CN102858983B - 最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供降低烟草植物和其植物部分中去甲烟碱和N’-亚硝基降烟碱（NNN）水平的组合物和方法。所述组合物包含用于根特异性烟碱脱甲基化酶CYP82E10及其变体的分离多核苷酸和多肽，所述酶参与这些植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变。本发明的组合物还包括烟草植物或其植物部分，包含编码CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变使CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。还提供这些烟草植物或其后代的种子和从本发明所述烟草植物或其植物部分或后代制备的烟草产品。还提供降低烟草植物或其植物部分中去甲烟碱水平或降低烟碱向去甲烟碱转变率的方法。所述方法包括向烟草植物基因组引入至少三种烟碱去甲基化酶基因中各至少一种等位基因内的突变，其中所述突变降低所述烟碱去甲基化酶基因的表达，且其中这些烟碱去甲基化酶基因的第一种基因编码烟草植物或其植物部分中参与烟碱向去甲烟碱代谢转变的根特异烟碱去甲基化酶。所述方法发现生产烟草产品的用途，所述产物具有降低水平的去甲烟碱和其致癌代谢物NNN从而降低消耗这些烟草产品或暴露于源自这些产物的二次烟的个体致癌可能性。

Description

最小化烟草中去甲烟碱合成的组合物和方法
序列表纳入
序列表的正式文本通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子化提交，文件名“400712SequenceListing.txt”，2011年1月12日生成，大小149KB，与说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书一部分且通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及最小化烟草植物和植物部分中去甲烟碱合成以及因此其代谢物N’-亚硝基降烟碱的组合物和方法，尤其是用于抑制联合绿叶的根特异性烟碱去甲基化酶和衰老诱导的烟碱去甲基化酶的表达或功能的组合物和方法。
技术背景
市售烟草品种中发现的主要生物碱是烟碱，通常占总生物碱池的90-95％。剩余的生物碱组分主要由3种其他吡啶类生物碱构成：去甲烟碱、安纳巴松和安那他品。去甲烟碱通过烟碱N-去甲基化酶活性从烟碱直接生成。去甲烟碱通常代表少于5％的总吡啶类生物碱池，但通过称为“转变”的过程，最初生产非常少量去甲烟碱的烟草植物产生将较大百分比叶片烟碱代谢“转变”为去甲烟碱的后代。经遗传转变(称为“转化体”)的烟草植物中，成熟叶片衰老和固化期间产生大量去甲烟草(Wernsman和Matzinger(1968)Tob.Sci.12:226-228)。白莱烟特别倾向于遗传转变，在一些栽培品种中每代有高至20％的比例。
烟草叶片固化和加工期间，部分去甲烟碱代谢为一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)化合物N-亚硝基降烟碱(NNN)，据称其在实验室动物中致癌(Hecht和Hoffmann(1990)Cancer Surveys 8:273-294；Hoffmann等.(1994)J.Toxicol.Environ.Health 41:1-52；Hecht(1998)Chem.Res.Toxicol.11:559-603)。烟熏烟中，发现TSNA主要通过生物碱和存在于燃烧气体中的微量氮氧化物反应形成，所述燃烧气体通过常规熟化室的直接燃烧加热系统形成(Peele和Gentry(1999)“Formation ofTobacco-specific Nitrosamines in Flue-cured Tobacco,”(烟熏烟中烟草特异亚硝胺的形成)CORESTA会议,农学与植病学组，中国苏州农业植物组织(Agro-PhytoGroups,Suzhou,China))。用热交换器改进这些熟化室实际上消除了固化气体和燃烧气体的混合并显著降低该方法固化的烟草中TSNA的形成(Boyette和Hamm(2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27:17-22.)。相反，风干的白莱烟中，TSNA形成主要通过叶具微生物催化的烟草生物碱和亚硝酸盐的反应进行(Bush等.(2001)Rec.Adv.Tob.Sci.27:23-46)。迄今，通过改良固化条件来降低TSNA同时保持可接受质量标准的尝试在风干烟中尚未证实取得成功。
除了作为NNN的前体之外，近期研究表明烟草产品中发现的去甲烟碱可具有其他不想要的健康影响。Dickerson和Janda(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:15084-15088证明去甲烟碱引起细胞内异常蛋白糖化。发现吸烟者血浆中去甲烟碱修饰蛋白的浓度比非吸烟者高很多。这些相同研究还显示去甲烟碱可共价修饰常见处方类固醇药如强的松。所述修饰具有改变这些药物的效力和毒性的潜能。此外，研究报道将烟草产品中发现的所述去甲烟碱与年龄相关性黄斑变性、出生缺陷和牙周疾病相关联(Brogan等.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:10433-10438；Katz等.(2005)J.Periodontol.76:1171-1174)。
在白莱烟中，发现叶片的去甲烟碱含量和固化产物中积累的NNN含量正相关(Bush等.(2001)Rec.Adv.Tob.Sci,27:23-46；Shi等.(2000)Tob.Chem.Res.Conf.54:Abstract 27)。因此，有效降低叶片中去甲烟碱含量的策略不仅有助于改善上述去甲烟碱本身的潜在不良健康影响，还同时降低NNN水平。这种关联在Lewis等.(2008)Plant Biotech.J.6:346-354的近期研究中进一步被证实，其证明用针对编码衰老诱导的烟碱去甲基化酶的CYP82E4v2基因的RNAi转基因构建体降低去甲烟碱水平导致固化叶片的NNN含量伴随降低。尽管该研究证明转基因技术可用于大量降低烟草的去甲烟碱和NNN含量，公众认知和知识产权问题使之难以用于商业生产源自转基因植物的产物。
因此很需要有效使烟草中去甲烟碱积累最小化的不依赖转基因学使用的方法。
发明内容
提供最小化烟草植物和其植物部分中去甲烟碱含量的组合物和方法。组合物包括称为CYP82E10多核苷酸的已分离根特异细胞色素P450多核苷酸，如SEQID NO:1所示，和从而编码的CYP82E10烟碱去甲基化酶多肽，如SEQ ID NO:2所示，和其变体和片段，包括但不限于包含SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12或13所示序列的多肽，以及编码SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12或13所示多肽的多核苷酸。本发明的CYP82E10多肽是参与烟草根中烟碱向去甲烟碱代谢转变的烟碱去甲基化酶。本发明的分离多核苷酸还包括含SEQ ID NO:3或4所示序列的多核苷酸及其变体和片段。本发明的组合物还包括烟草植物或其植物部分，其包含编码CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变使CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。在一些实施方式中，本发明的烟草植物还包含编码CYP82E4烟碱去甲基化酶基因的突变和/或编码CYP82E5烟碱去甲基化酶基因的突变，其中这些基因的突变使CYP82E4或CYP82E5烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。还提供这些烟草植物或其后代的种子和本发明所述烟草植物或其植物部分或后代制备的烟草产品。
还提供降低烟草植物或其植物部分中去甲烟碱水平或降低烟碱向去甲烟碱转变率的方法。所述方法包括向烟草植物基因组引入至少三种烟碱去甲基化酶基因中各至少一种等位基因内的突变，其中所述突变降低所述烟碱去甲基化酶基因的表达，且其中这些烟碱去甲基化酶基因的第一种基因编码烟草植物或其植物部分中参与烟碱向去甲烟碱代谢转变的根特异烟碱去甲基化酶。在一些实施方式中，所述根特异烟碱去甲基化酶是CYP82E10或其变体。在其他实施方式中，这些方法还包括在烟草基因组中引入编码CYP82E10或其变体的烟碱去甲基酶化基因的至少一种等位基因内的突变和编码CYP82E4或其变体和/或编码CYP82E5或其变体的烟碱去甲基化酶的至少一种等位基因内的突变。还提供鉴定具有低水平去甲烟碱的烟草植物的方法，其中所述植物或其植物部分就编码CYP82E10或其变体的基因中是否存在突变进行单独筛选，或与就编码CYP82E4或其变体的基因中是否存在突变和/或编码CYP82E5或其变体的基因中是否存在突变进行联合筛选。
本发明涵盖如下实施方式。
1.一种烟草植物或其植物部分，其包含编码CYP82E10烟碱去甲基化酶的基因的突变，其中所述突变使所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
2.如实施方式1所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基酶选自SEQ ID NO:2、5、6、7、8和9所示序列。
3.如实施方式1或2所示的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变使所述CYP82E10烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基79、107、381、419和其任何组合的位置发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:2。
4.如实施方式3所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变选自下组：
a)用丝氨酸替代位置79的甘氨酸残基；
b)用丝氨酸替代位置107的脯氨酸残基；
c)用丝氨酸替代位置381的脯氨酸残基；
d)用丝氨酸替代位置419的脯氨酸残基；和
e)其任意组合。
5.如实施方式1-4中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，还包含编码CYP82E4烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变使所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
6.如实施方式5所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19和20所示序列。
7.如实施方式5或6所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变使所述CYP82E4烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基329、364、376、381和458的位置发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:14。
8.如实施方式7所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变选自下组：
a)用终止密码子替代位置329的色氨酸残基；
b)用天冬酰胺替代位置364的赖氨酸残基；
c)用甲硫氨酸替代位置376的缬氨酸残基；
d)用丝氨酸替代位置381的脯氨酸残基；
d)用丝氨酸替代位置458的脯氨酸残基；和
e)其任意组合。
9.如实施方式1-8中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，还包含编码CYP82E5烟碱去甲基酶化基因的突变，其中所述突变使所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
10.如实施方式9所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31和32所示序列。
11.如实施方式9或10所示的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变使所述CYP82E5烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基422和449的位置发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:26。
12.如实施方式11所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变选自下组：
a)用终止密码子替代位置422的色氨酸残基；
b)用亮氨酸替代位置449的脯氨酸残基；和
c)其任意组合。
13.如实施方式9-12中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，包括所述CYP82E10烟碱去甲基化酶基因和所述CYP82E4烟碱去甲基化酶基因中的突变。
14.如实施方式1-13中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述的烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
15.如实施方式14所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶在位置381含突变、所述CYP82E4烟碱去甲基化酶在位置329含突变，且所述CYP82E5烟碱去甲基化酶在位置422含突变，其中所述编号的依据分别是SEQ ID NO:2、14和26。
16.如实施方式15所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述突变选自下组：
a)用丝氨酸替代位置381的脯氨酸残基；
b)用终止密码子替代位置329的色氨酸残基；
c)用终止密码子替代位置422的色氨酸残基；和
d)其任意组合。
17.如实施方式13-16中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述植物或其植物部分的烟碱向去甲烟碱转变低于1.5％。
18.如实施方式17所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述植物或其植物部分的烟碱向去甲烟碱转变不高于0.5％。
19.实施方式1-18中任一项所述的烟草植物的种子或其后代。
20.实施方式1-19中任一项所述烟草植物或其植物部分或后代制备的烟草产品。
21.一种降低烟草产品致癌可能的方法，所述方法包括从如实施方式1-18中任一项所述烟草植物或其植物部分或后代制备所述烟草产品。
22.一种降低烟草植物或其植物部分中去甲烟碱水平或降低烟碱向去甲烟碱转变率的方法，所述方法包括向所述植物基因组引入至少三种烟碱去甲基化酶基因中各至少一种等位基因内的突变，其中所述突变降低所述烟碱去甲基化酶基因的表达，且其中所述烟碱去甲基化酶基因的第一种基因编码烟草植物或其植物部分中参与烟碱向去甲烟碱代谢转变的根特异烟碱去甲基化酶。
23.如实施方式22所述的方法，其特征在于，所述根特异烟碱去甲基化酶是含选自下组的氨基酸序列的CYP82E10烟碱去甲基化酶：
a)SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9或10所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9或10所示的氨基酸序列具有至少98％序列相同性的氨基酸序列。
24.如实施方式23所述的方法，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的所述氨基酸序列在选自氨基酸残基79、107、381、419和其任何组合的位置处的氨基酸残基发生替换，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:2。
25.如实施方式24所述的方法，其特征在于，所述位置79、107、381或419的所述替换是丝氨酸残基。
26.如实施方式22-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述烟碱去甲基化酶基因的第二种基因编码CYP82E4烟碱去甲基酶。
27.如实施方式26所述的方法，其特征在于，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶包含选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20或21所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20或21所示的氨基酸序列具有至少98％序列相同性的氨基酸序列。
28.如实施方式27所述的方法，其特征在于，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的所述氨基酸序列在选自氨基酸残基329、364、381、458和其任何组合的位置处的氨基酸残基发生替换，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:14。
29.如实施方式28所述的方法，其特征在于，位置329的所述替换是终止密码子，位置364的所述替换是天冬酰胺残基，位置381的所述替换是丝氨酸残基，位置458的所述替换是丝氨酸残基或其任何组合。
30.如实施方式22-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述烟碱去甲基化酶基因的第三种基因编码CYP82E5烟碱去甲基化酶。
31.如实施方式30所述的方法，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶包含选自下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31或32所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31或32所示的氨基酸序列具有至少98％序列相同性的氨基酸序列。
32.如实施方式31所述的方法，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的所述氨基酸序列在选自氨基酸残基422和449和其任何组合的位置处的氨基酸残基发生替换，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:26。
33.如实施方式32所述的方法，其特征在于，位置422的所述替换是终止密码子，位置449的所述替换是亮氨酸残基,或其任何组合。
34.如实施方式22-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物或其植物部分对所述突变为纯合。
35.如实施方式22-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述引入包括育种方案。
36.如实施方式22-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
37.如实施方式1-18中任一项所述的烟草植物或其植物部分，其特征在于，所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
38.一种鉴定有低水平去甲烟碱的烟草植物的方法，所述方法包括从感兴趣的烟草植物中筛选SEQ ID NO:1或3内存在突变的DNA样品。
39.如实施方式38所述的方法，其特征在于，所述烟草植物是非转化体。
40.如实施方式38或39所述的方法，其特征在于，所述筛选用选自SEQ IDNO:1、3、35、36、37和38的序列进行。
41.如实施方式38-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据是否存在SEQ ID NO:14中的突变、是否存在SEQ ID NO:26中的突变或是否存在SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:26中的突变来从所述感兴趣的烟草植物中筛选所述DNA样品或另一DNA样品。
42.一种含选自下组的核苷酸序列的分离多核苷酸:
a)含SEQ ID NO:1、3、或4的核苷酸序列；
b)含SEQ ID NO:1、3或4的至少20个毗连核苷酸片段的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO:1所示完整序列具有至少97％序列相同性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码参与植物中烟碱向去甲烟碱代谢转变的多肽。
d)编码选自SEQ ID NO:2和5-13的多肽，或其含有至少115个毗连残基片段的核苷酸序列；
e)编码与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示序列具有至少98％序列相同性的多肽的核苷酸序列；和
f)与前述条目(a)-(e)中任一项所述的序列互补的核苷酸序列。
43.一种含选自下组的氨基酸序列的分离多肽：
a)SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的氨基酸序列；和
b)与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的氨基酸序列具有至少98％相同性的氨基酸序列；和
c)作为SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示氨基酸序列片段的氨基酸序列，其中所述片段含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13的氨基酸序列的至少115个毗连残基。
44.一种烟草植物或其植物部分，其对编码CYP82E10烟碱去甲基化酶的基因、编码CYP82E4烟碱去甲基化酶的基因和编码CYP82E5烟碱去甲基化酶的基因中的突变纯合，其中所述突变引起所述CYP82E10、CYP82E4和CYP82E5烟碱去甲基化酶的表达和功能下降，其中所述CYP82E10烟碱去甲基化酶在位置381含突变、所述CYP82E4烟碱去甲基化酶在位置329含突变且所述CYP82E5烟碱去甲基化酶在位置422含突变、其中所述编号的依据分别是SEQ ID NO:2、14和26。
45.一种编码CYP82E10烟碱去甲基化酶的基因中的突变，其中所述突变使所述CYPe2E10烟碱去甲基化酶的表达和功能降低。
46.一种植物，所述植物具有CYP82E10基因中抑制根内烟碱去甲基化酶活性的突变、CYP82E4v2基因中抑制老叶内烟碱去甲基化酶活性的突变，和CYP83E5基因中抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的突变。
附图简要说明
图1A-C显示CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的DNA(SEQ ID NO:4)和预测蛋白序列。所述蛋白编码序列为大写字母，且5'和3'侧接序列为小写字母。内含子序列(SEQ ID NO:3)为小写斜体。核苷酸序列的编号示于左侧且蛋白序列的编号示于右侧。用于特异性扩增外显子1以筛选突变的对应PCR引物的核苷酸序列用下划线表示(未用粗体显示)，而带下划线的粗体序列表示外显子2特异引物位点。发现在突变筛选中改变的个体核苷酸和氨基酸残基(表2)用下划线和粗体表示。
图2A-C显示CYP82E10(SEQ ID NO:4)、CYP82E5v2(SEQ ID NO:38)和CYP82E4v2(SEQ ID NO:37)的基因组序列比对。蛋白编码序列为大写字母；5'和3'非翻译区域用小写字母表示；内含子序列用小写斜体字母表示。共有序列相同性的位置用阴影盒显示。
图3显示表达CYP82E10和来自植物1041的含Pro381Ser(P381S)突变的CYP82E10的酵母细胞中微粒体膜的烟碱去甲基化酶活性的薄层色谱数据。CPM,每分钟计数。
图4A和4B显示在CYP82E4v2,CYP82E5v2,and CYP82E10基因座含不同突变组合的白莱烟植物的平均烟碱转变百分比。不同字母的均值在P<0.05水平存在显著差异。
序列表序列的描述
以下列表显示序列表的序列信息。使用氨基酸取代标准注释。因此，例如，CYP82E10P419S表示位置419用丝氨酸取代脯氨酸残基的变体蛋白，其中编号参考野生型序列，本情况中CYP82E10序列示于SEQ ID NO:2。另一示例中，CYP82E4P38L表示位置38用亮氨酸取代脯氨酸残基的变体蛋白，其中编号参考野生型序列，本情况中CYP82E4序列示于SEQ ID NO:14。另一示例中，CYP82E5P72L表示位置72用亮氨酸取代脯氨酸残基的变体蛋白，其中编号参考野生型序列，本情况中CYP82E5序列示于SEQ ID NO:26。
SEQ ID NO:1表示CYP82E10的编码序列。
SEQ ID NO:2表示CYP82E10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3表示CYP82E10基因内含子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4表示CYP82E10的基因组序列。
SEQ ID NO:5表示CYP82E10 L148F的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6表示CYP82E10 G172R的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7表示CYP82E10 A344T的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8表示CYP82E10 A410T的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9表示CYP82E10 R417H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10表示CYP82E10 P419S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11表示CYP82E10 G79S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12表示CYP82E10 P107S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13表示CYP82E10 P381S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14表示CYP82E4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15表示CYP82E4 P38L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16表示CYP82E4 D171N的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17表示CYP82E4 E201K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18表示CYP82E4 R169Q的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19表示CYP82E4 G459R的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20表示CYP82E4 T427I的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21表示CYP82E4 V376M的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22表示CYP82E4 W329Stop的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23表示CYP82E4 K364N的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24表示CYP82E4 P381S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25表示CYP82E4 P458S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26表示CYP82E5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27表示CYP82E5 P72L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28表示CYP82E5 L143F的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29表示CYP82E5 S174L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30表示CYP82E5 M224I的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31表示CYP82E5 P235S的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32表示CYP82E5 A410V的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33表示CYP82E5 W422Stop的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34表示CYP82E5 P449L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35显示CYP82E10的外显子1的正向引物序列。
SEQ ID NO:36显示CYP82E10的外显子1的反向引物序列。
SEQ ID NO:37显示CYP82E10的外显子2的正向引物序列。
SEQ ID NO:37显示CYP82E10的外显子2的反向引物序列。
SEQ ID NO:38表示CYP82E4v2的基因组序列。
SEQ ID NO:39表示CYP82E5v2的基因组序列。
定义
本发明包括抑制根特异性烟碱去甲基化酶多肽的表达或功能的组合物和方法，所述烟碱去甲基化酶多肽参与植物根中烟碱向去甲烟碱烟碱的代谢转变，尤其是烟草(Nicotiana)属的植物，包括各种市售品种的烟草植物。
如本文所用，“抑制”、“抑制作用”和“抑制的”定义为本领域已知或本文所述的任何方法，其降低感兴趣基因产物(即靶基因产物)的表达或功能，本情况中的烟碱去甲基化酶如本发明的根特异烟碱去甲基化酶。已知烟碱去甲基化酶多肽可被本领域已知任何合适方法抑制，包括有义和反义抑制、RNAi抑制、敲除方法如诱变等。其中特别感兴趣的方法是敲除或敲减这些根特异烟碱去甲基化酶的表达和/功能，尤其是能在CYP82E10烟碱去甲基化酶基因中选择有利突变的诱变方法。
“有利突变”指导致CYP82E10多肽替换、插入、删除或截断的突变，从而其烟碱去甲基化酶活性被抑制。在一些实施方式中，烟碱去甲基化酶活性与相同测试条件下的野生型CYP82E10多肽活性相比被抑制至少25％、30％、35、40％、45、50％、55％或60％。在其他实施方式中，烟碱去甲基化酶活性被抑制至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在优选实施方式中，有利突变提供完全抑制(即100％抑制)，且烟碱去甲基化酶活性被敲除(即其活性检测不到)。
“抑制的”可在两种植物之间比较的内容中，例如遗传改变的植物与野生型植物。所述比较可为两种植物之间，例如野生型植物和其一缺乏能产生将烟碱转变为去甲烟碱的根特异烟碱去甲基化酶的DNA序列。靶基因产物的表达或功能的抑制还可在同一植物内或不同植物间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间的比较内容中，且包括相同植物或植物部分内或植物或植物部分间的发育或瞬时阶段之间的比较。
“抑制的”可包括感兴趣基因产物的功能或生产的任何相对下降，在本情况中是根特异烟碱去甲基化酶多至或包括该基因产物功能或生产的完全消除。比较基因产物水平时，该比较优选在有相似遗传背景的生物体之间进行。优选地，相似遗传背景中所比较生物体共有序列相同性为50％或更高的核遗传材料，更优选75％或更高，且更优选90％或更高。相似遗传背景中所比较的生物体是植物，或所述植物同基因除了最初用植物转化技术导入的任何遗传材料或人为介入生成的突变。基因产物的水平或含量测量可通过任何合适方法进行，其非限制性示例包括但不限于mRNA转录本水平、蛋白或肽水平和/或表型的比较，特别是烟碱向去甲烟碱的转变。如本文所用，mRNA转录本可包括加工或未加工的mRNA转录本，且多肽或肽可包括具有或不具有任何翻译后修饰的多肽或肽。
如本文所用，“变体”表示基本相似的序列。变体可具有与感兴趣野生型多肽不同的功能或基本相似的功能。对于烟碱去甲基化酶，基本相似的功能是相同条件或接近相同基因系下野生型酶将烟碱转变为去甲烟碱功能的至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、60％、50％、25％或15％。野生型CYP82E10如SEQ ID NO:2所示。野生型CYP82E4如SEQ ID NO:14所示。野生型CYP82E5如SEQ ID NO:26所示。本发明的野生型CYP82E10的示例性变体包括含SEQ IDNO:5、6、7、8、9、10、11、12或13所示序列的多肽。SEQ ID NO:10(CYP82E10P419S)所示的变体优选具有有利突变，所述突变使酶仅具有约25％的野生型CYP82E10多肽的烟碱去甲基化酶活性。SEQ ID NO:11(CYP82E10G79S)、12(CYP82E10与P107S)和13(CYP82E10与P381S)所示的变体优选具有有利突变，所述突变使其烟碱去甲基化酶活性被敲除(即100％抑制且因此产生无功能多肽)。在类似方法中，野生型CYP82E4的示例性变体包括含SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25所示序列的多肽。SEQ ID NO:21(CYP82E4V376M)所示的变体优选具有有利突变，所述突变使酶仅具有约50％的野生型CYP82E4多肽的烟碱去甲基化酶活性。SEQ ID NO:22(CYP82E4W329Stop)、23(CYP82E4K364N)和24(CYP82E4P381S)所示的变体优选具有有利突变，所述突变使其烟碱去甲基化酶活性被敲除(即100％抑制)。相似地，野生型CYP82E4的示例性变体包括含SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34所示序列的多肽。SEQ IDNO:34(CYP82E5P449L)所示的变体优选具有有利突变，所述突变使其烟碱去甲基化酶活性被抑制，且SEQ ID NO:33所示的变体优选具有有利突变，所述突变使其烟碱去甲基化酶活性被敲除(即100％抑制)。
如本文所用，“变体多核苷酸”或“变体多肽”表示非野生型的核酸或氨基酸序列。
变体可具有一种添加、缺失或取代；两种或更少的添加、缺失或取代；三种或更少的添加、缺失或取代；四种或更少的添加、缺失或取代；或者五种或更少的添加、缺失或取代。突变包括添加、缺失和取代。所述缺失或添加可在C-末端、N-末端或C-和N-末端二者。融合多肽或表位标记的多肽也可包括在本发明中。“沉默”核苷酸突变不改变给定位置的编码氨基酸。氨基酸取代可为保守的。保守取代是氨基酸中的变化，其中所述变化是变为与原始氨基酸相同氨基酸家族内的氨基酸。所述家族由个体氨基酸的侧链定义。氨基酸家族可具有碱性、酸性、不带电极性或非极性侧链。参见Alberts等.,(1994)Molecular biology of the cell(《细胞分子生物学》)(第三版,56-57页,纽约州纽约的加兰出版公司(Garland PublishingInc.,New York,New York))，通过引用其全文纳入本文。缺失、取代或添加可在另一CYP82E家族成员的相同位置氨基酸上。如本文所用，“片段”表示多核苷酸部分或多肽部分以及其编码的蛋白。
如本文所用，“植物部分”表示可再生为完整植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物，在植物或植物部分完整的植物愈伤组织、植物块和植物细胞如胚胎、花粉、花粉囊、胚珠、种子、叶子、花、茎、枝条、果实、根、根尖等。再生植物的后代、变体或突变体也包括在本发明范围内，只要其包含本发明的引入多核苷酸。如本文所用，“烟草植物材料”表示植物部分的任何部分或植物部分的任何组合。
发明详述
本发明涉及新烟碱去甲基化酶基因CYP82E10(基因组序列如SEQ ID NO:4所示)，和其编码的CYP82E10烟碱去甲基化酶(SEQ ID NO:2)，其涉及烟草植物根中烟碱向去甲烟碱的根特异性转变，及其在降低或最小化烟碱向去甲烟碱转变并因此降低烟草植物和其植物部分中去甲烟碱水平的应用。“根特异”指其优选在烟草植物根中表达，与其他植物器官如叶片或种子相反。通过将所选的有利突变引入具有烟碱去甲基化酶活性的该根特异烟碱去甲基化酶或其变体中，联合编码具有烟碱去甲基化酶活性的绿叶烟碱去甲基化酶基因(例如,SEQ ID NO:26所示的CYP82E5)或其变体内的一种或多种所选有利突变，还联合编码具有烟碱去甲基化酶活性的衰老诱导烟碱去甲基化酶基因(例如,SEQ ID NO:14所示的CYP82E4)或其变体内的一种或多种所选有利突变，可能产生具有烟碱向去甲烟碱最小转化的非转基因植物，其中所述转化率低于约1.5％，优选低于约1％。
非常需要降低烟草中的去甲烟碱水平，因为该生物碱是充分记载的致癌物质N’-亚硝基降烟碱(NNN)的前体。编码烟草中具有烟碱去甲基化酶活性的蛋白的两种基因先前已鉴定并称为CYP82E4v2和CYP82E5v2。CYP82E4多肽(SEQ IDNO:14)是衰老诱导的烟碱去甲基化酶。CYP82E4v2基因(包括编码和内含子区域)、其在烟草植物内去甲烟碱生成中的作用，和抑制其表达和功能的方法描述于美国专利申请号11/580,765，其公开为美国专利申请公开号2008/0202541A1。CYP82E5多肽(SEQ ID NO:26)是绿叶烟碱去甲基化酶(即其主要在绿叶中表达)。CYP82E4基因(包括编码和内含子区域)、其在烟草植物内去甲烟碱生成中的作用，和抑制其表达和功能的方法描述于美国专利申请号12/269,531，其公开为美国专利申请公开号2009/0205072A1。这两个美国专利申请的内容和其分别的公开都通过引用全文纳入本文。
然而，对有利突变cyp82e4v2和cyp82e5v2等位基因(即敲减或敲除这些各烟碱去甲基化酶基因表达的突变等位基因)纯合的植物也能将其多于2％的烟碱代谢为去甲烟碱，这代表仍能导致大量NNN形成的去甲烟碱水平。CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的发现提供了使烟草植物中烟碱向去甲烟碱转变率最小化的另一途径，且因此还降低烟草植物和其衍生植物材料中去甲烟碱以及NNN的水平。联合有利突变cyp82e10等位基因与有利突变cyp82e4v2和cyp82e5v2等位基因提供烟草植物，相比仅具有cyp82e4v2突变或加上cyp82e5v2突变的烟草植物中所观察到的，其去甲烟碱降低多于3倍。在一个实施方式中，本发明提供烟碱去甲基化酶基因cyp82e4v2、cyp82e5v2和cyp82e10的纯合三突变组合，产生与之前通过转基因抑制方法所得相当的极低去甲烟碱生成水平的非转基因烟草植物，如美国专利申请公开号2008/0202541A1和2009/0205072A1中所述。
烟碱去甲基化酶多核苷酸和多肽及其变体和片段。
本发明的组合物包括CYP82E10多肽和其变体及片段。所述烟碱去甲基化酶多核苷酸和多肽参与植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变，所述植物包括各种市售品种的烟草植物。具体地，本发明组合物包括含SEQ ID NO:2和5-13所示氨基酸序列的分离多肽，含SEQ ID NO:1、3和4所示核苷酸序列的分离多核苷酸，编码SEQID NO:2和5-13所示氨基酸序列的分离多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于抑制参与植物尤其是烟草植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变的烟碱去甲基化酶多肽或其变体的表达。本发明的一些多核苷酸具有导致野生型烟碱去甲基化酶的烟碱去甲基化酶活性被抑制的突变。本发明多肽的抑制对降低烟草系如晾烟中去甲烟碱水平有效，其中遗传转变发生在少于30％、50％、70％、90％的群体中。本发明多肽的抑制对降低烟草群中去甲烟碱水平有效，其中遗传转变发生在至少90％、80％、70％、60％、50％的植物群体中。群体优选含多于约25、50、100、500、1,000、5,000或25,000种植物，其中更优选至少约10％、25％、50％、75％、95％或100％的植物包含本发明的多肽。
本发明的烟碱去甲基化酶多核苷酸和编码的多肽包括新细胞色素P450基因，称为CYP82E10烟碱去甲基化酶基因，其新近鉴定出在烟草植物根内烟碱向去甲烟碱的代谢转变中发挥作用。可采用转基因方法如有义、反义和RNAi抑制以与CYP82E4和CYP82E5烟碱去甲基化酶所述相似的方法敲减该烟碱去甲基化酶的表达，如美国专利申请公开号2008/0202541 A1和2009/0205072 A1所述，其公开通过引用全文纳入本文。优选方法是将一种或多种有利突变引入该基因，该方法优选提供其中烟碱向去甲烟碱转变率降低并因此去甲烟碱和NNN水平降低的非转基因烟草植物。所述方法包括但不限于诱变等，如以下本文他处所述。
本发明涵盖分离或基本纯化的本发明多核苷酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或其生物活性部分基本或本质上不含其天然产生环境中通常伴随多核苷酸或蛋白或与之相互作用的组分。因此，通过重组技术产生时，分离或纯化的多核苷酸或蛋白基本不含其它细胞物质或培养基，或者通过化学方法合成时基本不含化学物质前体或其他化学物质。任选地，“分离的”多核苷酸不含该多核苷酸源自的生物体基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸(即位于多核苷酸5'和3'末端处的序列)的序列(任选蛋白编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的多核苷酸包含该多核苷酸源自的细胞基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本不含细胞材料的蛋白包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)污染蛋白的蛋白制品。本发明蛋白或其生物活性部分经重组生产时，最佳的培养基代表少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体或非感兴趣蛋白的化学品。
公开的多核苷酸片段和其编码的多肽也涵盖在本发明中。多核苷酸片段可编码维持天然蛋白生物活性的蛋白片段，且因此参与植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变。或者，用作杂交探针或PCR引物的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白。此外，公开的核苷酸序列片段包括那些可组装在重组构建体中用于由本领域已知方法进行基因沉默的那些，所述方法包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶和小干扰RNA或微小RNA，如本领域所述和本文以下所述。因此核苷酸序列片段的范围可根据所需结果而为至少约20核苷酸、约50核苷酸、约70核苷酸、约100核苷酸、约150核苷酸、约200核苷酸、250核苷酸、300核苷酸和最多至编码本发明蛋白的全长多核苷酸。在一个方面，核苷酸序列的片段可为100-约350核苷酸、100-约325核苷酸、100-约300核苷酸、约125-约300核苷酸、约125-约275核苷酸长度、约200-约320连续核苷酸、长度约200-约420连续核苷酸长度、约250-约450连续核苷酸长度的片段。另一实施方式包括具有长度约300-约450连续核苷酸的重组核酸分子。
编码本发明CYP82E10多肽的生物活性部分的本发明烟碱去甲基化酶多核苷酸片段编码至少15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、或500个连续氨基酸或多至本发明全长烟碱去甲基化酶多肽中存在的氨基酸总数(如SEQ ID NO:2和5-13的517个氨基酸)。烟碱去甲基化酶多肽的生物活性部分可通过下述方法制备：分离本发明的CYP82E10多核苷酸之一的部分、表达CYP82E10多肽的编码部分(例如通过体外重组表达)，和用本领域已知试验和下述提供的那些评估CYP82E10多肽编码部分的活性，即促进烟碱向去甲烟碱转变的能力。
作为本发明CYP82E10核苷酸序列片段的多核苷酸包括至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、或1700个连续核苷酸，或多至本文所述全长CYP82E10多核苷酸中存在的核苷酸数(如SEQ ID NO:1的1551；SEQ ID NO:4的2636)。作为本发明CYP82E10核苷酸序列片段的多核苷酸包括本文所述CYP82E10多核苷酸中约20-约1700个连续核苷酸、约50-约1600个连续核苷酸、约75-约1500个连续核苷酸、约100-约1400核苷酸、约150-约1300个连续核苷酸、约150-约1200个连续核苷酸、约175-约1100个连续核苷酸、约200-约1000个连续核苷酸、约225-约900个连续核苷酸、约500-约1600个连续核苷酸、约775-约1700个连续核苷酸、约1000-约1700个连续核苷酸、或约300-约800个连续核苷酸的片段。在一个方面，片段多核苷酸包括的多核苷酸序列含有CYP82E10编码序列中约700位-约1250位、CYP82E10基因组序列中约700位-约1250位、CYP82E10内含子序列中约10位-约900位或CYP82E10内含子序列中约100位-约800位处的核苷酸的多核苷酸序列。
公开的多核苷酸变体和其编码的多肽也涵盖在本发明中。天然产生的变体包括与本文下述的所公开CYP82E10多核苷酸和多肽共有显著序列相同性的那些变体。在另一实施方式中，天然产生的变体还与本文所述的CYP82E10多核苷酸共有显著功能相同性。本发明的组合物和方法可用于靶向与所公开CYP82E10多肽共有显著序列相同性的任何天然产生的CYP82E10的表达或功能。所述CYP82E10多肽可具有相关的烟碱去甲基化酶活性，即参与或不参与植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变。该变体可由于例如遗传多态性或由于人为操作在育种和选择中发生，包括诱变方法。本发明CYP82E10蛋白的生物活性变体，例如SEQ ID NO:2和5-13所示的多肽变体具有与野生型蛋白的氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性，如文本他处所述序列比对软件和参数所测，且可由其参与植物中烟碱向去甲烟碱的代谢转变的功能或缺失该功能表征。本发明蛋白的生物活性变体可与该蛋白有少至1-15氨基酸残基、少至10、少至9、少至8、少至7、少至6、少至5、少至4、少至3、少至2或少至1氨基酸残基的差异。本发明蛋白的生物失活变体可与该蛋白有少至1-15氨基酸残基、少至10、少至9、少至8、少至7、少至6、少至5、少至4、少至3、少至2或少至1氨基酸残基的差异。
本发明的具体多核苷酸变体包括编码CYP82E10多肽的天然产生的多核苷酸，所述CYP82E10多肽参与植物根中烟碱向去甲烟碱的代谢转变。该多核苷酸变体可包括在本文所述天然多核苷酸内一个或多个位置处删除和/或添加一种或多种核苷酸和/或天然多核苷酸中一个或多个位置处取代一种或多种核苷酸。由于遗传密码的简并性，多核苷酸的保守变体包括编码本发明CYP82E10多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然产生的变体如这些变体可通过用熟知的分子生物学技术鉴定，例如用聚合酶链式反应(PCR)和如本领域已知和本文公开的杂交技术。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，如用例如定点诱变生成但仍与本文公开的天然产生序列共有显著序列相同性的那些，且因此可用于本发明方法以抑制参与烟碱向去甲烟碱的代谢转变的烟碱去甲基化酶的表达和功能，所述酶包括SEQ IDNO:2、5、6、7、8、9和10所示的烟碱去甲基化酶多肽。通常，本发明的具体多核苷酸的变体例如SEQ ID NO:3的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO:2和5-13所示氨基酸序列的多核苷酸序列具有与该具体多核苷酸至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，如本文他处所述序列比对程序和参数所测。
本发明的具体多核苷酸(又称为参考多核苷酸)的变体还可通过比较该参考多核苷酸编码的多肽和变体多核苷酸编码的多肽之间的序列相同性百分比来评估。任何两种多肽之间的序列相同性百分比可用如本文他处所述序列比对程序和参数计算。本发明任何给定的多核苷酸对通过比较其编码的两种多肽共有的序列相同性百分比来计算时，该两种编码的多肽之间的序列相同性百分比至少为约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性。
此外，本发明的多核苷酸可用于从烟草属的其他成员中分离相应根特异烟碱去甲基化酶序列，具体为CYP82E10序列。PCR、杂交和其他类似方法可用于根据此类序列与本文所示序列的序列同源性来鉴定该序列。根据该序列与本文所示核苷酸序列或其变体和片段的序列相同性而分离的序列涵盖在本发明中。此类序列包括公开序列的直向同源物序列。
根据本发明，“直向同源物”是源自共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。不同物种中发现的基因在其核苷酸序列和/或其编码蛋白序列共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性时被认为是直向同源物。直向同源物的功能通常在物种间高度保守。因此，编码参与烟碱向去甲烟碱代谢转变的烟碱去甲基化酶多肽的分离多核苷酸或其变体或片段涵盖在本发明中，所述多核苷酸在严谨条件下与本文所述CYP82E10序列杂交。此类序列可用于本发明方法，以抑制参与植物中烟碱向去甲烟碱代谢转变的烟碱去甲基化酶多肽的表达。
使用PCR，寡核苷酸引物可设计用于PCR反应以从任何感兴趣植物所提取的cDNA或基因组DNA中扩增相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域普遍已知且公开于Sambrook等.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，纽约普莱恩维尤德冷泉港实验室出版社,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)).Innis等编.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(《PCR实验方案：方法和应用指南》)(纽约学术出版社(Academic Press,New York))；Innis和Gelfand,编.(1995)PCR Strategies(《PCR策略》)(纽约学术出版社)；和Innis和Gelfand,编.(1999)PCR Methods Manual(《PCR方法手册》)(纽约学术出版社)。PCR的已知方法包括但不限于，用配对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异引物、载体特异引物、部分错配引物等的方法。
杂交技术涉及使用全部或部分已知多核苷酸作为与克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群中存在的其他相应多核苷酸选择性杂交的探针。
杂交可在严谨条件下进行。“严谨条件”或“严谨杂交条件”指探针与其靶序列的杂交程度明显大于其他序列(如至少2倍于背景)的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。通过控制杂交和/或清洗条件的严谨性，可鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严谨性条件以使序列有一些错配从而检测较低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于约1000核苷酸，最佳长度少于500核苷酸。
通常，严谨性条件是那些在pH7.0-8.3时盐浓度低于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)且温度至少约30℃的条件。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。示例性的低严谨条件包括与30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃杂交，和在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50-55℃清洗。示例性的中等严谨条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交并在0.5X-1XSSC中于55-60℃清洗。示例性的高严谨条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交并在0.1X SSC中于60-65℃清洗。任选地，清洗缓冲液可包括约0.1％-约1％SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常为约4-约12小时。清洗的持续时间至少长至足以达到平衡。
在具体实施方式中，严谨条件包括在含5X SSC、0.5％SDS、5X邓哈特溶液(Denhardt's)、0.45ug/ul聚A RNA,0.45ug/ul牛胸腺DNA和50％甲酰胺的溶液中于42℃杂交，以及在含约0.01X SSC–约l X SSC的溶液中至少一次杂交后清洗。杂交的持续时间为约14-约16小时。
特异性通常随杂交后清洗而变化，关键因素是离子强度和最终清洗液温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可用Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284中的等式Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L估算；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交液中甲酰胺的百分比，且L是碱基对中的杂交体长度。Tm是50％互补靶序列与完全匹配探针杂交时的温度(在确定离子强度和pH的条件下)。每l％错配使Tm降低约1℃；因此，Tm、杂交和/或清洗条件可调整为与所需相同性的序列杂交。例如，若寻找相同性≥90％的序列，则Tm可降低10℃。通常，严谨条件选择为比特定序列和其互补物在确定离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5℃。然而，严格严谨条件可利用在低于热解链点(Tm)1、2、3或4℃的温度杂交和/或清洗；中等严谨条件可利用在低于热解链点(Tm)6、7、8、9或10℃的温度杂交和/或清洗；低严谨条件可利用在低于热解链点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的温度杂交和/或清洗。用所述等式、杂交和清洗组合物以及所需的Tm，普通技术人员应理解杂交和/或清洗溶液的严谨性变化从本质上加以描述。若所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以使用更高的温度。核酸杂交的广泛指南参见Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes,(《生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针杂交》)第一部分第二章(纽约埃斯威尔出版社(Elsevier,New York))；和Ausubel等编(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology,(《新编分子生物学实验指南》)第2章(纽约格林出版和韦利科学公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience))。参见Sambrook等.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，冷泉港实验室出版社,纽约普莱恩维尤)。
杂交探针可为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可用可检测基团如32P或其他任何可检测标记进行标记。例如，制备用于杂交的探针可通过基于本发明CYP82E10多核苷酸序列来标记合成寡核苷酸。制备杂交探针和构建cDNA和基因组库的方法为本领域公知且公开于Sambrook等.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，冷泉港实验室出版社,纽约普莱恩维尤)。
例如，本文公开的CYP82E10多核苷酸序列或其一个或多个部分可用作能特异杂交相应根特异烟碱去甲基化酶多核苷酸和信使RNA的探针。为了在各种条件下实现特异杂交，此类探针包括CYP82E10多核苷酸序列中独特的序列或对CYP82E10多核苷酸序列之一独特的序列，包括编码序列上游区域5'和编码序列下游区域3'以及内含子区域(例如,SEQ ID NO:3),优选至少约10个连续氨基酸长度，且更优选至少约20个连续核苷酸长度，且更优选至少约50个连续核苷酸长度，且更优选至少约75个连续核苷酸长度，且更优选至少约100个连续核苷酸长度。该探针可用于扩增相应CYP82E10多核苷酸。此技术可用于从所需植物分离其他编码序列或突变或作为诊断试验测定植物中编码序列的存在。杂交技术包括DNA库铺板的杂交筛选(噬斑或菌落；参见例如Sambrook等.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，冷泉港实验室出版社,纽约普莱恩维尤)。
如本文所用，涉及两种或多种多核苷酸或多肽之间的序列关系时，术语“参考序列”是用作序列比对基础的规定序列。参考序列可为特异序列的亚组或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或完整cDNA或基因序列。
如本文所用，术语“比对窗口”参考多核苷酸序列的连续和特异区段，其中比较窗口中的多核苷酸序列相较参考序列(不含添加或缺失)可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种多核苷酸。通常，比较窗口至少长20个连续核苷酸，任选可为30、40、50、100或更长。本领域技术人员理解，为了避免由于多核苷酸序列中包括缺口而与参考序列相似性高，通常引入缺口罚分并从匹配数中减去。
比对序列的比较方法是本领域熟知的。因此，可采用数学算法确定任意两个序列的序列相同性百分数。该数学算法的非限制性示例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法；Smith等.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索局部比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877改良。
Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。可利用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了进行缺口比对以用于比较目的，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402所述利用缺口BLAST(BLAST 2.0中)。或者，可利用PSI-BLAST(BLAST 2.0中)进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系。参见Altschul等.(1997)同上。利用BLAST、缺口BLAST、PSI-BLAST时，可使用各程序的默认参数(如BLASTN的核苷酸序列、BLASTX的蛋白)(参见www.ncbi.nlna.nih.gov)。比对还可手工检查进行。
在一些实施方式中，本文提供的序列相同性/相似性值通过BLASTX(Altschul等.(1997)同上)、Clustal W(Higgins等.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680)、和GAP(威斯康星州大学遗传计算组软件包(University of Wisconsin GeneticComputing Group software package))算法用默认参数计算。本发明还包括使用任何其等价程序用于分析和比较核酸和蛋白序列。“等价程序”指任何序列比较程序，相较BLASTX、Clustal W或GAP产生的相应算法，该程序对研究的任何两种序列生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对以及相同的序列相同性百分比。
对于本发明涵盖的各种核苷酸和多肽序列的前述讨论，在两种多核苷酸或多肽序列内容中的术语“序列相同性”或“相同性”是在特定比较窗口上比对最大对应性时参考两种序列中相同的残基。序列相同性百分比涉及蛋白使用时，认为不同的残基位置通常由保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列由于保守取代而不同时，序列相同性百分比可上调以根据该取代的保守性质校正。由于此类保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的方法为本领域技术人员公知。通常其涉及将保守取代作为部分评分而不是完全错配，从而增加序列相同性百分比。因此例如，相同氨基酸得分为1，非保守取代得分为0，保守取代得分为0-1。如程序PC/GENE(智慧遗传公司(IntelliGenetics,)加州芒廷维尤)中所执行的来计算保守取代的得分。
本文所用术语“序列相同性百分比”表示通过在比较窗口中对比两种最佳比对序列而测定的值，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种序列。该百分比如下计算：通过测定两种序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。
因此，CYP82E10多核苷酸和多肽序列可用本文提供的序列鉴定。该方法包括获得与SEQ ID NO:1、3或4的多核苷酸序列或其互补物或片段或者SEQ ID NO:2或5-13的多肽序列有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列相同性的多核苷酸或多肽。一个优选的实施方式包括对应于SEQ ID NO:2，在CYP82E10多肽的位置79、107或381有丝氨酸的多肽，其中所述编号对应于SEQ ID NO:2。
抑制烟碱去甲基化酶表达或功能的方法
提供在烟草植物或植物部分尤其是根组织中降低本发明CYP82E10多肽浓度、含量和/或活性的方法。可单独或组合使用许多方法以降低或消除本发明CYP82E10多肽(SEQ ID NO:2)及其保持烟碱去甲基化酶活性的变体(例如SEQ ID NO:7、8、9和10)的活性。此外，可使用方法的组合以降低或消除两种或更多不同烟碱去甲基化酶的活性，更具体地为根特异性CYP82E10烟碱去甲基化酶和一种或两种绿叶CYP82E5和衰老诱导的CYP82E4烟碱去甲基化酶。在具体实施方式中，CYP82E5是具有序列SEQ ID NO:26中至少一种氨基酸突变的多肽，所述突变对绿叶中的转变产生负向影响，且CYP82E4具有SEQ ID NO:14所示的序列，其有至少一种负向影响衰老叶片中转变的氨基酸突变。
根据本发明，若CYP82E10多肽的蛋白水平在统计上低于未遗传改良或突变成抑制该CYP82E10多肽表达的植物中相同CYP82E10多肽的蛋白水平，且这些植物用相同方案培养和收获时，则本发明的CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达受抑制。在本发明具体实施方式中，根据本发明改良的植物中CYP82E10多肽的蛋白水平低于未突变或未遗传改良成抑制该CYP82E10多肽表达的植物(用相同方案培养和收获)中相同CYP82E10多肽的蛋白水平的95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％或低于5％。CYP82E10多肽的表达水平可直接测量，例如通过分析烟草植物或植物部分中表达的CYP82E10转录本或CYP82E10多肽水平，或间接测量，例如通过测量烟草植物或植物部分中烟碱向去甲烟碱的转变。监控蛋白表达水平的方法为本领域已知，且包括但不限于Northern印迹分析和RNA分化试验。测定靶CYP82E10多肽在烟碱向去甲烟碱的转变中活性的方法为本领域已知且在下文另述，包括但不限于用气相色谱的生物碱分析。
本发明提供提供降低烟草植物或其植物部分中去甲烟碱水平或降低烟碱向去甲烟碱转变率的方法。所述方法包括向烟草植物基因组引入至少三种烟碱去甲基化酶基因中各至少一种等位基因内的突变，其中所述突变降低所述烟碱去甲基化酶基因的表达，且其中这些烟碱去甲基化酶基因的第一种基因编码烟草植物或其植物部分中参与烟碱向去甲烟碱代谢转变的根特异烟碱去甲基化酶。在一些实施方式中，所述根特异烟碱去甲基化酶是CYP82E10或其变体。在其他实施方式中，这些方法还包括在烟草基因组中引入编码CYP82E10或其变体的烟碱去甲基化酶基因的至少一种等位基因内突变和编码CYP82E4或其变体和/或编码CYP82E5或其变体的烟碱去甲基化酶的至少一种等位基因内突变。
许多方法用于组合一种植物中的突变，包括有性杂交。CYP82E10基因中具有抑制根烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物可与CYP82E4v2基因中具有抑制衰老叶片内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物杂交，或与CYP83E5v2基因中具有抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物杂交，产生烟碱向去甲烟碱转变降低的植物。在优选实施方式中，进行杂交以在相同植物的CYP82E10,CYP82E4v2和CYP82E5v2基因中引入有利突变。该方式中，CYP82E10基因中具有抑制根烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物与CYP82E4v2基因中具有抑制衰老叶片内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物和CYP83E5v2基因中具有抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物杂交。或者，CYP82E4v2基因中具有抑制衰老叶片内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物与CYP82E10基因中具有抑制根烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物和CYP83E5v2基因中具有抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物杂交。在另一实施方式中，CYP83E5v2基因中具有抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物与CYP82E10基因中具有抑制根烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物和CYP82E4v2基因中具有抑制衰老叶片内烟碱去甲基化酶活性的有利突变的植物杂交。通过将有利突变引入这些烟碱去甲基化酶基因的每一个，可产生烟碱向去甲烟碱的转变率降低的植物，其转变水平低于约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％。
在一个更优选的实施方式中，具有使CYP82E10多肽在位置79、107、381或419(编号对应于SEQ ID NO:2)修饰的一种或多种有利突变的植物可与具有使CYP82E4多肽在位置329、364、376、381或458修饰的一种或多种有利突变和具有使CYP82E5多肽在位置422或449修饰的一种或多种有利突变的植物杂交，产生转变水平低于约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％的植物。特别优选的烟碱向去甲烟碱的转变水平可为0.05％-0.4％、0.1-0.6％、0.1％-0.3％、0.1％-0.5％、0.1％-0.4％、0.1％-0.7％、0.1％-1.0％、0.1％-1.1％、0.1％-1.2％、0.1％-1.3％、0.1％-1.4％或0.1％-1.5％。引起CYP82E10、CYP83E4或CYP83E5在保守的血红素结合基序前截短的本发明多核苷酸的任何突变会抑制所述酶并可用于上述杂交。本领域已知细胞色素P450蛋白的结构域。参见例如Xu等.(2007)Physiologia Plantarum 129:307-319，其通过引用纳入本文。通过具有无功能或受抑制CYP82E10基因的植物与具有无功能或受抑制CYP82E4v2基因、无功能或受抑制CYP82E5v2基因、或无功能或受抑制CYP82E4v2和CYP82E5v2基因的植物杂交，烟草植物中的去甲烟碱水平可降低。
根据本发明，若CYP82E10、CYP82E4或CYP82E5烟碱去甲基化酶多肽在烟草植物或植物部分中转变烟碱为去甲烟碱中活性在统计上低于未遗传改良成抑制该烟碱去甲基化酶多肽的转变活性并用相同方案培养和收获的烟草植物或植物部分中相同烟碱去甲基化酶多肽的转变活性，则所述转变活性受到抑制。在具体实施方式中，烟碱去甲基化酶多肽在本发明改良的烟草植物或植物部分中转变烟碱为去甲烟碱的活性低于未遗传改良成抑制该烟碱去甲基化酶多肽表达并用相同方案培养和收获的烟草植物中相同烟碱去甲基化酶多肽的转变活性的95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于2％或低于1％时，所述活性受到抑制。根据本发明，烟草植物或植物部分中将烟碱转变为去甲烟碱的烟碱去甲基化酶多肽活性用本文另述的试验方法不能检测时，则所述活性被消除。用气相色谱测定烟草植物中将烟碱转变为去甲烟碱的烟碱去甲基化酶多肽活性的方法在下述实施例中公开。
在一些实施方式中，用诱变方法将有利突变导入烟草植物或植物部分，且所导入的突变用本领域技术人员已知的方法筛选，例如但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析、或表型分析。上述实施方式改变或改良的植物或植物部分在植物形成条件下生长一段时间，所述时间足以调控该植物中本发明多肽的浓度和/或活性。植物形成条件为本领域熟知并在本文他处简述。
含本文所述的烟碱去甲基化酶中有利突变的改良烟草植物具有降低水平的烟碱向去甲烟碱转变。在具体实施方式中，本发明改良的烟草植物或植物部分中烟碱向去甲烟碱的转变低于未遗传改良成抑制该烟碱去甲基化酶多肽表达并用相同方案培养和收获的烟草植物中的转变的95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、低于2％或低于1％。在一些实施方式中，改良的烟草植物是转化体烟草植物。在其他实施方式中，改良的烟草植物是非转化体烟草植物。在一些实施方式中，改良烟草植物的转变率低于市售非转化体烟草植物中观察到的比率。
根据本发明，本发明CYP82E10多肽的水平、比例、活性或分布，或者烟草植物或植物部分表型的改变，尤其是去甲烟碱和其致癌代谢物NNN的积累降低可通过比较对象植物或植物部分与用相同方案培养和/或收获的对照植物或植物部分来测量。如本文所用，对象植物或植物部分是例如通过诱变的基因改变已经影响感兴趣烟碱去甲基化酶多肽的植物或植物部分，或者是从所述改变的烟草植物或植物部分遗传下来的且含有该改变的烟草植物或植物部分。对照植物或植物部分提供测量对象植物或植物部分表型改变的参考点。表型变化的测量可在植物或植物部分中于任何时间测量，包括植物发育期间、衰老期间或固化后。在其他实施方式中，表型变化的测量可在生长于任何条件下的植物中测量，包括生长在培养室、温室或田地的植物。在一个实施方式中，表型的变化可通过测定烟碱向去甲烟碱的转变率来测量。在一个优选实施方式中，转变可通过将去甲烟碱百分比(以总组织重量的百分比计)除以烟碱和去甲烟碱百分比之和(以总组织重量的百分比计)并乘以100来测量。
根据本发明，对照植物或植物部分可包含野生型烟草植物或植物部分，即就产生对象植物或植物部分的遗传改变而言具有与起始材料相同的基因型。对照植物或植物部分还可包括与所述起始材料相同基因型的烟草植物或植物部分，但其转化有空构建体(即对感兴趣的性状没有已知影响的构建体如含选择标记基因的构建体)。在所有此类情况中，所述对象植物或植物部分和所述对照植物或植物部分用相同的方案培养和收获。
在一些实施方式中，本发明的烟碱去甲基化酶多肽活性可通过破坏编码所述烟碱去甲基化酶多肽的基因来降低或消除。本发明涵盖烟碱去甲基化酶基因中带有突变的诱变植物，其中所述突变降低烟碱去甲基化酶基因的表达或抑制本发明的编码烟碱去甲基化酶多肽的活性。
在其他实施方式中，本发明的烟碱去甲基化酶多肽活性通过破坏编码所述烟碱去甲基化酶多肽的基因来降低或消除。编码烟碱去甲基化酶多肽的基因可被本领域任何已知方法破坏，例如通过转座子标签或者随机或靶向诱变的诱变植物，并筛选烟碱去甲基化酶活性降低或者有CYP82E10突变(单独或与CYP82E4或CYP82E5中的突变组合)的植物。
转座子标签可用于降低或消除本发明的一种或多种CYP82E10烟碱去甲基化酶多肽的活性。转座子标签包括在内源烟碱去甲基化酶基因中插入转座子以降低或消除该烟碱去甲基化酶多肽的表达。
植物中特异基因的转座子标签方法为本领域熟知。参见例如,Maes等.(1999)Trends Plant Sci.4:90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Micerobiol.Lett.179:53-59；Meissner等.(2000)Plant J.22:265-274；Phogat等.(2000)J.Biosci.25:57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2:103-107；Gai等.(2000)NucleicAcids Res.28:94-9b；Fitzmaurice等.(1999)Genetics 153:1919-1928)。
减少或消除植物内源基因表达的其他方法在本领域也已知且可在本发明中相似应用。这些方法包括其他形式的诱变、用诱变或致癌化合物，包括甲基磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变、和反向遗传(用PCR)中使用的快中子缺失诱变，以鉴定缺失内源基因的植物系。这些方法的示例参见Ohshima等.(1998)Virology213:472-481；Okubara等.(1994)Genetics 137:867-874；和Quesada等.(2000)Genetics 154:421-4315；各通过引用纳入本文。此外，筛选化学诱导突变的快速和可自动化的方法TILLING(定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced LocalLesions In Genomes))也可应用于本发明，其使用变性HPLC或选择性内切核酸酶消化所选的PCR产物。参见McCallum等(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457,其通过引用纳入本文。
影响基因表达或干扰编码烟碱去甲基化酶蛋白功能的突变可用本领域熟知的方法测定。基因外显子中的插入突变通常产生无效突变体。保守残基中的突变可在抑制所述编码蛋白的代谢功能中尤其有效。已描述植物烟碱去甲基化酶多肽中适于突变的保守残基，旨在消除烟草植物或植物部分中烟碱去甲基化酶多肽将烟碱转变为去甲烟碱的活性。参见美国专利申请公开号2009/0205072A1的图1A-C，其通过引用全文纳入本文，其中与其他P450多肽不同的残基用灰色阴影显示。保守残基在各位置中未用灰色阴影显示。该突变体可根据熟知程序分离。
在本发明的其他实施方式中，显性突变体可用于引发由重复基因座的基因倒置和重组引起的RNA沉默。参见例如,Kusaba等.(2003)Plant Cell 15:1455-1467。
在本发明的另一实施方式中，本发明的组合物用于鉴定育种计划所用非转化体植物的筛选方法。在此方法中，本发明的核苷酸序列可用于筛选本文所鉴定CYP82E10基因中具有稳定突变的非转化体植物的天然种质。本发明方法鉴定的这些非转化体植物可用于发育成育种品系。
除了编码本文所述CYP82E10多肽的核苷酸序列，本发明组合物包括可用于筛选方法的CYP82E10基因中的内含子序列。不受任何作用机制约束，CYP82E10基因可代表参与烟草根中烟碱向去甲烟碱代谢转变的细胞色素P450家族中的唯一成员。对于某些应用，具有从诊断上区分细胞色素P450家族中特定成员和该家族内剩余紧密相关序列的方法会有用。例如，可能在天然存在的烟草种质中(或突变群体中)存在登录号，其中该基因天然功能异常并因此可作为永久的非转化体资源发挥作用。该功能异常的序列可包括编码SEQ ID NO:11、12或13所示多肽的那些。具体分析该基因型(如缺失突变体、重排等)的方法可作为有力的工具。本发明包括设计用于特异扩增CYP82E10外显子1和外显子2的引物，其中所述两种引物对之一对应于所述外显子之间的内含子。用于扩增CYP82E10外显子的引物示例包括SEQ ID NO:35与SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38。这些相同的引物可用于所述产物的序列分析。
由于基因的内含子区域通常没有外显子保守，预测用内含子特异探针能更好地区分CYP82E10基因的对应基因和CYP82E家族中的其他成员。使用CYP82E10内含子特异探针，和/或用于生成产物的PCR引物提供分析中的有力工具，以测定是否存在具有可能使基因失活的缺失或重排的任何天然产生或诱变的烟草植物。然后该植物可用于产生不能转变的烟草系的育种计划。
具有减少的去甲烟碱和NNN含量的烟草植物、植物部分和产物
本发明的CYP82E10多核苷酸及其变体和片段可用于本发明方法中以抑制参与植物中烟碱向去甲烟碱代谢转变的CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能。在此方法中，有利突变被引入感兴趣的CYP82E10基因。本发明方法不依赖于将有利突变引入CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的特定方法。
本发明的组合物和方法可用于降低烟草属中任何植物的去甲烟碱含量，尤其是叶片和茎中，所述植物包括但不限于下述种：尖叶烟草(acuminata)、近缘烟草(affinis)、花烟草(alata)、渐狭叶烟草(attenuate)、比格罗夫烟草(bigelovii)、克利夫兰烟草(clevelandii)、高烟草(excelsior)、福尔吉特氏烟草(forgetiana)、光烟草(glauca)、粘烟草(glutinosa)、蓝格斯多夫烟草(langsdorffii)、长花烟草(longiflora)、欧布斯特烟草(obtusifolia)、帕欧姆烟草(palmeri)、圆锥烟草(paniculata)、蓝茉莉叶烟草(plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(qudrivalvis)、残波烟草(repanda)、黄花烟草(rustica)、茄叶烟草(suaveolens)、林烟草(sylvestris)、普通烟草(tabacum)、绒毛烟草(tomentosa)、三角叶烟草(trigonophylla)和红花烟草(x sanderae)。本发明还可用任何品种的烟草属植物实施，包括但不限于，尖叶多花烟草(Nicotiana acuminata multiflora)、矮生花烟草(Nicotiana alatagrandiflora)、夸德瑞伍氏比格罗夫烟草(Nicotiana bigelovii quadrivalvis)、华莱氏比格罗夫烟草(Nicotiana bigelovii wallacei)、钝叶欧布斯特烟草(Nicotiana obtusifoliaobtusifolia)、帕欧姆欧布斯特欧烟草(Nicotiana obtusifolia plameri)、比格罗夫夸德瑞伍氏烟草(Nicotiana quadrivalvis bigelovii)、方苞夸德瑞伍氏烟草(Nicotianaquadrivalvis quadrivalvis)、华莱氏夸德瑞伍氏烟草(Nicotiana quadrivalviswallacei)、和帕欧姆三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla palmeri)以及通常称为熏烟或亮叶烟品种、白莱烟品种、深色烟品种和东方/土耳其品种的品种。在一些实施方式中，感兴趣的烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
本文所述烟草植物和品种适于常规生长和收获技术，如在富含肥料或不含肥料的土地上培养、花套袋或不套袋、或者去顶或不去顶。收获的叶和茎可用在任何传统烟草产品中，包括但不限于烟斗、雪茄烟和香烟烟草，以及任何形式的嚼烟包括叶烟、切碎烟丝(shredded tobacco)或生切烟丝(cut tobacco)。
因此本发明提供烟草植物或其植物部分，其在编码CYP82E10烟碱去甲基化酶的基因中包括突变，其中所述突变引起所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，以及去甲烟碱和N’-亚硝基降烟碱含量减少。如本文所用，术语“含量减少”或“水平降低”指去甲烟碱和/或N’-亚硝基降烟碱在本发明植物或其植物部分或烟草产品中的含量低于同品种烟草以相同方法加工(即培养和收获)的烟草属植物或植物部分或烟草产品(未经遗传改良以降低去甲烟碱和/或N’-亚硝基降烟碱)中发现的含量。去甲烟碱的含量可降低约10％-多于约90％，包括多于约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％和约80％。本发明的植物、植物部分和产物中，更具体在CYP82E10、CYP82E4v2和CYP825v2内具有突变的植物、植物部分中，烟碱向去甲烟碱的转变可低于0.3％、低于0.5％、低于0.7％、0.1％-0.5％、0.1％-0.4％、0.1％-0.7％或0.1％-1.0％。
本文所用术语“烟草产品”包括但不限于吸烟材料(如任何香烟，包括小雪茄、非通气或通气式过滤嘴香烟、雪茄、烟斗烟)、无烟产品(如鼻烟、嚼烟、生物可降解嵌入物(如树胶、锭剂、溶解条))。参见例如美国专利第2005/0019448号，该文献通过引用纳入本文。本发明还涵盖可通过组合常规烟草和不同含量的本文所述低去甲烟碱和/或N-亚硝基降烟碱而制备的一定范围的烟草产品混合物。在其他实施方式中，上述烟草属的植物或植物部分是熟烟。
在本发明的一些实施方式中，所述烟草产品降低消耗烟草产品如雪茄、香烟或烟斗烟时直接吸入或作为二次烟(即个体吸入由消耗烟草产品如雪茄、香烟或烟斗烟的某一个体生成的烟草烟)吸入的烟草烟的致癌可能。本文所述熟烟可用于制备烟草产品，尤其是经历热引起的化学变化的烟草产品，在直接吸入或作为二次烟吸入的烟流中包含低量的去甲烟碱和/或N-亚硝基降烟碱。在相同的方法中，本发明的烟草产品可用于制备无烟产品如嚼烟、鼻烟等。
因此源自本发明烟草植物的烟草产品可用于降低这些烟草产品的致癌可能和降低人类与致癌亚硝胺NNN接触的方法，尤其是对于这些烟草产品的使用者个体。通过说明的方式、而非限制性方式提供以下实施例。
实验
下述讨论中涉及的引用在实验部分末端提供。
背景
关于转化体植物中CYP82E4v2代表负责高去甲烟碱积累的烟碱去甲基化酶基因座的知识(Siminszky等.,2005)为克服转变问题和降低衰老、固化叶片中去甲烟碱含量的非转基因以及转基因方法打开了大门。具体地，研究人员可生成暴露于化学诱变剂的烟草群体并选择在CYP82E4v2基因座具有非功能性等位基因的个体。事实上，基于该策略已生成非转化烟草系的三种独立组(Dewey等.,2007；Xu等.,2007b；Julio等.,2008)。
如前报道，从白莱烟系DH98-325-6的EMS诱变群中鉴定到称为775的烟草植物，显示其在CYP82E4v2基因中具有敲除突变(Dewey等.,2007)。2008年夏季，北卡莱罗州洛矶山城的上滨海平原(Upper Coastal Plains)研究站培养了775突变的植物纯合子，并根据标准行业惯例风干。这些材料的生物碱分析用Jack等.(2007)所述的"LC方案"进行。如表1所示，具有775突变的植物平均含有2.6％的烟碱向去甲烟碱转变。相反，强转化体基因型即亲本DH98-325-6中观察到>60％的转变。Julio等.(2008)最近报道了相同的结果，其报道强转化体白莱烟基因型BB16NN中cyp82e4v2敲除突变的植物纯合子的转变百分比为2.82-3.37(亲本转变率为68-98％)。因此，减弱单独CYP82E4v2中的突变似乎对消除与生成转化植物相关的不稳定遗传现象所引起问题有效。
尽管利用CYP82E4v2中具有775或类似突变的烟草植物可以是消除烟草群内转化体植物引入的有效方法，但这些植物中剩余有少量但显著的去甲烟碱。鉴于在表达针对CYP82E4v2的以RNAi为基础构建体的转基因植物中观察到烟碱向去甲烟碱转变率低至0.45％(Lewis等.,2008)，显然至少有一种具有与CYP82E4v2高度DNA序列同源性的其他基因负责主要的烟碱合成，这在具有失活CYP82E4v2基因的非转化体植物和转化体植物中观察到。这种可能性进一步由以下发现支持：一种与CYP82E4v2共有92.7％DNA序列相同性的基因CYP82E5v2也编码功能性烟碱去甲基化酶(Dewey等.,2007；Gavilano和Siminszky,2007)。CYP82E5v2烟碱去甲基化酶基因在转化和非转化植物的烟草绿叶中低水平表达，相反，CYP82E4v2高水平表达，但仅在转化植物衰老和风干的叶片中。
如Dewey等.(2007)所概括，筛选EMS-诱变的DH98-325-6烟草群鉴定到CYP82E5v2中具有敲除突变的个体(植物1013)。为了确定非功能性cyp82e5v2等位基因对去甲烟碱积累的影响，进行组合植物775和1013突变的杂交。初始杂交的F1后代所衍生大量F2个体的分子基因分型鉴定到两种突变均为纯合(e4e4/e5e5)的9种个体。该9种植物也包括在2008年的田间试验中。尽管已显示CYP82E5v2编码功能性烟碱去甲基化酶(Dewey等.,2007；Gavilano和Siminszky,2007)，组合功能异常的cyp82e5v2突变和敲除的cyp82e4v2突变对叶片去甲烟碱水平具有非常小的影响。如表1所示，双突变(e4e4/e5e5)的植物纯合子平均有2.3％的烟碱转变，相比之下仅具有cyp82e4v2突变(e4e4)的植物中转变平均为2.6％。两种基因型之间平均转变的适度差异在统计学上不显著(P＝0.118)。相反，本研究所包括CYP82E4v2RNAi-沉默的转基因系之一的转变平均为0.7％，显著低于(P<0.001)获自e4e4或e4e4/e5e5基因型的转变。因此，与CYP82E4v2高度同源的另一基因必须存在于烟草基因组中，其有助于植物中的去甲烟碱生产。
实施例1：cyp82e10烟碱去甲基化酶基因的分离和表征
为了鉴定烟草基因组中具有编码烟碱去甲基化酶可能的其他基因，用BLASTN和BLASTX算法(Altschul等.,1990,1997)的同源搜索指向基因库(GenBank)中普通烟草表达序列标签(EST)数据库，使用CYP82E4v2的DNA和蛋白序列作为分别的查询序列。除了鉴定对应于先前表征的CYP82E超家族成员(如CYP82E2、CYP82E3和CYP82E5v2)的cDNA序列，发现与先前表征的该基因家族成员比对不完全的7种EST。有趣的是，所有7种EST源自根特异cDNA库或由包括根的混合组织构成的cDNA库。该发现表明新CYP82E基因在根组织中特异表达，该性质能解释为什么CYP82E P450超家族的该特定成员先前能逃避检测，因为先前主要关注叶片组织中表达的CYP82E基因表征。由于没有个体EST序列长至足以覆盖该新基因的完整编码区域，设计能从烟草根组织的RNA生成的第一链cDNA扩增完整cDNA序列的PCR引物。此外，引物用于扩增包括中央大内含子的基因的相应基因组区域。该新CYP82E cDNA与烟草CYP82E4v2 cDNA共有92.4％的核苷酸相同性，且预测氨基酸水平有91.1％的相同性。遵循P450基因命名法指南，该新基因称为CYP82E10。CYP82E超家族的已表征成员中，CYP82E10显示出与CYP82E5v2最高的序列相似性，cDNA水平共有96.5％的核苷酸相同性且预测氨基酸序列相同性为95.7％。CYP82E10的DNA序列和其预测蛋白序列示于图1。
尽管各种CYP82E家族成员的cDNA倾向于高度保守，但这些基因的基因组形式显示出更高的序列多样性。这主要是由于大中央内含子中观察到的显著序列差异。CYP82E4v2、CYP82E5v2和CYP82E10基因组序列的比对示于图2。如用EMBOSS逐对比对算法(www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html)所计算，存在于所述烟草基因组内时，CYP82E4v2和CYP82E10基因共有78.3％核苷酸相同性，且CYP82E10与CYP82E5v2基因有84.9％的相同性(CYP82E4v2和CYP82E5v2的基因组序列共有75％相同性)。
如数篇发表物所详述，烟草基因组中发现的CYP82E超家族的大多数基因不编码功能性烟碱去甲基化酶(Siminszky等.,2005；Chakrabarti等.,2007；Dewey等.,2007；Gavilano等.,2007；Xu等.,2007a)。因此，单独序列同源不能精确指示CYP82E家族的基因功能。反而，转基因植物中(Siminszky等.,2005)或酵母中(Gavilano和Siminszky,2007；Xu等.,2007a)的表达分析已成为测定该基因家族的个体成员是否编码烟碱去甲基化酶活性的确立方法。
为了测定CYP82E10是否作为烟碱去甲基化酶基因行使功能，将其cDNA克隆到酵母表达载体pYeDP60并转化到酵母株系W(R)中。株系W(R)是工程改造以过表达作为P450直接电子供体的酵母NADPH-依赖性P450还原酶的酵母细胞系；该系统大大提高酵母中表达的外源P450酶活性的检测(Pompon等.,1995)。烟碱去甲基化酶试验通过用[14C]-烟碱孵育酵母微粒体膜制剂，并如Siminszky等.(2005)所述用薄层色谱解析所述产物。
如图3所示，用来自仅表达pYeDP60载体的W(R)株系的酵母微粒体无法检测到烟碱去甲基化酶活性。相反，源自表达CYP82E10 cDNA的酵母细胞的微粒体能测量到非常强的烟碱去甲基化酶活性。通过在大范围的[14C]-烟碱浓度中测量CYP82E10酶活性，用微粒体试验建立底物饱和曲线并计算3.9μM烟碱的表观Km。在酵母中相似表达时，CYP82E10的该动力学参数与就CYP82E4v2和CYP82E5v2酶报道的Km非常相似(Gavilano等.,2007；Gavilano和Siminszky,2007；Xu等.,2007a)。
实施例2：鉴定具有CYP82E10突变等位基因的植物
为了精确评估CYP82E10对烟草植物中总去甲烟碱含量的具体作用，需要：(1)鉴定该基因内具有敲除突变的烟草植物；和(2)将该突变与源自植物775和1013的cyp82e4v2和cyp82e5v2突变分别组合。为了鉴定CYP82E10中可能的减弱突变，通过高通量DNA序列分析筛选EMS-突变的DH98-325-6群体，使用特异扩增CYP82E10部分的引物(而不同时扩增CYP82E超家族的其他成员)。为了特异扩增CYP82E10的外显子1，使用下述PCR引物:5'-GTGATAGTTTGATTCCCAAGTGC-3'(正向)和5'-CTCCCAAAGTTAGATTAGTCCG-3'(反向)；特异扩增外显子2用下述引物实现5'-AGGTCGCGCTGATTCTTG-3'(正向)和5'-AGATGAATACCCATCTATCTAGGAGT-3'(反向)。为了确保最大特异性，外显子1的反向引物和外显子2的正向引物对应于CYP82E10内含子中的序列(图1)。诱变植物的PCR扩增和序列分析用Dewey等.(2007)所述的96孔形式进行。
诱变烟草群体中超过1,200个体的高通量序列分析鉴定到CYP82E10中具有突变的15个体。这些中最值得注意的个体见表2。这些植物中突变的核苷酸和氨基酸残基还在图1中突出显示。尽管这些个体中没有观察到截短突变，但在数个示例中，鉴定到改变所述酶的高度保守区域内氨基酸残基的突变。为了测定具体突变对CYP82E10酶活性的影响，使用定点诱变将对应于表2所示9种突变中7种的特定突变引入pYeDP60酵母表达载体内的CYP82E10 cDNA中。用非饱和(2.45μM)和饱和(50μM)浓度的[14C]-烟碱就烟碱去甲基化酶活性体外分析表达7种CYP82E10变体中每一个的酵母株系的微粒体制剂。酵母表达试验的结果显示植物693、817和1035中发现的突变不改变酶活性，而植物1041、1512和2476中发现的突变导致酶完全失活。植物1442中观察到的突变导致活性比野生型CYP82E10酶下降75％。
对应于植物1041突变的体外酵母表达试验的薄层色谱数据示于图3。选择该具体突变用于更广泛的研究。为了提供其他证据显示定义植物1041突变的氨基酸位置381处Pro替换为Ser与烟碱去甲基化功能不一致，将所述同一突变引入pYeDP60载体内相似克隆的CYP82E10 cDNA中。这些酵母试验的结果示于表3。不论引入CYP82E10或CYP82E4v2酶，位置381处Ser取代Pro导致该试验中烟碱去甲基化酶活性的完全消除。有趣的是，尽管野生型CYP82E10和CYP82E4v2酶的活性在非饱和[14C]-烟碱浓度(2.45μM)时相当，但在25μM底物水平，具有CYP82E10酶的微粒体制剂中[14C]-去甲烟碱合成率几乎是含CYP82E4v2制剂的3倍。
表2.CYP82E10基因中具有突变的DH98-325-6的EMS处理系
植物编号 突变a 氨基酸变化 突变酶活性b
2476 G235A G79S 未测得
1512 C319T P107S 未测得
319 C442T L148F 未测试
634 G514A G172R 未测试
1035 G1030A A344T 100％
1041 C1141T P381S 未测得
817 G1228A A410T 100％
693 G1250A R417H 100％
1442 C1255T P419S 25％
a参考CYP82E10 cDNA序列的起始密码子。
b相对于酵母中表达的野生型酶。
表3.具有1041突变(Pro381Ser)的CYP82E4v2和CYP82E10酶的烟碱去甲基化酶活性
a[14C]-去甲烟碱/毫克微粒体蛋白的每分钟计数。
b两种技术重复的标准差。
还在体内分析表达野生型和1041突变体CYP82E10的酵母细胞的烟碱去甲基化酶活性。酵母培养物在55μM[14C]-烟碱存在下振荡过夜，用甲醇提取并通过薄层色谱分析。可在表达野生型CYP82E10的酵母提取物中检测到[14C]-去甲烟碱，但在该基因的1041突变形式中没有测得(数据未显示)。综上所述，酵母表达试验明显表明CYP82E10酶功能通过引入该1041突变被完全消除。
实施例3：组合cyp82e10、cyp82e4v2和cyp82e5v2的突变等位基因。
鉴于原始1041突变是在含强转化体CYP82E4v2等位基因以及野生型CYP82E5v2基因的遗传背景(DH98-325-6)中，精确评估CYP82E10对总植物去甲烟碱含量的具体作用的唯一方法是将1041突变引入具有敲除CYP82E4v2以及CYP82E5v2突变的烟草植物中。为此，1041突变(e10E10)的植物杂合子与上述775和1013突变(e4E4/e5E5)的植物杂合子进行杂交。后一种植物代表杂交775/1013//TN90/3/TN90/4/TN90的后代。所有三种烟碱去甲基化酶突变(e4E4/e5E5/e10E10)的F1植物杂合子通过分子基因分型鉴定，并能自花授粉。分子基因分型还用于在超出400个F2后代中筛选，并随后将其归入下述基因型分类：E4E4/E5E5/e10e10(共3种植物)；e4e4/E5E5/e10e10(共4种植物)；E4E4/e5e5/e10e10(共5种植物)；和e4e4/e5e5/e10e10(共5种植物)。
上述所有植物在2009年夏季移植并生长在北卡莱罗州洛矶山城的上滨海平原的田地中。本研究还包括表1所示2008年田间试验中测试的两种基因型。具体地，仅cyp82e4v2突变(e4e4/E5E5/E10E10)的10种DH98-325-6植物纯合子和具有双纯合e4e4/e5e5/E10E10基因型的11种DH98-325-6植物包括在内用于比较。作为对照，随机选自市售“低转化体”种子批(TN90LC)、野生型DH98-325-6个体，和来自最佳CYP82E4v2RNAi抑制转基因系之一的植物的个体植物也包括在本研究中。所述植物长至约平均30cm高后(移植35天后)，收集相似茎位置的叶片，根据Jack等.(2007)建立的方案用乙烯利处理并风干。固化的叶片材料中生物碱含量如同一方案所述用气相色谱测定。
表4和图4显示2009年田间试验的生物碱分析结果。与先前观察一致，单独cyp82e4v2敲除突变消除DH98-325-6系的强转化体表型，且其赋予的去甲烟碱积累表型也比来自市售TN90LC种子的植物显著更低(分别为2.2％转变与7.1％转变)。如2008年田间试验所观察(表1)，组合cyp82e5v2突变和cyp82e4v2没有导致进一步的去甲烟碱含量降低。事实上，e4e4/E5E5/E10E10植物的平均烟碱转变实际低于e4e4/e5e5/E10E10个体中观察到的(2.2％与2.3％)，尽管该略微差异并非统计上显著。如预期，cyp82e10突变单独(E4E4/E5E5/e10e10基因型)或与突变cyp82e5v2等位基因(E4E4/e5e5/e10e10基因型)组合时，其对活性CYP82E4v2基因赋予的高去甲烟碱水平没有影响(图4A)。与cyp82e4v2和cyp82e5v2双突变体结果(表1和4)类似，将cyp82e10引入cyp82e4v2背景未能有效降低去甲烟碱水平至小于单独cyp82e4v2突变可实现的水平(图4B)。e4e4/E5E5/e10e10基因型的转变平均为1.85％，其与e4e4/E5E5/E10E10个体中观察到的平均2.2％转变水平没有显著差异(P＝0.235)。
尽管cyp82e5v2和cyp82e10突变单独组合时不显著降低cyp82e4v2植物的去甲烟碱含量，但逐渐增加所有三种烟碱去甲化基酶突变具有非常显著的效果。三重突变植物(e4e4/e5e5/e10e10)中烟碱向去甲烟碱转变平均仅为0.55％，该百分比实际上与RNAi抑制的转基因系中观察到的0.54％相同(P＝0.893；图4B)。这表明烟碱转变的降低超过单独cyp82e4v2突变介导的3倍以上。统计学上，e4e4/E5E5/E10E10和e4e4/e5e5/e10e10基因型之间烟碱转变百分比(和去甲烟碱积累占总干重的百分比)的差异具有高度显著性(P<0.0001)。与RNAi介导的烟碱转变抑制的研究(Lewis等.,2008)类似，当前烟草植物中烟碱去甲基化酶活性的非转基因改变似乎没有显著改变少数生物碱种类安纳巴松和安那他品的含量。
逐渐增加所述三种独立烟碱去甲基化酶基因突变的效果也在2010年生长季节期间进行田间试验测试。对于该研究，在DH98-325-6基因背景内进行完整杂交(与还使用TN90亲本的2009年研究相反)。再使用分子基因分型产生测定各CYP82E基因座分别对去甲烟碱表型的影响所需的每种可能组合。收集生长至成熟并根据标准行业惯例固化的烟草植物的生物碱数据。如表5所述，在野生型CYP82E4v2基因纯合的所有基因型(基因型E4E4/E5E5/E10E10、E4E4/e5e5/E10E10、E4E4/E5E5/e10e10和E4E4/e5e5/e10e10)中观察到高水平的烟碱转变(范围52.4–65.59％)。仅cyp82e4v2突变的植物纯合子(e4e4/E5E5/E10E10)的烟碱向去甲烟碱转变平均为2.91％。与2009年结果相似，cyp82e5v2和cyp82E10突变的效应没有加和，且仅在所有三种突变基因座一起逐渐增加时明显。DH98-325-6(e4e4/E5E5/e10e10)植物的转变平均为2.89％且DH98-325-6(e4e4/e5e5/E10E10)个体的转变平均为2.52％，这些数值与单独cyp82e4v2突变所观察到的相比没有统计学上差异。相反，三重突变DH98-325-6(e4e4/e5e5/e10e10)基因型(1.11％烟碱转变)中观察到的去甲烟碱降低比通过单独cyp82e4v2突变得到的低2.6倍。三重突变组合引起的去甲烟碱转变降低与单独cyp82e4v2或任何双重突变组合相比具有高度显著性(P<0.001)。
结论
通过本发现和新烟碱去甲基化酶基因CYP82E10的表征，可能开发出用于将市售级别风干烟植物的烟碱转变率(及因此的去甲烟碱水平)降低到先前仅用转基因方法可能实现的水平的策略。该基于非GMO的技术可将去甲烟碱的水平降低到与用转基因策略实现的水平相似的程度，而且提供绕过商业化转基因作物相关的主要障碍而作为开发超低去甲烟碱烟草品种的方法的极大优点，所述障碍例如：(1)谈判并支付生成转基因植物需要的数种使能技术的许可费用；(2)避免转基因事件去调节相关的冗长时间和大量成本；和(3)面对最终用户伦理学上反对GMO带来的拒绝产品的可能性。本文报道的发现表明与前述仅靶向CYP82E4v2烟碱去甲基化酶基因中突变的非GMO策略相比(Julio等.,2008；Xu等.,2007b)或组合的CYP82E4v2和CYP82E5v2突变(Dewey等.,2007)相比，我们在降低烟草产品中发现的最充分记载强致癌物之一的水平的能力上有显著的进步。使用转基因技术，先前证明将固化叶片中烟碱转变水平从约2.6％降低到约0.5％使叶片中的NNN含量也同等降低(Lewis等,2008)。可以预见本报道所述的含三重突变组合(e4e4/e5e5/e10e10)的烟草叶片中NNN含量发生相似降低。尽管初始靶向风干烟草，本技术也对烟熏烟品种有益。随着热交换器老化，其在烟熏期间移除NOx气体的能力下降。此外，近期的研究显示固化叶片储存期间可能形成相当量的TSNA。通过在烟熏烟品种中引入三重突变组合而使去甲烟碱水平最小化可作为储存期间针对NNN形成的保障或固化过程中低效率热交换的结果。
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通过以上描述和相关图所示内容，本发明相关领域技术人员可以想到本发明的许多改良和其它的实施方式。因此，应当理解本发明不仅限于所公开的具体实施方式，所述改良和其它实施方式也包括在所列实施方式和所附权利要求书的范围之内。尽管在本发明中使用了具体的术语，但是这些术语仅以通用和描述性意义使用，而不用于对本发明构成限制。
本说明书中涉及的所有出版物和专利申请指示本发明涉及领域技术人员的水平。所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物或专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。

Claims (47)

1.一种获得烟草产品的方法，所述方法包括：
(a)获得烟草植物或其植物部分制备的烟草产品，所述烟草植物或其植物部分包含编码CYP82E10烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变导致所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的表达或功能降低；和
(b)从所述烟草植物或其植物部分中制备烟草产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶选自SEQ ID NO:2、5、6、7、8和9所示序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变使所述CYP82E10烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基79、107、381、419和其任何组合的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:2。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述修饰选自下组：
a)用丝氨酸替换位置79的甘氨酸残基；
b)用丝氨酸替换位置107的脯氨酸残基；
c)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
d)用丝氨酸替换位置419的脯氨酸残基；和
e)其任意组合。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分还包含编码CYP82E4烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变导致所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19和20所示序列。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述突变使所述CYP82E4烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基329、364、376、381和458的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:14。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述修饰选自下组：
a)用终止密码子替换位置329的色氨酸残基；
b)用天冬酰胺替换位置364的赖氨酸残基；
c)用甲硫氨酸替换位置376的缬氨酸残基；
d)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
d)用丝氨酸替换位置458的脯氨酸残基；和
e)其任意组合。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
11.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分还包含编码CYP82E5烟碱去甲基化酶基因的突变，其中所述突变导致所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的表达或功能降低。
12.如权利要求11所述的烟草方法，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31和32所示序列。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述突变使所述CYP82E5烟碱去甲基化酶在选自氨基酸残基422和449的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:26。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述修饰选自下组：
a)用终止密码子替换位置422的色氨酸残基；
b)用亮氨酸替换位置449的脯氨酸残基；和
c)其任意组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分在所述CYP82E10烟碱去甲基化酶基因中含有所述突变，在所述CYP82E4烟碱去甲基化酶基因中含有所述突变，和在所述CYP82E5烟碱去甲基化酶基因中含有所述突变。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶在位置381含修饰、所述CYP82E4烟碱去甲基化酶在位置329含修饰，且所述CYP82E5烟碱去甲基化酶在位置422含修饰，其中所述编号的依据分别是SEQ ID NO:2、14和26。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述修饰选自下组：
a)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
b)用终止密码子替换位置329的色氨酸残基；
c)用终止密码子替换位置422的色氨酸残基；和
d)其任意组合。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分中烟碱向去甲烟碱的转变低于1.5％。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分中烟碱向去甲烟碱的转变不高于0.5％。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
22.如权利要求16所述的方法，其中：
a)所述CYP82E10烟碱去甲基化酶中的所述突变引起在所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的选自氨基酸残基79、107、381和419或其任意组合的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:2；
b)所述CYP82E4烟碱去甲基化酶中的所述突变引起在所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的选自氨基酸残基329、364、376、381和458或其任意组合的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:14；和
c)所述CYP82E5烟碱去甲基化酶中的所述突变引起在所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的选自氨基酸残基422和449或其任意组合的位置处发生修饰，其中所述编号的依据是SEQ ID NO:26。
23.如权利要求22所述的方法，其中：
a)所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的所述修饰选自下组：
i)用丝氨酸替换位置79的甘氨酸残基；
ii)用丝氨酸替换位置107的脯氨酸残基；
iii)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
iv)用丝氨酸替换位置419的脯氨酸残基；和
v)其任意组合；
b)所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的所述修饰选自下组：
i)用终止密码子替换位置329的色氨酸残基；
ii)用天冬氨酸替换位置364的赖氨酸残基；
iii)用甲硫氨酸替换位置376的缬氨酸残基；
iv)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
v)用丝氨酸替换位置458的脯氨酸残基；和
vi)其任意组合；和
c)所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的所述修饰选自下组：
i)用终止密码子替换位置422的色氨酸残基；
ii)用亮氨酸替换位置449的脯氨酸残基；和
v)其任意组合。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述烟草植物或其植物部分对所述突变为纯合。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
26.如权利要求6所述的方法，其中所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
27.如权利要求11所述的方法，其中所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
28.如权利要求16所述的方法，其中所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述烟草植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
30.一种降低烟草产品致癌可能的方法，所述方法包括从如权利要求16所述烟草植物或其植物部分制备所述烟草产品，其中
a)所述CYP82E10烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:2的79、107、381或419或其任意组合的位置处的氨基酸残基；
b)所述CYP82E4烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:14的329、364、376、381或458或其任意组合的位置处的氨基酸残基；和
c)所述CYP82E5烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:26的422或449或其任意组合的位置处的氨基酸残基。
31.一种降低烟草植物或其植物部分中去甲烟碱水平或降低烟碱向去甲烟碱转变率的方法，所述方法包括向所述植物基因组引入至少三种编码烟碱去甲基化酶的基因中各至少一种等位基因内的突变，其中所述突变降低所述烟碱去甲基化酶的表达或功能，且其中所述烟碱去甲基化酶基因的第一种基因编码CYP82E10烟碱去甲基化酶，所述烟碱去甲基化酶基因的第二种基因编码CYP82E4烟碱去甲基化酶，所述烟碱去甲基化酶基因的第三种基因编码CYP82E5烟碱去甲基化酶，其中
a)所述CYP82E10烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E10烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:2的79、107、381或419或其任意组合的位置处的氨基酸残基；
b)所述CYP82E4烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E4烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:14的329、364、376、381或458或其任意组合的位置处的氨基酸残基；和
c)所述CYP82E5烟碱去甲基化酶中的所述突变引起所述CYP82E5烟碱去甲基化酶的氨基酸序列的修饰，所述修饰发生于对应SEQ ID NO:26的422或449或其任意组合的位置处的氨基酸残基。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9或10所示的氨基酸序列。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述CYP82E10烟碱去甲基化酶氨基酸序列的所述修饰选自下组：
i)用丝氨酸替换位置79的甘氨酸残基；
ii)用丝氨酸替换位置107的脯氨酸残基；
iii)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
iv)用丝氨酸替换位置419的脯氨酸残基；和
v)其任意组合。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶包含SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20或21所示的氨基酸序列。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述CYP82E4烟碱去甲基化酶氨基酸序列的所述修饰选自下组：
i)用终止密码子替换位置329的色氨酸残基；
ii)用天冬氨酸替换位置364的赖氨酸残基；
iii)用甲硫氨酸替换位置376的缬氨酸残基；
iv)用丝氨酸替换位置381的脯氨酸残基；
v)用丝氨酸替换位置458的脯氨酸残基；和
vi)其任意组合。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶包含SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31或32所示的氨基酸序列。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶氨基酸序列的所述修饰选自下组：
i)用终止密码子替换位置422的色氨酸残基；
ii)用亮氨酸替换位置449的脯氨酸残基；和
v)其任意组合。
38.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述植物或其植物部分对所述突变为纯合。
39.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述引入包括育种方案。
40.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述植物是白莱烟、弗吉尼亚烟、烟熏烟、风干烟、烤烟、东方烟或深色烟植物。
41.一种鉴定具有低水平去甲烟碱的烟草植物的方法，所述方法包括从感兴趣的烟草植物中筛选SEQ ID NO:1或3内存在突变的DNA样品，其中所述突变导致所述烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，且其中所述筛选用选自SEQ IDNO:1、3、35、36、37和38的序列进行。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述烟草植物是非转化体。
43.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据是否存在SEQ ID NO:14的编码基因中的突变、是否存在SEQ ID NO:26的编码基因中的突变或是否存在SEQ ID NO:14的编码基因和SEQ ID NO:26的编码基因中的突变来从所述感兴趣的烟草植物中筛选所述DNA样品或另一DNA样品。
44.一种含选自下组的核苷酸序列的分离多核苷酸:
a)SEQ ID NO:1、3、或4所示的核苷酸序列；
b)编码选自SEQ ID NO:2和5-13的多肽；和
c)与前述条目(a)或(b)所述的序列互补的核苷酸序列。
45.一种由SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的氨基酸序列组成的分离多肽。
46.一种获得烟草产品的方法，所述方法包括：
(a)获得烟草植物或其植物部分，所述烟草植物或其植物部分对编码CYP82E10烟碱去甲基化酶的基因、编码CYP82E4烟碱去甲基化酶的基因和编码CYP82E5烟碱去甲基化酶的基因中的突变为纯合，其中所述CYP82E10烟碱去甲基化酶由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成，所述CYP82E5烟碱去甲基化酶由SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列组成，其中所述突变引起所述CYP82E10、CYP82E4和CYP82E5烟碱去甲基化酶的表达和功能下降，其中所述CYP82E10烟碱去甲基化酶基因中的所述突变引起氨基酸残基381的修饰，所述CYP82E4烟碱去甲基化酶基因中的所述突变引起氨基酸残基329的修饰且所述CYP82E5烟碱去甲基化酶基因中的所述突变引起氨基酸残基422的修饰；和
(b)从所述烟草植物或其植物部分制备烟草产品。
47.一种获得烟草产品的方法，所述方法包括：
(a)获得烟草植物或其植物部分制备的烟草产品，所述烟草植物或其植物部分包含CYP82E10基因中抑制根内烟碱去甲基化酶活性的突变、CYP82E4v2基因中抑制衰老叶内烟碱去甲基化酶活性的突变和CYP82E5v2基因中抑制绿叶内烟碱去甲基化酶活性的突变；和
(b)从所述烟草植物或其植物部分制备烟草产品。
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