WO2020161306A1 - Obtention de plantes ayant une digestibilite de la biomasse amelioree - Google Patents

Obtention de plantes ayant une digestibilite de la biomasse amelioree Download PDF

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WO2020161306A1
WO2020161306A1 PCT/EP2020/053140 EP2020053140W WO2020161306A1 WO 2020161306 A1 WO2020161306 A1 WO 2020161306A1 EP 2020053140 W EP2020053140 W EP 2020053140W WO 2020161306 A1 WO2020161306 A1 WO 2020161306A1
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protein
plant
plants
tps7
expression
Prior art date
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PCT/EP2020/053140
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Christine HORLOW
Marie-Hélène DURAND-TARDIF
Gregory MOUILLE
Peter Rogowsky
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Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the field of the production of plant biomass.
  • It relates more particularly to the preparation of plants which have a biomass exhibiting better digestibility (a property also referred to as degradability) and which retain satisfactory growth.
  • Fossil fuels such as petroleum, coal and gas are still the main source of energy in any sector.
  • oil is still largely predominant.
  • these hydrocarbons are very polluting for the environment, in particular in that they release a lot of CO2 during their combustion, a carbon stock which was previously buried.
  • deposits are becoming increasingly rare and extraction is becoming more and more expensive (https: //www.planete- energies.com/fr/medias/decryptages/les-energies-fossiles).
  • Biofuels could be part of the answer to the depletion of oil reserves.
  • the first generation biofuels are made from simple sugars and oils present in plants, which are transformed into ethanol and bio-ester.
  • Second generation biofuels (Sims et al., 2010) are produced from lignocellulosic biomass; this biomass is made up of all the cell walls of plants. The advantage of these second generation biofuels is that their production does not compete with human food.
  • the lignocellulosic biomass used for second generation bio-fuels can be extracted from crop residues such as those from corn.
  • tissue are richer than others in lignocellulosic biomass. This is the case in particular with xylem tissues, which are essentially composed of vessels which conduct raw sap and fibers.
  • the xylem is a carbon sink; the simple sugars resulting from photosynthesis are stored there in the form of bio-polymers constituting the wall.
  • Plant polymers are complex and linked together which makes their accessibility for digestion by animals or for their use in the chemical industry laborious and relatively polluting.
  • lignocellulosic biomass is a process which requires a first pretreatment step aimed at “breaking” the cellulose / hemicellulose / lignin matrix which forms the structure of the lignified secondary walls which consist of a complex tangle. of cellulose fibrils imbricated in a matrix of lignin and hemicellulose. This dense mesh can therefore hinder the access of digestive enzymes to polysaccharides of interest such as cellulose, a hexose polymer or hemicelluloses, such as xylan, a polymer of pentoses.
  • this mutant is characterized in particular by a dwarf phenotype and the plants carrying the eskl mutation ultimately produce very little biomass, which considerably limits their interest in production whether intended for food. animal or biofuel production.
  • the inventors have now identified a new mutation which, associated with the mutation of the eskl gene, leads to a line retaining a low level of xylan acetylation and having improved biomass production (suppression of the dwarf phenotype).
  • tps7 gene as a gene responsible for suppressing the dwarfism phenotype in eskl mutants. They then demonstrated that Arabidopsis thaliana plants carrying mutations in the eskl and tps7 genes exhibited improved biomass digestibility compared to wild Arabidopsis thaliana plants. In addition, they also demonstrated that the triple mutant Arabidopsis thaliana plants eskl, tps7 and kak and the triple mutant Arabidopsis thaliana plants eskl, tps7 and tps6 also exhibit better biomass digestibility compared to plants of d. "Wild Arabidopsis thaliana.
  • trehalose-6-phosphate (T6P) a precursor of trehalose, is produced from glucose-UDP and glucose-9-phosphate, thanks to the enzyme TPS.
  • T6P is then metabolized to trehalose by the enzyme TPP (Lunn et al., 2014, O'Hara et al., 2013; Vandesteene et al., 2012).
  • the tps7 gene which codes for a trehalose-6-phosphate synthase 7 (TPS7) belongs to class 2 of the putative genes for the biosynthesis of trehalose.
  • the present invention relates to a plant obtained by mutagenesis such as:
  • the non-mutagenized ESK1 protein has at least 50% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and comprising the acyl esterase and transmembrane domains, and
  • the non-mutagenized TPS7 protein has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 2 and comprising the TPS and TPP domains.
  • sequence SEQ ID NO: 2 comprising the sequence SEQ ID NO: 2 and comprising the TPS and TPP domains.
  • Those skilled in the art know the procedure to follow in order to obtain the best ortholog in a species of interest, and this via the “PLAZA” tool described in example 2, via the “PANTHER” tool (Mi and al., 2017), described below or via phylogenetic analyzes, such as those carried out by Paul et al., 2018.
  • the first step in using the "PANTHER” tool is to enter the identity of the gene (gene ID) on the TAIR website (http://www.arabidopsis.org).
  • the second step is to select on the PANTHER site (http://www.pantherdb.org/) “gene and orthologs”, then enter the gene ID and press “search”.
  • the “least ortholog divergent” LODs must be chosen; they correspond to the best orthologs for a given protein.
  • the non-mutagenized ESK1 protein as defined in the present invention has at least 50% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and in increasing order of preference at least 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity.
  • the non-mutagenized TPS7 protein as defined in the present invention has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 2 and in increasing order of preference at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity.
  • the present invention is applicable to all monocotyledonous or dicotyledonous plants. Without limitation, it can be applied to cereal plants, ornamental plants, fruit trees and non-fruit trees.
  • the best ortholog for each of the ESK1 and TPS7 proteins in the plants of interest listed above is found via the PLAZA tool or via the PANTHER tool.
  • the best orthologs for the ESK1 and TPS7 proteins in corn are: ZmESK1 (ZmOOOO 1 d028751) and ZmTRPS7 (Zm00001d043469).
  • the plant according to the invention may be a dicotyledon such as Arabidopsis thaliana, poplar (Populus trichocarpa) or grapevine (Vais vinifera).
  • the plant according to the invention is a monocotyledon such as wheat, corn (Zea mays), sorghum (Sorghum bicolor) or rice (Oryza sativa), even more preferably corn.
  • ESK1 also called TBL29, whose expression and / or activity is reduced in the plant according to the invention is defined with reference to the ESK1 protein of Arabidopsis thaliana of SEQ ID NO: 1; in fact, depending on the plant species considered, a person skilled in the art is able to identify the ortholog of the protein designated ESK1 which has: - an acyl-esterase domain, necessary for their enzymatic activity (Anantharaman et al., 2010 and Gille et al., 2012), comprising the conserved motif GDSL of sequence SEQ ID NO: 4 and the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 5, located at positions corresponding respectively to positions 214-217 and 462-465 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1, and
  • transmembrane domain an Ntb transmembrane domain, allowing anchoring to the internal membrane of the Golgi apparatus, the probable site of xylan acetylation (Gille et al., 2012 and Yuan et al., 2013).
  • the presence of the transmembrane domain is identified using the TMHMM bioinformatics tool, which is software for predicting the structure of membrane proteins.
  • the conserved GDSL motif signifies the linking of the amino acids glycine, aspartate, serine and leucine.
  • conserved domain or motif is understood to mean a chain of amino acids found identically in the orthologous proteins.
  • the ESK1 protein can be further defined by 3 additional conserved patterns of sequences:
  • SEQ ID NO: 6 located at positions corresponding to positions 211-224 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1 and which comprises the conserved motif GDSL, of sequence SEQ ID NO: 4,
  • RKD located at positions corresponding to positions 433-435 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 7 located at positions corresponding to positions 461- 470 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1 and which comprises the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 5.
  • the conserved motif RKD stands for the chain of the amino acids arginine, lysine and aspartate.
  • the ESK1 proteins come from Arabidopsis thaliana of sequence SEQ ID NO: 1 (ESK1 / TBL29), from Zea mays (ZmESKl, called Zm00001d028751) of sequence SEQ ID NO: 8, from Oryza sativa (called 0s03g0291800) of sequence SEQ ID NO: 9, of Populus trichocarpa (called POTR_0010s 19490) of sequence SEQ ID NO: 10 or of Sorghum bicolor (called Sb01g038450.1) of sequence SEQ ID NO: 11.
  • the plant according to the invention is a dicotyledon and said ESK1 protein has at least 65% identity with SEQ ID NO: 1 and in increasing order of preference at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 1 and comprises the units conserved GDSL sequences, of sequence SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 located at positions corresponding respectively to positions 214-217 and 462-465 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1.
  • the plant according to the invention is a monocotyledon and said ESK1 protein has at least 50% identity with SEQ ID NO: 1 and in increasing order of preference at least 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 1 and includes the conserved domains of GDSL sequences, sequence SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 located at positions corresponding respectively to positions 214-217 and 462-465 of the sequence SEQ ID NO: 1, and may also comprise at least one of the conserved domains of SEQ ID sequences NO: 6, RKD and SEQ ID NO: 7 located at positions corresponding respectively to positions 211-224, 433-435 and 461-470 of the sequence SEQ ID NO: 1, when said ESK1 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 1.
  • TPS7 The protein designated TPS7, the expression and / or activity of which is reduced in the plant according to the invention, is defined with reference to the TPS7 protein of Arabidopsis thaliana of SEQ ID NO: 2; in fact, depending on the plant species considered, those skilled in the art are able to identify the ortholog of the protein designated TPS7 as follows which has: a TPS domain (Yang et al., 2012), comprising the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 12 and the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 13, located at positions corresponding respectively to positions 203-207 and 226-236 of the sequence SEQ ID NO: 2, when said TPS7 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 2, and a TPP domain (Yang et al., 2012), comprising the conserved units of sequence SEQ ID NO: 14, 15 and 16, located at positions corresponding respectively to positions 649-654, 777 -787 and 807-815 of the sequence SEQ ID NO: 2, when said TPS7 protein is aligned with said
  • the TPS7 proteins are derived from Arabidopsis thaliana of sequence SEQ ID NO: 2 (AtTPS7), from Zea mays (Zmtrps7, called Zm00001d043469) of sequence SEQ ID NO: 17, from Oryza sativa (called 0s01g0749400 ) of sequence SEQ ID NO: 18, of Vitis vinifera (called VIT_12s0028g01670) of sequence SEQ ID NO: 19, of Populus trichocarpa (called POPTR_0011G70900) of sequence SEQ ID NO: 20, or of Sorghum bicolor (called SB03G034640) of sequence SEQ ID NO: 21.
  • the plant according to the invention is a dicotyledon and said TPS7 protein has at least 70% identity with SEQ ID NO: 2 and in increasing order of preference at least 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 2 and comprises the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 located at corresponding positions respectively at positions 203-207 and 226-236 of the sequence SEQ ID NO: 2, when said TPS7 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 2.
  • the plant according to the invention is a monocotyledon and said TPS7 protein has at least 60% identity with SEQ ID NO: 2 and in increasing order of preference at least 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 2 and comprises the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO : 13 located at positions corresponding respectively to positions 203-207 and 226-236 of the sequence SEQ ID NO: 2, and may also comprise at least one of the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 14, 15 and 16 located at positions corresponding respectively to positions 649-654, 777-787 and 807-815 of the sequence SEQ ID NO: 2, when said TPS7 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 2.
  • the plant according to the invention such that the expression and / or the activity of the proteins ESK1 and TPS7 are reduced is also such that the expression and / or the activity of the designated protein.
  • KAK are reduced, compared to a parent plant not mutagenized, the decrease in the expression and / or activity of the KAK protein having been obtained by at least one mutation in the gene encoding the KAK protein, and such that the non-mutagenized KAK protein has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 3 and comprising armadillo repeats and a HECT domain.
  • the non-mutagenized KAK protein as defined in the present invention has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 3 and in order of increasing preference at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity.
  • the best ortholog for the KAK protein in the plants of interest listed above is found via the PLAZA tool or via the PANTHER tool.
  • the best ortholog for the KAK protein in maize is ZmKAK1.
  • KAK protein whose expression and / or activity is reduced in the plant according to the invention is defined with reference to the KAK protein ⁇ A rabidopsis thaliana of SEQ ID NO: 3; in fact, depending on the plant species considered, those skilled in the art are able to identify the ortholog of the protein designated KAK as follows which has:
  • N3 ⁇ 4 - armadillo repeats in N3 ⁇ 4, defined as a target protein binding domain, which will be sent to the proteasome (Sharma et al., 2016) comprising the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 22 and 23, located at corresponding positions at positions 291-309 and 311-341 of the sequence SEQ ID NO: 3, when said KAK protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 3, and
  • the KAK protein can be further defined by 2 additional conserved patterns of sequences:
  • SEQ ID NO: 25 located at positions corresponding to positions 1466-1490 of the sequence SEQ ID NO: 3, when said KAK protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 3, and
  • SEQ ID NO: 26 located at positions corresponding to positions 1496-1521 of the sequence SEQ ID NO: 3, when said KAK protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 3.
  • the KAK proteins are obtained from Arabidopsis thaliana of sequence SEQ ID NO: 3 (AtKAK), from Zea mays (ZmUPL3, also called ZmKAKl and Zm00001d004139) of sequence SEQ ID NO: 27, from Vitis vinifera ( named VIT_03s0038g02340) of sequence SEQ ID NO: 28, of Populus trichocarpa (called POPTR_0009s 13670) of sequence SEQ ID NO: 29, or of Sorghum bicolor (named Sb06g003290.1) of sequence SEQ ID NO: 30.
  • the plant according to the invention is a dicotyledon and said KAK protein has at least 70% identity with SEQ ID NO: 3 and in increasing order of preference at least 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 3 and includes the conserved motifs of SEQ ID sequences NO: 22, 23 and 24 located at positions corresponding respectively to positions 291-309, 311-341 and 1845-1867 of the sequence SEQ ID NO: 3, when said KAK protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 3.
  • the plant according to the invention is a monocotyledon and said KAK protein has at least 60% identity with SEQ ID NO: 3 and in increasing order of preference at least 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 3 and comprises the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 22, 23 and 24 located at positions corresponding respectively to positions 291-309, 311-341 and 1845-1867 of the sequence SEQ ID NO: 3, and may also comprise at least one of the conserved motifs of sequences SEQ ID NO: 25 and 26 located at positions corresponding respectively to positions 1466-1490 and 1496-1521 of the sequence SEQ ID NO: 3, when said KAK protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 3.
  • the plant according to the invention such that the expression and / or activity of the ESK1 and TPS7 proteins are reduced is also such that the expression and / or activity of the designated protein.
  • TPS6 are reduced, compared to a parent plant not mutagenized, the decrease in the expression and / or activity of the TPS 6 protein having been obtained by at least one mutation in the gene encoding the TPS6 protein, and such that the non-mutagenized TPS6 protein has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 65 and preferably comprising the TPS and TPP domains.
  • the non-mutagenized TPS6 protein as defined in the present invention has at least 60% identity with the sequence SEQ ID NO: 65 and in order of increasing preference at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity.
  • the best ortholog for the TPS6 protein in the plants of interest listed above is found via the PLAZA tool or via the PANTHER tool.
  • the best ortholog for the TPS6 protein in corn is Zm00001d028267.
  • TPS6 protein the expression and / or activity of which is reduced in the plant according to the invention is defined with reference to the TPS6 protein of Arabidopsis thaliana of SEQ ID NO: 65; in fact, depending on the plant species considered, a person skilled in the art is able to identify the ortholog of the protein designated TPS6 as follows which has:
  • a TPS domain (Yang et al., 2012), comprising the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 12 and the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 13, located at positions corresponding respectively to positions 213-217 and 235-246 of the sequence SEQ ID NO: 65, when said TPS6 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 65, and a TPP domain (Yang et al., 2012), comprising the conserved motifs of sequence SEQ ID NO: 14, 15 and 16, located at positions corresponding respectively to positions 666-671, 794-804 and 824-832 of the sequence SEQ ID NO: 65, when said TPS6 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 65.
  • the TPS6 proteins are obtained from Arabidopsis thaliana of sequence SEQ ID NO: 65 (called AtTPS6 or AT1G68020), from Zea mays (Zm00001d028267, also called GRMZM2G099860) of sequence SEQ ID NO: 66, from Vitis vinifera (called VIT_00011634001) of sequence SEQ ID NO: 68, of Populus trichocarpa (called POPTR_010G104500v3) of sequence SEQ ID NO: 69, or of Sorghum bicolor (called SORBI_3001G450800) of sequence SEQ ID NO: 67.
  • AtTPS6 or AT1G68020 Zea mays
  • Zm00001d028267 also called GRMZM2G099860
  • VIT_00011634001 Vitis vinifera
  • POPTR_010G104500v3 Populus trichocarpa
  • Sorghum bicolor called SORBI_3001G450800
  • the plant according to the invention is a dicotyledon and said TPS6 protein has at least 70% identity with SEQ ID NO: 65 and in increasing order of preference at least 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 65 and comprises the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 12 and the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 13 , located at positions corresponding respectively to positions 213-217 and 235-246 of the sequence SEQ ID NO: 65 when said TPS6 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 65.
  • the plant according to the invention is a monocotyledon and said TPS6 protein has at least 60% identity with SEQ ID NO: 65 and in increasing order of preference at least 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and 99% identity with SEQ ID NO: 65 and comprises the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 12 and the conserved motif of sequence SEQ ID NO: 13, located at positions corresponding respectively to positions 213-217 and 235-246 of the sequence SEQ ID NO: 65 when said TPS6 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 65 and may also comprise the conserved motifs of sequence SEQ ID NO: 14, 15 and 16, located at positions corresponding respectively to positions 666-671, 794-804 and 824-832 of the sequence SEQ ID NO: 65, when said TPS6 protein is aligned with said sequence SEQ ID NO: 65.
  • the alignment between two peptide sequences and the calculation of the identity percentages are carried out over the entire length of the peptide sequences using the “needle” computer program (Needleman et al., 1970) using the default parameters: "Matrix”: EBLOSUM62, "Gap penalty”: 10.0 and "Extend penalty”: 0.5.
  • decrease in the expression of a protein in a plant obtained by mutagenesis refers to the decrease in the amount of protein produced by the plant obtained by mutagenesis in comparison with an unmutagenized parent plant and in which the expression of said protein is not reduced.
  • Methods used to measure decreased expression of a protein in a plant include, for example, the western blot technique.
  • decrease in the activity of a protein in a plant obtained by mutagenesis refers to the decrease in the activity of the protein produced by the plant obtained by mutagenesis in comparison with an unmutagenized parent plant and in which the 'activity of said protein is not reduced.
  • Methods used to measure the decrease in the activity of a protein in a plant include, for example, measurement of enzyme activity, by assaying sugars, by infrared, by mass spectrometry or by visual tests.
  • the decrease in the expression of each of the proteins ESK1, TPS7, KAK and TPS6 is measured by western blot and is compared respectively with the expression of the proteins ESK1, TPS7, KAK and TPS6 of a non-mutagenized plant. .
  • the decrease in the activity of ESK1 is measured by an acetate or infrared assay or by MS Maldi-TOL and is compared with the ESK1 protein of a non-mutagenized plant.
  • the decrease in the activity of TPS7 is measured by a sugar assay or by mass spectrometry and is compared to the TPS7 protein from an unmutagenized plant.
  • the decrease in KAK activity is measured by a visual test by observing the hyperbranched trichomes and is compared to the KAK protein of an unmutagenized plant.
  • the decrease in the activity of TPS6 is measured by an assay of sugars or by mass spectrometry and is compared to the TPS6 protein of a non-mutagenized plant.
  • the plant material protoplasts, calli, cuttings, seeds, etc.
  • the invention also encompasses the products obtained from the plants according to the invention, in particular fodder, wood, leaves, stems, roots, etc.
  • the plants according to the invention are such that they have improved digestibility.
  • Plants in which the expression and / or activity of the ESK1 and TPS7 proteins are reduced exhibit biomass production intermediate between that of the eskl mutant and the wild type.
  • Plants in which the expression and / or activity of the ESK1, TPS7 and KAK proteins are reduced and those for which the expression and / or activity of the ESK1, TPS7 and TPS6 proteins are reduced exhibit an intermediate or equivalent biomass. to that of a wild plant.
  • the calculation of the amount of biomass is done by measuring the dry weight per kg of fresh weight from ten plants.
  • the digestibility is evaluated by digestion of the parietal compounds with the enzymatic cocktail known as “Onozuka cellulase” as described in Bensussan et al., 2015.
  • the digestibility protocol then corresponds to an in vitro test aimed at estimating the contents of insoluble fibers after hydrolysis. acid.
  • the invention also relates to a process for preparing a plant with improved digestibility according to the invention in which the expression and / or activity of the protein designated ESK1, and the expression and / or activity of the protein designated TPS7, are reduced, said method comprising the steps of mutagenesis of the genes encoding the proteins designated ESK1 and TPS7.
  • this method allows the preparation of a plant such that the expression and / or the activity of the protein designated KAK are also reduced (in addition to those of ESK1 and TPS7) and comprises a additional step of mutagenesis of the gene encoding the protein designated KAK.
  • this method allows the preparation of a plant such that the expression and / or the activity of the protein designated TPS6 are also reduced (in addition to those of ESK1 and TPS7) and comprises a additional step of mutagenesis of the gene encoding the protein designated TPS 6.
  • each of the ESK1, TPS7, KAK and TPS6 proteins is obtained by mutagenesis of the genes encoding their respective proteins.
  • a mutation within the coding sequence of a gene can induce, depending on the nature of the mutation, the expression of an inactive protein, or of a protein with altered activity.
  • a knock-out type mutation in which the reading frame presents a premature stop codon can also induce a decrease in the expression of this protein.
  • the mutants can be obtained by deletion, insertion and / or substitution of one or more nucleotides, for example by deletion of all or part of the coding sequence of the gene encoding the protein or of its promoter or by the insertion of a exogenous sequence within the coding sequence of the gene encoding the protein or of its promoter.
  • Mutagenesis can be carried out by inducing random mutations, for example using physical or chemical agents such as EMS (Ethyl Methane Sulfonate) or random insertion mutagenesis, followed by selection of mutants with the targeted mutations.
  • High throughput mutagenesis methods followed by selection of mutants are well known.
  • TILLING method Targeting Induced Local Lesions IN Genomes
  • McCallum et al. 2000, Colbert et al., 2001 Henikoff et al. , 2003 and Till et al., 2003.
  • the TILLING technique has continued to develop on different cultivated species as evidenced by numerous publications such as, for example, Taheri et al., 2017.
  • mutagenesis can be carried out by methods using nucleases (TALEN, CRISPR / Cas9, etc.), described in Shan et al., 2013, Leng et al., 2013, Svitashev et al., 2015 and Char et al., 2017.
  • nucleases TALEN, CRISPR / Cas9, etc.
  • the mutants can be insertion lines, for example chosen from the collection of lines called mutator ULMu; the search for maize lines which possess transposon insertion into the orthologous genes of interest can be performed using the website https://maizegdb.org/data_center/stock.
  • RNAi RNA interference technique
  • TPS 7 RNA interference technique
  • this method also comprises a step of genetic modification of said plant to decrease the expression and / or activity of the protein designated KAK or a step of genetic modification of said plant to decrease the expression and / or the activity of the protein designated TPS6.
  • the invention also relates to the use of a plant according to the invention for the production of biofuel.
  • the invention further relates to the use of a plant according to the invention for animal nutrition.
  • Figure 1 Physical map of the candidate genes selected for the beemlAXC line. Beem stands for “biomass enhancement under eskimo 1 mutation”. These are mutagenized eskl mutant lines, the dwarf character of which is attenuated. Position of SNP variants from bioinformatics analysis.
  • Figure 2 Phenotype of the mutants eskl, beemlAXC (eskl mutant line suppressed or not suppressed for dwarfism after chemical mutagenesis) and wild type.
  • A Representative plants of each genotype cultivated under standard conditions: wild type Col-0, suppressed beemlAXC, beemlAXC eskimo- ⁇ kc segregating in the mutagenized unsuppressed population and eskX
  • B Representation of segregation of the beemlAXC line. The white squares show the plants which exhibit the beem phenotype
  • C Comparison of plant height between the parental mutant eskX and the suppressed mutant beemlAXC.
  • Figure 3 A Comparison of the surface area of rosettes between different lines.
  • the letter symbolizes the class to which each line belongs, a class determined by a multiple comparison test (Tuckey).
  • the line in the middle of each box represents the median, the diamond indicates the average, the ends of each box is 1 and the 3 rd quartile of the series, the standard deviation is shown by the vertical bars, extreme individuals are indicated by a black dot.
  • Figure 4 Graphic representation of plasmid L1657.
  • Figure 5 Phylogenetic tree produced with protein sequences of class 2 TPS genes anchored with the protein of the TPSX gene. The values indicate the length of the branches.
  • Figure 6 Arabidopsis plants at the floral induction and flowering stage.
  • FIG. 7 Position of the CrispR targets on the genomic sequences of the ZmOOOO1 d022582 (ESK3) and Zm00001d028751 (ESK6) genes.
  • Figure 8 Morphological characterization of corn plants. Left: Observation of the size of mutant plants esk3.1, eskô.l and esk3.1esk6.1 in relation to the size of the wild plant (WT) at the flowering stage and the photo from right to right shows a defect foliar visible from the 4 th sheet.
  • B Appearance of ligulate leaves over time.
  • C Measurement of the height of the plants at the flowering stage. The letters a and b according to Tukey's test indicate that the plants belong to two significantly different groups.
  • D Distribution of genotypes according to the length and width of the 8 th sheet.
  • Figure 10 Oligoxylans obtained after xylanase treatment and MALDI TOF identification.
  • the different oligoxylans are distributed according to their m / z (horizontal axis) and their proportion on the vertical axis.
  • the genotypes are represented by the pictograms, 3 biological repeats per genotype with the exception of the esk3.2esk6.2 lots (2 biological repeats).
  • Figure 11 Evaluation of the in vitro digestibility of dry matter (INDMD) and wall residue (INCWRD) and lignin content (klason) of the walls.
  • A above, averages of the digestibility of the dry matter according to the genotypes (3 biological repeats x 2 technical repeats per genotype); at the bottom, the digestibility of wall residues as a function of genotypes (3 biological repeats per genotype x 3 technical repeats). Tukey's test shows that the genotypes are divided into two significantly distinct groups (a and b).
  • B table of values of lignin content of wall residues according to genotypes. (3 biological repeats x 2 technical repeats per genotype)
  • C distribution of genotypes according to the digestibility of wall residues and the amount of lignin.
  • Figure 12 Cross sections of corn internodes after FASGA staining. Low-lignified tissue is colored blue and lignified tissue is pink. Below, magnification of the perivascular regions of the wild plant and of the mutant eskô.l which have very blue and large cells around the vessels compared to those of the wild plant.
  • EXAMPLE 1 Demonstration of the tps7 mutation as a suppressor of dwarfism in arabidopsis thaliana and characterization of the double mutant plants eskl and tps7 in arabidopsis thaliana
  • the eskl -5 mutant is genotyped with the pair of primers ESK1-5 # R2 and ESK1-5 # L1 for the wild-type allele and the pair of primers LBSalk2 and ESK1-5 # R2 for the mutated allele.
  • the tps7-1 mutant comes from the SALK135044 line and is genotyped with the primers LBSalk2 and RP-Salkl35044 for the mutant allele and RP-Salkl35044 and LP-Salkl35044 for the wild-type allele.
  • the tps7-2 mutant comes from the SALK116341c line and is genotyped with the primers RP-Salkl 16341 and LBSalk2 for the mutant allele and with the primers RP-Salkl 16341 and LP-Salkl l341 for the wild-type allele.
  • the tpsl-3 mutant is the line GABI341E02.
  • the mutant allele is determined by PCR with the primers Gabi08409 and RP-GK341E02 for the mutated allele and with the primers RP-GK341E02 and LP-GK341E02 for the wild-type allele.
  • the tpsl-A mutant is genotyped by PCR with the primers TS7 # U1 and TPS7 # L1 and the sequencing determines the presence of the SNP (G in A) relative to the reference sequence.
  • sequences of the PCR products are obtained by the Sanger method and the sequences are aligned with the reference wild-type gene to determine the presence of the SNP.
  • the sequences of the T-DNA primers are: LBSalk2, Gabi08409, Lbl.3.
  • a bioinformatic analysis was carried out by aligning the sequences (“reads”) of the genome of 5 beem mutants (563 B, 396B, 241 C, 142A, 648B) on the reference genome using the software CLC Genomics Workbench 7.5.2 ( Qiagen), knowing that the beem mutants were not allelic to each other. Sequence alignment
  • the “trimming” function provided by the CLC Genomics Workbench software was used. A trimming by quality and length of sequence was first done, with the following parameters:
  • Quality cutoff score 0.05 (Phred value equivalent to a quality score of 40: the probability of incorrectly calling a base is 1 in 10,000).
  • ambiguous nucleotides 0 (no ambiguous nucleotides are allowed)
  • trim. length reads with a length of less than 80 bp are discarded.
  • the “reads” were mapped on the VArabidopsis reference genome (T AIR 10.0) according to the default parameters. However, the parameters of fraction length (value of the alignment which must correspond to the reference sequence before being put in the list of mapped variants) and the similarity fraction (minimum percentage of identity between the "read” and the reference sequence) are 0.9 and 0.05 respectively.
  • a list of SNPs for each beem line was obtained. Then, the list of possible candidates was chosen according to the following parameters (Abe et al., 2012; Hartwig et al. 2012): a) SNP / INDEL (insertion or deletion in a biological sequence) exclusive and unique for the beem241 line. C, b) The SNP / INDEL must be located in a coding region to have effects on the amino acid sequences, c) The SNP / INDEL has an allelic frequency between 80-100%.
  • the amplification products are sequenced by the company Beckman Coulter Genomics (24 suppressed "beem” plants, 7 sister plants with the eskimo-like phenotype and one eskl plant). Analysis of wild-type or mutant alleles indicates whether or not there is a correlation with the phenotype of plants observed using CLC Genomics Workbench 7.5.2 software (Qiagen).
  • a cluster of mutations on the top of chromosome 1 is found.
  • CVP2 and TPS7 are the unique variants which show a frequency of 100% with 60 and 63 sequences respectively.
  • the deletion causes the change of a serine to proline at codon 814 of the coding sequence (CDS) of TPS7 potentially leading to the translation of the complete TPS domain (Trehalose Phosphate Synthase) and of the modified TPP domain (Trehalose Phosphate Phosphatase) of the protein .
  • CDS coding sequence
  • tps7-1, tps7-2, tps7-3 mutants were crossed with the eskl-5 mutant in order to select in F2 the double mutants tps7-l eskl-5, tps7-2eskl-5 and tps7-3eskl-5 using the primers identified in Table 1.
  • the tps7 eskl-5 double mutants have an intermediate phenotype between that of the wild plant and that of the eskl -5 mutant, as is observed in the beemlAXC mutant, the size of the rosettes being larger than that of the eskl mutant. -5.
  • the tps7 eskl-5 double mutants exhibit a higher biomass than that of the eskl -5 mutant in irrigated condition.
  • Table 4 Biomass (dry matter) of the rosettes of A. 44 day old thaliana taken from the Phenoscope. The number of individuals measured in each condition for each genotype is indicated in column N.
  • EXAMPLE 2 Demonstration of the selective effect of the tps7 mutation as a suppressor of dwarfism in arabidopsis thaliana and characterization of the triple mutant plants eskl, tps7 and tps6 in arabidopsis thaliana
  • the tpseskl double mutants were obtained from lines carrying mutations in each of the class 2 genes (Table 5 and Figure 5).
  • Table 5 List of class 2 TPS genes with their identifier (ID), the mutant lines obtained at the Stock Center and the oligonucleotides used to identify the mutant homozygous plants.
  • ID the identifier
  • the T-DNA oligonucleotides are those recommended on the site http://signal.salk.edU/tdnaprimers.2.html
  • EXAMPLE 3 Determination in corn of the ortholog of the AlESK I gene.
  • oligo A which targets Zm00001d022582 and is found at the end of the first of the exons.
  • Oligo B mainly targets Zm00001d028751 (23/23) but also Zm00001d022582 (17/23; 3 'end preserved). It is located in the exonl of a total of 3 exons and is located upstream of the conserved region.
  • Oligo A ESK3-CR85 in Zm00001d022582: ACAGGTCGCACCCGGCAACCTGG
  • Oligo B ESK6-CR24 in Zm00001d028751: GCAGACGTGCGACCTGTACCGGG
  • primers used to target the Zm00001d1d0286751 genes as well as the Zm00001d1d0286751
  • the immature corn embryos of the A188 line were transformed via Agrobacterium tumefaciens by the plasmid L1657-ESK carrying between the left and right limits of the T-DNA, the CAS9 gene under the control of the Ubiquitin promoter, the oligos A and B and the BAR gene.
  • the transformants obtained after the regeneration of the calli were cultured and crossed with the line A 188 used as maternal or paternal parent.
  • the whole plants with the ear are cut, then batches of plants of the same genotype are roughly crushed, bagged and weighed before being dehydrated by passing 96 hours in an oven at 50 ° C.
  • the dry matter content is calculated by the difference in mass before and after drying.
  • the samples are then finely ground using a hammer mill (1 mm grid) to a homogeneous powder.
  • Three batches of 3 plants of the same genotype constitute 3 biological repeats and two technical repetitions per analysis are carried out at least.
  • Biochemical analyzes are carried out on the powders after validation and calibration of the weighings.
  • CWR cell wall residues
  • Soxhlet Prior to the extraction of cell wall residues (CWR) through passages water / ethanol (Soxhlet), an amylase treatment is carried out on the dry matter powders. 2 g of dry matter are taken up in 20 ml of distilled water to which are added 400 ⁇ l of the amylase solution (HTL Ankom). Tubes are incubated at 100 ° C for 15 min with shaking in the middle of the incubation. Then the tubes are dipped in ice to cool them. A 15 min centrifugation at 18G is carried out, the supernatants are removed by aspiration and the pellets are rinsed twice with distilled water (20 ml) and centrifuged.
  • the pellets are then frozen at -80 ° C. and then lyophilized for 30 h.
  • the weight loss is estimated by weighing with 2 technical repetitions per sample. The value is validated if less than 5% error between the repetitions and the values of the standards (Ronaldinio Z18DIgPE106 are compliant) (figure 9).
  • the digestibility of the dry matter in vitro (IVDMD) and the digestibility of cell wall residues (IVCWRD) were estimated according to a modified protocol derived from Aufrère and Michalet-Doreau (1983).
  • 30 mg of dry matter are pretreated in an acid solution (0.1N HCL) at 40 ° C. for 24 h, then a 2 M NaOH solution is added to terminate the reaction.
  • the sample is then incubated in a cellulase solution (Cellulase Onozuka RIO 8 mg.ml-1, 0.1M NaAc pH 4.95, 0.4% Na2CO3) at 50 ° C for 72 h. After centrifugation, the pellet is washed with water and frozen before lyophilization.
  • Weight loss is expressed as a percentage of the initial weight (30 mg).
  • the lignin content in the cell wall (KL.CWR) is estimated by the Klason method according to Dence (1992) (2 technical repetitions per sample, a third is carried out if the results give more than 5% error).
  • the determination of the acetylation of xylan is carried out on a few micrograms of dry matter digested in a solution of endo-1,4-P-Xylanasc (E-XYRU6, Megazyme) in 50 mM sodium acetate buffer previously desalted. The samples are then analyzed and identified by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • oligo A which targets the gene ZmOOOOl d022582 (ESK3) and is at the end of the first exon
  • oligo B which mainly targets ZmOOOOl d028751 (ESK6) (23/23) but also ZmOOOOl d022582 (17/23; 3 'end retained). It is located in the exonl out of a total of 3 exons.
  • the maize transformants obtained by T-DNA transformation were analyzed by sequencing and thus several allelic mutants were obtained (Table 7). By backcrossing with the wild line, it was possible in the segregating progenies to select single allelic mutants esk3 and esk6 but also double allelic mutants esk3esk6.
  • mutants esk3.1 and esk3.2 whose mutations create a change in reading phase from amino acid 158 and to proteins truncated in size 223 and 225 amino acids respectively on the predicted 529 amino acids.
  • the double mutants esk3.1 eskô.l and esk3.2esk6.2 were also studied in this study.
  • Table 8 Percentage of dry matter of whole plants harvested at the silage stage.
  • the Zm00001d028751 (ESK6) gene is the ortholog of the AtlG55990 gene and has a function of Xylan O-Acetyl transferase.
  • the esk6 mutation affects the size of the internodes and the production of a less lignified bone marrow parenchyma.
  • FIG 12A In Figure 12A are shown sections of internodes of corn stems after staining with Fasga. It can be observed that plants carrying the esk6 mutation have reduced internode areas compared to those of wild and mutant esk3 plants. In addition, a more pronounced blue staining of the marrow in the mutants esk6 and esk3esk6 indicates to us that the cells of the medullary parenchyma are less lignified than those of the wild and mutant plants esk3 which have a pink parenchyma and therefore more lignified. The blue staining of the perivascular cells of the mutant esk6 (FIG.
  • the Zm00001d028751 gene is the ortholog of the AT1G55990 gene in arabidopsis. It leads to the same developmental defect, namely plant dwarfism, and is accompanied by better digestibility of the biomass resulting from a decrease in the acetylation of xylans.
  • the mutant's vascular vessels are not collapsed as is the case in the Ateskl mutant of arabidospis.
  • the observations of several hundred histological sections of corn internodes from plants cultivated under conditions of water stress have never made it possible to observe the collapse of the xylem vessels but the same distribution pattern of the tissues observed in the mutant. esk6.
  • the operation is repeated with the name of the TPS 7 gene in Arabidospsis thaliana, namely AT1G06410 and the ortholog is found in maize, under the reference Zm00001d043469. 1.1. Verification of the presence of the patterns preserved in the corn orthologs
  • a protein alignment is made between the sequence of Arabidopsis thaliana and that of
  • TMHMM transmembrane domain
  • ZM03G31920 ZmTprs7
  • ZM03G31900 ZmTprsS6
  • ZM08G34940 ZmTPrsl5
  • ZM03G31900 there are insertions of mutator transposons such as mul069747 in UFMu-08325 and mul077018 in UFMu-08873
  • ZM08G34940 gene there is only an insertion of a transposable element in the exonic part: it is mul057945 in line UFMu-07357.
  • ZM03G31920 gene which is the closest ortholog to AtTPS7, there is no transposable element in the gene.
  • a CRISPR / Cas9 mutagenesis strategy is then necessary.
  • Double mutants eskl tps7 as well as single mutants and savages are reared in greenhouse or dedicated platform. All informative morphometric and phenological characteristics such as date of appearance of the third ligulate leaf, date of flowering, height of plants, width and length of the longest leaf are measured.
  • the plants are collected at the silage stage and at the mature grain stage.
  • the water content of the stems and leaves is evaluated by weighing before and after drying in an oven at 50 ° C. for 4 days.
  • the dry biomass is crushed into a fine powder with an IKA M20 cutter mill.
  • trehalose-6 phosphate and trehalose are carried out by chemical analysis.
  • FTIR Infra-red spectra with Fourier transform
  • Histological stains with Fasga of the internodes under the spike make it possible to visualize the lignified and non-lignified tissues, the shape of the vessels as well as their density (Legland et al, 2017).
  • Homozygous mutant plants in the Zm Kaki gene were obtained by insertion of a mutator transposon: mul057066 into the UFMu-07383 line.
  • a CRISPR / Cas9 mutagenesis strategy is more suitable.
  • the eskl tps7 double mutants are crossed with the eskl kak double mutants.
  • the progeny of F1 plants (homozygous esk, heterozygous tps7, heterozygous kak) are bred to produce F2 progeny by selfing.
  • F2 plants 1/16 of the plants are triple mutants esk tps7 kak.
  • the selection of plants is done by genotyping by PCR with the primers used to select the single mutants.

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Abstract

Obtention de plantes ayant une digestibilité de la biomasse améliorée La présente invention se rapporte à une plante obtenue par mutagénèse telle que l'expression et/ou l'activité de la protéine ESK1 et l'expression et/ou l'activité de la protéine TPS7 sont diminuées par rapport à une plante parente non mutagénisée. Ladite plante dont la biomasse présente une meilleure digestibilité, conserve une croissance satisfaisante. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de ladite plante ainsi que l'utilisation de ladite plante pour la production de biocarburant.

Description

OBTENTION DE PLANTES AYANT UNE DIGESTIBILITE DE LA BIOMASSE
AMELIOREE
La présente invention se rapporte au domaine de la production de biomasse végétale.
Elle a plus particulièrement pour objet la préparation de plantes qui ont une biomasse présentant une meilleure digestibilité (propriété également désignée par dégradabilité) et qui conservent une croissance satisfaisante.
Les énergies fossiles comme le pétrole, le charbon et le gaz représentent toujours la principale source énergétique tout secteur confondu. Dans le domaine des transports, c’est encore le pétrole qui prédomine largement. Cependant, ces hydrocarbures sont très polluants pour T environnement notamment en ce qu’ils relarguent beaucoup de CO2 lors de leur combustion, stock de carbone qui était enfoui auparavant. En outre, les gisements se font de plus en plus rares et l’extraction devient de plus en plus onéreuse (https://www.planete- energies.com/fr/medias/decryptages/les-energies-fossiles).
Les biocarburants pourraient répondre en partie à l’amenuisement des réserves de pétrole. Les biocarburants de première génération sont issus des sucres simples et huiles présents dans les végétaux, qui sont transformés en éthanol et bio-ester. Les biocarburants de seconde génération (Sims et al., 2010) sont produits à partir de biomasse ligno- cellulosique ; cette biomasse est constituée de l'ensemble des parois cellulaires des végétaux. L'avantage de ces biocarburants de seconde génération est que leur production n'entre pas en compétition avec l'alimentation humaine. La biomasse ligno-cellulosique utilisée pour les bio-carburants de seconde génération peut être extraite des résidus culturaux tels que ceux du maïs.
Le coût de production de biocarburant à partir de cette biomasse ligno-cellulosique est encore relativement élevé bien que la matière première soit peu chère. De plus, la biomasse utilisée comme fourrage pour les animaux domestiques ne présente pas une digestibilité optimale.
Au sein des plantes, certains tissus sont plus riches que d’autres en biomasse ligno- cellulosique. C’est le cas notamment des tissus du xylème, composés essentiellement de vaisseaux conducteurs de sève brute et de fibres. Le xylème est un puits de carbone ; les sucres simples issus de la photosynthèse y sont stockés sous forme de bio-polymères constituants de la paroi. Les polymères végétaux sont complexes et liés entre eux ce qui rend leur accessibilité pour la digestion par les animaux ou pour leur exploitation dans l’industrie chimique laborieuse et relativement polluante.
En outre, l’exploitation de la biomasse ligno-cellulosique est un procédé qui requiert une première étape de prétraitement visant à « rompre » la matrice cellulose/hémicellulose/lignine qui forme la structure des parois secondaires lignifiées qui se composent d’un enchevêtrement complexe de fibrilles de celluloses imbriquées dans une matrice de lignine et d’hémicellulose. Ce maillage dense peut donc gêner l’accès des enzymes digestives aux polysaccharides d’intérêts comme la cellulose, polymère d’hexose ou les hémicelluloses, tels que le xylane, un polymère de pentoses.
L’obtention de lignées de plantes plus facilement digestibles avec une taille et une croissance identique à leur équivalent sauvage est ainsi un enjeu d’actualité (Kalluri et al., 2014). Parmi les stratégies mises en œuvre pour y parvenir, il existe des stratégies de réduction du taux de lignine ou la modification de leur structure chimique (décorations, liaison aux autres polymères), ce qui entraine des défauts de vigueur incompatibles avec leur culture (Mottiar et al., 2016). D’autres stratégies, notamment celles qui sont testées et inventoriées par Bhatia et collaborateurs (Bhatia et al., 2017) consistent en la modification des liaisons entre les polymères ainsi que la modification des décorations des hémicelluloses.
De précédents travaux ont permis d’identifier des mutants d'Arabidopsis thaliana tolérants au gel sans période d’acclimatation préalable nommés eskimo 1 ( eskl ) (Xin et al., 1998). Des plantes ayant le gène eskl muté ont ensuite été caractérisées par leur insensibilité au stress hydrique (Bouchabke-Coussa et al., 2008), leur phénotype nain (Lefebvre et al., 2011) ainsi qu’un faible niveau d’acétylation des xylanes (Yuan et al., 2013).
Cette faible acétylation des xylanes observée chez le mutant eskl entraîne une meilleure digestibilité enzymatique des parois (Bensussan et al., 2015), ce qui représente un avantage précieux pour la transformation des végétaux d’intérêt agronomique, notamment pour la production de bio-carburants ou pour l'alimentation animale.
Toutefois, même en conditions de culture optimales, ce mutant se caractérise notamment par un phénotype nain et les plantes portant la mutation eskl produisent finalement très peu de biomasse, ce qui limite considérablement leur intérêt pour la production qu’elle soit destinée à l’alimentation animale ou à la fabrication de biocarburants.
Dans ce contexte, des études complémentaires ont porté sur l’identification de nouvelles lignées présentant une bonne dégradabilité de leur paroi mais ayant une croissance améliorée ; ces études ont conduit à l’identification d’un double mutant (gènes kak et eskl- 5) qui conserve un bas niveau d’acétylation des xylanes mais chez qui le phénotype nain est supprimé (Bensussan et al., 2015).
Les Inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle mutation qui, associée à la mutation du gène eskl, conduit à une lignée conservant un bas niveau d’acétylation des xylanes et ayant une production de biomasse améliorée (suppression du phénotype nain).
Plus spécifiquement, ils ont identifié le gène tps7 comme un gène responsable de la suppression du phénotype du nanisme chez les mutants eskl. Ils ont ensuite mis en évidence que des plantes d 'Arabidopsis thaliana portant les mutations sur les gènes eskl et tps7 présentaient une digestibilité de la biomasse améliorée par rapport aux plantes d 'Arabidopsis thaliana sauvages. En outre, ils ont également mis en évidence que les plantes d’ Arabidopsis thaliana triples mutants eskl, tps7 et kak et les plantes d "Arabidopsis thaliana triples mutants eskl, tps7 et tps6 présentent également une meilleure digestibilité de la biomasse par rapport aux plantes d "Arabidopsis thaliana sauvages.
Chez Arabidopsis, il existe 21 gènes putatifs de biosynthèse du tréhalose répartis en trois classes selon leur homologie avec les gènes de levure ScTPSl et ScTPSl (Ramon et al., 2009). Les gènes de classe 1 et 2 codent pour des protéines bipartites, le domaine TPS (tréhalose-6-phosphate synthase) et le domaine TPP (tréhalose-6-phosphate phosphatase). Ainsi le tréhalose-6-phosphate (T6P), précurseur du tréhalose, est produit à partir de glucose- UDP et de glucose-9-phosphate, grâce à l’enzyme TPS. Puis le T6P est ensuite métabolisé en tréhalose par l’enzyme TPP (Lunn et al., 2014, O’Hara et al., 2013; Vandesteene et al., 2012). Le gène tps7 qui code pour une tréhalose-6-phosphate synthase 7 (TPS7) appartient à la classe 2 des gènes putatifs de biosynthèse du tréhalose.
Ainsi la présente invention se rapporte à une plante obtenue par mutagénèse telle que :
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7,
sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée et la diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéines ESK1 et TPS7 ayant été obtenues par au moins une mutation dans chacun des gènes codant pour les protéines ESK1 et TPS7, et telle que : la protéine ESK1 non mutagénisée a au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et comprenant les domaines acyl-estérase et transmembranaire, et
la protéine TPS7 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprenant les domaines TPS et TPP. L’homme de l’art connaît la démarche à suivre pour obtenir le meilleur orthologue dans une espèce d’intérêt, et ceci via l’outil « PLAZA » décrit dans l’exemple 2, via l’outil « PANTHER » (Mi et al., 2017), décrit ci-après ou via des analyses phylogénétiques, comme celles menées par Paul et al., 2018.
La première étape en utilisant l’outil « PANTHER » consiste à saisir l’identité du gène (gène ID) sur le site TAIR (http://www.arabidopsis.org). La deuxième étape consiste à sélectionner sur le site PANTHER (http://www.pantherdb.org/) « gene and orthologs », puis saisir le gene ID et appuyer sur « search ». Parmi les orthologues proposés, les LOD « least ortholog divergent » doivent être choisis ; ils correspondent aux meilleurs orthologues d’une protéine donnée.
La protéine ESK1 non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
La protéine TPS7 non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
La présente invention s’applique à toutes les plantes monocotylédones ou dicotylédones. De manière non limitative, elle peut s’appliquer aux plantes céréalières, aux plantes ornementales, aux arbres fruitiers et aux arbres non fruitiers.
Le meilleur orthologue pour chacune des protéines ESK1 et TPS7 dans les plantes d’intérêt citées ci-dessus est trouvé via l’outil PLAZA ou via l’outil PANTHER. Les meilleurs orthologues pour les protéines ESK1 et TPS7 chez le maïs sont les suivants : ZmESKl (ZmOOOO 1 d028751) et de ZmTRPS7 (Zm00001d043469).
La plante selon l’invention peut être une dicotylédone telle que Arabidopsis thaliana, le peuplier ( Populus trichocarpa ) ou la vigne { Vais vinifera). De préférence, la plante selon l’invention est une monocotylédone telle que le blé, le maïs ( Zea mays), le sorgho ( Sorghum bicolor) ou le riz ( Oryza sativa), de manière encore plus préférée le maïs.
La protéine désignée ESK1, également dénommée TBL29, dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine ESK1 d’ Arabidopsis thaliana de SEQ ID NO: 1; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée ESK1 qui possède : - un domaine acyl-estérase, nécessaire pour leur activité enzymatique (Anantharaman et al., 2010 et Gille et al., 2012), comprenant le motif conservé GDSL de séquence SEQ ID NO: 4 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 5, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO : 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, et
- un domaine transmembranaire en Ntb, permettant un ancrage à la membrane interne de l’appareil de Golgi, site probable de l’acétylation des xylanes (Gille et al., 2012 et Yuan et al., 2013). La présence du domaine transmembranaire est identifiée via l’outil bioinformatique TMHMM qui est un logiciel de prédiction de la structure des protéines membranaires.
Le motif conservé GDSL signifie l’enchaînement des acides aminés glycine, aspartate, serine et leucine.
On entend par domaine ou motif conservé, un enchaînement d’acides aminés retrouvé à l’identique dans les protéines orthologues.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la protéine ESK1 peut être définie en outre par 3 motifs conservés supplémentaires de séquences :
SEQ ID NO: 6 situé à des positions correspondant aux positions 211-224 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1 et qui comprend le motif conservé GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4,
RKD situé à des positions correspondant aux positions 433-435 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, et SEQ ID NO: 7 situé à des positions correspondant aux positions 461-470 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1 et qui comprend le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 5.
Le motif conservé RKD signifie l’enchaînement des acides aminés arginine, lysine et aspartate.
A titre d’exemple, les protéines ESK1 sont issues d'Arabidopsis thaliana de séquence SEQ ID NO: 1 (ESK1/TBL29), de Zea mays (ZmESKl, dénommé Zm00001d028751) de séquence SEQ ID NO: 8, d’Oryza sativa (dénommé 0s03g0291800) de séquence SEQ ID NO: 9, de Populus trichocarpa (dénommé POTR_0010s 19490) de séquence SEQ ID NO: 10 ou de Sorghum bicolor (dénommé Sb01g038450.1) de séquence SEQ ID NO: 11.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine ESK1 possède au moins 65% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et comprend les motifs conservés de séquences GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine ESK1 possède au moins 50% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et comprend les domaines conservés de séquences GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO: 1, et peut également comprendre au moins un des domaines conservés de séquences SEQ ID NO: 6, RKD et SEQ ID NO: 7 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 211-224, 433-435 et 461-470 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1.
La protéine désignée TPS7 dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine TPS7 d’ Arabidopsis thaliana de SEQ ID NO: 2; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée TPS7 comme suit qui possède : un domaine TPS (Yang et al., 2012), comprenant le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 12 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 13, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO : 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 2, et un domaine TPP (Yang et al., 2012), comprenant les motifs conservés de séquence SEQ ID NO : 14, 15 et 16, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 649-654, 777-787 et 807-815 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
A titre d’exemple, les protéines TPS7 sont issues d’ Arabidopsis thaliana de séquence SEQ ID NO: 2 (AtTPS7), de Zea mays (Zmtrps7, dénommé Zm00001d043469) de séquence SEQ ID NO: 17, d’Oryza sativa (dénommé 0s01g0749400) de séquence SEQ ID NO: 18, de Vitis vinifera (dénommé VIT_12s0028g01670) de séquence SEQ ID NO: 19, de Populus trichocarpa (dénommé POPTR_0011G70900) de séquence SEQ ID NO: 20, ou de Sorghum bicolor (dénommé SB03G034640) de séquence SEQ ID NO: 21. Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine TPS7 possède au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine TPS7 possède au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO: 2, et peut également comprendre au moins un des motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 14, 15 et 16 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 649-654, 777-787 et 807-815 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
Selon un premier mode de réalisation particulier, la plante selon l’invention telle que l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1 et TPS7 sont diminuées est en outre telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de de la protéine KAK ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine KAK, et telle que la protéine KAK non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et comprenant des répétitions armadillo ainsi qu’un domaine HECT.
La protéine KAK non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
Le meilleur orthologue pour la protéine KAK dans les plantes d’intérêt citées ci-dessus est trouvé via l’outil PLAZA ou via l’outil PANTHER. Le meilleur orthologue pour la protéine KAK chez le maïs est ZmKAKl.
La protéine KAK dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine KAK ïA rabidopsis thaliana de SEQ ID NO: 3; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée KAK comme suit qui possède :
- des répétitions armadillo en N¾, définies comme un domaine de liaison aux protéines cibles, qui vont être adressées au protéasome (Sharma et al., 2016) comprenant les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22 et 23, situés à des positions correspondant aux positions 291-309 et 311-341 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3, et
- un domaine HECT en COOH, liant des unités ubiquitine qui seront par la suite liés aux cibles pour l’adressage au protéasome (El Refy et al., 2003), comprenant le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 24, situé à des positions correspondant à la position 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
La présence des répétitions armadillo et du domaine HECT est identifiée via l’outil bioinformatique « Protein Sequence Analysis and Classification » de InterPro 68.0 (EMBL- EBI), trouvé à l’aide du site internet https://www.ebi.ac.uk/interpro/.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la protéine KAK peut être définie en outre par 2 motifs conservés supplémentaires de séquences :
SEQ ID NO: 25 situé à des positions correspondant aux positions 1466-1490 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3, et
SEQ ID NO: 26 situé à des positions correspondant aux positions 1496-1521 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
A titre d’exemple, les protéines KAK sont issues d’ Arabidopsis thaliana de séquence SEQ ID NO: 3 (AtKAK), de Zea mays (ZmUPL3, dénommé également ZmKAKl et Zm00001d004139) de séquence SEQ ID NO: 27, de Vitis vinifera (dénommé VIT_03s0038g02340) de séquence SEQ ID NO: 28, de Populus trichocarpa (dénommé POPTR_0009s 13670) de séquence SEQ ID NO: 29, ou de Sorghum bicolor (dénommé Sb06g003290.1) de séquence SEQ ID NO: 30.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine KAK possède au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22, 23 et 24 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 291-309, 311-341 et 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine KAK possède au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22, 23 et 24 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 291-309, 311-341 et 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, et peut également comprendre au moins un des motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 25 et 26 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 1466-1490 et 1496-1521 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
Selon un second mode de réalisation particulier, la plante selon l’invention telle que l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1 et TPS7 sont diminuées est en outre telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS6 sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de de la protéine TPS 6 ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine TPS6, et telle que la protéine TPS6 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 65 et comprenant de préférence les domaines TPS et TPP.
La protéine TPS6 non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 65 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
Le meilleur orthologue pour la protéine TPS6 dans les plantes d’intérêt citées ci-dessus est trouvé via l’outil PLAZA ou via l’outil PANTHER. Le meilleur orthologue pour la protéine TPS6 chez le maïs est Zm00001d028267.
La protéine TPS6 dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine TPS6 d’Arabidopsis thaliana de SEQ ID NO: 65; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée TPS6 comme suit qui possède :
un domaine TPS (Yang et al., 2012), comprenant le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 12 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 13, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 213-217 et 235-246 de la séquence SEQ ID NO : 65, lorsque ladite protéine TPS6 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 65, et un domaine TPP (Yang et al., 2012), comprenant les motifs conservés de séquence SEQ ID NO : 14, 15 et 16, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 666-671, 794-804 et 824-832 de la séquence SEQ ID NO: 65, lorsque ladite protéine TPS6 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 65.
A titre d’exemple, les protéines TPS6 sont issues d’ Arabidopsis thaliana de séquence SEQ ID NO: 65 (dénommé AtTPS6 ou AT1G68020), de Zea mays (Zm00001d028267, dénommé également GRMZM2G099860) de séquence SEQ ID NO: 66, de Vitis vinifera (dénommé VIT_00011634001) de séquence SEQ ID NO: 68, de Populus trichocarpa (dénommé POPTR_010G104500v3) de séquence SEQ ID NO: 69, ou de Sorghum bicolor (dénommé SORBI_3001G450800) de séquence SEQ ID NO: 67.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine TPS6 possède au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO: 65 et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 65 et comprend le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 12 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 13, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 213-217 et 235-246 de la séquence SEQ ID NO : 65 lorsque ladite protéine TPS6 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 65.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine TPS6 possède au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO: 65 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 65 et comprend le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 12 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 13, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 213-217 et 235-246 de la séquence SEQ ID NO : 65 lorsque ladite protéine TPS6 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 65 et peut aussi comprendre les motifs conservés de séquence SEQ ID NO : 14, 15 et 16, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 666-671, 794-804 et 824- 832 de la séquence SEQ ID NO: 65, lorsque ladite protéine TPS6 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 65.
Sauf précision contraire, l’alignement entre deux séquences peptidiques et le calcul des pourcentages d’identité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiques à l’aide du programme d’ordinateur « needle » (Needleman et al., 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité dans une plante des protéines ESK1, TPS7 et optionnellement KAK ou TPS6 telles que définies ci-dessus, peut être obtenue de différentes manières détaillées ci-après.
Le terme « diminution de l’expression d’une protéine dans une plante obtenue par mutagénèse » se réfère à la diminution de quantité de protéine produite par la plante obtenue par mutagénèse en comparaison avec une plante parente non mutagénéisée et dans laquelle l’expression de ladite protéine n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’expression d’une protéine dans une plante comprennent par exemple la technique du western blot.
Le terme « diminution de l’activité d’une protéine dans une plante obtenue par mutagénèse » se réfère à la diminution de l’activité de la protéine produite par la plante obtenue par mutagénèse en comparaison avec une plante parente non mutagénéisée et dans laquelle l’activité de ladite protéine n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’activité d’une protéine dans une plante comprennent par exemple la mesure de l’activité enzymatique, par dosage de sucres, par infra-rouge, par spectrométrie de masse ou par des tests visuels.
Dans le cas présent, la diminution de l’expression de chacune des protéines ESK1, TPS7, KAK et TPS6 est mesurée par western blot et est comparée respectivement à l’expression des protéines ESK1, TPS7, KAK et TPS6 d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de ESK1 est mesurée par un dosage acétate ou par infra-rouge ou encore par MS Maldi-TOL et est comparée à la protéine ESK1 d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de TPS7 est mesurée par un dosage des sucres ou par spectrométrie de masse et est comparée à la protéine TPS7 d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de KAK est mesurée par un test visuel en observant les trichomes hyperbranchés et est comparée à la protéine KAK d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de TPS6 est mesurée par un dosage des sucres ou par spectrométrie de masse et est comparée à la protéine TPS6 d’une plante non mutagénisée. Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc.) obtenu à partir des plantes selon l’invention fait également partie de l’objet de la présente invention. L’invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes selon l’invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines...
Les plantes selon l’invention sont telles qu’elles ont une digestibilité améliorée. Les plantes dans lesquelles l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1 et TPS7 sont diminuées présentent une production de biomasse intermédiaire entre celle du mutant eskl et le sauvage. Les plantes dans lesquelles l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1, TPS7 et KAK sont diminuées et celles pour lesquelles l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1, TPS7 et TPS6 sont diminuées présentent une biomasse intermédiaire ou équivalente à celle d’une plante sauvage.
Le calcul de la quantité de biomasse se fait par la mesure du poids sec par kg de poids frais provenant de dix plantes.
La digestibilité est évaluée par digestion des composés pariétaux avec le cocktail enzymatique dit « cellulase Onozuka » telle que décrit dans Bensussan et al., 2015. Le protocole de digestibilité correspond alors à un essai in vitro visant à estimer des teneurs en fibres insolubles après hydrolyse acide.
L’invention se rapporte également à un procédé de préparation d’une plante à digestibilité améliorée selon l’invention dans laquelle l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7, sont diminuées, ledit procédé comprenant les étapes de mutagénèse des gènes codant pour les protéines désignées ESK1 et TPS7.
Selon un premier mode de réalisation particulier, ce procédé permet la préparation d’une plante telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK, sont également diminuées (en plus de celles de ESK1 et TPS7) et comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée KAK.
Selon un second mode de réalisation particulier, ce procédé permet la préparation d’une plante telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS6, sont également diminuées (en plus de celles de ESK1 et TPS7) et comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée TPS 6.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité de chacune des protéines ESK1, TPS7, KAK et TPS6 est obtenue par mutagénèse des gènes codant pour leurs protéines respectives. Par exemple, une mutation à l’intérieur de la séquence codante d’un gène peut induire, en fonction de la nature de la mutation, l’expression d’une protéine inactive, ou d’une protéine avec une activité altérée. Une mutation de type knock-out où le cadre de lecture présente un codon stop prématuré peut également induire une diminution de l’expression de cette protéine.
Les mutants peuvent être obtenus par délétion, insertion et/ou substitution d’un ou de plusieurs nucléotides, par exemple par délétion de tout ou partie de la séquence codante du gène codant la protéine ou de son promoteur ou par l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéine ou de son promoteur.
La mutagénèse peut être mise en œuvre par l’induction de mutations aléatoires, par exemple en utilisant des agents physiques ou chimiques tels que l’EMS (Ethyl Methane Sulfonate) ou la mutagénèse d’insertion aléatoire, suivie de la sélection des mutants avec les mutations ciblées. Les méthodes de mutagénèse à haut débit suivie de la sélection des mutants sont bien connues. Par exemple, on peut citer la méthode de TILLING (Targeting Induced Local Lésions IN Genomes) qui est décrite notamment dans by McCallum et al., 2000, Colbert et al., 2001 Henikoff et al. , 2003 et Till et al., 2003). La technique de TILLING n’a cessé de se développer sur différentes espèces cultivées comme en témoignent de nombreuses publications telles que par exemple Taheri et al., 2017.
Alternativement, la mutagénèse peut être mise en œuvre par des méthodes utilisant des nucléases (TALEN, CRISPR/Cas9,...), décrites dans Shan et al., 2013, Leng et al., 2013, Svitashev et al., 2015 et Char et al., 2017.
Pour certaines plantes telles que le maïs, les mutants peuvent être des lignées d’insertion, par exemple choisis parmi la collection de lignées dites mutator ULMu ; la recherche des lignées de maïs qui possèdent une insertion de transposons dans les gènes orthologues d’intérêt peut être réalisée à l’aide du site internet https://maizegdb.org/data_center/stock.
Le génotypage des lignées est effectué selon les recommandations des auteurs (McCarty et al., 2013).
En l’absence d’insertion d’éléments transposables ou de mutants de TILLING dans les gènes choisis, la stratégie de mutagénèse par CRISPR/Cas9 est réalisée.
Enfin, l’inhibition de l’expression de la protéine cible peut être obtenue par une technique d’interférence ARN (RNAi), par expression d’un ARN antisense ou encore par des aptamères. La présente invention a pour objet un procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutation eskl, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS 7.
De façon préférée, ce procédé comporte également une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK ou une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS6.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une plante selon l’invention pour la production de biocarburant.
L’invention a en outre pour objet l’utilisation d’une plante selon l’invention pour la nutrition animale.
Figure 1 : Carte physique des gènes candidats sélectionnés pour la lignée beemlAXC. Beem signifie « biomass enhancement under eskimo 1 mutation ». Ce sont des lignées mutantes eskl mutagénéisées, dont le caractère nain est atténué. Position des variants SNP issue de l’analyse bio-informatique.
Figure 2 : Phénotype des mutants eskl , beemlAXC (lignée mutante eskl suppressée ou non suppressée pour le nanisme après une mutagénèse chimique) et sauvage. (A) Plantes représentatives de chaque génotype cultivé dans des conditions standards: type sauvage Col- 0, beemlAXC suppressée, beemlAXC eskimo- \kc en ségrégation dans la population mutagénisée non suppressée et eskX (B) Représentation de la ségrégation de lignée beemlAXC. Les carrés blancs montrent les plantes qui présentent le phénotype beem (C) Comparaison de la hauteur des plantes entre le mutant parental eskX et le mutant supressé beemlAXC.
Figure 3 : A Comparaison de la surface des rosettes entre différentes lignées. La lettre symbolise la classe à laquelle appartient chaque lignée, classe déterminée par un test de comparaison multiple (Tuckey). Le trait au milieu de chaque boîte représente la médiane, le losange indique la moyenne, les extrémités de chaque boîte représente le 1er et le 3eme quartile de la série, l’écart-type est représenté par les barres verticales, les individus extrêmes sont signalés par un point noir. B Effectifs du test d’allélisme.
Figure 4 : Représentation graphique du plasmide L1657.
Figure 5 : Arbre phylogénétique réalisé avec séquences protéiques des gènes TPS de classe 2 ancré avec la protéine du gène TPSX. Les valeurs indiquent la longueur des branches. Figure 6 : Plantes d’Arabidopsis au stade induction florale et à floraison.
A- En haut de gauche à droite : 2 plantes du mutant eskl, suivis de 2 plantes du double mutant tpsôeskl, de 2 plantes du double mutant tps7eskl , de 2 plantes du double mutant tps8eskl, 2 plantes du double mutant tps9eskl et 2 plantes du double mutant tpslOeskl. En bas sont présentes 2 plantes wild type (ColO).
B- De gauche à droite : 2 plantes Wild type (ColO), 2 plantes du simple mutants tps6, 2 plantes du double mutants tps6tps7 et 2 plantes du simple mutants tps7.
C- Plantes à floraison. De gauche à droite, la plante wild type ColO, suivi du triple mutant tps6tps7eskl, le double mutant tpsôeskl, le double mutant tps7eskl et le simple mutant eskl .
D- Vue des rosettes des plantes entières présentées en C.
Figure 7 : Position des cibles CrispR sur les séquences génomiques des gènes ZmOOOOl d022582 (ESK3) et Zm00001d028751 (ESK6).
Figure 8 : Caractérisation morphologique des plantes de maïs. A à gauche: Observation de la taille des plantes mutantes esk3.1, eskô.l et esk3.1esk6.1 par rapport à la taille de la plante sauvage (WT) au stade de floraison et la photo de droite à droite montre un défaut foliaire visible à partir de la 4eme feuille. B : Apparition des feuilles ligulées au cours du temps. C : Mesure de la hauteur des plantes au stade floraison. Les lettres a et b selon le test de Tukey indique que les plantes appartiennent deux groupes significativement différents. D : Distribution des génotypes en fonction de la longueur et largeur de la 8eme feuille.
Figure 9 : Résultat du traitement amylase réalisé sur les échantillons. Deux répétitions techniques par échantillon ont été effectuées, les résultats sont comparés à ceux provenant des étalons du laboratoire (points gris = répétition 1, points blancs = répétition 2, points noirs = étalons).
Figure 10 : Oligoxylanes obtenus après traitement xylanase et identification MALDI TOF. Les différents oligoxylanes sont répartis en fonction de leur m/z (axe horizontal) et leur proportion sur l’axe vertical. Les génotypes sont représentés par les pictogrammes, 3 répétions biologiques par génotype à l’exception des lots esk3.2esk6.2 (2 répétions biologiques).
Figure 11 : Evaluation de la digestibilité in vitro de la matière sèche (INDMD) et des résidus pariétaux (INCWRD) et des contenus en lignines (klason) des parois. A : en haut, moyennes de la digestibilité de la matière sèche en fonction des génotypes (3 répétions biologiques x 2 répétions techniques par génotype) ; en bas, la digestibilité des résidus pariétaux en fonction des génotypes (3 répétions biologiques par génotype x 3 répétions techniques). Le test de Tukey montre que les génotypes sont répartis en deux groupes significativement distincts (a et b). B : tableau des valeurs du contenu en lignine des résidus pariétaux selon les génotypes. (3 répétions biologiques x 2 répétions techniques par génotype) C : distribution des génotypes en fonction de la digestibilité des résidus pariétaux et de la quantité de lignine. Figure 12 : Coupes transversales d’entrenœuds de maïs après coloration FASGA. Les tissus peu lignifiés sont colorés en bleu et les tissus lignifiés en rose. En bas, grossissement des régions périvasculaires de la plante sauvage et du mutant eskô.l qui présentent des cellules très bleues et larges autour des vaisseaux par rapport à ceux de la plante sauvage.
Figure 13 : Mesures des surfaces des sections de coupes d’entrenœuds sous épi et quantification des différents tissus observés après la coloration FASGA. Les étoiles indiquent que les différences sont significatives (n=57).
EXEMPLE 1 : Mise en évidence de la mutation tps7 comme suppresseur de nanisme chez arabidopsis thaliana et caractérisation des plantes doubles mutants eskl et tps7 chez arabidopsis thaliana
Matériels et Méthodes
1. Obtention des « beem » par mutagenèse du mutant eskimol
Après mutagenèse chimique par EMS (3%), des graines homozygotes mutantes eskl- 5 d’ Arabidopsis thaliana , 4500 plantes Ml ont été cultivées, puis des groupes de 7 plantes Ml ont été réalisés. 200 graines M2 par groupe ont ensuite été semées et les groupes qui présentaient 4 à 5 plantes M2 ayant une croissance supérieure à celle du mutant eskl ont été isolés. Ces plantes appelées « beem » pour « Biomass Enhancement under Eskimol Mutation » ont été rétrocroisées avec le mutant eskl -5 et autofécondées pour observer à nouveau la suppression du phénotype nain en M3. Ainsi 12 lignées contenant des suppresseurs du nanisme du mutant At eskl ont été isolées. Des croisements entre les suppresseurs beem et les observations des ségrégations des phénotypes en Fl et en F2 indiquent que les mutations affectent des gènes différents à l’exception des beem308A et beem396B qui sont alléliques. L’ADN extrait à partir de groupe de 100 plantes beem F2 et le séquençage des génomes avec une profondeur de 100X a été réalisé pour 5 beem (563B, 396B, 241C, 142A, 648B).
Le mutant eskl -5 est génotypé avec la paire d’amorces ESK1-5#R2 et ESK1-5#L1 pour l’allèle sauvage et la paire d’amorces LBSalk2 et ESK1-5#R2 pour l’allèle muté. Le mutant tps7-l provient de la lignée SALK135044 et est génotypé avec les amorces LBSalk2 et RP-Salkl35044 pour l’allèle mutant et RP-Salkl35044 et LP-Salkl35044 pour l’allèle sauvage.
Le mutant tps7- 2 provient de la lignée SALK116341c et est génotypé avec les amorces RP-Salkl 16341 et LBSalk2 pour l’allèle mutant et avec les amorces RP- Salkl 16341 et LP-Salkl l341 pour l’allèle sauvage.
Le mutant tpsl-3 est la lignée GABI341E02. L’allèle mutant est déterminé par PCR avec les amorces Gabi08409 et RP-GK341E02 pour l’allèle muté et avec les amorces RP- GK341E02 et LP-GK341E02 pour l’allèle sauvage.
Le mutant tpsl-A est génotypé par PCR avec les amorces TS7#U1 et TPS7#L1 et le séquençage détermine la présence du SNP (G en A) par rapport à la séquence de référence.
Les séquences des produits PCR sont obtenues par la méthode Sanger et les séquences sont alignées sur le gène sauvage de référence pour déterminer la présence du SNP.
Les séquences des amorces T-DNA sont : LBSalk2, Gabi08409, Lbl.3.
Figure imgf000018_0001
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la PCR
2. Analyse bioinformatique
Une analyse bioinformatique a été menée en alignant les séquences (« reads ») du génome de 5 mutants beem (563 B, 396B, 241 C, 142A, 648B ) sur le génome de référence en utilisant le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.2 (Qiagen), sachant que les mutants beem n’étaient pas alléliques entre eux. Alignement de séquences
La fonction du“trimming” fournie par le logiciel CLC Genomics Workbench a été utilisée. Un trimming par qualité et par longueur de séquence a été fait dans un premier temps, avec les paramètres suivants :
score limite de qualité = 0,05 (Valeur de Phred équivalent à un score de qualité de 40: la probabilité d’appeler une base incorrectement est de 1 sur 10 000).
trim. de nucléotides ambigus = 0 (aucun nucléotide ambigu est permis)
trim. de longueur = reads avec une longueur de moins de 80 pb sont éliminés.
Les « reads » ont été cartographiés sur le génome de référence VArabidopsis (T AIR 10.0) selon les paramètres par défaut. Cependant, les paramètres de longueur de fraction (valeur de l'alignement qui doit correspondre à la séquence de référence avant d’être mise dans la liste de variants cartographiées) et la fraction de similarité (pourcentage minimum d'identité entre le « read » et la séquence de référence) sont respectivement 0.9 et 0.05.
La détection de SNP
La fonction « détection basique de variants » a été utilisée avec les paramètres suivants : couverture minimale= 6; comptage minimal= 2; et fréquence allélique minimum= 80%. Une liste de SNP pour chaque lignée beem a été obtenue. Puis, la liste des éventuels candidats a été choisie selon les paramètres suivants (Abe et al. , 2012 ; Hartwig et al. 2012) : a) SNP/INDEL (insertion ou délétion dans une séquence biologique) exclusif et unique pour la lignée beem241 C, b) Le SNP/INDEL doit être situé dans une région codante pour avoir des effets sur les séquences d’acides aminés, c) Le SNP/INDEL a une fréquence allélique entre 80- 100%.
La validation des SNP candidats
480 plantes de la descendance F2 du rétrocroisement : beemlAXC x esk 1 -5 ainsi que 24 plantes de la lignée parentale eskl -5 et 10 plantes sauvages Col-0 ont été semées en serre, afin d’évaluer la récessivité de la mutation beemlAXC pour les caractères morphologiques sélectionnés. Les plantes suppressées ont un aspect proche de celui d’une plante sauvage alors que les plantes non suppressées présentent des petites rosettes, des feuilles de couleur verte foncée et une hauteur des plantes plus petite que celle de plantes sauvages.
L’ADN des plantes suppressées « beem » a été extrait individuellement. Toutes les plantes ont été génotypées par PCR afin de vérifier leur homozygotie pour la mutation eskl . Puis des amorces ont été définies sur les gènes candidats pour lesquels les mutations EMS ont un effet sur la séquence en acides aminés (Tableau 2).
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Figure imgf000020_0001
Tableau 2 : Amorces utilisées. Séquences des amorces pour les gènes candidats exclusifs et indépendants responsables de la suppression du phénotype nain de la lignée beemlAXC.
Les produits d’amplification sont séquencés par la société Beckman Coulter Genomics (24 plantes suppressées « beem », 7 plantes sœurs avec le phénotype eskimo-like et une plante eskl). L’analyse des allèles sauvage ou mutant indique s’il y a une corrélation ou non avec le phénotype des plantes observées en utilisant le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.2 (Qiagen).
Résultats
1. Identification de la mutation beemlAXC
Environ 2000 SNP/INDEL ont été obtenus pour chaque lignée beem , mais seulement ceux qui sont exclusifs pour la lignée beemlAXC et qui répondent aux critères de sélection établis (fréquence allélique 80%- 100%, SNP/INDEL situés sur des exons) ont été retenus. Ainsi pour la lignée beemlAXC, 19 SNP/INDEL ont été obtenus avec une couverture de 76% pour l’ensemble des chromosomes. Mais seulement neuf gènes candidats répartis sur les chromosomes 1, 4 et 5 sont uniques et apparaissent avec une fréquence allélique allant de 80 à 100%. Ils sont situés dans les régions codantes des gènes (Figure 1 et tableau 3).
Un cluster de mutations sur le haut du chromosome 1 est retrouvé.
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Tableau 3 : Gènes candidats repartis sur les chromosomes 1, 4 et 5 retrouvés lors de l’analyse bio-informatique. Chr. Chromosome, Réf. Nucléotide de référence, Mut. Nucléotide de mutant, Couv. Couverture, Freq. Fréquence. (*) Protéine Inconnue, (SNV) Single Nucléotide Variant, (D) Délétion, (I) Insertion, (G) Guanine, (A) Adénine, (T) Thymine.
La plupart des mutations sur le chromosome 1 présentent des changements de G par A. Sur les chromosomes 4 et 5 les variants correspondent à des délétions et insertions rarement retrouvées par mutagenèse chimique EMS. CVP2 et TPS7 sont les variants uniques qui présentent une fréquence de 100% avec 60 et 63 séquences respectivement.
Des plantes M2 beemlAXC ont été rétrocroisées cinq fois avec leur parent eskl . La population F2 résultante a montré une ségrégation pour la taille de la rosette de 138 plantes beem : 342 plantes non suppressées (Test du Chi2 positif pour la ségrégation espérée 1:3- p- value =0.05778) (Figure. 2). Ce résultat confirme que la mutation responsable du phénotype suppressé est récessive. L’ADN des 138 plantes suppressées a été extrait individuellement pour vérifier par PCR que toutes les plantes sont homozygotes eskl, puis le séquençage des gènes candidats autour du SNP détecté a été réalisé. La suppression entraîne le changement d’une serine en proline au codon 814 de la séquence codante (CDS) de TPS7 conduisant potentiellement à la traduction du domaine TPS complet (Tréhalose Phosphate Synthase) et du domaine TPP modifié (Tréhalose Phosphate Phosphatase) de la protéine.
2) _ Tests de complémentation avec les mutants d’insertion d’ADN-T dans le gène TPS7
Les mutants tps7-l, tps7-2, tps7-3 ont été croisés avec le mutant eskl-5 afin de sélectionner en F2 les doubles mutants tps7-l eskl-5, tps7-2eskl-5 et tps7-3eskl-5 en utilisant les amorces identifiées dans le tableau 1.
Pour réaliser le test de complémentation, ces doubles mutants ont été croisés avec le mutant beemlAXC et la surface des rosettes des descendances Fl ( beem241C tps7 eskl ) a été mesurée après 4 semaines de croissance. La surface des rosettes des descendances Fl ( beem241C tp7s eskl ) observée est similaire à celle de beemlAXC. Les résultats des tests de complémentation représentés à la Figure. 3 nous indiquent donc que beemlAXC est tpsl .
On observe aussi que les doubles mutants tps7 eskl-5 ont un phénotype intermédiaire entre celui de la plante sauvage et celui du mutant eskl -5 comme ce qui est observé chez le mutant beemlAXC, la taille des rosettes étant plus importante que celle du mutant eskl-5.
3 ) _ Production de biomasse
Pour évaluer la production de biomasse, les plantes ont été cultivées sur l’automate de phénotypage Phenoscope (Tisne et al. 2013), dans des conditions contrôlées et reproductibles. Le poids de matière sèche des rosettes âgées de 44 jours et déshydratées pendant 48 h a été mesuré.
Les résultats de cette mesure sont disponibles dans le tableau 4.
On peut constater que les simples mutants tps7 présentent une biomasse significativement plus élevée (23 à 32%) que le sauvage en condition irriguée comme en condition de déficit hydrique.
Les doubles mutants tps7 eskl-5 présentent une biomasse supérieure à celle du mutant eskl -5 en condition irriguée.
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Tableau 4 : Biomasse (matière sèche) des rosettes d’A. thaliana âgées de 44 jours prélevées sur le Phenoscope. Le nombre d’individus mesurés dans chaque condition pour chaque génotype est indiqué dans la colonne N.
EXEMPLE 2 : Mise en évidence de l’effet sélectif de la mutation tps7 comme suppresseur de nanisme chez arabidopsis thaliana et caractérisation des plantes triples mutants eskl, tps7 et tps6 chez arabidopsis thaliana
L’obtention des double mutants tpseskl a été réalisé à partir des lignées porteuses de mutation dans chacun des gènes de classe 2 (Tableau 5 et figure 5).
Figure imgf000023_0001
Tableau 5 : Liste des gènes TPS de classe 2 avec leur identifiant (ID), les lignées mutantes obtenues au Stock Center et les oligonucléotides utilisés pour identifier les plantes homozygotes mutantes. Les oligonucléotides T-DNA sont ceux préconisés sur le site http://signal.salk.edU/tdnaprimers.2.html
Après sélection des plantes homozygotes mutantes tps, celles-ci ont été croisées avec le mutant eskl. Les plantes Fl ont ensuite été semées pour rechercher les doubles mutants. Ainsi les doubles mutants : tps5eskl, tpsôeskl, tps8eskl, tps9eskl, tpslOeskl Tpslleskl ont été sélectionnés en F2. Seul le mutant tps7eskl présente des rosettes de taille supérieure à celle du mutant eskl de même que par rapport celles des autres mutants (figure 6A).
Lors de la sélection des simples mutants tps6 (un des proches homologues du gène TPS7 et d &TPS5 (figure 6B) montrent une taille de rosette semblable à celle du mutant tps7. La sélection du double mutant tps6tps7 a donc été entreprise et une surface légèrement supérieure des rosettes a été notée.
Les profils d’expression des gènes TPS de classe 2 d’après Ramon et al, 2009 et la très forte homologie entre les séquences protéiques des gènes TPS5, TPS6 et TPS7 représentée sur l’arbre phylogénétique (figure 5), a conduit à rechercher les triple mutants tps6tps7 eskl (figures 6C et 6D). Alors que le double mutant tpsôeskl ne supprime pas le nanisme des rosettes, celui-ci est supprimé avec la triple combinaison et la surface des rosettes semble même être augmentée avec un plus grand nombre d’inflorescences secondaires. Ce résultat suggère qu’il existe une interaction entre les protéines TPS6 et TPS7 capable dans le contexte de la mutation eskl de supprimer les effets de « stress » qui bloquent la croissance des plantes.
EXEMPLE 3 : Détermination chez le maïs de l’orthologue du gène AlESK I.
Matériel et méthodes
La recherche chez le maïs des orthologues au gène AlESK I (ID du gène AT3G55990) a été effectuée sur la plate-forme Plaza v.4 (Van Bel et al., 2017).
Le ciblage CrispR cas9 se fait avec l'oligo A qui cible Zm00001d022582 et se trouve à la fin du premier des exons. L'oligo B cible principalement Zm00001d028751 (23/23) mais aussi Zm00001d022582 (17/23 ; 3' fin conservée). Il est situé dans l'exonl d'un total de 3 exons et est situé en amont de la région conservée.
Oligo A = ESK3-CR85 dans Zm00001d022582 : ACAGGTCGCACCCGGCAACCTGG Oligo B = ESK6-CR24 dans Zm00001d028751 : GCAGACGTGCGACCTGTACCGGG Ci-dessous figurent les amorces utilisées pour cibler les gènes Zm00001d028751 ( ESK3 ) et Zm00001d028751(ESK6 ) ainsi que les amorces utilisées pour les PCR et le séquençage (Tableau 6).
Figure imgf000024_0001
Tableau 6 Obtention et sélection des mutants
Les embryons immatures de maïs de la lignée A188 ont été transformés via Agrobacterium tumefaciens par le plasmide L1657-ESK portant entre les limites gauche et droite de l'ADN- T, le gène CAS9 sous le contrôle du promoteur Ubiquitine, les oligos A et B et le gène BAR. Les transformants obtenus après la régénération des cals ont été cultivés et croisés avec la lignée A 188 utilisée comme parent maternel ou paternel.
En serre (photopériode de 16 jours), 12 plantes Fl de chaque croisement ont été cultivées. La présence ou l'absence des gènes BAR et CAS9 est déterminée par la présence ou l'absence de produits de la PCR effectuée sur l'ADN des plantes Fl avec les primers du tableau 6 ci- dessus. La présence de mutations hétérozygotes dans les gènes cibles est vérifiée par le séquençage des produits de PCR et par l'utilisation du logiciel (Dehairs, J. et al. CRISP-ID : décodage des indels médiés par CRISPR par Sanger séquençage Sci. Rep. 6, 28973 ; doi : 10.1038/srep28973 (2016)). Des plantes négatives pour les produits de PCR BAR et CAS9 mais hétérozygotes pour les gènes d'intérêt ont été rétrocroisées sur des plantes A 188 et autofécondées. Les plantes F2 sont ensuite cultivées en serre, parmi celles-ci, les plantes mutantes homozygotes et les plantes sœurs anizygotes sont sélectionnées par PCR et par séquençage PCR de Sanger et à nouveau autofécondées pour produire un nombre de grains suffisants permettent les analyses suivantes.
Les plantes mutantes F3 (n=12) de chaque génotype et les plantes de type sauvage sont cultivées en serre jusqu'au stade de l'ensilage. Les caractéristiques morphologiques comme la taille de la plante, la longueur et la largeur de la 8ème feuille sont mesurées au moment de la floraison et pendant le développement des plantes. Le nombre de feuilles ligulées est reporté au cours du temps.
Au stade ensilage, les plantes entières avec épi sont coupées, puis des lots de plantes de même génotype sont grossièrement broyés, mis en sac et pesés avant d'être déshydratés par un passage de 96 heures dans une étuve à 50°C. La teneur en matière sèche est calculée par la différence de masse avant et après le séchage. Les échantillons sont ensuite finement broyés à l'aide d'un broyeur à marteaux (grille de 1 mm) en une poudre homogène.
Trois lots de 3 plantes de même génotype constituent 3 répétitions biologiques et deux répétitions techniques par analyses sont effectuées au minimum.
Analyses biochimiques
Des analyses biochimiques sont effectuées sur les poudres après validation et calibration des pesées. Préalablement à l’extraction des résidus de paroi cellulaire (CWR) par des passages eau/éthanol (Soxhlet), un traitement amylase est effectué sur les poudres de matière sèche. 2g de matière sèche sont repris dans 20 ml d’eau distillée auxquels sont ajoutés 400pl de la solution amylase (HTL Ankom). Les tubes sont incubés à 100°C pendant 15 min avec une agitation au milieu de l’incubation. Puis les tubes sont plongés dans la glace pour les refroidir. Une centrifugation de 15 min à 18G est effectuée, les surnageants sont éliminés par aspiration et les culots sont rincés deux fois à l’eau distillée (20 ml) et centrifugés. Les culots sont ensuite congelés à -80°C puis lyophilisés pendant 30h. La perte pondérale est estimée par pesée avec 2 répétitions technique par échantillon. La valeur est validée si moins de 5% d’erreur entre les répétions et les valeurs des étalons (Ronaldinio Z18DIgPE106 sont conformes) (figure 9).
La digestibilité de la matière sèche in vitro (IVDMD) et la digestibilité des résidus de paroi cellulaire (IVCWRD) ont été estimées selon un protocole modifié dérivé de Aufrère et Michalet-Doreau (1983). 30 mg de matière sèche sont prétraités dans une solution acide (HCL 0,1N) à 40°C pendant 24 h, puis une solution de NaOH 2 M est ajoutée pour mettre fin à la réaction. L'échantillon est ensuite incubé dans une solution de cellulase (Cellulase Onozuka RIO 8 mg.ml-1, NaAc 0,1M pH 4,95, Na2C03 0,4%) à 50°C pendant 72 h. Après centrifugation, le culot est lavé à l'eau et congelé avant la lyophilisation. La perte de poids est exprimée en pourcentage du poids initial (30 mg). La teneur en lignine dans la paroi cellulaire (KL.CWR) est estimée par la méthode Klason selon Dence (1992) (2 répétions techniques par échantillon, une troisième est réalisée si les résultats donnent plus de 5% d’erreur).
La détermination de l'acétylation du Xylane est effectuée sur quelques microgrammes de matière sèche digérée dans une solution tïendo- 1 ,4-P-Xylanasc (E-XYRU6, Megazyme) en tampon acétate de sodium 50mM préalablement dessalée. Les échantillons sont ensuite analysés et identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
La préparation des coupes histologiques et les analyses statistiques ont été réalisées selon les protocoles décrits dans la publication (Legland et al., 2017).
Traitements statistiques
Les analyses statistiques des données sont effectuées sous Excel ou avec le logiciel RStudio.
Résultats
Par analyse bioinformatique à l’aide du logiciel PLAZA v.4, deux gènes candidats Zm00001d028751 et Zm00001d022582 ont été sélectionnés comme étant les meilleurs candidats orthologues au gène AtESKl (AT1G55990) chez Arabidopsis. Il est apparu intéressant de réaliser directement le double ciblage génétique par la stratégie CrispR cas9 pour valider rapidement si ces candidats étaient les bons, étant donné la très forte homologie avec les autres gènes orthologues appartenant à la famille des TBL29.
Sur la figure 7 sont représentés l’oligo A qui cible le gène ZmOOOOl d022582 ( ESK3 ) et se trouve à la fin du premier exon, et l'oligo B qui cible principalement ZmOOOOl d028751 ( ESK6 ) (23/23) mais aussi ZmOOOOl d022582 (17/23 ; extrémité 3' conservée). Il est situé dans l'exonl sur un total de 3 exons.
Les transformants de maïs obtenus par transformation T-DNA ont été analysés par séquençage et ainsi plusieurs mutants alléliques ont été obtenus (tableau 7). Par rétrocroisement avec la lignée sauvage, il a été possible dans les descendances en ségrégation de sélectionner des simples mutants alléliques esk3 et esk6 mais aussi des doubles mutants alléliques esk3esk6.
Figure imgf000027_0001
Tableau 7: Description des mutations obtenues dans chaque gène étudié
Les caractérisations morphologiques et biochimiques se sont focalisées sur deux des 4 mutants alléliques du gène ZmOOOOl <1028751. Il s’agit du mutant eskô.l dont la mutation crée un codon STOP ayant pour conséquence une protéine tronquée de 192 acides aminés sur les 555 totaux, et du mutant esk6.2 dont la mutation entraine un changement de phase de lecture à partir de l’acide aminé 192 jusqu’au 308eme conduisant ainsi à une protéine tronquée de 247 acides aminés.
Pour le gène ZmOOOOl <1022582, seulement deux mutants alléliques ont été obtenus, il s’agit des mutants esk3.1 et esk3.2 dont les mutations créent un changement de phase de lecture à partir de l’acide aminé 158 et à des protéines tronquées de taille 223 et 225 acides aminés respectivement sur les 529 acides aminés prédits. Les doubles mutants esk3.1 eskô.l et esk3.2esk6.2 ont aussi été étudiés dans cette étude.
La culture de l’ensemble des plantes mutantes et sauvages a permis de montrer que les plantes porteuses de la mutation esk6 ont une taille réduite de 27% par rapport à celle des plantes sauvages (figures 8A et 8C). La longueur et la largeur de la plus longue feuille sont elles aussi impactées avec une diminution des surfaces de 20 et 27% respectivement (figure 8D). Un retard de croissance de 3 semaines environ est également observé chez toutes les plantes porteuses de la mutation esk6 (figure 8B). En revanche, les plantes porteuses de la mutation esk3 ne sont pas différentes des plantes sauvages (figures 8A et 8C). Les doubles mutants esk3esk6 sont aussi nains, ce qui indique une forte pénétrance de la mutation (figures 8A et 8C). Comme les simples mutants esk6, les bordures et les extrémités des feuilles des doubles mutants esk3esk6 jaunissent ou se dessèchent à partir de la 4eme feuille. Au stade ensilage déterminé après observation de la maturation des grains situés au milieu de l’épi (stade pâteux, vitreux, laiteux), les lots de plantes de même génotype (3 lots) ont été récoltés et les pourcentages de matière sèche indiquent que les plantes ont été prélevées au même stade de maturité avec des valeurs qui varient entre 30 et 37% selon les lots (Tableau
8)-
Figure imgf000028_0001
Tableau 8: Pourcentage de matière sèche des plantes entières récoltées au stade ensilage.
L’analyse des oligoxylanes montrent que seuls les mutants alléliques eskô.l et esk6.2 ont une diminution de Xyl6 Ac2, Xyl6 Ac3, Xyl6 Ac4 et une augmentation très importante de Xyl4(Glc4Me)Ac (figure 10). Par contre les simples mutants alléliques esk3 et les doubles mutants esk3esk6 ont des oligoxylanes peu de différents de ceux des plantes sauvages.
A partir de ces résultats, on peut conclure que le gène Zm00001d028751 ( ESK6 ) est l’orthologue du gène AtlG55990 et a une fonction de Xylane O-Acetyl transférase.
Le nanisme observé chez toutes les plantes porteuses de la mutation esk6, simple ou double mutant, montre la pénétrance de la mutation. D’après ces résultats, le gène ZmOOOOl <3022582 ( ESK3 ) n’a pas de fonction impliquée dans l’acétylation des xylanes.
Amélioration de la digestibilité de la biomasse par la mutation esk6. Toutes les plantes porteuses de la mutation esk6 (simples et doubles mutants) ont une meilleure digestibilité de la matière sèche (INDMD) de 2 à 4% selon les génotypes par rapport aux plantes sauvages. Les plantes porteuses de la simple mutation esk3 sont peu digestibles par rapport aux plantes sauvages (de -2 à -4%) et fortement moins digestibles par rapport aux mutants esk6 et aux doubles mutants esk3esk6 (de -5 à -8%) (figure 11A).
L’analyse des résultats de la digestibilité des résidus pariétaux (INCWRD) montrent également les mêmes résultats avec clairement une amélioration de la digestibilité de la biomasse chez les plantes porteuses de la mutation esk6 comme l’indique le test statistique de Tukey sur la figure 11A. Cette digestibilité est améliorée de 3 à 4 points selon les génotypes.
La teneur, la composition et la structure des lignines sont inchangées chez les mutants.
Pour savoir si l’amélioration de la digestibilité de la biomasse des mutants est liée à une teneur plus faible en lignine, celle-ci a été quantifiée par la méthode Klason sur les résidus pariétaux. Les teneurs varient extrêmement peu de 13,8 à 14,9% (figure 11B). La distribution des génotypes en fonction de TIVCWRD et de la teneur en lignine Klason montre deux groups de plantes distincts. Le premier groupe est constitué de tous mutants porteurs de la mutation esk6 (simples et doubles mutants) et le deuxième des simples mutants esk3 et des plantes sauvages (figure 11C). Ce résultat nous indique qu’à teneur en lignine équivalente, les plantes mutantes esk6 et esk3esk6 sont beaucoup plus digestibles.
Pour savoir, si cette digestibilité est liée à un changement dans la composition et la structure des lignines, une thioacidolyse a été réalisée sur les simples mutants esk6 et les doubles mutants esk3esk6.
Les résultats (non présentés ici) indiquent qu’il n’y a pas de changement dans la composition et la structure des lignines des mutants par rapport au témoin sauvage.
La mutation esk6 agit sur la taille des entrenœuds et la production d’un parenchyme médullaire moins lignifié.
Sur la figure 12A sont présentées des coupes d’entrenœuds de tiges de maïs après coloration au Fasga. On peut observer que les plantes porteuses de la mutation esk6 ont des surfaces d’entrenœuds réduites par rapport à celles des plantes sauvage et mutantes esk3. De plus une coloration bleue plus prononcée de la moelle chez les mutants esk6 et esk3esk6 nous indique que les cellules du parenchyme médullaire sont moins lignifiées que celles des plantes sauvage et mutantes esk3 lesquelles ont un parenchyme rose donc plus lignifié. La coloration bleue des cellules périvasculaires du mutant esk6 (figure 12B) indiquent qu’elles sont peu lignifiées et elles semblent de taille plus importante par rapport à celles du sauvage. Ces observations sont confirmées par le traitement statistique des coupes d’entrenœuds (n=57) (figure 13). Il montre que les mutants esk6 et esk3esk6 ont une réduction significative de la surface des entrenœuds. Egalement, ces derniers ont significativement moins de tissus lignifiés et une proportion plus importante de tissus non lignifié. Cependant, l’analyse statistique ne révèle pas de différence significative concernant l’épaisseur de l’écorce et la surface des vaisseaux vasculaires.
Etant donné les résultats obtenus en biochimie sur les teneurs en lignine, ceci suggère une distribution spatiale différente des lignines au sein des tissus.
Conclusion
Le gène Zm00001d028751 est l’orthologue du gène AT1G55990 chez arabidopsis. Il conduit au même défaut développemental à savoir le nanisme des plantes et s’accompagne d’une meilleure digestibilité de la biomasse résultant d’une diminution de l’acétylation des xylanes. Les vaisseaux vasculaires du mutant ne sont pas collapsés comme c’est le cas chez le mutant Ateskl d’arabidospis. Par ailleurs les observations de plusieurs centaines de coupes histologiques d’entrenœuds de maïs issus de plantes cultivées en condition de stress hydrique n’ont jamais permis d’observer le collapse des vaisseaux de xylème mais le même pattern de distribution des tissus observés chez le mutant esk6.
EXEMPLE 4 : Caractérisation des plantes doubles mutants eskl et tps7 chez le maïs
1. Recherche des orthologues in silico chez le maïs à partir des plantes d Arabidopsis thaliana
Sur le site internet https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v4_monocots/, dans le moteur de recherche, rentrer le nom du gène ES Kl chez Arabidospsis thaliana , à savoir AT3G55990,
dans la partie « Toolbox, explorer », sélectionner l’onglet « the orthologs using the Intégrative Orthology Viewer »,
sélectionner pour l’espèce“Zea Mays” l’orthologue correspondant au « Best-Hits- and-Inparalogs(BHI)family », en l’occurrence Zm00001d028751,
dans la partie « Toolbox, view », sélectionner l’onglet « sequences ».
Les séquences nucléotidiques et protéiques de Zm00001d028751 sont alors accessibles.
Pour le gène TPS 7, on renouvelle l’opération avec le nom du gène TPS 7 chez Arabidospsis thaliana , à savoir AT1G06410 et on trouve l’orthologue chez le maïs, sous la référence Zm00001d043469. 1.1. Vérification de la présence des motifs conservés dans les orthologues de maïs
On réalise un alignement protéique entre la séquence d’Arabidopsis thaliana et celle de
Zea Mays, à l’aide du site https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/.
La présence du motif GDSL, présent dans le domaine acyl-estérase de la protéine ESK1 est confirmée directement à partir de cet alignement de séquences.
La présence d’un domaine transmembranaire est identifiée via l’outil bioinformatique TMHMM, accessible à partir du site internet http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
1.2. Obtention des mutants de maïs
Il existe 2 gènes orthologues pour le gène ES Kl (AT3G55990) chez le maïs : Zm00001d022582 et Zm00001d028751.
Des transformations génétiques d’embryons immatures de maïs A188 sont réalisées avec le plasmide L1657-ESK (Figure 4) portant entre les bordures du T-DNA le gène codant pour la protéine CAS9 sous le contrôle du promoteur Ubiquitine ainsi que les séquences cibles des gènes d’intérêt. Pour les gènes Zm00001d022582 et Zm00001d028751, les séquences cibles sont respectivement CAGGTCGCACCCGGCAACC et
CAGACGTGCGACCTGTACC.
Il existe 3 gènes orthologues pour le gène TPS7 (AT1G06410) chez le maïs: ZM03G31920 (ZmTprs7), ZM03G31900 (ZmTprsSô) et ZM08G34940 (ZmTPrsl5) chez le maïs. Pour le gène ZM03G31900, il existe des insertions de transposons mutator comme mul069747 dans UFMu-08325 et mul077018 dans UFMu-08873 et pour le gène ZM08G34940, il existe seulement une insertion d’un élément transposable dans la partie exonique : il s’agit de mul057945 dans la lignée UFMu-07357. Pour le gène ZM03G31920 qui est le plus proche orthologue de AtTPS7, il n’y a aucun élément transposable dans le gène. Une stratégie de mutagenèse par CRISPR/Cas9 est alors nécessaire.
2. Matériels et Méthodes
Les doubles mutants eskl tps7 ainsi que les simples mutants et les sauvages sont élevés en serre ou plateforme dédiée. Toutes les caractéristiques morphométriques et phénologiques informatives comme la date d’apparition de la troisième feuille ligulée, date de floraison, hauteur des plantes, largeur et longueur de la plus longue feuille sont mesurées.
Les plantes sont prélevées au stade ensilage et au stade grains matures. La teneur en eau des tiges et des feuilles est évaluée par pesée avant et après séchage en étuve à 50°C pendant 4 jours. La biomasse sèche est broyée en poudre fine avec un broyeur à couteaux IKA M20.
La biomasse des différentes lignées est caractérisée comme suit :
1 / La digestibilité par hydrolyses enzymatiques (Virlouvet et al., en préparation).
3 répétitions techniques par échantillon sont effectuées.
30 mg de matière sèche sont incubés 24h à 40°C en présence de HCL0,1N puis 90m1 de soude 2M sont ajoutés. Après avoir passé le mélange au vortex, 2 ml de solution de cellulolyse (NaAc 0,1M pH 4,95, Sodium azide 0,4%, Cellulase ONOZUKA RIO 8mg.ml- 1) sont ajoutés. L’ensemble est placé sous agitation à 50°C pendant 72h. Les tubes sont centrifugés 15 min à 4000 RPM 8°C , les surnageants sont éliminés et 4 ml d’eau sont ajoutés pour laver les culots. Après reprise des culots à l’aide d’un vortex, une nouvelle centrifugation est réalisée pendant 10min. Un nouveau rinçage à l’eau et centrifugation sont réalisés et le surnageant est ensuite éliminés. Les culots sont congelés à -80°C avant lyophilisation pendant 48h minimum. Les culots secs sont ensuite pesés. La perte pondérale est calculée en pourcentage.
2 / Le taux d’acétate selon les recommandations du kit de K-Acetic acid de Megazyme à partir de 25mg de résidus pariétaux obtenus par la méthode Soxhlet.
3 / Le contenu en sucre de 10 mg de résidus pariétaux non cellulosiques obtenus après un traitement à l’acide Triflluoroacétque (TFA) 2,5M. L’analyse est effectuée par HPLC par rapport aux sucres de référence (D(+)-Fucose , D(+)- Arabinose, D(+)- Glucose, D(+)- Galactose, D(+)- Mannose, D(+)-D(+)- Xylose, L-Rhamnose, D(-)-Fructose.
Le dosage du tréhalose-6 phosphate et du tréhalose sont effectués par analyse chimique.
4 / Des observations cytologiques des vaisseaux xylémiens (entrenoeud sous épi) et des racines sont réalisées en microscopie photonique.
Les taux de lignine par la méthode lignin Klason à partir de 150mg de résidus pariétaux selon le protocole décrit par Méchin et al., 2014.
Au stade ensilage, l’acquisition de spectres Infra-rouge avec transformée de Fourier (FTIR) obtenus à partir des tissus xylémiens sur coupe d’entrenoeuds sous épi de 50 mhi permet la mise en évidence de l’acétylation des xylanes (Lefebre et al., 2011).
Des colorations histologiques au Fasga des entrenoeuds sous épi permettent de visualiser les tissus lignifiés et non lignifiés, la forme des vaisseaux ainsi que leur densité (Legland et al, 2017).
EXEMPLE 5 : Caractérisation des plantes triples mutants eskl, tps7 et KAK chez le maïs
1. Recherche des orthologues in silico chez le maïs à partir des plantes d’Arabidopsis thaliana
La recherche de l’orthologue du gène KAK chez le maïs est réalisée comme décrit dans l’exemple 2 avec le nom du gène KAK chez Arabidospsis thaliana, à savoir AT4G38600 et on trouve l’orthologue chez le maïs, sous la référence Zm00001d004139.
Il existe 2 gènes orthologues pour le gène KAK (AT4G38600) chez le maïs : ZmOOOO 1 d004139 (ZmKak\ ) et ZmOOOOldO 14920 (Zm Kaki).
Des plantes homozygotes mutantes dans le gène Zm Kaki ont été obtenues par insertion d’un transposon mutator : mul057066 dans la lignée UFMu-07383. En ce qui concerne le gène ZmKakl, une stratégie de mutagenèse par CRISPR/Cas9 est plus adaptée.
2. Matériels et Méthodes Les doubles mutants eskl tps7 sont croisés avec les doubles mutants eskl kak. La descendance des plantes Fl (homozygote esk, hétérozygote tps7, hétérozygote kak) est élevée pour produire une descendance F2 par autofécondation. Parmi les plantes F2, l/16ème de plantes sont triples mutants esk tps7 kak. La sélection des plantes se fait par génotypage par PCR avec les amorces utilisées pour sélectionner les simples mutants.
Les mêmes études que celles décrites dans l’exemple 2 sont menées.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Plante obtenue par mutagénèse telle que :
l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et
l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7,
sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée et la diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéines ESK1 et TPS7 ayant été obtenues par au moins une mutation dans chacun des gènes codant pour les protéines ESK1 et TPS7, et telle que :
la protéine ESK1 non mutagénisée a au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et comprenant les domaines acyl-estérase et transmembranaire, et
la protéine TPS7 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprenant les domaines TPS et TPP.
2. Plante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de la protéine KAK ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine KAK, et telle que la protéine KAK non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et comprenant les répétitions armadillo ainsi qu’un domaine HECT.
3. Plante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS6 sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de la protéine TPS6 ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine TPS6, et telle que la protéine TPS6 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 65 et comprend les domaines TPS et TPP.
4. Procédé de préparation d’une plante à digestibilité améliorée selon la revendication
1, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes de mutagénèse des gènes codant pour les protéines désignées ESK1 et TPS7.
5. Procédé selon la revendication 4 de préparation d’une plante selon la revendication
2, caractérisé en ce qu’il comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée KAK.
6. Procédé selon la revendication 4 de préparation d’une plante selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée TPS 6.
7. Procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutation eskl, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7.
8. Procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutation eskl selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il comporte une étape additionnelle de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK.
9. Procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutation eskl selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il comporte une étape additionnelle de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS 6.
10. Utilisation d’une plante selon Tune quelconque des revendications 1 à 3, pour la production de biocarburant.
11. Utilisation d’une plante selon Tune quelconque des revendications 1 à 3, pour la nutrition animale.
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