-에틸, N-이소프로필, N-디에틸 및/또는 N-시아노디메틸메틸 알킬 측쇄를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 디아진은 구조 -2-R1-4-R2-6-R3-1,3-피리미딘을 가지며, 여기서 R1은 Cl, Fl, OCH3, SCH3, S(O)CH3, 또는 Ν3일 수 있고, 여기서 R2 또는 R3은 OCH3, NHCH2CH2OH, NH(CH2)2CH3, NH(CH2)3CH3, NHCH2CH(CH3)2, NHCH(CH3)CH2CH3, MHC(CH3)2CN, MHC(CH3)3, NH2, 또는 OH일 수 있다. 디아진 유형의 예에는, 여기에 제한되지는 않지만, 클로로-s-디아진 및 플루오로-s-디아진이 포함된다. 제초제인 디아진의 예는 브로마실 (5-브로모-3-sec-부틸-6-메틸우라실)이다.
폴리펩티드
"실질적으로 정제된" 또는 "정제된"에 대해 본 발명자들은 정상 상태에서 함께 결합된 하나 이상의 지질, 핵산, 다른 폴리펩티드, 또는 다른 오염 분자로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 자연적으로 결합된 다른 성분으로부터 60% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 자유로운 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드가 자연적으로 존재한다는 증거는 현재 없다.
폴리펩티드의 문맥에서 용어 "재조합"은 정상 상태와 비교하여 변경된 양 또는 변경된 비율로 세포, 또는 무세포 발현계에서 생성된 폴리펩티드를 나타낸다. 한 실시양태에서 세포는 폴리펩티드를 자연적으로 생성하지 않는 세포이다. 그러나, 세포는 생성될 폴리펩티드의 양을 변경시키는, 바람직하게는 증가시키는 비내인성 유전자를 포함하는 세포일 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 형질전환 (재조합) 세포의 다른 성분, 또는 그것이 생성된 무세포 발현계로부터 분리되지 않은 폴리펩티드, 및 최소한 특정 다른 성분으로부터 후속적으로 정제된, 그러한 세포 또는 무세포계에서 생성된 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 일반적으로 상호 교환가능하게 사용되며, 비-아미노산기의 첨가에 의해 변경되거나 변경되지 않을 수 있는 단일 폴리펩티드 쇄를 나타낸다. 그러한 폴리펩티드 쇄는 다른 폴리펩티드 또는 단백질 또는 다른 분자, 예컨대 보조 인자와 결합될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 또한 본원에 기재된 폴리펩티드의 변이체, 돌연변이체, 생물학적 활성 단편, 변형체, 유사체 및/또는 유도체를 포함한다.
폴리펩티드의 % 동일성은 갭 생성 패널티 (gap creation penalty)=5, 및 갭 확장 (extension) 패널티=0.3으로 GAP (Needleman and Wunsch, 1970) 분석 (GCG 프로그램)에 의해 결정된다. 질의 (query) 서열은 길이가 아미노산 25개 이상이며, GAP 분석은 25개 이상의 아미노산 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 아미노산 50개 이상이며, GAP 분석은 50개 이상의 아미노산 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 아미노산 100개 이상이며, GAP 분석은 100개 이상의 아미노산 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 아미노산 250개 이상이며, GAP 분석은 250개 이상의 아미노산 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 아미노산 400개 이상이며, GAP 분석은 400개 이상의 아미노산 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, GAP 분석은 서열의 전체 길이 상에서 2개의 서열을 정렬한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "생물학적 활성 단편"은 전장 폴리펩티드의 한정된 활성을 유지하는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 부분이다. 생물학적 활성 단편은 정의된 활성을 유지하는 길이의 임의의 크기일 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 활성 단편은 길이가 아미노산 100개 이상, 보다 바람직하게는 400개 이상이다.
바람직한 실시양태는 "가용성 생물학적 활성 형태"로 생성된 폴리펩티드에 관한 것이다. 당업자는 이것이 세포에서 발현될 때 불용성, 따라서 비활성, 형태로 존재하지 않는 폴리펩티드를 나타냄을 인정할 것이다. 또한, 생물학적 활성은 s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해시키는 능력을 의미한다.
정의된 폴리펩티드에 대해, 상기 제시된 것보다 높은 % 동일성 수치가 바람직한 실시양태를 포함할 것임이 인정될 것이다. 따라서, 해당되는 경우, 최소한의 % 동일성 수치를 고려하여, 폴리펩티드는 적절한 지명된 서열 번호에 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 91% 이상, 보다 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.1% 이상, 보다 바람직하게는 99.2% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상, 보다 바람직하게는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상, 보다 바람직하게는 99.6% 이상, 보다 바람직하게는 99.7%, 보다 바람직하게는 99.8%, 보다 더 바람직하게는 99.9% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열 돌연변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화가 본원에 정의된 핵산으로 도입되거나, 또는 바람직한 폴리펩티드의 시험관내 합성에 의해 생성될 수 있다. 그러한 돌연변이체는, 예를 들어, 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 조합물이 최종 구조물에 도달하기 위해 만들어질 수 있으며, 단 최종 폴리펩티드 생성물은 바람직한 특성을 지닌다.
돌연변이체 (변경된) 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 시험관 내 돌연변이 생성이 수행될 수 있다. 그러한 시험관 내 돌연변이 생성 기술은 폴리뉴클레오티드의 적합한 벡터로의 서브-클로닝, 벡터의 "돌연변이 유발" 균주, 예컨대 이. 콜라이 XL-1 레드 (Stratagene)로의 형질전환 및 세대의 적합한 수를 위한 형질전환된 박테리아의 증식을 포함할 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하라야마 (Harayama)에 의해 가장 넓게 기재된 바와 같은 (1998) DNA 셔플링 기술이 수행된다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유래된 생성물은 바람직한 표현형, 예컨대 증진된 활성 및/또는 변경된 기질 특이성을 수여할 수 있는지 결정하기 위해 본원에 기재된 기술을 사용하여 용이하게 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체의 고안에서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형될 특성(들)에 따라 달라질 것이다. 돌연변이 부위는, 예를 들어, (1) 우선 보존적 아미노산 선택들로 치환한 후, 달성된 결과에 따른 보다 근본적인 선별로의 치환, (2) 표적 잔기의 결실, 또는 (3) 위치결정된 부위 근처의 다른 잔기 삽입에 의해 개별적으로 또는 연속적으로 변형될 수 있다.
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1개 내지 15개의 잔기, 보다 바람직하게는 약 1개 내지 10개의 잔기 및 전형적으로 약 1개 내지 5개의 인접한 잔기의 범위이다.
치환 돌연변이체는 제거된 폴리펩티드 분자에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그의 자리에 삽입된 다른 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 생성을 위해 가장 대상이 되는 부위는 기능에 중요하다고 확인된 부위를 포함한다. 대상이 되는 다른 부위는 다양한 균주 또는 종으로부터 얻은 특정 잔기가 동일한 것이다. 이들 위치는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 이들 부위, 특히 3개 이상의 다른 동일하게 보존된 부위의 서열 내에 포함된 부위들은 바람직하게는 상대적 보존 방식으로 치환된다. 그러한 보존적 치환은 표 1에 제시되어 있다.
바람직한 실시양태에서 돌연변이체/변이체 폴리펩티드는 본원에 특히 정의된 폴리펩티드와 비교하는 경우 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개의 보존적 아미노산 변화를 갖는다. 보존적 아미노산 변화의 상세 설명은 표 1에 제공되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 아미노산 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치에서 하나의 치환을 갖는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다: I2T, F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, I107T, E109A, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 및 L451M.
[표 1]
Figure pct00001

추가적 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 아미노산들 중 하나 이상에서, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치에서 치환을 갖는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다: M82, W85, L86, M92, L131, M163, L172, C211, Y215, H238, E241, L243, M247, H274, P299, D300, M303, W305, T325 및 S329. 하나 이상의 이들 아미노산은 폴리펩티드의 특이적 활성, 촉매 상수 (k cat), 기질 특이성 (Km), 안정성 및/또는 2차 속도 상수 (k cat/Km)를 변경시키기 위해 변화될 수 있다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는:
i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 67에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 91에 상응하는 위치에서 세린, 및/또는
iii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신, 및/또는
iv) 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는
v) 서열 번호 1의 아미노산 번호 161에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는
vi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 210에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는
vii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 243에 상응하는 위치에서 프롤린 또는 글리신, 및/또는
viii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 246에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 리신, 발린 또는 알라닌, 및/또는
ix) 서열 번호 1의 아미노산 번호 294에 상응하는 위치에서 트레오닌, 세린 또는 류신, 및/또는
x) 서열 번호 1의 아미노산 번호 335에 상응하는 위치에서 메티오닌, 및/또는
xi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 350에 상응하는 위치에서 티로신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘, 및/또는
xii) i) 내지 xi) 중 임의의 하나의 생물학적 활성 단편
을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 아미노산 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다:
i) Y313F
ii) Y67F
iii) A159V
iv) A159V, L243P
v) D350Y
vi) G190D, M227I
vii) A159T
viii) A408V
ix) L26M, S161G
x) F13L, A34D, G246A, D350Y
xi) T137I, S140R
xii) L335M
xiii) P210A
xiv) A294T
xv) I123V
xvi) Y67F, V437I
xvii) M163I, D249N
xviii) T137I
xix) G246S
xx) L90M
xxi) A159V, L243P, L451M
xxii) T150S, A159V, A229V, D230E, L243P
xxiii) Y67F, L335M
xxiv) Y67F, KlOlR, A294T
xxv) L335M
xxvi) V106A, S161G, F177L, L335M
xxvii) S43G, I107T, A159V, D350Y
xxviii) M53L, T137I, S140R, D182G, G190S, D350Y
xxix) A159V, L335M, D350Y
xxx) D28E, A294T, D350N
xxxi) P210A, V424I
xxxii) A159V, G190D
xxxiii) P210A, A294T, R365H, D350Y
xxxiv) I123V, S161G, A294T
xxxv) Y67F, A159V, D350Y
xxxvi) T91S, A159V, A294T
xxxvii) Y67F, A159V, L243P
XXXViii) A159V, P210A
xxxix) A159V, I310V, L335M, L396M, L243P
xl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335M
xli) A159V, L335M
xlii) S84R, D105G, A159V
xliii) Y67F, A294T
xliv) A159V, D182E, L335M, D350Y
xlv) Y67F, A159V, L243P
xlvi) D38N, A159V
xlvii) A159V, M163I, Y195F, D350Y
xlviii) F156L, P210A, D350Y
xlix) Y67F, D350Y
l) A159V, D350Y
li) Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M
lii) E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D
liii) A159V, L335M
liv) Y67F, A159V, L335M, D350Y
lv) D38N, L131P, A159V
lvi) T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y
lvii) R183H, P210A, D350Y
lviii) Y67F, A159V, D350Y
lix) A159V, P210A, A294T, D350N
lx) Y67F, A159V, D350N
lxi) A159V, L335M, D350Y
lxii) P210A, A294T, D350Y
lxiii) T91S, A159V, A294T
lxiv) P210A, A294T, L335M, 또는
lxv) Y67F, L335M.
보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 하기 아미노산 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치(들)에서 하나의 치환들을 갖는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다:
liv) Y67F, A159V, L335M, D350Y
lv) D38N, L131P, A159V
lvi) T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y
lvii) R183H, P210A, D350Y
lviii) Y67F, A159V, D350Y
lix) A159V, P210A, A294T, D350N
lx) Y67F, A159V, D350N
lxi) A159V, L335M, D350Y
lxii) P210A, A294T, D350Y
lxiii) T91S, A159V, A294T
lxiv) P210A, A294T, L335M, 또는
lxv) Y67F, L335M.
특히 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함하며, 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 가용성 생물학적 활성 형태로 생성된다. 또한, 이 실시양태에서 폴리펩티드가, i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴, 및 ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 다르게 한정되지 않는 한, 제시된 아미노산 위치에서 폴리펩티드는 서열 번호 1과 같이 제시된 폴리펩티드의 상응하는 위치에서 발견된 바와 같은 아미노산을 포함한다.
지명된 부위에서 아미노산이 표 1에 제시된 아미노산 치환과 부합하지 않는다면, 지명된 아미노산은 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 본 발명의 2개의 분리 폴리펩티드 쇄의 다이머이다. 폴리펩티드는 호모다이머 또는 헤테로다이머일 수 있다. 헤테로다이머와 관련하여, 2개의 폴리펩티드 쇄는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 동일한 것이 바람직하다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 Zn2 + 또는 Co2 +와 결합된다.
또한, 추가적 돌연변이체를 고안하는 경우, 당업자는 TrzNcc3.2의 구조에 관하여 실시예 2에 제시된 정보를 사용할 수 있다.
또한, 경우에 따라, 비천연 아미노산 또는 화학 아미노산 유사체는 본원에 기술된 폴리펩티드로 치환 또는 첨가로서 도입될 수 있다. 그러한 아미노산에는, 여기에 제한되지는 않지만, 일반적으로 통상적 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 고안자(designer) 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체가 포함된다.
또한 본 발명의 범주 내에 포함되는 것은, 예를 들어 비오티닐화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드로의 연결 등에 의해 합성 중간 또는 이후에 차등적으로 변형된 본 발명의 폴리펩티드이다. 이들 변형은 폴리펩티드의 안정성 및/또는 생물활성을 증가시키기 위해 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드의 생성 및 회수, 재조합 폴리펩티드의 생성 및 회수, 및 폴리펩티드의 화학 합성을 비롯한 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는, 폴리펩티드를 생성하기에 효과적인 조건 하에 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 세포를 배양하고, 폴리펩티드를 회수함으로써 생성될 수 있다. 배양하기에 바람직한 세포는 본 발명의 재조합 세포이다. 효과적인 배양 조건은, 여기에 제한되지는 않지만, 폴리펩티드 생성을 허용하는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함한다. 효과적인 배지는 본 발명의 폴리펩티드를 생성하기 위해 세포가 배양되는 임의의 배지를 나타낸다. 그러한 배지는 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 인산염 공급원, 및 적당한 염, 무기질, 금속 및 다른 영양소, 예컨대 비타민을 갖는 수성 배지를 전형적으로 포함한다. 본 발명의 세포는 통상적 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬, 및 페트리 접시에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적당한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 그러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 내에 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열을 포함한다. 다수의 상기 신호 서열은 N- 및 C-말단 신호 서열을 포함하여 단리된다. 원핵생물 및 진핵생물 N-말단 신호 서열은 유사하며, 이는 진핵생물 N-말단 신호 서열이 박테리아에서 분비 서열로서 작용할 수 있다는 것을 제시한다. 그러한 N-말단 신호 서열의 예는 익히 연구된 서열인 박테리아 β-락타마아제 신호 서열이며, 폴리펩티드의 외부 환경으로의 분비를 촉진시키기 위해 널리 사용되어 왔다. C-말단 신호 서열의 예는 이. 콜라이의 헤모리신 A (hlyA) 신호 서열이다. 신호 서열의 추가적 예에는, 비제한적으로, 에어로리신 (aerolysin), 알칼리 포스파타제 유전자 (phoA), 키티나아제, 엔도키티나아제, α-헤모리신, MIpB, 풀룰라나아제, Yops 및 TAT 신호 펩티드가 포함된다.
폴리뉴클레오티드
센스 또는 안티센스 배향 또는 둘 다의 조합인 단일 또는 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 이들의 조합물, dsRNA 또는 그 외를 비롯하여 "단리된 폴리뉴클레오티드"에 대해, 본 발명자들은 정상 상태에서 결합되거나 연결된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 결합된 다른 성분으로부터 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 자유롭다. 또한, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 용어 "핵산"과 함께 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.
폴리뉴클레오티드의 문맥에서 용어 "외인성"은 정상 상태와 비교하여 변경된 양으로 세포, 또는 무세포 발현계에서 존재하는 경우의 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 한 실시양태에서, 세포는 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 포함하지 않는 세포이다. 그러나, 세포는 인코딩된 폴리펩티드의 생성의 변경된, 바람직하게는 증가된 양을 초래하는 비-내인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포일 수 있다. 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드는 형질전환 (재조합) 세포의 다른 성분, 또는 그것이 존재하는 무세포 발현계로부터 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 특정 다른 성분으로부터 후속적으로 정제된 그러한 세포 또는 무세포계에서 생성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드의 % 동일성은 갭 생성 패널티=5, 및 갭 확장 패널티=0.3으로 GAP (Needleman 및 Wunsch, 1970) 분석 (GCG 프로그램)에 의해 결정된다. 달리 기재되지 않으면, 질의 서열은 길이가 뉴클레오티드 45개 이상이며, GAP 분석은 45개 이상의 뉴클레오티드 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 뉴클레오티드 150개 이상이며, GAP 분석은 150개 이상의 뉴클레오티드 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 바람직하게는, 질의 서열은 길이가 뉴클레오티드 300개 이상이며, GAP 분석은 300개 이상의 뉴클레오티드 영역 상에서 2개의 서열을 정렬한다. 보다 더 바람직하게는, GAP 분석은 서열의 전체 길이 상에서 2개의 서열을 정렬한다.
정의된 폴리뉴클레오티드에 대해, 상기 제시된 것보다 높은 % 동일성 수치가 바람직한 실시양태를 포함할 것임이 인정될 것이다. 따라서, 해당되는 경우, 최소한의 % 동일성 수치를 고려하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적절한 지명된 서열 번호에 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 91% 이상, 보다 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.1% 이상, 보다 바람직하게는 99.2% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상, 보다 바람직하게는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상, 보다 바람직하게는 99.6% 이상, 보다 바람직하게는 99.7%, 보다 바람직하게는 99.8%, 보다 더 바람직하게는 99.9% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 이는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하고/하거나 본원에 정의된 바와 같은 치환(들)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건" 등은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 길이와 혼성화 온도의 변동을 비롯하여, 당업자에게 익숙한 매개변수를 나타낸다. 핵산 혼성화 매개변수는 그러한 방법을 편집한 문헌, 문헌 [Sambrook, et al., (상기 문헌)], 및 [Ausubel, et al., (상기 문헌)]에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건은 65℃에서 혼성화 완충제 (3.5xSSC, 0.02% 피콜 (Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA)에서 혼성화하고, 65℃에서 0.2xSSC, 0.1% SDS로 2회 세척하며, 각 세척 단계는 약 30분씩 소요되는 것을 나타낼 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 번호 468에 상응하는 위치에서 시토신을 포함하고, 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양한 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 생성된다.
보다 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 박테리아 세포에서 발현시킬 때 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 가용성 생물학적 활성 형태로 생성된다. 또한, 이 실시양태에서 폴리뉴클레오티드가, i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 38에 상응하는 위치에서 아스파라긴, 및 ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신을 포함하는 폴리펩티드를 추가적으로 인코딩하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 함께 제시된 분자와 비교하여, 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이체는 자연적으로 발생하거나 (즉, 천연 공급원으로부터 단리됨), 또는 (예를 들어, 핵산 상에서 부위-지정된 돌연변이 생성을 수행함으로써) 합성될 수 있다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드의 모노머는 인산디에스테르 결합 또는 그의 유사체에 의해 연결된다. 인산디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트를 포함한다.
재조합 벡터
본 발명의 한 실시양태는 폴리뉴클레오티드 분자를 숙주 세포로 전달할 수 있는 임의의 벡터로 삽입된 본 발명의 하나 이상의 단리된/외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 그러한 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 인접하게 자연적으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 서열인 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하며, 이는 폴리뉴클레오티드 분자(들)이 유도된 종 이외에 다른 종으로부터 유도되는 것이 바람직하다. 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물의 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 전형적으로 트랜스포존 (transposon) (예컨대, 미국 특허 US 5,792,294에 기재됨), 바이러스 또는 플라스미드이다.
재조합 벡터의 한 유형은 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 어구 "작동가능하게 연결된"은 분자가 숙주 세포로 형질전환 시 발현될 수 있는 방식으로 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 벡터로의 삽입을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같은, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고, 특정 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 수행할 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 복제할 수 있다. 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 전형적으로 바이러스 또는 플라스미드이다. 발현 벡터는 박테리아, 균류, 내부 기생체, 절지동물, 동물, 및 식물 세포를 비롯하여, 재조합 세포에서 기능하는 (즉, 지시 유전자 발현) 임의의 벡터를 포함한다. 본 발명의 벡터는 또한 무세포 발현계에서 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 그러한 계는 당업계에 익히 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 나타낸다. 전형적으로, 이는 전사 조절 인자와 전사된 서열과의 기능적 관계를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 적당한 숙주 세포 및/또는 무세포 발현계에서 코딩 서열의 전사를 촉진하거나 조절하는 경우, 코딩 서열, 예컨대 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 인자는 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있으며, 즉, 이들은 cis-작용 (acting)이다. 그러나, 특정 전사 조절 인자, 예컨대 인핸서는 그가 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 아주 근접하여 위치할 필요는 없다.
특히, 본 발명의 발현 벡터는, 재조합 세포와 적합성이며 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 제어하는 조절 서열, 예컨대 전사 제어 서열, 번역 제어 서열, 복제 개시점 (origins of replication), 및 다른 조절 서열을 함유한다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 전사 제어 서열을 포함한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장 및 종결을 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 전사 개시를 제어하는 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 (operator) 및 리프레서 (repressor) 서열이다.
적합한 전사 제어 서열은 본 발명의 하나 이상의 재조합 세포에서 기능할 수 있는 임의의 전사 제어 서열을 포함한다. 다양한 그러한 전사 제어 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 제어 서열은 박테리아, 효모, 절지동물, 선충, 식물 또는 동물 세포, 예컨대, 비제한적으로, tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, 박테리오파지 람다, 박테리오파지 T7, T7lac, 박테리오파지 T3, 박테리오파지 SP6, 박테리오파지 SP01, 메탈로티오네인, 알파-메이팅 (alpha-mating) 인자, 피치아 (Pichia) 알코올 산화효소, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 (예컨대, 신드비스 (Sindbis) 바이러스 서브게놈 프로모터), 항생물질 내성 유전자, 배큘로바이러스, 헬리오디스 제아 (Heliothis zea) 곤충 바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스, 너구리 폭스바이러스, 다른 폭스바이러스, 아데노바이러스, 세포거대바이러스 (cytomegalovirus) (예컨대, 중간체 초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40, 레트로바이러스, 액틴, 레트로바이러스 긴 종결 반복서열 (retroviral long terminal repeat), 라우스 육종 (Rous sarcoma) 바이러스, 열 충격 (heat shock), 인산염 및 질산염 전사 제어 서열뿐만 아니라 원핵세포 또는 진핵세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열에서 기능할 수 있는 서열을 포함한다.
숙주 세포
본 발명의 또다른 실시양태는 본원에 기재된 하나 이상의 재조합 분자 또는 그의 자손 세포와 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 세포로의 형질전환은 폴리뉴클레오티드 분자가 세포로 삽입될 수 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 형질전환 기술에는, 여기에 제한되지는 않지만, 형질주입, 전기천공법, 미세주입, 리포펙션 (lipofection), 흡착, 및 원형질체 융합이 포함된다. 재조합 세포는 단세포로 남아있거나 또는 조직, 기관 또는 다세포 유기체로 성장할 수 있다. 본 발명의 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외에 남아있거나, 또는 발현되는 그의 능력이 보유되는 방식으로 형질전환된 (즉, 재조합) 세포의 염색체 내에서 하나 이상의 부위로 통합될 수 있다.
형질전환에 적합한 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 본 발명의 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩티드를 내생적으로 (즉, 자연적으로) 생성할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자와 형질전환된 후에 그러한 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포는 본원에 정의된 하나 이상의 단백질을 생성할 수 있는 임의의 세포일 수 있으며, 박테리아, (효모를 비롯한) 균류, 기생충, 선충, 절지동물, 동물 및 식물 세포를 포함한다. 숙주 세포의 예에는 살모넬라 (Salmonella), 에스케리키아 (Escherichia), 바실루스 (Bacillus), 리스테리아 (Listeria), 사카로미세스 (Saccharomyces), 스포돕테라 (Spodoptera), 마이코박테리아 (Mycobacteria), 트리코플루시아 (Trichoplusia), BHK (새끼 햄스터 신장) 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, CV-1 세포, COS (예를 들어, COS-7) 세포, 및 베로 (Vero) 세포가 포함된다. 숙주 세포의 추가적 예는 이. 콜라이 K-12 유도체를 비롯한 이. 콜라이; 살모넬라 티피 (Salmonella typhi); 희석된 균주를 비롯한 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium); 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda); 트리코풀시아 니 (Trichoplusia ni); 및 비-종양형성 쥐 근원세포 G8 세포 (예를 들어, ATCC CRL 1246)이다. 유용한 효모 세포에는 피치아 속 (Pichia sp.), 아스퍼길러스 속 (Aspergillus sp.) 및 사카로미세스 속 (Saccharomyces sp.)이 포함된다. 특히 바람직한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포이다.
형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 개선하기 위해, 예를 들어, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 분자의 카피 수, 이들 폴리뉴클레오티드 분자가 전사된 효율, 결과로 생기 전사체가 번역된 효율, 및 번역후 변형의 효율을 조작함으로써 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 증가시키기에 유용한 재조합 기술에는, 여기에 제한되지는 않지만, 폴리뉴클레오티드 분자를 높은 카피 수 플라스미드로 작동가능하게 연결하기, 폴리뉴클레오티드 분자를 하나 이상의 숙주 세포 염색체로 통합하기, 벡터 안정성 서열을 플라스미드로 첨가하기, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보좀 결합 부위, 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용빈도에 상응하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 변형, 및 전사체를 불안정하게 만드는 서열의 삭제가 포함된다.
형질전환 식물
본 발명의 실시에서의 용도를 위해 고려된 식물에는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물이 둘 다 포함된다. 표적 식물에는, 여기에 제한되지는 않지만, 곡류 (예를 들어, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 벼, 옥수수, 수수 및 관련된 곡물); 비트 (사탕무 및 사료용 비트); 이과, 핵과 및 장과 (사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 산딸기 및 블랙베리); 콩과 식물 (콩, 렌즈콩 (lentil), 완두콩, 대두); 유지 식물 (땅콩, 평지 (rape), 겨자, 양귀비, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 카카오 씨, 지두 (groundnut)); 오이과 식물 (호박, 오이, 멜론); 섬유 식물 (목화, 아마, 대마, 황마); 감귤류 (오렌지, 레몬, 자몽, 귤); 채소류 (시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추, 당근, 양파, 토마토, 감자, 파프리카); 녹나무과 (아보카도, 시나몬, 장뇌); 또는 식물, 예컨대 담배, 견과, 커피, 사탕수수, 차, 덩굴식물, 홉, 잔디, 바나나 및 천연 고무 식물, 뿐만 아니라 관상수 (화초류, 관목, 활엽수 및 상록수, 예컨대 구과 식물)가 포함된다. 본 발명의 표적 식물인 아스퍼길러스 종 감염에 빈번하게 작용을 받는 곡물에는, 여기에 제한되지는 않지만, 곡류 (옥수수, 수수, 펄 밀렛 (pearl millet), 벼, 밀), 지방 종자 (땅콩, 대두, 해바라기, 목화), 향신료 (칠레 페퍼 (chile pepper), 후추, 고수, 강황, 생강), 및 각과류 (아몬드, 피스타치오, 호두, 코코넛)이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 식물은 사탕, 목화, 옥수수, 수수, 파인애플, 구과 식물, 예컨대 크리스마스 트리, 유칼립트, 밀, 귀리, 보리, 벼 및 캐놀라로부터 선택된다.
명사로서 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 전체 식물, 예컨대, 예를 들어, 상업적 밀 생산을 위한 밭에서 자라는 식물을 나타낸다. "식물 부분"은 식물생장 구조 (예를 들어, 잎, 줄기), 뿌리, 꽃 기관/구조, (배아, 내배유, 및 종피를 비롯한) 종자, 식물 조직 (예를 들어, 유관속 조직, 기본 조직 등), 그의 세포 및 자손을 나타낸다.
본 발명의 문맥에 정의된 바와 같은 형질전환 식물은 재조합 기술을 사용하여 유전자 변형되어 바람직한 식물 또는 식물 기관에서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드의 생성을 초래하는 식물 (뿐만 아니라 상기 식물의 부분 및 세포) 및 그의 자손을 포함한다. 형질전환 식물은 당업계에 공지된 기술, 예컨대 문헌 [A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003)], 및 [P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)]에 일반적으로 기재된 것들을 이용하여 생성될 수 있다.
"형질전환 식물"은 동일 종, 변종 또는 재배종의 야생형 식물에서 발견되지 않는 유전자 구조 ("전이유전자")를 함유하는 식물을 나타낸다. 본원에 나타낸 바와 같은 "전이유전자"는 생물공학 분야에서의 통상적인 의미를 가지며, 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생성되거나 변경되고, 식물 세포로 도입된 유전자 서열을 포함한다. 전이유전자는 식물 세포로부터 유래된 유전자 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 전이유전자는 인간 조작, 예컨대, 예를 들어, 형질전환에 의해 식물로 도입될 수 있으나, 임의의 방법이 당업자가 인정한 바와 같이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 형질전환 식물은 그의 자손이 바람직한 표현형으로 분리하지 않기 위해 도입된 (전이유전자) 각각 및 모든 유전자에 대해 동형접합체이다. 형질전환 식물은 또한, 예컨대, 예를 들어, 잡종 종자로부터 성장한 F1 자손에서 도입된 전이유전자(들)에 대해 이형접합일 수 있다. 그러한 식물은 당업계에 익히 공지된 이점, 예컨대 잡종 강세를 제공할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 발달의 모든 단계 동안 형질전환 식물에서 본질적으로 발현될 수 있다. 식물 또는 식물 기관의 용도에 따라, 폴리펩티드는 단계-특이적 방식으로 발현될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 조직-특이적으로 발현될 수 있다.
식물에서 대상이 되는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현을 초래하는 것으로 공지되거나 밝혀진 조절 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 사용된 조절 서열의 선택은 대상이 되는 표적 식물 및/또는 표적 기관에 따라 달라진다. 그러한 조절 서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 얻어질 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 그러한 조절 서열은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
식물 세포의 안정한 형질주입 또는 형질전환 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터는, 예를 들어, 문헌 [Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987]; [Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989]; 및 [Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990]에 기재되어 있다. 전형적으로, 식물 발현 벡터는, 예를 들어, 5' 및 3' 조절 서열의 전사적 제어 하에 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자 및 우성 선별가능 마커를 포함한다. 그러한 식물 발현 벡터는 또한 프로모터 조절 영역 (예를 들어, 유도가능한 또는 구성적, 환경적으로- 또는 발전적으로-조절된, 또는 세포- 또는 조직-특이적 발현을 제어하는 조절 영역), 전사 개시 시작 부위, 리보좀 결합 부위, RNA 프로세싱 신호, 전사 종결 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다.
식물 세포에서 활성인 다수의 구성적 프로모터가 기재되어 있다. 식물에서 구성적 발현에 적합한 프로모터에는, 여기에 제한되지는 않지만, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 현삼 (Figwort) 모자이크 바이러스 (FMV) 35S, 사탕수수 간균형 바이러스 프로모터, 닭의장풀 (commelina) 노랑 반점 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소형 서브유닛으로부터의 광-유도성 프로모터, 벼 시토졸 3탄당인산 이성질화효소 프로모터, 아라비돕시스 (Arabidopsis)의 아데닌 포스포리보실전달효소 프로모터, 벼 액틴 1 유전자 프로모터, 만노핀 (mannopine) 신타아제 (synthase) 및 옥토파인 (octopine) 신타아제 프로모터, Adh 프로모터, 수크로스 신타아제 프로모터, R 유전자 복합체 프로모터, 및 클로로필 α,β 결합 단백질 유전자 프로모터가 포함된다. 이들 프로모터는 식물에서 발현된 DNA 벡터를 생성하기 위해 사용되어 왔으며, 예를 들어, WO 84/02913을 참조한다. 모든 이들 프로모터는 식물-발현가능한 재조합 DNA 벡터의 다양한 유형을 생성하기 위해 사용되어 왔다.
식물의 공급 조직, 예컨대 잎, 종자, 뿌리 또는 줄기에서 발현시키기 위해, 본 발명에서 이용된 프로모터는 이들 특이적 조직에서 상대적으로 높은 발현율을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 조직- 또는 세포-특이적 또는 -증진된 발현을 갖는 유전자에 대한 다수의 프로모터로부터 하나가 선택될 수 있다. 문헌에서 보고된 그러한 프로모터의 예에는 완두콩으로부터의 클로로플라스트 글루타민 합성효소 GS2 프로모터, 밀로부터의 클로로플라스트 프룩토스-1,6-비포스파타아제 프로모터, 감자로부터의 핵 광합성 ST-LS1 프로모터, 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터의 세린/트레오닌 키나아제 프로모터 및 글루코아밀라아제 (CHS) 프로모터가 포함된다. 또한 광합성 활성 조직에서 활성인 것으로 보고된 것은 이스턴 라치 (eastern larch) (Larix laricina)로부터의 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 프로모터, 소나무로부터의 Cab6을 비롯한 Cab 유전자에 대한 프로모터, 밀로부터의 Cab-1 유전자에 대한 프로모터, 시금치로부터의 Cab-1 유전자에 대한 프로모터, 벼로부터의 Cab 1R 유전자에 대한 프로모터, 피루베이트, 옥수수 (Zea mays)로부터의 오르토포스페이트 디키나아제 (PPDK) 프로모터, 담배 Lhcb1*2 유전자에 대한 프로모터, 애기장대 Suc2 수크로스-H30 심포터 프로모터, 및 시금치로부터의 틸라코이드막 단백질 유전자에 대한 프로모터 (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS)이다.
클로로필 α,β-결합 단백질에 대한 다른 프로모터가 또한 본 발명에서 이용될 수 있는데, 예로는 백겨자 (Sinapis alba)로부터의 LhcB 유전자 및 PsbP 유전자에 대한 프로모터가 있다. 환경, 호르몬, 화학, 및/또는 발달 신호에 반응하여 조절되는 다양한 식물 유전자 프로모터가 또한, (1) 열, (2) 빛 (예를 들어, 완두콩 RbcS-3A 프로모터, 옥수수 RbcS 프로모터); (3) 호르몬, 예컨대 아브시스산, (4) 상해 (예를 들어, WunI); 또는 (5) 화학물질, 예컨대 메틸 자스메이트, 살리실산, 스테로이드 호르몬, 알코올, 완화제 (Safeners) (WO 97/06269)에 의해 조절되는 프로모터를 비롯한, 식물 세포에서 RNA-결합 단백질 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있거나, (6) 기관-특이적 프로모터를 이용하는 것이 또한 이로울 수 있다.
식물의 수용 조직, 예컨대 감자 식물의 덩이줄기, 토마토의 열매, 또는 대두, 캐놀라, 목화, 옥수수 (Zea may), 밀, 벼, 및 보리의 종자에서의 발현을 위해, 본 발명에서 이용된 프로모터는 이들 특이적 조직에서 상대적으로 높은 발현율을 갖는 것이 바람직하다. 클래스 I 파타틴 (patatin) 프로모터, 감자 덩이줄기 ADPGPP 유전자에 대한 프로모터, 대형 및 소형 서브유닛 둘 다, 수크로스 신타아제 프로모터, 22 kD 단백질 복합체 및 단백질분해효소 저해 유전자를 비롯한 주요 덩이줄기 단백질에 대한 프로모터, 전분립 신타아제 유전자 (GBSS)에 대한 프로모터, 및 다른 클래스 I 및 II 파타틴 프로모터를 비롯한 덩이줄기-특이적 또는 -증진된 발현을 갖는 유전자에 대한 다수의 프로모터가 공지되어 있다. 다른 프로모터가 또한 특이적 조직, 예컨대 종자 또는 과실에서 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. β-콘글리시닌에 대한 프로모터 또는 다른 종자-특이적 프로모터, 예컨대 나핀 (napin) 및 파세올린 프로모터가 사용될 수 있다. 옥수수 내배유 발현을 위한 특히 바람직한 프로모터는 벼로부터의 글루텔린 유전자에 대한 프로모터, 보다 특히 Osgt-1 프로모터이다. 밀에서의 발현에 적합한 프로모터의 예에는 ADP글루코스 피로신타아제 (ADPGPP) 서브유닛, 전분립 및 다른 전분 신타아제, 분지 및 탈분지 효소, 배발생-풍부 단백질, 글리아딘, 및 글루테닌에 대한 이들 프로모터가 포함된다. 벼에서의 그러한 프로모터의 예에는 ADPGPP 서브유닛, 전분립 및 다른 전분 신타아제, 분지 효소, 탈분지 효소, 수크로스 신타아제, 및 글루텔린에 대한 이들 프로모터가 포함된다. 특히 바람직한 프로모터는 벼 글루텔린, Osgt-1 유전자에 대한 프로모터이다. 보리에 대한 그러한 프로모터의 예에는 ADPGPP 서브유닛, 전분립 및 다른 전분 신타아제, 분지 효소, 탈분지 효소, 수크로스 신타아제, 호르데인, 배아 글로불린, 및 호분 특이적 단백질에 대한 것들이 포함된다.
뿌리 특이적 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 그러한 프로모터의 예는 산 키티나아제 유전자에 대한 프로모터이다. 뿌리 조직에서의 발현은 또한 정의된 CaMV 35S 프로모터의 뿌리 특이적 서브도메인을 이용함으로써 달성될 수 있다.
5' 비-번역된 선도 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 이종 유전자 서열을 발현시키기 위해 선택된 프로모터로부터 유도될 수 있으며, mRNA의 번역을 증가시키기 위해 바람직한 경우 특이적으로 변형될 수 있다. 전이유전자의 발현의 최적화에 대해 검토하기 위해, 문헌 [Koziel et al. (1996)]을 참조한다. 5' 비-번역된 영역은 또한 식물 바이러스 RNA (그 중에서도 특히 담배 모자이크 바이러스, 담배 식각 바이러스 (Tobacco etch virus), 옥수수 위축 모자이크 바이러스, 알팔파 (Alfalfa) 모자이크 바이러스), 적합한 진핵생물 유전자, 식물 유전자 (밀 및 옥수수 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 선도), 또는 합성 유전자 서열로부터 얻을 수 있다. 본 발명은 구축물에 제한되지 않으며, 여기서 비-번역된 영역은 프로모터 서열을 동반하는 5' 비-번역된 서열로부터 유도된다. 선도 서열은 또한 관련없는 프로모터 또는 코딩 서열로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 유용한 선도 서열은 옥수수 Hsp70 선도 (US 5,362,865 및 US 5,859,347), 및 TMV 오메가 요소를 포함한다.
전사의 종결은 키메라 벡터에서 대상이 되는 폴리뉴클레오티드로 작동가능하게 연결된 3' 비-번역된 DNA 서열에 의해 달성된다. 재조합 DNA 분자의 3' 비-번역된 영역은 식물에서 작용하여 아데닐레이트 뉴클레오티드의 RNA의 3' 말단으로의 첨가를 초래하는 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 3' 비-번역된 영역은 식물 세포에서 발현되는 다양한 유전자로부터 얻을 수 있다. 노팔린 (nopaline) 신타아제 3' 비번역된 영역, 완두콩 소형 서브유닛 루비스코 (Rubisco) 유전자로부터의 3' 비번역된 영역, 대두 7S 종자 저장 단백질 유전자로부터의 3' 비번역된 영역이 이 능력으로 통상적으로 사용된다. 아그로박테리움 (Agrobacterium) 종양-유도 (Ti) 플라스미드 유전자의 폴리아데닐레이트 신호를 함유하는 3' 전사된, 비-번역된 영역이 또한 적합하다.
유전자의 세포로의 직접적 전달을 위한 4가지 일반적인 방법이 하기에 기재되어 있다: (1) 화학적 방법 (문헌 [Graham et al., 1973]); (2) 물리적 방법, 예컨대 미세주입법 (문헌 [Capecchi, 1980]); 전기천공법 (예를 들어, WO 87/06614, US 5,472,869, 5,384,253, WO 92/09696 및 WO 93/21335 참조); 및 유전자 총 (예를 들어, US 4,945,050 및 US 5,141,131 참조); (3) 바이러스 벡터 (문헌 [Clapp, 1993]; [Lu et al., 1993]; [Eglitis et al., 1988]); 및 (4) 수용체-매개된 메카니즘 (문헌 [Curiel et al., 1992]; [Wagner et al, 1992]).
사용될 수 있는 가속 방법은, 예를 들어, 미세사출법 등이 포함된다. 형질전환 핵산 분자를 식물 세포로 전달하기 위한 방법의 한 예는 미세사출법이다. 이 방법은 문헌 [Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)]에 의해 검토되었다. 비-생물학적 입자 (미세발사체)는 핵산으로 코팅되었고, 추진력에 의해 세포로 전달된다. 예시적 입자에는 텅스텐, 금, 백금 등으로 구성된 것들이 포함된다. 외떡잎식물의 복제적 형질전환의 효과적인 수단이기도한 미세사출법의 특별한 이점은 원형질체의 단리도, 아그로박테리움 감염의 민감성도 요구되지 않는다는 것이다. 가속에 의한 DNA의 옥수수 (Zea mays) 세포로의 전달 방법의 예시적 실시양태는 바이오리스틱스 (biolistics) α-입자 전달 시스템이며, 이는 현탁액 중에서 배양된 옥수수 세포로 코팅된 필터 표면 상에서 스크린, 예컨대 스테인리스 스틸 또는 니텍스 (Nytex) 스크린을 통해 DNA로 코팅된 입자를 나아가게 하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 입자 전달 시스템은 바이오-래드 래보러토리즈 (Bio-Rad Laboratories)에서 입수가능한 헬륨 가속 PDS-1000/He 총이다.
충격 (bombardment)을 위해, 현탁액 중 세포는 필터 상에서 농축될 수 있다. 충격을 줄 세포를 함유하는 필터는 미세발사체 정지 판 밑에 적당한 거리에 위치시킨다. 바람직한 경우, 하나 이상의 스크린이 또한 총과 충격을 줄 세포 사이에 위치한다.
별법으로, 미숙배 또는 다른 표적 세포가 고체 배양 배지 상에 배열될 수 있다. 충격을 줄 세포는 미세발사체 정지 판 밑에 적당한 거리에 위치시킨다. 바람직한 경우, 하나 이상의 스크린이 또한 가속 장치와 충격을 줄 세포 사이에 위치한다. 본원에 기재된 기술의 이용을 통해, 당업자는 마커 유전자를 일시적으로 발현시키는 세포 중심 (foci)을 1000개까지 또는 그 이상으로 얻을 수 있다. 충격 후 48시간 외인성 유전자 생성물을 발현시키는 하나의 중심에서 세포 수는 종종 1개 내지 10개의 범위를 가지며, 평균적으로 1개 내지 3개이다.
충격 형질전환에서, 당업자는 충격 전 배양 조건 및 충격 매개변수를 최적화하여 최대 수의 안정한 형질전환체를 수득할 수 있다. 충격을 위한 물리적 및 생물학적 매개변수 둘 다 이 기술에서 중요하다. 물리적 인자는 DNA/미세발사체 촉발을 조작하는 것을 포함하는 것, 또는 거대- 또는 미세발사체의 비행 및 속도에 영향을 미치는 것이다. 생물학적 인자는 충격 전 및 직후 세포의 조작, 충격과 관련된 외상을 완화를 돕기 위한 표적 세포의 삼투압 조정, 및 또한 형질전환 DNA, 예컨대 직선형 DNA 또는 온전 초나선 플라스미드의 성질과 관련된 모든 단계를 포함한다. 충격 전 조작은 미숙배의 성공적인 형질전환을 위해 특히 중요하다고 여겨진다.
또다른 별도의 실시양태에서, 색소체는 안정하게 형질전환될 수 있다. 고등 식물에서 색소체 형질전환에 대해 개시된 방법은 선별가능한 마커를 함유하고 상동 재조합을 통해 DNA를 색소체 게놈으로 표적화하는 DNA의 입자 총 전달을 포함한다 (US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932,479, 및 WO 99/05265).
따라서, 당업자가 소규모 연구에서 충격 매개변수의 다양한 측면을 조정하여 조건을 충분히 최적화하길 원할 수 있다는 것이 고려된다. 당업자는 특히 물리적 매개변수, 예컨대 갭 (gap) 거리, 비행 거리, 조직 거리, 및 헬륨 압력을 조정하길 원할 수 있다. 당업자는 또한 수용체 세포의 생리적 상태에 영향을 주는 조건을 변경함으로써 외상 감소 인자를 최소화하고, 따라서 형질전환 및 통합 효율에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 수용체 세포의 삼투압 상태, 조직 수화 및 계대배양 단계 또는 세포 주기는 최적의 형질전환을 위해 조정될 수 있다. 다른 통상적 조정의 수행은 본 개시물을 감안하여 당업자에게 익히 공지되어 있다.
아그로박테리움-매개된 전이는 유전자의 식물 세포로의 도입을 위해 널리 적용가능한 시스템인데, 이유는 DNA가 전체 식물 조직으로 도입됨으로써 원형질체로부터 온전 식물의 재생에 대한 필요가 없기 때문이다. DNA를 식물 세포로 도입하기 위한 아그로박테리움-매개된 식물 통합 벡터의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,177,010, US 5,104,310, US 5,004,863, US 5,159,135 참조). 추가로, T-DNA의 통합은 약간의 재배열을 초래하는 상대적으로 정밀한 과정이다. 전이된 DNA의 영역은 가장자리 서열에 의해 한정되고, 개입하는 DNA는 일반적으로 식물 게놈으로 삽입된다.
현대 아그로박테리움 형질전환 벡터는 문헌 [Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)]에 기술된 바와 같은 간편한 조작을 감안하여 이. 콜라이 뿐만 아니라 아그로박테리움에서 복제가 가능하다. 게다가, 아그로박테리움-매개된 유전자 전이에 대한 벡터에서의 기술적 진보는 벡터에서 유전자 및 제한 부위의 배열을 개선시켜 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터의 구성을 촉진시킨다. 기재된 벡터는 프로모터 측면에 위치한 편리한 다중-링커 영역 및 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접 발현을 위한 폴리아데닐화 부위를 가지며, 본 발명의 목적에 적합하다. 또한, 무장된 및 비무장된 Ti 유전자 둘 다를 함유하는 아그로박테리움이 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 그러한 식물 변종에서 아그로박테리움-매개된 형질전환이 효율적인 경우 용이성 및 유전자 전이의 정의된 성질로 인한 선택 방법이다.
아그로박테리움 형질전환 방법을 이용하여 형성된 형질전환 식물은 한 염색체 상에 단일 유전자 좌를 전형적으로 함유한다. 그러한 형질전환 식물은 첨가된 유전자에 대해 반접합성이라 할 수 있다. 첨가된 구조 유전자에 대해 동형접합성인 형질전환 식물; 즉, 2개의 첨가된 유전자를 함유하며, 염색체 쌍의 각 염색체 상에서 동일한 좌위에서 한 유전자를 함유하는 형질전환 식물이 보다 바람직하다. 동형접합성 형질전환 식물은 단일 첨가된 유전자를 함유하는 독립된 분리개체 형질전환 식물을 유성 교배 (자가생식)시키고, 생성된 종자의 일부를 발아시키고, 대상이 되는 유전자에 대해 생성된 식물을 분석함으로써 얻을 수 있다.
또한 2개의 다른 형질전환 식물이 2개의 독립적으로 분리 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생성하기 위해 교배될 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 적합한 자손의 자가생식은 외인성 유전자 둘 다에 대해 동형접합성인 식물을 생성할 수 있다. 모 식물에의 여교배 (Back-crossing) 및 비-형질전환 식물과의 이종교배 (out-crossing)가 또한 고려되며, 식물생장 증식에서와 같다. 다른 특성 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법의 기술은 문헌 [Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)]에서 찾을 수 있다.
식물 원형질체의 형질전환은 인산칼슘 침강법, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공법, 및 이들 처리의 조합에 기반을 둔 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 이들 시스템의 다른 식물 변종에의 적용은 원형질체로부터 그 특정한 식물 균주를 재생시키는 능력에 따라 달라진다. 원형질체로부터의 곡류의 재생을 위한 예시적 방법은 문헌 [Fujimura et al, 1985]; [Toriyama et al, 1986]; [Abdullah et al, 1986]에 기재되어 있다.
세포 형질전환의 다른 방법이 또한 사용될 수 있으며, 여기에 제한되지는 않지만, 화분으로의 직접 DNA 전이, DNA의 식물의 생식 기관으로의 직접 주입, 또는 DNA의 미숙배의 세포로의 직접 주입에 의한 DNA의 식물로의 도입 이후에 건조된 배의 재수화가 포함된다.
단일 식물 원형질체 형질전환체 또는 다양한 형질전환된 외식편으로부터의 식물의 재생, 발달, 및 재배는 당업계에 익히 공지되어 있다 (문헌 [Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif, (1988)]. 이 재생 및 성장 과정은, 뿌리내린 소식물체 단계를 통한 배 발달의 일반적인 단계를 통한 이들 개별화된 세포를 배양하는 형질전환된 세포의 선택 단계를 전형적으로 포함한다. 형질전환 배아 및 종자는 유사하게 재생된다. 생성된 형질전환 뿌리내린 순 (shoot)은 그 후에 적당한 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 심어진다.
외부, 외인성 유전자를 함유하는 식물의 발달 또는 재생은 당업계에 익히 공지되어 있다. 바람직하게는, 재생된 식물은 동형접합성 형질전환 식물을 제공하기 위해 자가수분된다. 그렇지 않다면, 재생된 식물로부터 얻어진 화분은 작물학적으로 중요한 계통의 종자-장성 (seed-grown) 식물과 교차된다. 역으로, 이들 중요한 계통의 식물로부터의 화분은 재생된 식물을 수분시키기 위해 사용된다. 바람직한 외인성 핵산을 함유하는 본 발명의 형질전환 식물은 당업자에게 익히 공지된 방법을 이용하여 재배된다.
주로 근두암종균 (Agrobacterium tumefaciens)의 사용에 의한 쌍떡잎식물의 형질전환 방법, 및 형질전환 식물의 수득은 목화 (US 5,004,863, US 5,159,135, US 5,518,908); 대두 (US 5,569,834, US 5,416,011); 배추 (Brassica) (US 5,463,174); 땅콩 (문헌 [Cheng et al, 1996]); 및 완두콩 (문헌 [Grant et al, 1995])에 대해 공개되어 있다.
곡초류, 예컨대 밀 및 보리의 형질전환 방법, 외인성 핵산의 도입에 의한 유전자 변형의 식물로의 도입 방법, 및 원형질체 또는 미숙 식물 배아로부터 식물의 재생 방법은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, CA 2,092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6,100,447, WO 97/048814, US 5,589,617, US 6,541,257, 및 WO 99/14314를 참조한다. 바람직하게는, 형질전환 밀 또는 보리 식물은 근두암종균 매개된 형질전환 공정에 의해 생성된다. 바람직한 핵산 구조물을 운반하는 벡터는 조직 배양된 식물 또는 외식편, 또는 적합한 식물계, 예컨대 원형질체의 재생가능한 밀 세포로 도입될 수 있다.
재생가능한 밀 세포는 바람직하게는 미숙 배아, 성숙 배아의 배반, 이들로부터 얻은 칼루스 (callus), 또는 분열 조직으로부터 얻는다.
형질전환 세포 및 식물에서 전이유전자의 존재를 확인하기 위해, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 또는 사우던 블롯 (Southern blot) 분석이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 전이유전자의 발현 생성물은, 생성물의 성질에 따라 다르게, 웨스턴 블롯 (Western blot) 및 효소 분석법을 비롯한 임의의 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 단백질 발현을 정량화하고, 다른 식물 조직에서 복제를 검출하는 특히 유용한 한 방식은 리포터 (reporter) 유전자, 예컨대 GUS를 사용하는 것이다. 형질전환 식물이 수득되면, 바람직한 표현형을 갖는 식물 조직 또는 부분을 생성하기 위해 길러질 수 있다. 식물 조직 또는 식물 부분은, 수확되고/되거나, 종자 채취될 수 있다. 종자는 바람직한 특성을 갖는 조직 또는 부분을 갖는 부가적 식물을 기르기 위한 공급원으로써 작용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 형질전환 식물은 미국 특허 US 6,369,299에 일반적으로 기재된 방법을 이용하여 생성된다.
형질전환 인간 이외의 동물
"형질전환 인간 이외의 동물"은 동일한 종 또는 품종의 야생형 동물에서 발견되지 않는 유전자 구조물 ("전이유전자")을 함유하는 인간 이외의 동물을 나타낸다. 본원에 나타낸 바와 같은 "전이유전자"는 생물 공학 분야에서의 통상적인 의미를 가지며, 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생성되거나 변경되고, 동물 세포로 도입된 유전자 서열을 포함한다. 전이유전자는 동물 세포로부터 유래된 유전자 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 전이유전자는 동물로 인간 조작 예컨대, 예를 들어, 형질전환에 의해 도입될 수 있으나, 당업자가 인지하는 바와 같은 임의의 방법이 사용될 수 있다.
형질전환 동물의 생성을 위한 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이 주제에 대해 유용한 일반적인 교과서는 문헌 [Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)]이다.
이종 DNA가 예를 들어, 수정된 포유류의 난자로 도입될 수 있다. 예를 들어, 분화전능 (totipotent) 또는 분화다능 (pluripotent) 줄기 세포는 미세주입법, 인산칼슘 매개된 침강법, 리포좀 융합, 레트로바이러스 감염 또는 다른 수단에 의해 형질전환될 수 있고, 이후에 형질전환된 세포는 배아로 도입된 후, 배아는 형질전환 동물로 성장한다. 매우 바람직한 방법에서, 성장하는 배아는 바람직한 DNA를 함유하는 레트로바이러스, 및 감염된 배아로부터 생성된 형질전환 동물로 감염된다. 그러나, 가장 바람직한 방법에서, 적당한 DNA는 바람직하게는 단일 세포 단계에서 배아의 전핵 또는 세포질, 및 성숙 형질전환 동물로 성장하도록 허용된 배아로 공동주입된다.
형질전환 동물을 생성하기 위해 이용된 또다른 방법은 표준 방법에 의해 핵산을 전핵 단계 난자로 미세주입하는 것을 포함한다. 이후에 주입된 난자는 배양된 후 가임신 수용체의 난관으로 전달된다.
형질전환 동물은 또한 핵 치환 (nuclear transfer) 기술에 의해 생성될 수 있다. 이 방법을 이용하여, 공배 (donor) 동물로부터의 섬유아세포는 조절 서열의 제어 하에 대상이 되는 결합 도메인 또는 결합 파트너에 대한 코딩 서열을 혼입한 플라스미드로 안정적으로 형질감염된다. 안정한 형질감염체는 이후에 제핵 난모세포로 융합되고, 배양되어 암컷 수용체로 전이된다.
조성물
본 발명의 조성물은, 또한 "허용가능한 담체"로서 본원에 언급된 부형제를 포함한다. 부형제는 처리된 동물, 식물, 식물 또는 동물 물질, 또는 (토양 및 물 샘플을 비롯한) 환경이 허용할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 그러한 부형제의 예에는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크 용액, 및 다른 수성 생리적 평형 염류액이 포함된다. 비수성 비히클, 예컨대 고정유, 참기름, 에틸 올레에이트, 또는 트리글리세라이드가 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 제제에는 점도 증진제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유하는 현탁액제가 포함된다. 부형제는 또한 최소량의 첨가제, 예컨대 등장성 및 화학 안정성을 증진시키는 물질을 함유할 수 있다. 완충제의 예에는 인산염 완충제, 중탄산염 완충제 및 트리스 (Tris) 완충제가 포함되며, 보존제의 예에는 티메로살 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알코올이 포함된다. 부형제는 또한 조성물의 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 여기에 제한되지는 않지만, 고분자 제어된 방출 비히클, 생분해성 이식물, 리포좀, 박테리아, 바이러스, 다른 세포, 오일, 에스테르, 및 글리콜이 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체 상에서 고정되어 있다. 이는 s-트리아진 또는 디아진의 가수분해 속도 및/또는 정도를 증진시킬 수 있고/있거나, 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리우레탄 매트릭스 상에서 고정될 수 있거나 (문헌 [Gordon et al., 1999]), 또는 적합한 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다 (문헌 [Petrikovics et al., 2000a and b]). 폴리펩티드는 또한 발포체, 예컨대 화재 진압에서 통상적으로 사용되는 것들을 포함하는 조성물로 혼입될 수 있다 (문헌 [LeJeune et al., 1998]). 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 WO 00/64539에 개시된 바와 같이 스펀지 또는 폼으로 용이하게 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 다른 고체 지지체는 아크릴형 구조를 갖는 수지, 에폭시 관능기를 갖는 수지, 예컨대 세파비즈 (Sepabeads) EC-EP (Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation) 및 유퍼짓 (Eupergit) C (Rohm-Degussa), 또는 1차 아미노기를 갖는 수지, 예컨대 세파비즈 EC-has 및 EC-EA (Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)를 포함한다. 임의의 경우에서, 폴리펩티드는 수지와 접촉하여 있으며 관능기 (에폭시드)의 높은 반응성 또는 이관능성 작용제, 예컨대 글루타르알데히드를 갖는 수지의 활성화를 통해 고정되어, 효소가 매트릭스에 결합하도록 한다. 본 발명에 적합한 다른 수지는 폴리스티렌 수지, 거대망상 수지 및 기본 관능기를 갖는 수지, 예컨대 세파비즈 EC-Q1A이며: 폴리펩티드는 수지 상에 흡수된 후, 이관능성 작용제 (글루타르알데히드)와 가교됨으로써 안정화된다.
한 실시양태에서, 조성물은 Zn2 + 및/또는 Co2 +를 포함한다. 또다른 실시양태에서, s-트리아진 또는 디아진의 가수분해를 위한 본 발명의 방법은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 보조 인자로서 Zn2 + 및/또는 Co2 +를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 조성물을 동물, 식물, 동물 또는 식물 물질, 또는 (토양 및 물 샘플을 비롯한) 환경으로 서서히 방출할 수 있는 제어된 방출 제제이다. 본원에서 사용된 바와 같은, 제어된 방출 제제는 제어된 방출 비히클 중에 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 제어된 방출 비히클에는, 여기에 제한되지는 않지만, 생체적합성 중합체, 다른 중합 매트릭스, 캡슐, 미소캡슐, 극미립자, 농축괴 제제, 삼투압 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스피어, 및 경피 전달계가 포함된다. 바람직한 제어된 방출 제제는 생분해성 (즉, 생체부식성)이다.
본 발명의 바람직한 제어된 방출 제제는 본 발명의 조성물을 s-트리아진 또는 디아진을 포함하는 영역에 있는 토양 또는 물로 방출될 수 있다. 제제는 바람직하게는 시간 범위가 약 1개월 내지 약 12개월에 이르는 기간에 걸쳐 방출된다. 본 발명의 바람직한 제어된 방출 제제는 바람직하게는 약 1개월 이상, 보다 바람직하게는 약 3개월 이상, 보다 더 바람직하게는 약 6개월 이상, 보다 더 바람직하게는 약 9개월 이상, 보다 더 바람직하게는 약 12개월 이상 처리를 수행할 수 있다.
s-트리아진 또는 디아진의 가수분해를 위해 효과적인 조성물을 생성하기 위해 요구될 본 발명의 폴리펩티드, 벡터, 또는 숙주 세포 등의 농도는 오염물질제거된 샘플의 성질, 샘플에서 s-트리아진 또는 디아진의 농도, 및 조성물의 제형화에 따라 달라질 것이다. 조성물 내에서 폴리펩티드, 벡터, 또는 숙주 세포 등의 효과적인 농도는 본 발명의 방법을 이용하여 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 효소, 및/또는 이를 위한 숙주 세포 인코딩은 WO 2004/112482 및 WO 2005/26269에 일반적으로 기재된 바와 같은 코팅 조성물에서 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 증진된 활성을 갖는 TrzN 돌연변이체
방법 및 물질
잘려진 pET14b 플라스미드 (pETcc2)를 TrzN 및 그의 변이체의 발현에 사용하였다. 모든 trzN 유전자는 독특한 NdeI 및 BamHI 부위를 사용하여 pETcc2로 클로닝하였고, 이. 콜라이 균주 BL21 λDE3 (Novagen)에서 발현시켰다. NdeI/BamHI 소화된 pETcc2를 라이브러리에서 투입된 벡터의 비율의 단순 가시 표지를 제공하는 pETcc2::egfp (도 2)로부터 제조하였다 (즉, 청색광 하에 강한 형광 반응을 보이는 투입된 벡터).
코돈 최적화된 TrzN (서열번호 2 - TrzNco)를 진아트 (GENEART) AG (BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg Germany)에 의해 제조하였다.
임의 돌연변이 생성은 진몰프 (GeneMorph) II (Stratagen)를 이용하여 제조자 지침서에 따라 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 1 및 2를 사용하여 유전자를 증폭시켰다 (표 2).
부위-포화 돌연변이 생성은 표 2에 상술된 바와 같이, 프라이머 3-24를 이용하여 PCR 매개된 부위-지시된 돌연변이 생성에 의해 수행하였다. NNS 동의성 (문헌 [Georgescu et al., in Directed Evolution Library Creation, Eds.: F. H. Arnold, G. Georgiou, Humana Press, Totowa, NJ, 2003, pp. 75 - 89])을 사용하여 trzN 유전자의 67, 91, 131, 159, 161, 243, 246, 294, 335, 350 번째 코돈에서 다양성을 생성하였다 (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고, S는 G 또는 C이다).
임의 및 부위-포화된 라이브러리는 200 μg.mL-1의 암피실린, 1 μM IPTG로 충전된 LB 아가 플레이트를 사용하여 스크리닝하였고, 1 mg.mL-1 아트라진 (90% 아트라진 w/w; 게사프림 (Gesaprim) 900 WG, (Syngenta))으로 침지시켰다. TrzN 활성을 활성 TrzN을 발현시키는 콜로니 근방에서 배지의 정화 (clearing)를 초래하는 아트라진 탈염소화에 의해 평가하였다. 활성 수준은 정화가 발생하는 속도에 따라 결정하였다.
모든 시퀀싱은 마이크로몬 (Micromon) (Monash University, Melbourne, Victoria)에 의해 수행하였다.
기질 범위는 이전에 보고된 바와 같이 (문헌 [Shapir et al., 2005b]) 264 nm에서의 흡수 손실에 의해 측정된 바와 같이, 정제된 His6TrzNcc3.2의 기질 가수분해 속도를 측정함으로써 시험하였다. 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 및 시아노진 (99% 초과의 순도 페스티날 (Pestinal) 표준; Sigma)을 이 방법에 의해 시험하였다. His6TrzNcc3.2를 친화 크로마토그래피 (HisTrap; GE HealthCare)에 의해 정제한 후, 크기 배제 (size exclusion) 크로마토그래피 (Superdex 200; GE HealthCare)에 의해 정제하였다.
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결과
반복된 임의 돌연변이 생성
아트라진 플레이트-정화 분석을 이용하여 BL21 λDE3 pETcc2::trzNco의 아트라진 가수분해 탈염소화 능력을 평가하였다. 박테리아 성장 부근에서 고체 배지의 정화가 30일 이후에도 발견되지 않음으로써, BL21 λDE3 pETcc2::trzNco는 아트라진 클로로히드로라아제 활성이 전혀 또는 검출가능하지 않다고 여겨진다. trzNco의 임의 돌연변이체를 낮은 정확도 DNA 중합효소 뮤타자임 (Mutazyme) II (GeneMorph II)를 이용하여 생성하였고, 아트라진에 대한 가수분해 활성에 대해 아트라진 함유 아가 플레이트 상에서 스크리닝하였다. trzNco에서의 단일 동의 돌연변이 (T468C)는 페닐알라닌을 코딩하는 156번째 코돈을 TTT에서 TTC로 변경시켰다 (서열번호 3). 이 돌연변이체 (TrzN L1, 표 3)는 37℃에서 8일 후 아트라진을 정화하는 능력을 부여받았다.
TrzN L1을 임의 돌연변이 생성의 다음 단계에 대한 주형으로 사용하였다 (반복 1). 27개의 돌연변이체는 BL21에 부모 trzNco보다 신속하게 정화 구역을 형성하는 능력을 부여하는 것으로 밝혀졌다 (TrzN L1, 표 3). 반복 1 돌연변이체는 3 내지 6일 사이에 정화 구역이 나타났다. 정화 구역을 가장 신속하게 형성하는 15개의 돌연변이체 (TrzN cc1.1, TrzN cc1.3, TrzN cc1.4, TrzN cc1.6, TrzN cc1.8, TrzN cc1.9, TrzN cc1.10, TrzN cc1.11, TrzN cc1.12, TrzN cc1.13, TrzN cc1.14, TrzN cc1.15, TrzN cc1.25, TrzN cc1.26 및 TrzN cc1.27)는 다른 단계의 임의 돌연변이 생성을 위한 주형으로 사용하였다 (반복 2).
반복 2 돌연변이유발 PCR로부터의 생성물을 함께 스크리닝하여 최상의 종합적 수행 돌연변이체가 선택되도록 하였다. 45 내지 96시간에 이르러 정화 구역을 형성한 36개의 콜로니를 선택하였다 (표 3). 최상의 13개의 반복 2 돌연변이체 (45 내지 48시간에서 정화; TrzN cc2.1, TrzN cc2.2, TrzN cc2.3, TrzN cc2.4, TrzN cc2.5, TrzN cc2.6, TrzN cc2.7, TrzN cc2.8, TrzN cc2.9, TrzN cc2.10, TrzN cc2.11, TrzN cc2.12 및 TrzN cc2.13)를 임의 돌연변이 생성의 세 번째 반복을 위해 사용하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

다시 반복 2 돌연변이유발 PCR로부터의 생성물을 함께 스크리닝하여 최상의 종합적 수행 돌연변이체가 선택되도록 하였다. 13개의 제3 반복 돌연변이체가 선택되었으며; 24 내지 31시간에서 정화를 부여하는 것이 선택되었다. 상기 돌연변이체의 뉴클레오티드 및 아미노산 치환을 각각 표 4 및 5에 요약하였다. 단일 유전자 내에서 가장 많은 수의 뉴클레오티드 돌연변이는 14개이며, 임의의 변이체 효소에서 최대 7개의 아미노산이 치환되었다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Figure pct00009
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흥미롭게도, 하나의 아미노산 치환으로 생성된 돌연변이 및 정화 속도에 영향을 미치는 것으로 보이지 않은 돌연변이는, 단백질 폴딩 및 안정성에 영향을 주는 인자 이외에 종합적 TrzN 활성의 전사 또는 번역 요인이 있다는 것을 시사하였다. 이는 단백질 서열에는 변화가 없었으나 F156을 인코딩하는 데 사용된 페닐알라닌 코돈에 다소 변경되어 생성된 (TTT에서 TTC로), trzNco에서 trzN L1 돌연변이 (T468C)로의 작용에 의해 명백히 증명되었다. 그들의 동일한 생성물에도 불구하고 trzN L1이 모 유전자보다 명백히 더 나은 결과를 보였다 (표 3).
부위-포화 돌연변이 생성
임의 돌연변이 생성 프로그램의 첫 번째, 두 번째, 또는 세 번째 반복 동안 한번 이상 변경된 아미노산, 또는 임의 돌연변이 생성의 두 번째 및 세 번째 반복 때 강하게 선택된 아미노산, 또는 임의 돌연변이 생성의 한 단계에서 존재하고 독립적인 제2-부위 돌연변이로서 임의 돌연변이 생성의 두 번째 및 세 번째 반복의 모 주형에서 다른 돌연변이와 결합한 아미노산은 trzNco 돌연변이체의 개선된 아트라진 데클로리나아제 활성의 중요한 결정 요인으로 여겨졌다. 임의 돌연변이 생성에 의해 도입될 것 같지 않은 아미노산의 치환을 비롯하여 이러한 위치에서 서열 공간을 보다 완전히 탐구하기 위해, 각각의 이들 부위에 대한 부위-포화 라이브러리를 제조하였다 (코돈 67, 91, 131, 159, 161, 210, 243, 246, 294, 335 및 350; 표 6).
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특정 부위에서 광범위한 대체물에 의한 아미노산 치환은 모 유전자와 비교하여 정화 속도의 증가를 초래한 한편, 다른 것은 단지 하나의 대체 아미노산의 상당한 보존적 치환만을 허용하였다. L131, D350, G246의 12개 (P, N, T, D, V, G, C, S, Q, H, Y, I), 6개 (D, S, E, K, V, A), 5개 (Y, N, F, K, H) 대체 아미노산으로의 치환은 야생형 효소와 비교하여 증가된 데클로리나아제활성을 초래하였다. A294는 3개의 대체 아미노산 (T, S 또는 L)으로 치환되어 더 큰 아트라진 데클로리나아제 활성을 수득할 수 있으나, A159 및 L243은 각각 2개의 대체물 (각각 V 또는 T, 및 P 또는 G)로 치환되는 것만 성공적이었다. 위치 중 5곳에서, 오직 하나의 가능한 치환만이 개선된 활성을 수득하였다 (Y67F, T91S, S161G, P210A 및 L335M) (표 6). 본 발명자들은 또한 L131P A159V를 배경으로 D38X 부위 포화 라이브러리로부터 100개의 콜로니를 스크리닝하였다. 본 발명자들은 명백히 개선된 정화 표현형을 갖는 5개의 콜로니를 얻었다. 그러한 표현형을 제공한 하나의 치환은 D38N이었다.
변이체 TrzN cc3 .2에서 돌연변이의 특성
SDS-PAGE 및 반응속도법 분석은 활성에서의 방대한 다수의 개선은 증가된 발현의 결과라는 것을 입증하였다. 실제로, 발현이 돌연변이 생성의 각 단계에서 점진적으로 증가하여, 3개의 아미노산 치환 (D38N, L131P 및 A159V) (도 3)을 포함하는 세 번째 단계에서 최상의 활성 돌연변이체가 얻어졌다. trzN에 다수의 침묵 돌연변이가 존재하였고, 이들은 아마 tRNA의 용법, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 대한 2차 구조 작용을 변화시켜 증가된 발현에 기여할 수 있다. 각각의 아미노산 변화의 용해도 증가에 대한 기여는 이들을 TrzN 야생형 배경으로 개별적으로 도입하고, 회귀성 돌연변이를 돌연변이체로 개별적으로 도입함으로써 분석하였다. 돌연변이 생성 동안 도입된 첫 번째 돌연변이인 A159V 치환의 존재는 최종 변이체보다 수용성 발현이 12.5% (8.4 mg/L)로 증진되었다. 두 번째 치환 (L131P)의 A159V 배경으로의 도입은 최종 변이체보다 수용성 발현이 42% (28 mg/L)로 증진되었고, 세 번째 치환 (D38N)의 131P, A159V 배경으로의 도입은 수용성 발현이 67.2 mg/L로 증가하였다 (도 3). 야생형 TrzN 배경에서 L131P 돌연변이는 A159V 치환과 같이 용해도에 대해 유사한 효과 (6.6 mg/L 수율)를 가졌다. 따라서, 돌연변이를 합하는 효과는 가산적인 것이 아니라 시너지적이었다. 실제로 D38N, L131 변이체는 L131P 변이체보다 상당히 용해도가 낮았고, 한편 D38N 변이체는 야생형의 TrzN에 대해 이전에 보고된 것과 수율에서 유사하였으며, 이는 D38N 치환이 A159V 치환의 존재 하를 제외하고는, 효소 수율에 부정적으로 영향을 미치는 것을 시사한다.
기질 범위
크기 배제 크로마토그래피에 의한 TrzN cc3.2의 정제로 75 내지 150 kDa의 native 분자량을 가짐이 밝혀졌고, 이는 호모다이머 또는 호모트라이머 (homotrimer)임을 시사한다. 이것은 호모헥사머 (homohexamer)인 AtzA와 대조적이며, 이전에는 TrzN이 모노머라고 보고되었다 (문헌 [Shapir et al., 2006]).
정제된 효소를 사용하여 반복 3 TrzN 변이체의 기질 범위를 결정하였다. TrzN cc3.2는 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 및 시아노진을 가수분해할 수 있고 (표 7), 이는 할로겐 및 메틸티올 이탈기, N-에틸, N-이소프로필, N-디에틸, N-시아노디메틸메틸 알킬 측쇄를 갖는 s-트라이아진을 나타낸다. 메틸티올 및 메톡시 이탈기의 화학적 성질이 매우 유사해서, TrzN cc3.2는 메톡시-s-트리아진 (예를 들면, 아트라톤)에 대해 이전에 보고된 활성을 보유할 것이 예상된다 (문헌 [Shapir et al., 2005b]).
정제된 TrzN cc3.2 대 트리아진 범위에 대한 특이적 활성 데이타.
보고된 특이적 활성은 100 μM 기질 및 41 nM TrzN cc3.2에서 측정됨.
*은 문헌 [Shapir et al., 2006] 참조. ND (not determined): 결정되지 않음.
기질 이탈기 N-알킬 측쇄 1 N-알킬 측쇄 2 TrzN cc3.2 관련 활성 TrzN 관련 활성 *
아트라진 염화물 에틸 이소프로필 1.36 0.16
아메트린 메틸싸이올기 에틸 이소프로필 1 1
프로파진 염화물 이소프로필 이소프로필 0.86 ND
프로메트린 메틸싸이올기 이소프로필 이소프로필 1 ND
시마진 염화물 에틸 에틸 1.36 0.41
시메트린 메틸싸이올기 에틸 에틸 0.57 0.14
이파진 염화물 이소프로필 다이에틸 0.07 ND
트리에타진 염화물 에틸 다이에틸 0.04 ND
시아노진 염화물 에틸 시아노디메틸메틸 0.43 ND
숙주 및 벡터 범위
TrzNcc3.2 및 야생형 TrzN 둘 다의 모든 코딩 영역을 유도성, 높은 수준의 발현 벡터 pETcc2로부터 낮은 수준의, 항시적 발현 벡터 (pCS150, 문헌 [Scott et al., 2009])로 옮겼다. 그 결과로 생긴 벡터를 사용하여 이. 콜라이 JM109, DH10β, 및 BL21 λDE3 세포를 형질전환시켰다. 아트라진 정화 배지 분석을 이용하여 그 결과로 생긴 6개의 균주를 그의 정화 속도에 대해 시험하였다. 각각의 경우에서 TrzNcc3.2 발현 균주는 37℃에서 2일 내에 정화한 한편, 야생형 TrzN을 발현시키는 균주는 37℃에서 12일 후에도 정화하지 못하였다. 이는 TrzN 발현의 개선이 플라스미드나 균주에 따라 달라지지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 2 - 증진된 활성을 갖는 TrzN 돌연변이체의 구조
방법 및 물질
구조 풀이 ( Structure Solution )
데이터 수집 통계자료는 다른 곳에 보고되어 있다 (문헌 [Jackson et al., 2006]). 금속효소의 활성 부위 메탈로부터 단일-파장 변칙 회절 (single-wavelength anomalous diffraction: SAD) (문헌 [Dauter et al., 2002])을 이용한 위상 (phase) 결정이 이전에 보고되었다 (문헌 [Liu et al., 2005]). 이전의 연구 (Jackson 등, 2006)가 TrzN 다이머가 비대칭의 구성단위를 가진다고 제안하였기 때문에, 프로그램의 CCP4 모음 (Collaborative-Computational-Research-Project-4, 1994)에서 시행된 바와 같은 SHELXD (문헌 [Schneider et al., 2002])를 이용하여 1.28269 Å에서 수집된 SAD 자료를 이용한 변칙 회절 패터슨 (Patterson) 합성에서 4개의 Zn2 + 이온 부위의 위치를 찾아냈다. MLPHARE (문헌 [Otwinowski, 1991])를 후속적으로 사용하여 4개의 부위의 분율 (site occupancy)을 정련하고 2.43의 위상 출력 (phasing power)으로 초기 위상을 얻었다. SHELXE를 밀도 변형 및 위상 개선을 위해 사용하고 (문헌 [Sheldrick et al., 2002]), 높은 용매 함량 (79%)이 의심할 여지없이 위상의 질에 기여한다 (문헌 [Terwilliger, 2001]).
모델의 구성 및 정련
초기 위상은 ARPwARP를 사용하여 자동화 모델 구성을 수행하였다 (문헌 [Perrakis et al., 2001]). 이로써 38.0%의 Rfree를 갖는 초기 위상이 생성되었다. 이어서 COOT (문헌 [Emsley and Cowtan, 2004])를 이용하여 상호적인 모델 구성의 수회의 단계를 수행한 후, REFMAC v5 .0 (문헌 [Murshudov et al., 1997])에서 시행된 바와 같이 구조의 이상화를 수행한 결과, Rfree는 28.7%였다. 억제된 정련 및 물 분자의 첨가는 Rfree를 23.5%로 감소시켰다. 이어서, B-인자를 20으로 맞추고, 각 쇄의 1-195, 196-255 및 256-271 잔기를 포함하는 세 견고한 바디를 사용하여 TLS 정련 (문헌 [Winn et al., 2001]) 10회에 이어서 가능한 최대의 정련 3회를 실시하여 Rfree를 20.0%으로 낮추고 또 19.6%로 더욱 낮췄다. TLSANL (문헌 [Howlin et al., 1993]) 및 ANISOANL (문헌 [Winn, 2001])을 이용하여 TLS 정련에 의해 생성된 데이터를 분석하였다. TLSANL에 의해 생성된 진동 텐서 (libration tensor)는 1.5의 척도 인자 (scale factor)를 사용하여 RIBBONS (문헌 [Carson, 1991])를 이용하여 시각화하였다. 구조의 기하학적인 검증은 RAMPAGE (문헌 [Lovell et al., 2003])를 사용하여 이루어졌으며, 제시된 모든 잔기는 선호하거나 허용되는 영역에 있음을 나타냈으며; PROCHECK (문헌 [Laskowski et al., 1993])로 제시된 모든 입체화학적 매개변수가 정상 한계 보다 좋거나 또는 그 안에 있음을 나타냈고; SFCHECK (문헌 [Vaguine et al., 1999])로 0.45 Å2의 루자티 플롯 (Luzatti plot)에 의해 좌표에서 전체적인 오류를 보였다.
결과
사르가소해 (Sargasso Sea)의 환경 샘플로부터의 27%의 유사성 구조 2PAJ를 사용하여 분자 치환으로 TrzNcc3.2의 구조를 풀었다 (Argawal, R. et al., 출판되지 않음). 정확한 풀이는 검색 모델의 광범위한 '가지치기' (pruning) 후에야 발견되었고, 프로그램 PHASER (문헌 [McCoy et al., 2007])를 이용한 두 번째 최상 히트인 다이머의 한 분자만을 찾을 수 있었다. 다이머 중의 두 번째 분자는 프로그램 MOLREP (문헌 [Vagin and Teplyakov, 2000])을 이용하여 후속적으로 발견하였다. 53.4%의 모델에 대한 초기 Rfree가 광범위한 모델 구성 및 정련 후에 21.1%로 감소하였다.
결정학적 비대칭 단위에서 한 개의 99.8 kDa 호모다이머가 존재하며, 이는 두 개의 실질적으로 동일한 TrzN의 49.6 kDa 서브유닛을 함유하고 (도 4), 이들은 편각 (polar angle)에서 (θ, φ) = (93, 90°)인 비-결정학적 이중-접힘 축 (non-crystallographic two-fold axis)에 의해 연관되어 있다. 공지된 구조에 대한 낮은 서열 유사도에도 불구하고, TrzNcc3.2는 (β/α)8 바렐 구조적 접힘 (barrel structural fold)을 채용하며, 크고 기능적으로 다양한 금속-의존형 아미도히드롤라아제 상과에 속하였다. 단백질 데이타 뱅크 (PDB)에서 가장 유사한 구조는 2PAJ와 같이 기능이 대부분 공지되지 않았다. 그러나 기능적으로 주석을 단 것들과 가장 가까운 동족은 21% 서열 동일성 및 2.2Å의 주쇄 평균제곱근편차 (r.m.s.d)를 갖는 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima )로부터의 5-메틸티오아데노신/S-아데노실호모시스테인/아데노신 데아미나아제인 TmO938 (문헌 [Hermann et al. 2007]), 19% 서열 동일성 및 2.5Å의 주쇄 r.m.s.d를 갖는 인간 구아닌 데아미나아제 (2uz9; Moche, M et al., 출판되지 않음), 및 19%의 서열 동일성 및 2.9Å의 주쇄 r.m.s.d를 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis )로부터의 이미다졸론 프로피오나아제 (문헌 [Yu et al., 2006])이다.
TrzN의 활성 부위 공동 (cavity) (도 5)은 각각의 서브유닛의 촉매적 도메인의 중심에 위치한다. 도킹된 (docked) 기질 아트라진을 갖는 활성 부위 구조의 도표를 도 4에 제시하였다. 2번 가닥의 글루타민 잔기 및 추정 물/히드록시드 친핵체 이외에 1번 가닥 (H63, H65) 및 5번 가닥 (H238) 상에 위치한 아미도히드롤라아제 모티브의 세 개의 보존된 히스티딘이 금속 리간드를 구성한다. 활성 부위 Zn2 + 금속이온은 가로축 (equatorial) 리간드를 포함하는 H63, H65, 및 H238, 및 세로축 (axial) 리간드를 포함하는 Q142 및 물 분자와 함께 삼각형의 양추 (bipyramidal) 기하학적 구조로 배위결합된다. Q 129로의 결합-길이 (3.5 Å)는 예상보다는 길지만 이 잔기의 최소의 움직임을 통해 유의하게 짧아질 수 있다. Zn2 + 금속이온은 낮은 점유율 (occupancy) (약 20%)에서만 결합하므로, 본 발명자들은 완전히 점유한 활성 부위는 Q129-Zn2 + 상호작용을 가질 수 있다고 제안한다. 상기 금속의 낮은 점유율이 전자 밀도에 기초한 그의 지정을 모호하게 하기 때문에, Zn K-edge에서 수집된 변칙적 데이타를 사용하여 Zn2 +-TrzN 활성 부위의 비보에 차이 푸리에 맵 (Bijvoet difference Fourier map)을 계산하였으며, 이는 금속효소에서 활성 부위 금속 이온을 동정하는 데 효과적임이 제시되었다. 이 맵은 예상되는 위치에서 활성 부위에 결합된 Zn2 +을 명확하게 제시하였다. 친핵성인 물분자가 H274에 추가적으로 수소결합을 하는 것으로 제시되었으며, H274는 아미도히드롤라아제 모티브의 보존된 잔기이며, 결과적으로 D300에 수소결합하여 H-D 촉매 한 쌍 (dyad)을 형성한다. 상이한 pH 수치에서 운동역학적 분석을 한 결과 친핵체가 대략 8의 pKa를 가짐을 알 수 있었고 (도 9), 8.4의 용액 중 pKa 수치를 갖는 Zn2 +-OH- 추가적 활성화와 일치하였다.
금속 이온-의존성 아미도히드롤라아제 족의 다른 구성원의 활성 부위와 표면적으로 비슷하지만 하나의 주요한 차이가 있는데: 모든 다른 아미도히드롤라아제 구조에 존재하는 보존된 아스파르트산 금속 리간드가 금속 이온 리간드로 작용하지 못하는 트레오닌 잔기에 의해 치환된 것이다. 아스파르트산은 금속 이온의 삼각형의 양추 배위결합 기하학적 구조를 복원하는 Q129에 의하여 비-유사 (non-analogous) 위치에 기능적으로 치환되었다. 전하를 띄는 금속 리간드의 극성 리간드로의 치환은 금속이온 친화성을 감소시킬 수 있다 (도 7). 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes)로부터의 메탈로-포스포디에스테라아제의 활성 부위가 이 측면에서 정보를 제공한다; 활성 부위에서의 두 금속 이온의 배위권은 α-부위에 있는 아스파르트산이 β-위치에 있는 아스파라긴으로의 치환이 상이하며, 이는 β-부위에 대한 금속 이온 친화성을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 실제로, TrzN이 금속 이온에 대해 상대적으로 약한 친화성을 갖는 것으로 보이며; 과량의 Zn2+을 성장 배지에 첨가하고, 정제 또는 결정화 동안 금속 킬레이터를 사용하지 않아도, 결정 구조는 아연의 매우 낮은 점유율을 갖는다 (상기 참조).
Zn2 +의 해리 상수는 다수의 Zn2 +-함유 효소에 대해 결정된 것보다 높은 규모의 5위와 6위 사이인 2.6 μM (도 6)로 결정되는데, 상기 효소는 보통 낮은 피코몰 범위에서 아연에 대한 Kd를 갖는다 (탄산무수화효소 Kd = 4 pM; 글리옥실라아제 I, Kd = 27 pM; 디펩티딜 펩티다아제 III, Kd = 17 pM; 카르복시펩티다아제 A, Kd =1.6 pM; 과산화물 제거효소, Kd = 10 pM).
TrzN의 기질-결합 포켓을 특성화하기 위해, 아트라젠을 수동으로 활성 부위 상에 모델링시켰다 (도 5 및 7). 공동 (cavity)은 4 구역으로 나눌 수 있으며; 이소프로필 및 에틸 측쇄 포켓, 아트라젠의 방향족 고리와 π-π 스택킹 (stacking)을 통해 상호작용하는 하나의 잔기, 및 기질 및/또는 생성물과 수소 결합하는 잔기들로 되어있다. 금속 이온 리간드 H238에 추가로, 이소프로필 측쇄 포켓은 M82, L86, P131, F132, M163, C198 및 Y215의 측쇄에 의해 형성된다. 에틸 측쇄 포켓은 친핵성 리간드 H274 뿐만 아니라 4개의 잔기 P299, D300, M303 및 W305 측쇄에 의해 형성된다. 포켓의 '베이스 (base)'에서 W85는 아트라젠의 방향족 고리와 π-π 스택킹 상호작용을 형성하며, 이는 전이 상태 동안 발생하는 결합 및 음전하 둘 다를 안정화시킬 것이다. 마지막으로 E241은 아트라젠과 수소 결합을 형성하기 위해 자리를 잡는데, 이소프로필 측쇄의 NH기로부터 카르복실기의 산소원자의 거리는 3.3Å이며, 2.9Å 수소결합에 의해 연결된 S328-T325 한 쌍 (dyad)은 가수분해를 통해 생성된 클로라이드 이온과 상호작용할 수 있으며, 이때 정사면체 중간체 상에 발생할 음전하를 안정화시킨다.
흥미롭게도, 노카르디오이데스 종 (Nocardioides sp.) 균주 AN3으로부터의 천연 TrzN 변이체에 대한 최근 연구는 약한 이탈기를 갖는 기질, 예컨대 아메트린에 대한 효소적 활성을 막는 E241Q 돌연변이를 확인하였다 (문헌 [Yamazaki et al., 2008]). 본 발명들은 우리 시스템에서 이 효과를 시험하였고, 또한 이 돌연변이의 결과로서 활성에서의 변화를 발견하였으나, 이것은 기질의 결합 (Km)보다는 기질 대사 회전율 (turnover) (K cat )의 감소의 결과임이 제시되었다 (표 8). 대사 회전율이 영향을 받는다는 관찰은 약한 이탈기를 갖는 기질에 대해 감소된 활성을 갖는 Q241 돌연변이에도 일관되게 나왔으며, 이는 돌연변이가 반응에 대한 활성화 에너지를 효과적으로 낮추는 효소의 능력을 감소시키는 것을 제시한다. 동일한 보고에서 위치 214 및 215는 약한 기질에 대한 촉매작용에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 다시 말하지만, 본 발명자들은 이것이 k cat 에서의 감소로 인한 것임을 제시한다 (표 8). 종합적으로, 기질의 결합 공동의 상호보완적 성질은 형태 및 소수성 (hydrophobicity) 둘 다에 관하여 현저하다. 금속 리간드 및 기질/생성물에 대한 수소 결합에 관여하는 잔기를 제외하고, 11/12 잔기는 소수성이며, 이는 동일하게 소수성인 아트라진 기질의 단단하고 정력적으로 친화적인 결합 및 탈용매를 촉진시킬 것이다.
TrzN cc3.2에서의 위치 214, 215 및 241에서의 아미노산 치환의 작용
아미노산 위치 아트라진 아메트린
214 215 241 k cat (sec-1) K m (μM) k cat (sec-1) K m (μM)
TrzN 3.2



 P Y E 3.5 49 10.5 43
T Y E 1.8 53 0.4 49
T H E 1.3 59 0.3 61
P Y Q 12.1 61 ND ND
P H Q 3.4 58 ND ND
ND (not detected) : 검출되지 않음
활성 부위가 아트라진에 이상적으로 맞는 것처럼 보이기는 하나, 벌크 (bulk) 용매에는 완벽히 폐쇄적인데, 즉, 아트라진이 이 기질 결합 포켓에 들어갈 수 있는 방법이 없다는 것이 흥미롭다. 따라서, 이는 구조 역학이 어느 정도 확신을 가지고 기질 대사회전에 통합되도록 제시될 수 있음을 보여주는 한 예이다. 폐쇄된 활성 부위 열 (cleft)은 도 5 및 7에 제시되었으며, 소수성 잔기 (L86, M92, L172, Y215, L243, M247, M303 및 W305)의 네트워크가 활성 부위 입구에서 상호작용하여 효과적으로 '집핑 (zipping)'되어 닫힌다. '록 (lock)'은 루프 3번의 L172이며, 이는 네트워크의 상부에 존재하며 공간에 있는 다른 잔기를 효과적으로 잡는다. 활성부위가 개방됨으로써 합당한 메카니즘은 특히 움직이는 루프의 정점에 위치하는 L185를 주로 고려하며, 이는 단백질의 나머지 부분에 상대적으로 평균적인 B-인자가 부분적 점유율/높은 운동성에 일치하게 매우 높다. 이 루프에서의 구조적 변화는 활성 부위 열의 두 측면을 자유롭게 하여 유사한 효소에서 관찰되어 온 (문헌 [Jackson et al., 2007]) '호흡' 동작에서 분리하고, 기질이 들어오도록 하고 생성물이 출발하도록 한다. 실제로, 이 족의 구성원에서의 표면 루프의 구조적 변동의 역할은 최근 다루어졌고, 촉매반응 (폐쇄) 및 확산 (개방)에 대해 최적화된 구조적 기질들 사이에서 효소를 전환시킴으로써 대사 회전율을 조정하도록 할 수 있다.
TrzN의 구조, 기질 도킹 및 역학은 촉매 매카니즘을 도 8에 약술한 바와 같이 제시도록 한다. 반응은 1) 기질 결합 및 친핵체 발생, 2) 친핵성 공격, 3) 정사면체 중간체의 분해, 4) 생성물 방출의 네 단계로 나눌 수 있다. 촉매작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 TrzN의 활성 부위에 존재하는 2개의 촉매적 한 쌍이 있다. 이들 중 첫 번째인 D300-H274 한 쌍은 활성 부위 아연 금속이온과 함께 친핵성 수산화물의 생성에 필수적으로 보인다. 활성 부위 Zn2 + 이온은 루이스산으로 작용하여 결합된 물의 pKa를 낮추는 한편, D300에 의해 위치결정하고 안정화된 H274는 탈양성자화에 기여하여 친핵성 수산화물을 형성한다. 기질 결합은 주로 W85와의 π-π 스택킹 상호작용 및 E241과의 수소 결합을 포함한다. 약한 이탈기에 대한 활성 손실 (문헌 [Yamazaki et al., 2008]) 및 Q241에 대한 이 잔기의 돌연변이 생성 상에서 k cat 수의 감소 (표 8)는 E241과의 정전기적 상호작용이 방향을 최적화하는 것 이외에도 기질을 활성화시키는 데 작용할 수 있음을 시사한다. 기질 결합 및 친핵체 발생 후에, 친핵성 공격이 C4 탄소에서 발생하여, 신규 히드록실기, 염소 원자를 통해, 전이상태의 방향족 트리아진 고리 내에 분산된 다른 위치로 옮겨진 음이온과 함께, 정사면체 중간체 (이 배열은 SN2 치환을 불가능하게 함)의 형성을 초래한다. 이 전하는 히드록실기에서의 D300-H274 한 쌍, 및 염소 원자에서의 S329-T325 한 쌍, 방향족 고리에서의 W85와의 π-π 스택킹에 의해 안정화될 수 있다. 이 중간체의 분해는 탈염소화된 생성물 히드록시아트라진과 함께 하나의 유리된 클로라이드를 생성할 것이다. 이어서 생성물 방출은 효소에서의 구조적 변화 및 활성 부위 열의 개방을 요구할 것이다.
결론적으로, 하기 잔기가 변화되어 특이적 활성, 촉매 상수 (k cat ), 기질 특이성 (Km), 안정성 및/또는 이차속도상수 (k cat /Km)를 변경시킬 수 있다: M82, W85, L86, M92, P131, M163, L172, C211, Y215, H238, E241, L243, M247 H274, P299, D300, M303, W305, T325 또는 S329.
실시예 3- 실지 시험
방법 및 물질
TrzNcc 3.2-함유 균질현탁액의 제조
활성 TrzNcc3.2를 함유하는 청징화된 박테리아 균질현탁액을 최소배지 (10.6 g/L KH2PO4, 4 g/L (NH4)2HPO4, 1.7 g/L 시트르산 모노히드레이트, 31.3 mL/L 글리세롤)에서 성장한 TrzNcc3.2 발현하는 BL21 λDE3의 2 리터 발효기로부터 제조하였다. 10 mL/L의 PTM4 염 (0.2 g/L D-비오틴, 2.0 g/L CuSO4.5H2O, 0.08 g/L NaI, 3.0 g/L MnSO4.H2O, 0.2 g/L Na2MoO4, 0.02 g/L 붕산, 0.5 g/L CoCl2.6H2O, 7.0 g/L ZnCl2, 22.0 g/L FeSO4.7H2O, 0.5 g/L CaSO4, 1 mL/L H2SO4)을 오토클레이브한 후, 0.6 g/L MgSO4를 첨가하였다. 글리세롤을 주면서 발효를 시키고, 150 mg/L 암피실린 및 331 mg/L 티아민을 보충해주고, 11.9 mg/L IPTG로 유도시켰다. 발효는 약 240 g 습윤 중량의 세포 침전물 (OD600 = 122)을 생산하였다. 세포를 5.2 g/L MOPS pH 6.9 중에 현탁시킨 후, 균질기에 3회 통과시키고 원심분리에 의해 청징화하였다. 청징화된 용해물을 0.22 μm 필터에 통과시켜 온전한 세포를 제거하고, DNaseI을 사용하여 온전한 DNA를 제거하였다. 문헌 [de Souza et al., 1996]에 기재된 UV 흡광도 분석법 및 문헌 [Scott et al., 2009]에 기재된 비색법 둘 다를 이용하여 효소 활성을 결정하였다 (258 ± 19 mg의 아트라진/ mg의 용해물/분). 균질현탁액을 -80℃에 보관하고 필요할 때 4℃에서 해동하였다.
댐 시험의 준비
호주 퀸스랜드의 습윤/건조 회귀선에서의 클레어 (Clare; Lat. 19:48, Long. 147:14) 부근의 사탕수수 농장에 있는 약 1.5 ML 저장 댐을 아트라진의 추천되는 양 (헥터 당 3.3 kg)으로 선처리된 실지의 관개수의 상류수로 채웠다. 박테리아 균질현탁액 240 g을 물 20 리터 중에 현탁시키고, 저장 댐의 표면을 통해 균등하게 확산시키면서 손으로 적용하였다. 댐이 아트라진-오염된 유거수로 채워지기 전, 효소가 첨가되기 전, 및 효소 첨가 후 일정한 간격의 시간에서 1 리터의 샘플 두 개씩을 취하였다. 샘플은 효소 반응을 멈추게 하기 위해 얼음 상에서 즉시 저장하였다. 샘플은 얼음 상에서 4시간 이내에 얼었다.
아트라진 농도의 결정
두 다른 실험실 (Queensland Health Forensic and Scientific Services (QHFSS))에서, 직접 주입을 사용하여 변형된 문헌 [Lewis et al., 2009]에 기재된 LCMSMS 방법; 및 하기 LCMS 방법에 의한 CSIRO 곤충학에 의해 아트라진의 농도를 결정하였다. 간단히, 100 mL 샘플을 HCl로 pH 2.8까지 산성화시킨 후, 샘플 중의 아트라젠을 선-조절된 오아시스 SPE 맥스 카트리지 (Oasis SPE Max Cartridges) (Waters, USA)를 이용하여 고체상 추출법으로 1000배 농축시키고, 3 mL의 메탄올 (암모니아와 함께) 중에 용출시켰다. 샘플을 후속적으로 건조시키고, 100 μl의 메탄올 중에 용해시켰다. 샘플을 HPLC에 의해 분리시키고, 265 nm에서 흡광도, 및 애널리스트 (Analyst) 소프트웨어를 이용하여 계산된 애널라이트 (analyte) 피크를 측정함으로써 아트라진의 농도에 대해 분석하였다. 샘플의 반복 검증은 10% 내의 일치를 나타냈다. HPLC peak의 동일성은 질량 스팩트럼 분석에 의해 확인하였고, 아트라진 이온 216 m/z를 아길런트 (Agilent) ToF-MSD 상에서 추출하였다.
결과
호주 퀸스랜드의 습윤/건조 회귀선에서의 클레어 (Clare; Lat. 19:48, Long. 147:14)) 부근의 사탕수수 농장에 있는 약 1.5 ML 저장 댐을 아트라진의 추천되는 양 (헥터 당 3.3 kg)으로 선처리된 실지의 관개수의 상류수로 채웠다. TrzNcc 3.2를 생성하는 박테리아 균질현탁액 240 g을 물 20 리터 중에 현탁시키고, 저장 댐의 표면을 통해 균등하게 확산시키면서 손으로 적용하였다. 댐이 아트라진-오염된 유거수로 채워지기 전, 효소가 첨가되기 전, 및 효소 첨가 후 일정한 간격의 시간에서 1 리터의 샘플 두 개씩을 취하였다. 샘플은 효소 반응을 멈추게 하기 위해 얼음 상에서 즉시 저장하였다. 샘플은 얼음 상에서 4시간 이내에 얼었다.
저장 댐 중의 물은 관개 방수된 물을 수집하기 전에 8 내지 12 μg 아트라진을 함유하였다 (제시되지 않은 데이타). 관개 방수된 물로 채운 후에 아트라진 농도는 157-170 μg/L로 증가하였다 (도 10). 효소의 첨가 후 아트라진의 소모 속도에 정체가 있었으며, 효소가 저장 댐 중의 물과 섞이는 속도가 가장 큰 원인일 것 같다. 이러한 방식으로 적용된 효소에 대한 "혼합 단계 (mixing phase)" 기간은 복원될 수역의 부피 및 표면적:부피 비에 따라 거의 확실하게 달라질 것이고; 즉, 보다 큰 수역 및 낮은 표면적:부피비를 갖는 수역은 보다 긴 혼합 단계가 요구될 것이다.
혼합단계 동안 정체가 있었음에도 불구하고, 효소의 첨가는 첨가 후 최초 4시간 내에 아트라진 농도의 90% 이상 소모를 야기했다. 이 결과는 트리아진에 대한 TrzN-기반 생물학적 복원이 기술적으로 실현가능함을 보여준다.
다양한 변이체 및/또는 변형물이 광범위하게 기재된 바와 같은 본 발명의 목적 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 구체적 실시양태에서 제시된 바와 같이 본 발명에 대해 제조될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 본 실시양태는 예시적이고 제한적이지 않은 바와 같은 모든 측면으로 고려되어야 한다.
본 출원은 US 61/094,044로부터 우선권을 주장하며, 이 거명으로서 전문이 본원에 포함된다.
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ggcggtatca ccaccgtcgc cgatcagcat ctgttttttc caggtgcaac cgcagatagc 420 tatattgatg caaccatcga agccgcgacc gacctgggta ttcgctttca tgccgcgcgc 480 agcagcatga ctctgggtaa gagcgaaggt ggcttctgtg atgacctgtt tgtggaacca 540 gtggatcgtg tggttcagca ttgcctgggc ctgattgatc agtaccacga gccggaacca 600 tttggcatgg tccgcattgc actgggtccg tgcggcgttc cgtatgataa accagaactg 660 tttgaggcgt ttgcccagat ggccgccgac tacgacgtgc gcctgcatac gcatttttat 720 gaaccgctgg acgcgggtat gagcgatcat ctgtatggca tgacgccgtg gcgtttctta 780 gagaagcatg gctgggccag cgaccgcgtt tggctggcac atgccgttgt gccgccgcgt 840 gaagagattc cagaatttgc ggatgccggc gttgcaattg cccacctgat tgcgccggat 900 ctgcgtctgg gctggggtct ggcaccgatt cgtgaatatc tggatgcggg catcaccgtg 960 ggtttcggaa ccaccggtag cgccagcaac gacggtggca acctgttagg tgatctgcgc 1020 ctggcagccc tggcgcatcg cccggcggac ccgaatgaac cagagaagtg gctgagcgcc 1080 cgtgaactgc tgcgcatggc tacgcgcggt agcgcagagt gtctgggccg cccggatctg 1140 ggtgtgctgg aagagggtcg tgccgcagac atcgcgtgct ggcgcctgga tggcgtggac 1200 cgcgtgggtg 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tggttcagca ttgcctgggc ctgattgatc agtaccacga gccggaacca 600 tttggcatgg tccgcattgc actgggtccg tgcggcgttc cgtatgataa accagaactg 660 tttgaggcgt ttgcccagat ggccgccgac tacgacgtgc gcctgcatac gcatttttat 720 gaaccgctgg acgcgggtat gagcgatcat ctgtatggca tgacgccgtg gcgtttctta 780 gagaagcatg gctgggccag cgaccgcgtt tggctggcac atgccgttgt gccgccgcgt 840 gaagagattc cagaatttgc ggatgccggc gttgcaattg cccacctgat tgcgccggat 900 ctgcgtctgg gctggggtct ggcaccgatt cgtgaatatc tggatgcggg catcaccgtg 960 ggtttcggaa ccaccggtag cgccagcaac gacggtggca acctgttagg tgatctgcgc 1020 ctggcagccc tggcgcatcg cccggcggac ccgaatgaac cagagaagtg gctgagcgcc 1080 cgtgaactgc tgcgcatggc tacgcgcggt agcgcagagt gtctgggccg cccggatctg 1140 ggtgtgctgg aagagggtcg tgccgcagac atcgcgtgct ggcgcctgga tggcgtggac 1200 cgcgtgggtg tgcacgatcc ggctatcggc ctgatcatga ccggtctgag cgaccgcgca 1260 agcctggttg tcgtcaacgg ccaggttctg gtcgaaaatg aacgtccggt tctggcggat 1320 ctggaacgca tcgtggctaa taccacggcc ctgattccga aaaatctgta a 1371 <210> 4 <211> 1371 <212> DNA <213> Arthrobacter aurescens <220> <221> misc_feature <222> (792) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1241) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1312) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1321) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 atgatcctga tccgcggact gacacgtgtc atcactttcg acgatcaaga acgcgagttg 60 gaagacgccg acattctgat cgacgggccg aagatcgtcg ccgtcggaaa ggacctgtcg 120 gatcgcagcg tttcacggac aatcgacggg cgtggaatga ttgcgctgcc aggtctcatc 180 aactcgcacc agcacctgta cgaaggcgca atgcgggcga ttccccaact cgagcgggtc 240 acgatggcca gttggctcga aggcgtcctg accagaagcg caggatggtg gcgcgacggg 300 aagttcggtc cagatgtcat ccgggaggtt gcgcgcgccg tcctcctcga gtcgctcctc 360 ggtggcatca ccacggtcgc cgaccagcac ctattcttcc ccggtgccac ggccgatagc 420 tatatcgacg caaccatcga ggccgccacc gacctcggga tccggttcca tgcggcaagg 480 tcatcgatga cgctcggcaa gagcgaaggt ggcttctgcg acgacctgtt cgtcgagccc 540 gtcgacagag tcgtccagca ctgtctgggt ctcatcgacc agtaccacga gccggaaccg 600 tttggaatgg ttcgaatcgc tcttggaccc tgcggcgtcc cctacgacaa gcccgaactc 660 ttcgaagcgt tcgcacagat ggcggcggac tacgacgtgc gcctccacac ccacttctac 720 gaaccgctcg acgcgggaat gagcgaccac ctctacggta tgacgccgtg gcgtttcctt 780 gagaagcacg gntgggccag cgaccgagta tggctggctc acgctgtggt acctccacgg 840 gaggagatcc ccgagttcgc cgacgcaggc gtcgcgatcg cgcatctcat tgcgccggac 900 cttcggttgg gctggggact cgcgcctatc cgggaatacc tcgacgccgg aatcacggtt 960 gggtttggaa cgaccgggtc cgccagcaac gatggcggga acctgcttgg cgatctgcgc 1020 ctggctgcgc tggcgcaccg ccccgctgac cccaacgagc ccgaaaagtg gctgtcggca 1080 cgcgagctgc tccgaatggc aaccagggga tcagcggagt gcctcggcag gcccgacctg 1140 ggcgtcctcg aggagggtcg tgctgcggac atcgcctgtt ggcgcctcga tggagtcgac 1200 cgggttggtg tgcacgaccc ggcgatcggc ctgatcatga ntggtctttc agaccgggca 1260 agcctggtgg tcgtgaatgg tcaggtgctc gtcgagaacg aacgacccgt tntggcagat 1320 ntcgaacgca tcgtcgcgaa tacgacagca ctcattccca agaacttgta g 1371 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 ccacaacata tgattctgat ccgtggtctg acccgcgtta tc 42 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 cttcgaattc ttacagattt ttcggaatca gggccgtggt attag 45 <210> 7 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (64)..(65) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66) <223> s = c or g <400> 7 cgcacgatcg atggtcgcgg catgattgcc ctgccgggtc tgatcaatag ccaccagcat 60 ctgnnsgagg gc 72 <210> 8 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 cagatgctgg tggctattga tcagacccgg cagggcaatc atgccgcgac catcgatcgt 60 gc 62 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> s = c or g <400> 9 gcgagctggt tagagggcgt cctgnnscgt agcgcgggtt ggtggcgt 48 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 acgccaccaa cccgcgctac g 21 <210> 11 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (53) <223> s = c or g <400> 11 tcctgctgga aagcctgctg ggcggtatca ccaccgtcgc cgatcagcat nnsttttttc 60 caggtgcaac cgc 73 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 atgctgatcg gcgacggtgg tgataccgcc cagcaggctt tccagcagga 50 <210> 13 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57) <223> s = c or g <400> 13 tatattgatg caaccatcga agccgcgacc gacctgggta ttcgctttca tgccnnscgc 60 agcagcatg 69 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 14 ggcatgaaag cgaataccca ggtcggtcgc ggcttcgatg gttgcatcaa tata 54 <210> 15 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (49) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50) <223> s = c or g <400> 15 accatcgaag ccgcgaccga cctgggtatt cgctttcatg ccgcgcgcnn sagcatgact 60 ctgggtaag 69 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 16 gcgcgcggca tgaaagcgaa tacccaggtc ggtcgcggct tcgatggt 48 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> s = c or g <400> 17 gaaccatttg gcatggtccg cattgcactg ggtnnstgcg gcgttccgta t 51 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 acccagtgca atgcggacca tgccaaatgg ttc 33 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> s = c or g <400> 19 gtgcgcctgc atacgcattt ttatgaaccg nnsgacgcg 39 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 20 cggttcataa aaatgcgtat gcaggcgcac 30 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> s = c or g <400> 21 ctgcatacgc atttttatga accgctggac gcgnnsatga gc 42 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 22 cgcgtccagc ggttcataaa aatgcgtatg cag 33 <210> 23 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> s = c or g <400> 23 attccagaat ttgcggatgc cggcgttgca attnnscacc tgattgcgcc ggatctgcgt 60 c 61 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 24 aattgcaacg ccggcatccg caaattctgg aat 33 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33) <223> s = c or g <400> 25 accggtagcg ccagcaacga cggtggcaac nnsttaggtg atctg 45 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 26 gttgccaccg tcgttgctgg cgctaccggt 30 <210> 27 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> s = c or g <400> 27 ttaggtgatc tgcgcctggc agccctggcg catcgcccgg cgnnsccgaa tgaa 54 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 28 cgccgggcga tgcgccaggg ctgccaggcg cagatcacct aa 42 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> s = g or c <400> 29 gctgtgggta aannsttaag cgatcgtag 29 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> s = g or c <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 ctacgatcgc ttaasnnttt acccacagc 29

Claims (41)

  1. 폴리펩티드가 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 40% 이상 동일하고,
    i) 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 생성되고/되거나,
    ii) 상기 폴리펩티드가 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 것인,
    s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 하나의 치환을 갖는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드: T5C, C39A, C76A, C84A, T87C, C101A, T108A, T108A, G112A, A127G, C135T, A157T, C165T, G168A, C180T, C189T, A200T, C207T, G210A, G225T, A228G, C229T, T240C, A250C, C268A, G270A, A271T, T273A, C279T, A296G, A302G, A303G, A314G, C315A, T317C, T320C, A326C, A333G, T336C, C346T, G357A, A367G, C372T, C375A, C381T, T384C, C391A, C391G, C391T, T392C, T392A, T392G, G393C, T399C, C410T, C411A, C411T, A414G, A418C, T423C, T426A, A432T, C438T, C449G, C454T, T466C, T468C, T471C, C474T, G475A, C476T, A481G, C483T, G489A, G489T, T498C, T531A, A537G, A540G, A545G, T546G, G548A, T555C, T555C, C564T, G567A, G567A, G568A, G569A, G573C, T579C, A584T, G589A, A600G, T618C, T618C, T627C, C628G, G630A, C633T, G637A, T639C, T639C, A654G, G660A, G660T, T663C, C675A, G681T, C686T, C690A, C696T, G705A, A723G, C727G, T728C, T728G, G729C, G736A, G737C, G737A, G737T, T738G, T738C, T738C, G745A, G753C, G768A, T774A, C807A, T840A, A843G, A852T, A855G, C867T, T879C, G880A, G880T, G880C, C881T, G882T, C885T, G897A, T900C, T906A, A928G, A938T, T941C, C957A, T959A, C972T, T978A, C981T, C993T, C999T, C1003A, C1003T, T1011C, G1048A, G1048T, G1048C, A1049T, A1049G, G1053A, A1059G, A1086G, G1094A, T1101C, T1101G, C1128T, A1152G, G1176T, C1186A, C1186T, T1196C, C1203T, G1221A, C1223T, C1236T, G1248T, G1270A, C1278T, T1286A, T1305C, G1309A, C1321T, A1326G, C1329T, C1329T, C1332T, C1344A, C1351A 및 G1353T.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 아미노산 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치에서 하나의 치환을 갖는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드: I2T, F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, I107T, E109A, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 및 L451M.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 번호 468에 상응하는 위치에서 시토신을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 67에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
    ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 91에 상응하는 위치에서 세린, 및/또는
    iii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신, 및/또는
    iv) 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는
    v) 서열 번호 1의 아미노산 번호 161에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는
    vi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 210에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는
    vii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 243에 상응하는 위치에서 프롤린 또는 글리신, 및/또는
    viii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 246에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 리신, 발린 또는 알라닌, 및/또는
    ix) 서열 번호 1의 아미노산 번호 294에 상응하는 위치에서 트레오닌, 세린 또는 류신, 및/또는
    x) 서열 번호 1의 아미노산 번호 335에 상응하는 위치에서 메티오닌, 및/또는
    xi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 350에 상응하는 위치에서 티로신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘, 및/또는
    xii) i) 내지 xi) 중 어느 하나의 생물학적 활성 단편
    을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 아미노산 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드:
    i) Y313F
    ii) Y67F
    iii) A159V
    iv) A159V, L243P
    v) D350Y
    vi) G190D, M227I
    vii) A159T
    viii) A408V
    ix) L26M, S161G
    x) F13L, A34D, G246A, D350Y
    xi) T137I, S140R
    xii) L335M
    xiii) P210A
    xiv) A294T
    xv) I123V
    xvi) Y67F, V437I
    xvii) M163I, D249N
    xviii) T137I
    xix) G246S
    xx) L90M
    xxi) A159V, L243P, L451M
    xxii) T150S, A159V, A229V, D230E, L243P
    xxiii) Y67F, L335M
    xxiv) Y67F, K101R, A294T
    xxv) L335M
    xxvi) V106A, S161G, F177L, L335M
    xxvii) S43G, I107T, A159V, D350Y
    xxviii) M53L, T137I, S140R, D182G, G190S, D350Y
    xxix) A159V, L335M, D350Y
    xxx) D28E, A294T, D350N
    xxxi) P210A, V424I
    xxxii) A159V, G190D
    xxxiii) P210A, A294T, R365H, D350Y
    xxxiv) I123V, S161G, A294T
    xxxv) Y67F, A159V, D350Y
    xxxvi) T91S, A159V, A294T
    xxxvii) Y67F, A159V, L243P
    xxxviii) A159V, P210A
    xxxix) A159V, I310V, L335M, L396M, L243P
    xl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335M
    xli) A159V, L335M
    xlii) S84R, D105G, A159V
    xliii) Y67F, A294T
    xliv) A159V, D182E, L335M, D350Y
    xlv) Y67F, A159V, L243P
    xlvi) D38N, A159V
    xlvii) A159V, M163I, Y195F, D350Y
    xlviii) F156L, P210A, D350Y
    xlix) Y67F, D350Y
    l) A159V, D350Y
    li) Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M
    lii) E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D
    Iiii) A159V, L335M
    liv) Y67F, A159V, L335M, D350Y
    lv) D38N, L131P, A159V
    lvi) T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y
    lvii) R183H, P210A, D350Y
    lviii) Y67F, A159V, D350Y
    lix) A159V, P210A, A294T, D350N
    lx) Y67F, A159V, D350N
    lxi) A159V, L335M, D350Y
    lxii) P210A, A294T, D350Y
    lxiii) T91S, A159V, A294T
    lxiv) P210A, A294T, L335M, 또는
    lxv) Y67F, L335M.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 뉴클레오티드 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 뉴클레오티드 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 같이 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    i) T468C,
    ii) T468C, A938T,
    iii) A200T, G210A, T468C,
    iv) T468C, C476T, G753C,
    v) T468C, C476T, T728C,
    vi) T468C, 1048T,
    vii) T384C, T468C, G569A, G681T,
    viii) T468C, G475A,
    ix) C279T, T468C, C1223T, C1329T,
    x) C76A, T468C, A481G,
    xi) C39A, C101A, T468C, T639C, G737C, G1048T,
    xii) C410T, A418C, T468C, A600G,
    xiii) T468C, G705A, C1003A,
    xiv) T468C, G573C,
    xv) T468C, C474T, C628G, C1278T,
    xvi) T399C, T468C, G880A, T900C,
    xvii) T468C, C1236T,
    xviii) T87C, A367G, T468C,
    xix) T468C, G1176T,
    xx) C135T, T468C, C1344A,
    xxi) T468C, A852T,
    xxii) T468C, T738C,
    xxiii) C454T, T468C,
    xxiv) A200T, T468C, G1309A,
    xxv) T468C, G489T, G745A,
    xxvi) C410T, T468C,
    xxvii) T468C, G736A,
    xxviii) G225T, C268A, A414G, T468C, T627C, C1321T,
    xxix) A432T, T468C, T471C, C476T, T728C, G1053A, C1351A,
    xxx) A303G, C449G, T468C, C476T, C686T, C690A, T728C, C1128T,
    xxxi) A200T, G210A, C372T, T468C, A654G, C1003A,
    xxxii) C180T, A200T, A302G, C375A, T399C, C411T, T468C, A540G,
    G880A, T900C,
    xxxiii) C229T, T468C, G705A, C1003A,
    xxxiv) T317C, T468C, A481G, T531A, G753C, T906A, T978A, C1003A, A1326G,
    xxxv) A127G, T320C, T468C, C476T, G753C, G1048T,
    xxxvi) A157T, C410T, A418C, T468C, A545G, G568A, A600G, C628G, G630A, G1048T, C1332T,
    xxxvii) T468C, C476T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,
    xxxviii) C84A, T399C, T468C, C483T, G880A, T900C, G1048A,
    xxxix) T468C, T498C, C628G, C885T, A1086G, G1270A,
    xl) T384C, T468C, C476T, G569A, G753C, A1152G,
    xli) T336C, T468C, C476T, A537G, C564T,
    xlii) A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, G1048T, G1094A,
    xliii) T273A, A367G, C381T, T399C, T468C, A481G, G880A, T900C,
    xliv) A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, G1048T, A1059G,
    xlv) A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1236T,
    xlvi) A200T, G210A, C346T, T468C, C476T, T579C, T728C, C1278T,
    xlvii) C438T, T468C, C476T, A855G,
    xlviii) G168A, T426A, T468C, C476T, C628G, C1203T, T1305C,
    xlix) T468C, C476T, T663C, C1236T,
    l) T384C, T468C, C476T, T728C, A928G, C1003A, C1186A,
    li) T5C, C315A, T468C, C476T, G589A, G681T, T728C, G897A, C1003A,
    lii) C279T, T468C, C476T, C1003A,
    liii) A250C, A314G, T468C, C476T,
    liv) A200T, G210A, T468C, T555C, G880A, T900C,
    lv) T468C, C476T, T546G, C696T, C1003A, G1048T,
    lvi) A200T, G210A, T468C, C476T, T728C, T1101G,
    lvii) G112A, C165T, T468C, C476T, T618C, G753C, C999T, T1101C,
    lviii) T423C, T468C, C476T, G489A, A584T, G753C, G1048T,
    lix) T466C, T468C, C474T, C628G, G1048T,
    lx) T108A, A200T, G210A, G357A, T468C, G1048T, A1059G, C1278T,
    lxi) T468C, C476T, G567A, G753C, G1048T,
    lxii) A200T, G210A, A296G, T468C, C476T, G637A, T728C, C1003A,
    lxiii) C189T, A326C, T468C, C476T, T941C, T959A, A1059G, C1186T, T1196C, G1248T, T1286A,
    lxiv) T468C, C476T, C1003A,
    lxv) A200T, G210A, C279T, T468C, C476T, T879C, C1003A, G1048T,
    lxvi) G112A, C165T, T392C, T468C, C476T, T618C, G660A, C675A, G753C, C807A, C993T, C999T, T1101C, T1305C,
    lxvii) A271T, T392C, T468C, C476T, G753C, G880A, G1048T, G1094A, C1186A, G1221A,
    lxviii) A228G, T240C, T468C, G548A, C628G, G1048T, C1332T,
    lxix) T108A, A200T, G210A, T423C, T468C, C476T, G567A, G1048T,
    lxx) T384C, T468C, C476T, C628G, C867T, G880A, T900C, C981T, G1048A, A1326G,
    lxxi) A200T, C207T, G210A, T468C, C476T, T840A, T900C, G1048A,
    lxxii) T468C, C476T, C633T, G660T, A723G, C1003A, G1048T, C1329T,
    lxxiii) A228G, T240C, G270A, T468C, C628G, 880A, G1048T,
    lxxiv) A271T, A333G, T399C, T468C, C476T, A843G, G880A, T900C, C1003T, C1236T,
    lxxv) A228G, T240C, T468C, C628G, G880A, C957A, C1003A, 또는
    lxxvi) A200T, G210A, C411A, T468C, T555C, T639C, A654G, G768A, T774A, C972T, C1003A, T1011C, G1353T.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, s-트리아진이 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 또는 시아노진인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포가 이. 콜라이 (E. coli)인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4와 90% 이상 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제14항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 샤페론을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 숙주 세포.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포인 숙주 세포.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 형질전환 식물.
  19. 제15항 또는 제16항의 하나 이상의 세포를 포함하는 형질전환 인간 이외의 동물.
  20. 폴리펩티드가 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 40% 이상 동일하고, 여기서
    i) 박테리아 세포에서 발현시킬 때, 서열 번호 1과 같이 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 동질유전자 박테리아 세포에 의해서보다 더 많은 폴리펩티드가 생성되고/되거나,
    ii) 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 것인,
    s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해하는, 실질적으로 정제된 또는 정제되지 않은 재조합 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린을 포함하는 폴리펩티드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 하기 아미노산 치환들 중 하나 이상, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치에서 하나의 치환을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: I2T, F13L, L26M, D28E, A34D, D38N, S43G, M53L, Y67F, S84R, L90M, T91S, D99G, K101R, D105E, D105G, V106A, I107T, E109A, I123V, L131P, L131N, L131T, L131D, L131V, L131G, L131C, L131S, L131Q, L131H, L131Y, L131I, T137I, S140R, T150S, F156L, A159T, A159V, S161G, M163I, F177L, D182E, D182G, R183H, G190D, G190S, Y195F, E197K, P210A, V213I, M227I, M227I, A229V, D230E, L243P, L243G, G246A, G246S, G246D, G246E, G246K, G246V, D249N, A294T, A294S, A294L, I310V, Y313F, L314P, V320E, L335M, D350N, D350Y, D350F, D350R, D350H, R365H, L396M, V399A, A408V, V424I, V429D, V437I 및 L451M.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열 번호 1의 아미노산 번호 67에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
    ii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 91에 상응하는 위치에서 세린, 및/또는
    iii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 131에 상응하는 위치에서 프롤린, 아스파라긴, 트레오닌, 아스파르트산, 발린, 글리신, 시스테인, 세린, 글루타민, 히스티딘, 티로신 또는 이소류신, 및/또는
    iv) 서열 번호 1의 아미노산 번호 159에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는
    v) 서열 번호 1의 아미노산 번호 161에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는
    vi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 210에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는
    vii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 243에 상응하는 위치에서 프롤린 또는 글리신, 및/또는
    viii) 서열 번호 1의 아미노산 번호 246에 상응하는 위치에서 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 리신, 발린 또는 알라닌, 및/또는
    ix) 서열 번호 1의 아미노산 번호 294에 상응하는 위치에서 트레오닌, 세린 또는 류신, 및/또는
    x) 서열 번호 1의 아미노산 번호 335에 상응하는 위치에서 메티오닌, 및/또는
    xi) 서열 번호 1의 아미노산 번호 350에 상응하는 위치에서 티로신, 아스파라긴, 페닐알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘, 및/또는
    xii) i) 내지 xi) 중 어느 하나의 생물학적 활성 단편
    을 포함하는 폴리펩티드.
  24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 아미노산 치환들 중 하나 또는 치환들의 군, 또는 이에 상응하는 아미노산 위치(들)에서 하나의 치환(들)을 갖는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
    i) Y313F
    ii) Y67F
    iii) A159V
    iv) A159V, L243P
    v) D350Y
    vi) G190D, M227I
    vii) A159T
    viii) A408V
    ix) L26M, S161G
    x) F13L, A34D, G246A, D350Y
    xi) T137I, S140R
    xii) L335M
    xiii) P210A
    xiv) A294T
    xv) I123V
    xvi) Y67F, V437I
    xvii) M163I, D249N
    xviii) T137I
    xix) G246S
    xx) L90M
    xxi) A159V, L243P, L451M
    xxii) T150S, A159V, A229V, D230E, L243P
    xxiii) Y67F, L335M
    xxiv) Y67F, K101R, A294T
    xxv) L335M
    xxvi) V106A, S161G, F177L, L335M
    xxvii) S43G, I107T, A159V, D350Y
    xxviii) M53L, T137I, S140R, D182G, G190S, D350Y
    xxix) A159V, L335M, D350Y
    xxx) D28E, A294T, D350N
    xxxi) P210A, V424I
    xxxii) A159V, G190D
    xxxiii) P210A, A294T, R365H, D350Y
    xxxiv) I123V, S161G, A294T
    xxxv) Y67F, A159V, D350Y
    xxxvi) T91S, A159V, A294T
    xxxvii) Y67F, A159V, L243P
    xxxviii) A159V, P210A
    xxxix) A159V, I310V, L335M, L396M, L243P
    xl) I2T, D105E, A159V, E197K, M227I, L243P, L335M
    xli) A159V, L335M
    xlii) S84R, D105G, A159V
    xliii) Y67F, A294T
    xliv) A159V, D182E, L335M, D350Y
    xlv) Y67F, A159V, L243P
    xlvi) D38N, A159V
    xlvii) A159V, M163I, Y195F, D350Y
    xlviii) F156L, P210A, D350Y
    xlix) Y67F, D350Y
    l) A159V, D350Y
    li) Y67F, D99G, A159V, V213I, L243P, L335M
    lii) E109A, A159V, L314P, V320E, V399A, V429D
    Iiii) A159V, L335M
    liv) Y67F, A159V, L335M, D350Y
    lv) D38N, L131P, A159V
    lvi) T91S, L131P, A159V, A294T, R365H, L396M, D350Y
    lvii) R183H, P210A, D350Y
    lviii) Y67F, A159V, D350Y
    lix) A159V, P210A, A294T, D350N
    lx) Y67F, A159V, D350N
    lxi) A159V, L335M, D350Y
    lxii) P210A, A294T, D350Y
    lxiii) T91S, A159V, A294T
    lxiv) P210A, A294T, L335M, 또는
    lxv) Y67F, L335M.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, s-트리아진이 아트라진, 아메트린, 프로파진, 프로메트린, 시마진, 시메트린, 이파진, 트리에타진 또는 시아노진인 폴리펩티드.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 2배 이상 더 큰 아트라진 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질인 폴리펩티드.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체 상에 고정된 폴리펩티드.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제18항의 식물 및/또는 제19항의 동물의 추출물.
  30. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제14항의 벡터, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제29항의 추출물, 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  31. s-트리아진 또는 디아진을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제14항의 벡터, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제29항의 추출물 및/또는 제30항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, s-트리아진 또는 디아진을 가수분해하기 위한 방법.
  32. 제31항에 있어서, s-트리아진 또는 디아진이 토양, 물, 생물학적 물질 또는 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플 중에 있는 것인 방법.
  33. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제14항의 벡터, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제29항의 추출물 및/또는 제30항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 s-트리아진 또는 디아진에 의해 야기된 독성을 치료하는 방법.
  34. 대상체에서 s-트리아진 또는 디아진에 의해 야기된 독성을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제14항의 벡터, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제29항의 추출물 및/또는 제30항의 조성물의 용도.
  35. s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건 하에, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 제14항의 벡터를 배양하고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, s-트리아진 및/또는 디아진을 가수분해할 수 있는 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  36. i) 세포(들)에 의한 폴리뉴클레오티드의 흡수를 허용하는 조건 하에 세포 또는 세포군을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및
    ii) i) 단계로부터의 세포, 또는 그의 자손 세포를 s-트리아진 또는 디아진에 노출시킴으로써 숙주 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 숙주 세포를 검출하기 위한 방법.
  37. 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제14항의 벡터, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제29항의 추출물 및/또는 제30항의 조성물을 포함하는, s-트리아진 또는 디아진을 가수분해하기 위한 키트.
  40. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 결정.
  41. s-트리아진 또는 디아진의 후보 폴리펩티드와의 결합 능력을 산출적으로 평가하기 위해 제40항에 따른 결정의 원자 동등물을 사용하고, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 선택하는 것을 포함하는, 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드보다 보다 더 큰 s-트리아진 및/또는 디아진 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 고안하는 방법.
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