CN105132443A - 除草剂降解酶基因、工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种阿特拉津除草剂降解酶基因、含有上述降解酶基因的工程菌以及上述工程菌的应用。本发明的除草剂降解酶基因来源于一株高效降解阿特拉津的盐单胞菌Halomonas？sp.SY-AD-9，其表达产物三嗪水解酶能够高效的降解阿特拉津；本发明利用上述除草剂降解酶基因构建的工程菌能够高效的表达除草剂降解酶(三嗪水解酶)，能够应用于环境的生物修复。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种阿特拉津除草剂降解酶基因、含有上述降解酶基因的工程菌以及上述工程菌的应用。
背景技术
阿特拉津又名莠去津，其是一种三嗪类除草剂。阿特拉津除草剂的大量使用，导致对土壤、地下水和地表水的污染。阿特拉津对动物的生殖功能影响已被证明，且被世界野生动物基金会列为环境荷尔蒙(内分泌干扰剂)的可疑物质，有扰乱内分泌的作用，是人类潜在的致癌物。为了治理和修复阿特拉津污染的环境，很多研究人员分离和鉴定了大量能降解阿特拉津的细菌，可将这些菌主要分为两类。第一类是假单胞菌属Pseudomonas，例如：代表菌株为Pseudomonassp.ADP，其含有atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF六个降解基因；第二类是节杆菌属Arthrobacter，例如：代表菌株为Arthrobactersp.TC1，其含有trzN和atzB、atzC三个降解基因。上述两类细菌的降解途径中第一步反应都是将有毒的阿特拉津降解为无毒的羟基阿特拉津。现有技术研究发现由trzN基因编码的三嗪水解酶比atzA基因编码的阿特拉津氯水解酶具有更广泛的应用性且催化能力更高。
发明内容
本发明的目的在于针对阿特拉津除草剂的降解问题，提供一种阿特拉津除草剂降解酶基因。
本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：
一种除草剂降解酶基因，其为阿特拉津降解酶的编码基因，所述除草剂降解酶基因具有如SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组质粒，其为含有上述的除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒。
本发明另外提供了含有上述的除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
上述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
细菌总DNA提取步骤：将保藏号为CGMCCNO.4165的盐单胞菌SY-AD-9于LB培养基中进行培养，收集菌体提取总基因组DNA；
目的基因的PCR扩增步骤：以SEQIDNo：2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQIDNo：3所示的核苷酸序列为下游引物，以所得总基因组DNA为模板进行PCR扩增获得如SEQIDNo：1所示的除草剂降解酶基因片段；
构建重组质粒的步骤：将所得除草剂降解酶基因片段与pET-28b(+)质粒依次进行双酶切和连接反应获得含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒；
重组菌构建步骤：将所述的含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
优选地，在目的基因的PCR扩增步骤中的PCR反应参数为：95℃预变性10分钟；94℃变性1分钟，66℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环；72℃再延伸5分钟。
优选地，所述目的基因的PCR扩增步骤之后还包括除草剂降解酶基因片段纯化的步骤。
优选地，所述重组菌构建步骤之后还包括基因工程菌E.coliBL21(DE3)阳性克隆筛选的步骤。
本发明还提供了上述的除草剂降解酶基因以及上述的含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)在降解阿特拉津除草剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下，本发明的除草剂降解酶基因来源于一株高效降解阿特拉津的盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9，其表达产物三嗪水解酶能够高效的降解阿特拉津；本发明利用上述除草剂降解酶基因构建的工程菌能够高效的表达除草剂降解酶(三嗪水解酶)，能够应用于环境的生物修复。
附图说明
图1是本发明的工程菌的构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员可参考CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自测量中存在的标准偏差所致。另外，本发明公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应理解为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
术语“部分”和“片段”可互换的指代多肽、核酸或其他分子构建物的一部分。
生物材料保藏信息：盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9已于2010年09月13日保存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.4165，上述菌株16SrDNA基因序列的GenBank登录号为HM627247，上述菌株具有与trzN基因功能相似的能够将阿特拉津降解为无毒的羟基阿特拉津的除草剂降解酶基因。
为了修复被高浓度阿特拉津污染的土壤，本发明克隆了上述的盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9菌株的阿特拉津除草剂降解酶基因(类trzN基因)到容易培养且繁殖速度快的大肠杆菌中，并使目的基因表达，降解污染土壤中的高浓度阿特拉津，以修复被高浓度阿特拉津污染的土壤。
本发明的除草剂降解酶基因具有如SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。
本发明提供的重组质粒为含有上述除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒。
本发明的工程菌为含有上述除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
如图1所示，上述工程菌的构建方法包括如下步骤：
细菌总DNA提取步骤：将保藏号为CGMCCNO.4165的盐单胞菌SY-AD-9于LB培养基中进行培养，收集菌体提取总基因组DNA；
目的基因的PCR扩增步骤：以SEQIDNo：2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQIDNo：3所示的核苷酸序列为下游引物，以所得总基因组DNA为模板进行PCR扩增获得如SEQIDNo：1所示的除草剂降解酶基因片段；
构建重组质粒的步骤：将所得除草剂降解酶基因片段与pET-28b(+)质粒依次进行双酶切和连接反应获得含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒；
重组菌构建步骤：将所述的含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
具体地，本发明的除草剂降解酶基因来源于一株高效降解阿特拉津的盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9，其表达产物三嗪水解酶能够高效的降解阿特拉津；本发明利用上述除草剂降解酶基因构建的工程菌能够高效的表达除草剂降解酶(三嗪水解酶)，能够广泛地应用于环境的生物修复。
实施例1
trzN基因DNA片段的扩增与纯化
第一步，细菌总DNA提取：
用天根公司基因组提取试剂盒提取盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9菌株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。
第二步，trzN基因DNA片段扩增：
上游引物：5’-GGAATTCCATATGATCCTGATCCGCG-3’(序列表中SEQIDNO.2)，其中包含有限制性内切酶NdeI的酶切位点(CATATG)；下游引物：5’-CCCAAGCTTCTACAAGTTCTTGGGA-3’(序列表中SEQIDNO.3)，其中包含有限制性内切酶HindIII的酶切位点(AAGCTT)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9菌株的基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为：在95℃预变性10分钟，然后以94℃变性1分钟、66℃退火30秒、72℃延伸30秒循环30次，再在72℃延伸5分钟。体系体积为25μl，配制如表1：
表1
| 总体系 | 25μl | 总浓度 |
| 10×buffer | 2.5μl | 1×buffer |
| dNTP | 2μl | 2mmol/L |
| 模板 | 0.5μl | 10ng/μl |
| 上游引物 | 1μl | 1μM/L |
| 下游引物 | 1μl | 1μM/L |
| Taq DNA聚合酶 | 0.5μl | 0.04u/μL |
| 超纯水 | 补足至体系体积25μl |
PCR反应完成后，取3μl反应产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
第三步，PCR扩增产物的纯化：
PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带切下，使用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化PCR片段，其操作步骤如下：
柱平衡：向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中；
将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；
向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，当回收片段小于150bp或者琼脂糖浓度大于2％时，需要使用6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如还有未溶的胶块，可补加一些溶胶液或者继续放置几分钟，直至胶块完全溶解；
将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2分钟，12000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复此步骤一次；
将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
将吸附柱CA2放到干净离心管中面向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温防止2分钟，12000离心2分钟收集DNA溶液，得到纯化的PCR产物。
实施例2
原核表达载体pET-28b(+)-trzN的构建与鉴定
将纯化的PCR产物和pET-28b(+)载体分别使用NdeI和HindIII(所有限制性内切酶均购自NEB公司)进行双酶切，并用TIANGEN公司的琼脂糖DNA试剂盒回收纯化酶切产物，再将酶切后的PCR产物和酶切后的pET-28b(+)载体进行粘性末端连接，然后利用trzN基因DNA片段克隆引物通过菌落PCR筛选的方法鉴定阳性克隆，具体步骤如下：
第一步，trzN基因DNA片段和pET-28b(+)载体的双酶切：
分别对trzN基因DNA片段的PCR产物和pET-28b(+)载体用引物两端的限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切，反应体系如表2：
表2
| 总体系 | 50μl | 总浓度 |
| 10×NEB Buffer | 5μl | 10×NEB Buffer |
| 纯化的PCR产物/pET-28b(+)载体 | 10μl | 0.02μg/L |
| 限制性内切酶Nde I | 1μl | 20U/μl |
| 限制性内切酶Hind III | 0.5μl | 20U/μl |
| 超纯水 | 33.5μl |
配制好充分混匀后放入37℃培养箱中培养12小时，随后在80℃水浴中热失活20分钟。
第二步，trzN基因DNA片段和pET-28b(+)载体的连接及转化：
用上一步所得到的酶切过的trzN基因DNA片段与酶切过的pET-28b(+)载体进行连接，反应体系如表3：
表3
| 总体系 | 20μl | 总浓度 |
| 10×T4DNA连接缓冲液 | 2μl | 1×T4DNA连接缓冲液 |
| trzN基因 | 6μl | 45ng/μl |
| pET-28b(+)载体 | 2.5μl | 45ng/μl |
| T4DNA连接酶 | 1μl | 400U/μl |
| 超纯水 | 8.5μl |
配制好充分混匀后放于16℃连接12～16小时，得到所述原核表达载体pET-28b(+)-trzN的重组质粒。
实施例3
含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)的构建
将实施例2所得的含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒转化到宿主菌E.coliDH5α获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliDH5α。
转化步骤如下：①取100μl感受态细胞(购买自TransGenBiotech)冰浴中融解；②迅速将连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20分钟；③42℃，热激30秒，冰浴冷却2分钟；④加SOC培养基800μl，放于37℃恒温箱中培养1小时；⑤取适量涂于LB培养板(30μg/ml卡那霉素)上，倒置于37℃恒温箱中过夜培养。然后挑选菌落进行PCR筛选。
菌落PCR筛选阳性克隆
用灭菌的牙签沾取适量的白色菌落放入配好的PCR混合液中，PCR混合液的配置如表4：
表4
| 总体系(每管量) | 10μl |
| 10×Buffer | 1μl |
| dNTP | 0.2μl |
| 模板 | 菌落 |
| trzN上游引物 | 0.1μl |
| trzN下游引物 | 0.1μl |
| Taq DNA聚合酶 | 0.1μl |
| MiLiQ-H2O | 补足10μl |
洗脱菌体后放入PCR中进行反应。条件如下：在95℃预变性10分钟，然后以94℃变性1分钟、66℃退火30秒、72℃延伸30秒循环30次，再在72℃延伸5分钟(延伸时间依插入片段大小而定)。扩增完毕后，每管取3μlPCR产物进行电泳检测。
第三步，重组质粒的提取、酶切检测及测序：
对挑取的阳性克隆菌落进行质粒的提取，并选取合适的内切酶进行酶切检测，以确保载体的插入片段为目的基因。质粒提取试剂盒购买自TIANGEN公司的普通质粒小提取试剂盒，质粒提取的方法如下：
1)将菌落筛选的阳性克隆挑去后用3mlLB+30μg/ml卡那霉素培养基37℃摇床过夜培养。
2)将约3ml菌液收集，常温下离心6000rpm/2min，去上清。
3)用120ulSolutionⅠ悬浮细胞。
4)快速加200ulSolutionⅡ裂解细胞，使细胞内各种物质变性。
5)菌液变清亮后加入150ulSolutionⅢ冰上放置1-5min使质粒复性。
6)12000rpm/15min离心，将上清(约400ul)转移至新的1.5mlEP管中
7)加两倍体积(约800ul)100％乙醇沉淀DNA，室温放置30min。
8)12000rpm，15min离心弃上清。
9)然后用70％的乙醇冲洗沉淀3遍。
10)然后用70％的乙醇和10％的醋酸钠纯化质粒，室温放置1h。
11)12000rpm，15min离心弃上清
12)70％的乙醇冲洗沉淀一遍。12000rpm，15min离心弃上清。
13)用去离子水溶解。-20℃保存。
质粒提取完成后，根据引物上的酶切位点选择特定的限制性内切酶进行酶切，酶切体系如表5所示。选用克隆用两种酶进行酶切检验。
表5
| 总体积 | 5μl |
| 10×Buffer M | 0.5μl |
| Nde I | 0.13μl |
| Hind III | 0.13μl |
| 重组质粒 | 1μl |
| H2O | 3.24μl |
酶切反应条件：37℃水浴1h，电泳检测后将初步确定为阳性克隆的质粒进行测序。
测定插入的目的基因(本发明的除草剂降解酶基因)序列，将基因序列等入道美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进行核苷酸序列Blast比对。测序结果表明，插入的目的基因与Pseudomonassp.AD39的trzN基因(GenBank注册号：FJ161692)相比，有4个碱基不同，在基因序列的第200、640、643和886碱基处，AD39的trzN基因在上述位点碱基分别是T、C、T、C，而插入的目的基因序列在上述位点碱基则分别是A、A、C、A。
从含有重组质粒的E.coliDH5α菌株中提取重组质粒，并转化到具有表达重组蛋白能力的E.coliBL21(DE3)菌株中表达目的蛋白。
实施例4
IPTG诱导表达阿特拉津除草剂降解酶蛋白
在LB液体培养基中加入30μg/ml的卡那霉素，转接克隆菌以后在37度中培养，在OD600大概到0.6-0.8的时候加入终浓度为1mM的IPTG(诱导剂)，使其目的基因(本发明的除草剂降解酶基因)诱导表达，加入诱导剂以后再培养6个小时，取样，离心后将克隆菌的粗蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳，确认到插入的目的基因(本发明的除草剂降解酶基因)正常表达。
实施例5
含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)在土壤修复中的
应用
将实施例3中构建的工程菌在被高浓度阿特拉津污染的土壤中应用。具体应用方法为将诱导好的工程菌菌液均匀喷洒在含有100ppm阿特拉津的土壤中，室温条件下降解两周后取样，样品用二氯甲烷萃取，用气象色谱法测定其含量，计算降解率。阿特拉津的的半衰期根据土壤类型、温度、湿度和pH值的不同，其差异明显：厌氧环境中为160～330天，中性土壤中竟高达398～742天。然而，构建的基因工程菌经过两周时间可以将土壤中的阿特拉津降解45％～55％左右。这表明构建的工程菌具有对含有高浓度阿特拉津污染土壤具有较高的降解能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种除草剂降解酶基因，其为阿特拉津降解酶的编码基因，其特征在于，所述除草剂降解酶基因具有如SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有权利要求1所述的除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒。
3.含有权利要求1所述的除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
4.如权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
细菌总DNA提取步骤：将保藏号为CGMCCNO.4165的盐单胞菌SY-AD-9于LB培养基中进行培养，收集菌体提取总基因组DNA；
目的基因的PCR扩增步骤：以SEQIDNo：2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQIDNo：3所示的核苷酸序列为下游引物，以所得总基因组DNA为模板进行PCR扩增获得如SEQIDNo：1所示的除草剂降解酶基因片段；
构建重组质粒的步骤：将所得除草剂降解酶基因片段与pET-28b(+)质粒依次进行双酶切和连接反应获得含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒；
重组菌构建步骤：将所述的含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在目的基因的PCR扩增步骤中的PCR反应参数为：95℃预变性10分钟；94℃变性1分钟，66℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环；72℃再延伸5分钟。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述目的基因的PCR扩增步骤之后还包括除草剂降解酶基因片段纯化的步骤。
7.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组菌构建步骤之后还包括基因工程菌E.coliBL21(DE3)阳性克隆筛选的步骤。
8.权利要求1所述的除草剂降解酶基因在降解阿特拉津除草剂中的应用。
9.权利要求3所述的含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21(DE3)在降解阿特拉津除草剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151209 |