FR3092473A1 - Obtention de plantes ayant une digestibilite de la biomasse améliorée - Google Patents
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Abstract
[Obtention de plantes ayant une digestibilité de la biomasse améliorée La présente invention se rapporte à une plante obtenue par mutagénèse telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine ESK1 et l’expression et/ou l’activité de la protéine TPS7 sont diminuées par rapport à une plante parente non mutagénisée. Ladite plante dont la biomasse présente une meilleure digestibilité, conserve une croissance satisfaisante. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de ladite plante ainsi que l’utilisation de ladite plante pour la production de biocarburant.
Description
La présente invention se rapporte au domaine de la production de biomasse végétale.
Elle a plus particulièrement pour objet la préparation de plantes qui ont une biomasse présentant une meilleure digestibilité (propriété également désignée par dégradabilité) et qui conservent une croissance satisfaisante.
Les énergies fossiles comme le pétrole, le charbon et le gaz représentent toujours la principale source énergétique tout secteur confondu. Dans le domaine des transports, c’est encore le pétrole qui prédomine largement. Cependant, ces hydrocarbures sont très polluants pour l’environnement notamment en ce qu’ils relarguent beaucoup de CO2lors de leur combustion, stock de carbone qui était enfoui auparavant. En outre, les gisements se font de plus en plus rares et l’extraction devient de plus en plus onéreuse (https://www.planete-energies.com/fr/medias/decryptages/les-energies-fossiles).
Les biocarburants pourraient répondre en partie à l’amenuisement des réserves de pétrole. Les biocarburants de première génération sont issus des sucres simples et huiles présents dans les végétaux, qui sont transformés en éthanol et bio-ester. Les biocarburants de seconde génération (Simset al.,2010) sont produits à partir de biomasse ligno-cellulosique ; cette biomasse est constituée de l'ensemble des parois cellulaires des végétaux. L'avantage de ces biocarburants de seconde génération est que leur production n'entre pas en compétition avec l'alimentation humaine. La biomasse ligno-cellulosique utilisée pour les bio-carburants de seconde génération peut être extraite des résidus culturaux tels que ceux du maïs.
Le coût de production de biocarburant à partir de cette biomasse ligno-cellulosique est encore relativement élevé bien que la matière première soit peu chère. De plus, la biomasse utilisée comme fourrage pour les animaux domestiques ne présente pas une digestibilité optimale.
Au sein des plantes, certains tissus sont plus riches que d’autres en biomasse ligno-cellulosique. C’est le cas notamment des tissus du xylème, composés essentiellement de vaisseaux conducteurs de sève brute et de fibres. Le xylème est un puits de carbone ; les sucres simples issus de la photosynthèse y sont stockés sous forme de bio-polymères constituants de la paroi.
Les polymères végétaux sont complexes et liés entre eux ce qui rend leur accessibilité pour la digestion par les animaux ou pour leur exploitation dans l’industrie chimique laborieuse et relativement polluante.
En outre, l’exploitation de la biomasse ligno-cellulosique est un procédé qui requiert une première étape de prétraitement visant à « rompre » la matrice cellulose/hémicellulose/lignine qui forme la structure des parois secondaires lignifiées qui se composent d’un enchevêtrement complexe de fibrilles de celluloses imbriquées dans une matrice de lignine et d’hémicellulose. Ce maillage dense peut donc gêner l’accès des enzymes digestives aux polysaccharides d’intérêts comme la cellulose, polymère d’hexose ou les hémicelluloses, tels que le xylane, un polymère de pentoses.
L’obtention de lignées de plantes plus facilement digestibles avec une taille et une croissance identique à leur équivalent sauvage est ainsi un enjeu d’actualité (Kalluriet al.,2014). Parmi les stratégies mises en œuvre pour y parvenir, il existe des stratégies de réduction du taux de lignine ou la modification de leur structure chimique (décorations, liaison aux autres polymères), ce qui entraine des défauts de vigueur incompatibles avec leur culture (Mottiaret al., 2016). D’autres stratégies, notamment celles qui sont testées et inventoriées par Bhatia et collaborateurs (Bhatiaet al.,2017) consistent en la modification des liaisons entre les polymères ainsi que la modification des décorations des hémicelluloses.
De précédents travaux ont permis d’identifier des mutants d’Arabidopsis thalianatolérants au gel sans période d’acclimatation préalable nomméseskimo 1(esk1) (Xinet al., 1998). Des plantes ayant le gèneesk1muté ont ensuite été caractérisées par leur insensibilité au stress hydrique (Bouchabke-Coussaet al., 2008), leur phénotype nain (Lefebvreet al., 2011) ainsi qu’un faible niveau d’acétylation des xylanes (Yuanet al., 2013).
Cette faible acétylation des xylanes observée chez le mutantesk1entraîne une meilleure digestibilité enzymatique des parois (Bensussanet al., 2015), ce qui représente un avantage précieux pour la transformation des végétaux d’intérêt agronomique, notamment pour la production de bio-carburants ou pour l'alimentation animale.
Toutefois, même en conditions de culture optimales, ce mutant se caractérise notamment par un phénotype nain et les plantes portant la mutationesk1produisent finalement très peu de biomasse, ce qui limite considérablement leur intérêt pour la production qu’elle soit destinée à l’alimentation animale ou à la fabrication de biocarburants.
Dans ce contexte, des études complémentaires ont porté sur l’identification de nouvelles lignées présentant une bonne dégradabilité de leur paroi mais ayant une croissance améliorée ; ces études ont conduit à l’identification d’un double mutant (gèneskaketesk1-5) qui conserve un bas niveau d’acétylation des xylanes mais chez qui le phénotype nain est supprimé (Bensussanet al., 2015).
Les Inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle mutation qui, associée à la mutation du gèneesk1, conduit à une lignée conservant un bas niveau d’acétylation des xylanes et ayant une production de biomasse améliorée (suppression du phénotype nain).
Plus spécifiquement, ils ont identifié le gènetps7comme un gène responsable de la suppression du phénotype du nanisme chez les mutantsesk1. Ils ont ensuite mis en évidence que des plantes d’Arabidopsis thalianaportant les mutations sur les gènesesk1ettps7présentaient une digestibilité de la biomasse améliorée par rapport aux plantes d’Arabidopsis thalianasauvages. En outre, ils ont également mis en évidence que les plantes d’Arabidopsis thalianatriples mutantsesk1,tps7etkakprésentent également une meilleure digestibilité de la biomasse par rapport aux plantes d’Arabidopsis thalianasauvages.
ChezArabidopsis, il existe 21 gènes putatifs de biosynthèse du tréhalose répartis en trois classes selon leur homologie avec les gènes de levureScTPS1etScTPS2 (Ramonet al.,2009). Les gènes de classe 1 et 2 codent pour des protéines bipartites, le domaine TPS (tréhalose-6-phosphate synthase) et le domaine TPP (tréhalose-6-phosphate phosphatase). Ainsi le tréhalose-6-phosphate (T6P), précurseur du tréhalose, est produit à partir de glucose-UDP et de glucose-9-phosphate, grâce à l’enzyme TPS. Puis le T6P est ensuite métabolisé en tréhalose par l’enzyme TPP (Lunnet al., 2014, O’Haraet al., 2013; Vandesteeneet al., 2012). Le gènetps7qui code pour une tréhalose-6-phosphate synthase 7 (TPS7) appartient à la classe 2 des gènes putatifs de biosynthèse du tréhalose.
Ainsi la présente invention se rapporte à une plante obtenue par mutagénèse telle que :
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7,
sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée et la diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéines ESK1 et TPS7 ayant été obtenues par au moins une mutation dans chacun des gènes codant pour les protéines ESK1 et TPS7, et telle que :
- la protéine ESK1 non mutagénisée a au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et comprenant les domaines acyl-estérase et transmembranaire, et
- la protéine TPS7 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprenant les domaines TPS et TPP.
L’homme de l’art connaît la démarche à suivre pour obtenir le meilleur orthologue dans une espèce d’intérêt, et ceci via l’outil « PLAZA » décrit dans l’exemple 2, via l’outil « PANTHER » (Miet al., 2017), décrit ci-après ou via des analyses phylogénétiques, comme celles menées par Paulet al., 2018.
La première étape en utilisant l’outil « PANTHER » consiste à saisir l’identité du gène (gène ID) sur le site TAIR (http://www.arabidopsis.org). La deuxième étape consiste à sélectionner sur le site PANTHER (http://www.pantherdb.org/) « gene and orthologs », puis saisir le gene ID et appuyer sur « search ». Parmi les orthologues proposés, les LOD « least ortholog divergent » doivent être choisis ; ils correspondent aux meilleurs orthologues d’une protéine donnée.
La protéine ESK1 non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
La protéine TPS7 non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
La présente invention s’applique à toutes les plantes monocotylédones ou dicotylédones. De manière non limitative, elle peut s’appliquer aux plantes céréalières, aux plantes ornementales, aux arbres fruitiers et aux arbres non fruitiers.
Le meilleur orthologue pour chacune des protéines ESK1 et TPS7 dans les plantes d’intérêt citées ci-dessus est trouvé via l’outil PLAZA ou via l’outil PANTHER. Les meilleurs orthologues pour les protéines ESK1 et TPS7 chez le maïs sont les suivants : ZmESK1 (Zm00001d028751) et de ZmTRPS7 (Zm00001d043469).
La plante selon l’invention peut être une dicotylédone telle queArabidopsis thaliana, le peuplier (Populus trichocarpa) ou la vigne (Vitis vinifera). De préférence, la plante selon l’invention est une monocotylédone telle que le blé, le maïs (Zea mays), le sorgho (Sorghum bicolor) ou le riz (Oryza sativa), de manière encore plus préférée le maïs.
La protéine désignée ESK1, également dénommée TBL29, dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine ESK1 d’Arabidopsis thalianade SEQ ID NO: 1; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée ESK1 qui possède :
- un domaine acyl-estérase, nécessaire pour leur activité enzymatique (Anantharamanet al., 2010 et Gilleet al., 2012), comprenant le motif conservé GDSL de séquence SEQ ID NO: 4 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 5, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO : 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, et
- un domaine transmembranaire en NH2, permettant un ancrage à la membrane interne de l’appareil de Golgi, site probable de l’acétylation des xylanes (Gilleet al., 2012 et Yuanet al.,2013). La présence du domaine transmembranaire est identifiée via l’outil bioinformatique TMHMM qui est un logiciel de prédiction de la structure des protéines membranaires.
Le motif conservé GDSL signifie l’enchaînement des acides aminés glycine, aspartate, serine et leucine.
On entend par domaine ou motif conservé, un enchaînement d’acides aminés retrouvé à l’identique dans les protéines orthologues.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la protéine ESK1 peut être définie en outre par 3 motifs conservés supplémentaires de séquences :
- SEQ ID NO: 6 situé à des positions correspondant aux positions 211-224 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1 et qui comprend le motif conservé GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4,
- RKD situé à des positions correspondant aux positions 433-435 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, et
- SEQ ID NO: 7 situé à des positions correspondant aux positions 461-470 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1 et qui comprend le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 5.
Le motif conservé RKD signifie l’enchaînement des acides aminés arginine, lysine et aspartate.
A titre d’exemple, les protéines ESK1 sont issues d’Arabidopsis thalianade séquence SEQ ID NO: 1 (ESK1/TBL29), deZea mays(ZmESK1, dénommé Zm00001d028751) de séquence SEQ ID NO: 8, d’Oryza sativa(dénommé Os03g0291800) de séquence SEQ ID NO: 9, dePopulus trichocarpa(dénommé POTR_0010s19490) de séquence SEQ ID NO: 10 ou deSorghum bicolor(dénommé Sb01g038450.1) de séquence SEQ ID NO: 11.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine ESK1 possède au moins 65% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et comprend les motifs conservés de séquences GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine ESK1 possède au moins 50% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et par ordre de préférence croissant au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 1 et comprend les domaines conservés de séquences GDSL, de séquence SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 214-217 et 462-465 de la séquence SEQ ID NO: 1, et peut également comprendre au moins un des domaines conservés de séquences SEQ ID NO: 6, RKD et SEQ ID NO: 7 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 211-224, 433-435 et 461-470 de la séquence SEQ ID NO: 1, lorsque ladite protéine ESK1 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 1.
La protéine désignée TPS7 dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine TPS7 d’Arabidopsis thalianade SEQ ID NO: 2; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée TPS7 comme suit qui possède :
- un domaine TPS (Yanget al., 2012), comprenant le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 12 et le motif conservé de séquence SEQ ID NO : 13, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO : 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO : 2, et
- un domaine TPP (Yanget al., 2012), comprenant les motifs conservés de séquence SEQ ID NO : 14, 15 et 16, situés à des positions correspondant respectivement aux positions 649-654, 777-787 et 807-815 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
A titre d’exemple, les protéines TPS7 sont issues d’Arabidopsis thalianade séquence SEQ ID NO: 2 (AtTPS7), deZea mays(Zmtrps7, dénommé Zm00001d043469) de séquence SEQ ID NO: 17,d’Oryza sativa(dénommé Os01g0749400) de séquence SEQ ID NO: 18, deVitis vinifera(dénommé VIT_12s0028g01670) de séquence SEQ ID NO: 19, dePopulus trichocarpa(dénommé POPTR_0011G70900) de séquence SEQ ID NO: 20, ou deSorghum bicolor(dénommé SB03G034640) de séquence SEQ ID NO: 21.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine TPS7 possède au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine TPS7 possède au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 2 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 203-207 et 226-236 de la séquence SEQ ID NO: 2, et peut également comprendre au moins un des motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 14, 15 et 16 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 649-654, 777-787 et 807-815 de la séquence SEQ ID NO: 2, lorsque ladite protéine TPS7 est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 2.
Selon un mode de réalisation particulier, la plante selon l’invention est telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de de la protéine KAK ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine KAK, et telle que la protéine KAK non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et comprenant des répétitions armadillo ainsi qu’un domaine HECT.
La protéine KAK non mutagénisée telle que définie dans la présente invention possède au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité.
Le meilleur orthologue pour la protéine KAK dans les plantes d’intérêt citées ci-dessus est trouvé via l’outil PLAZA ou via l’outil PANTHER. Le meilleur orthologue pour la protéine KAK chez le maïs est ZmKAK1.
La protéine KAK dont l’expression et/ou l’activité est diminuée dans la plante selon l’invention est définie en référence à la protéine KAK d’Arabidopsis thalianade SEQ ID NO: 3; en effet, selon l’espèce végétale considérée, l’homme du métier est en mesure d’identifier l’orthologue de la protéine désignée KAK comme suit qui possède :
- des répétitions armadillo en NH2, définies comme un domaine de liaison aux protéines cibles, qui vont être adressées au protéasome (Sharmaet al., 2016) comprenant les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22 et 23, situés à des positions correspondant aux positions 291-309 et 311-341 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3, et
- un domaine HECT en COOH, liant des unités ubiquitine qui seront par la suite liés aux cibles pour l’adressage au protéasome (El Refyet al., 2003), comprenant le motif conservé de séquence SEQ ID NO: 24, situé à des positions correspondant à la position 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
La présence des répétitions armadillo et du domaine HECT est identifiée via l’outil bioinformatique « Protein Sequence Analysis and Classification » de InterPro 68.0 (EMBL-EBI), trouvé à l’aide du site internet https://www.ebi.ac.uk/interpro/.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la protéine KAK peut être définie en outre par 2 motifs conservés supplémentaires de séquences :
- SEQ ID NO: 25 situé à des positions correspondant aux positions 1466-1490 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3, et
- SEQ ID NO: 26 situé à des positions correspondant aux positions 1496-1521 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
A titre d’exemple, les protéines KAK sont issues d’Arabidopsis thalianade séquence SEQ ID NO: 3 (AtKAK), deZea mays(ZmUPL3, dénommé également ZmKAK1 et Zm00001d004139) de séquence SEQ ID NO: 27, deVitis vinifera(dénommé VIT_03s0038g02340) de séquence SEQ ID NO: 28, dePopulus trichocarpa(dénommé POPTR_0009s13670) de séquence SEQ ID NO: 29, ou deSorghum bicolor(dénommé Sb06g003290.1) de séquence SEQ ID NO: 30.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une dicotylédone et ladite protéine KAK possède au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22, 23 et 24 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 291-309, 311-341 et 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la plante selon l’invention est une monocotylédone et ladite protéine KAK possède au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et par ordre de préférence croissant au moins 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d’identité avec SEQ ID NO: 3 et comprend les motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 22, 23 et 24 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 291-309, 311-341 et 1845-1867 de la séquence SEQ ID NO: 3, et peut également comprendre au moins un des motifs conservés de séquences SEQ ID NO: 25 et 26 situés à des positions correspondant respectivement aux positions 1466-1490 et 1496-1521 de la séquence SEQ ID NO: 3, lorsque ladite protéine KAK est alignée avec ladite séquence SEQ ID NO: 3.
Sauf précision contraire, l’alignement entre deux séquences peptidiques et le calcul des pourcentages d’identité sont effectués sur toute la longueur des séquences peptidiques à l’aide du programme d’ordinateur «needle» (Needlemanet al., 1970) en utilisant les paramètres par défaut : «Matrix» : EBLOSUM62, «Gap penalty» : 10,0 et «Extend penalty» : 0,5.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité dans une plante des protéines ESK1, TPS7 et optionnellement KAK telles que définies ci-dessus, peut être obtenue de différentes manières détaillées ci-après.
Le terme « diminution de l’expression d’une protéine dans une plante obtenue par mutagénèse » se réfère à la diminution de quantité de protéine produite par la plante obtenue par mutagénèse en comparaison avec une plante parente non mutagénéisée et dans laquelle l’expression de ladite protéine n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’expression d’une protéine dans une plante comprennent par exemple la technique du western blot.
Le terme « diminution de l’activité d’une protéine dans une plante obtenue par mutagénèse » se réfère à la diminution de l’activité de la protéine produite par la plante obtenue par mutagénèse en comparaison avec une plante parente non mutagénéisée et dans laquelle l’activité de ladite protéine n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’activité d’une protéine dans une plante comprennent par exemple la mesure de l’activité enzymatique, par dosage de sucres, par infra-rouge, par spectrométrie de masse ou par des tests visuels.
Dans le cas présent, la diminution de l’expression de ESK1, TPS7 et KAK est mesurée par western blot et est comparée aux protéines ESK1, TPS7 et KAK d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de ESK1 est mesurée par un dosage acétate ou par infra-rouge et est comparée à la protéine ESK1 d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de TPS7 est mesurée par un dosage des sucres ou par spectrométrie de masse et est comparée à la protéine TPS7 d’une plante non mutagénisée.
Dans le cas présent, la diminution de l’activité de KAK est mesurée par un test visuel en observant les trichomes hyperbranchés et est comparée à la protéine KAK d’une plante non mutagénisée.
Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc.) obtenu à partir des plantes selon l’invention fait également partie de l’objet de la présente invention. L’invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes selon l’invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines...
Les plantes selon l’invention sont telles qu’elles ont une digestibilité améliorée. Les plantes dans lesquelles l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1 et TPS7 sont diminuées présentent une production de biomasse intermédiaire entre celle du mutantesk1et le sauvage. Les plantes dans lesquelles l’expression et/ou l’activité des protéines ESK1, TPS7 et KAK sont diminuées présentent une biomasse intermédiaire ou équivalente à celle d’une plante sauvage.
Le calcul de la quantité de biomasse se fait par la mesure du poids sec par kg de poids frais provenant de dix plantes.
La digestibilité est évaluée par digestion des composés pariétaux avec le cocktail enzymatique dit « cellulase Onozuka » telle que décrit dans Bensussanet al., 2015. Le protocole de digestibilité correspond alors à un essaiin vitrovisant à estimer des teneurs en fibres insolubles après hydrolyse acide.
L’invention se rapporte également à un procédé de préparation d’une plante à digestibilité améliorée selon l’invention dans laquelle l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7, sont diminuées, ledit procédé comprenant les étapes de mutagénèse des gènes codant pour les protéines désignées ESK1 et TPS7.
Selon un mode de réalisation particulier, ce procédé permet la préparation d’une plante telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK, sont également diminuées et comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée KAK.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéines ESK1, TPS7 et KAK est obtenue par mutagénèse des gènes codant pour leurs protéines respectives.
Par exemple, une mutation à l’intérieur de la séquence codante d’un gène peut induire, en fonction de la nature de la mutation, l’expression d’une protéine inactive, ou d’une protéine avec une activité altérée. Une mutation de type knock-out où le cadre de lecture présente un codon stop prématuré peut également induire une diminution de l’expression de cette protéine.
Les mutants peuvent être obtenus par délétion, insertion et/ou substitution d’un ou de plusieurs nucléotides, par exemple par délétion de tout ou partie de la séquence codante du gène codant la protéine ou de son promoteur ou par l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéine ou de son promoteur.
La mutagénèse peut être mise en œuvre par l’induction de mutations aléatoires, par exemple en utilisant des agents physiques ou chimiques tels que l’EMS (Ethyl Methane Sulfonate) ou la mutagénèse d’insertion aléatoire, suivie de la sélection des mutants avec les mutations ciblées. Les méthodes de mutagénèse à haut débit suivie de la sélection des mutants sont bien connues. Par exemple, on peut citer la méthode de TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) qui est décrite notamment dans by McCallumet al., 2000, Colbertet al., 2001 Henikoffet al. , 2003 et Tillet al., 2003). La technique de TILLING n’a cessé de se développer sur différentes espèces cultivées comme en témoignent de nombreuses publications telles que par exemple Taheriet al., 2017.
Alternativement, la mutagénèse peut être mise en œuvre par des méthodes utilisant des nucléases (TALEN, CRISPR/Cas9,…), décrites dans Shanet al., 2013, Fenget al., 2013, Svitashevet al., 2015 et Charet al., 2017.
Pour certaines plantes telles que le maïs, les mutants peuvent être des lignées d’insertion, par exemple choisis parmi la collection de lignées dites mutator UFMu ; la recherche des lignées de maïs qui possèdent une insertion de transposons dans les gènes orthologues d’intérêt peut être réalisée à l’aide du site internet https://maizegdb.org/data_center/stock.
Le génotypage des lignées est effectué selon les recommandations des auteurs (McCartyet al., 2013).
En l’absence d’insertion d’éléments transposables ou de mutants de TILLING dans les gènes choisis, la stratégie de mutagénèse par CRISPR/Cas9 est réalisée.
Enfin, l’inhibition de l’expression de la protéine cible peut être obtenue par une technique d’interférence ARN (RNAi), par expression d’un ARN antisense ou encore par des aptamères.
La présente invention a pour objet un procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutationesk1, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7.
De façon préférée, ce procédé comporte également une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une plante selon l’invention pour la production de biocarburant.
L’invention a en outre pour objet l’utilisation d’une plante selon l’invention pour la nutrition animale.
Exemple 1 :Mise en évidence de la mutation tps7 comme suppresseur de nanisme chezarabidopsis thalianaet caractérisation des plantes doubles mutants esk1 et tps7 chezarabidopsis thaliana
Matériels et Méthodes
1. Obtention des «
beem
» par mutagenèse du mutant
eskimo1
Après mutagenèse chimique par EMS (3%), des graines homozygotes mutantesesk1-5d’Arabidopsis thaliana, 4500 plantes M1 ont été cultivées, puis des groupes de 7 plantes M1 ont été réalisés. 200 graines M2 par groupe ont ensuite été semées et les groupes qui présentaient 4 à 5 plantes M2 ayant une croissance supérieure à celle du mutantesk1ont été isolés. Ces plantes appelées «beem» pour « Biomass Enhancement underEskimo1Mutation » ont été rétrocroisées avec le mutantesk1-5et autofécondées pour observer à nouveau la suppression du phénotype nain en M3. Ainsi 12 lignées contenant des suppresseurs du nanisme du mutant Atesk1ont été isolées. Des croisements entre les suppresseursbeemet les observations des ségrégations des phénotypes en F1 et en F2 indiquent que les mutations affectent des gènes différents à l’exception des beem308A et beem396B qui sont alléliques. L’ADN extrait à partir de groupe de 100 plantesbeemF2 et le séquençage des génomes avec une profondeur de 100X a été réalisé pour 5beem(563B, 396B, 241C, 142A, 648B).
Le mutantesk1-5est génotypé avec la paire d’amorces ESK1-5#R2 et ESK1-5#L1 pour l’allèle sauvage et la paire d’amorces LBSalk2 et ESK1-5#R2 pour l’allèle muté.
Le mutanttps7-1provient de la lignée SALK135044 et est génotypé avec les amorces LBSalk2 et RP-Salk135044 pour l’allèle mutant et RP-Salk135044 et LP-Salk135044 pour l’allèle sauvage.
Le mutanttps7-2 provient de la lignée SALK116341c et est génotypé avec les amorces RP-Salk116341 et LBSalk2 pour l’allèle mutant et avec les amorces RP-Salk116341 et LP-Salk11341 pour l’allèle sauvage.
Le mutanttps7-3 est la lignée GABI341E02. L’allèle mutant est déterminé par PCR avec les amorces Gabi08409 et RP-GK341E02 pour l’allèle muté et avec les amorces RP-GK341E02 et LP-GK341E02 pour l’allèle sauvage.
Le mutanttps7-4 est génotypé par PCR avec les amorces TS7#U1 et TPS7#L1 et le séquençage détermine la présence du SNP (G en A) par rapport à la séquence de référence.
Les séquences des produits PCR sont obtenues par la méthode Sanger et les séquences sont alignées sur le gène sauvage de référence pour déterminer la présence du SNP.
Les séquences des amorces T-DNA sont : LBSalk2, Gabi08409, Lb1.3.
Les mutantskak-7etkak-8sont ceux décrits dans la publicationBensussan et al.,2015.
| Nom de l’amorce | Séquence | Dénomination |
| ESK1-5#R2 | 5’ CAATGGACTCAGGCATTATT3’ | 31 |
| ESK1-5#L1 | 5’ GAGTTTCCTTTCTCCACC3’ | 32 |
| LBSalk2 | 5’GCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC3’ | 33 |
| RP-Salk135044 | 5’CAATACCGTGCATTGTGTCAG3’ | 34 |
| LP-Salk135044 | 5’GAGGGTAAAACCTGGCAAAAG3’ | 35 |
| RP-Salk116341 | 5’TTCATTGTCAGTGGAAGAGGG3’ | 36 |
| LP-Salk11341 | 5’CAGACCAACAAACTCCCAGTC3’ | 37 |
| Gabi08409 | 5’ ATATTGACCATCATACTCATTGC3’ | 38 |
| RP-GK341E02 | 5’ GCTGGAGTATTACGGGAGGAC3’ | 39 |
| LP-GK341E02 | 5’ TTCACTGCCTGACCACCTAAG3’ | 40 |
| TS7#U1 | 5’ TCAATGGCCGGAAAGGGAAA3’ | 41 |
| TPS7#L1 | 5’ GGGCTTCATCAAGTTCACGC3’ | 42 |
| Lb1.3 | 5’ CATCAAACAGGATTTTCGCC 3’ | 43 |
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la PCR
2. Analyse bioinformatique
Une analyse bioinformatique a été menée en alignant les séquences (« reads ») du génome de 5 mutantsbeem(563B, 396B, 241C, 142A, 648B) sur le génome de référence en utilisant le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.2 (Qiagen), sachant que les mutantsbeemn’étaient pas alléliques entre eux.
Alignement de séquences
La fonction du “trimming” fournie par le logiciel CLC Genomics Workbench a été utilisée. Un trimming par qualité et par longueur de séquence a été fait dans un premier temps, avec les paramètres suivants :
score limite de qualité = 0,05 (Valeur de Phred équivalent à un score de qualité de 40: la probabilité d’appeler une base incorrectement est de 1 sur 10 000).
trim. de nucléotides ambigus = 0 (aucun nucléotide ambigu est permis).
trim. de longueur = reads avec une longueur de moins de 80 pb sont éliminés.
Les « reads » ont été cartographiés sur le génome de référence d’Arabidopsis(TAIR 10.0) selon les paramètres par défaut. Cependant, les paramètres de longueur de fraction (valeur de l'alignement qui doit correspondre à la séquence de référence avant d’être mise dans la liste de variants cartographiées) et la fraction de similarité (pourcentage minimum d'identité entre le « read » et la séquence de référence) sont respectivement 0.9 et 0.05.
La détection de SNP
La fonction « détection basique de variants » a été utilisée avec les paramètres suivants : couverture minimale= 6; comptage minimal= 2; et fréquence allélique minimum= 80%. Une liste de SNP pour chaque lignéebeema été obtenue. Puis, la liste des éventuels candidats a été choisie selon les paramètres suivants (Abeet al., 2012 ; Hartwiget al.2012) : a) SNP/INDEL (insertion ou délétion dans une séquence biologique) exclusif et unique pour la lignéebeem241C,b) Le SNP/INDEL doit être situé dans une région codante pour avoir des effets sur les séquences d’acides aminés, c) Le SNP/INDEL a une fréquence allélique entre 80-100%.
La validation des SNP candidats
480 plantes de la descendance F2 du rétrocroisement :beem241C xesk1-5 ainsi que 24 plantes de la lignée parentaleesk1-5et 10 plantes sauvages Col-0 ont été semées en serre, afin d’évaluer la récessivité de la mutationbeem241C pour les caractères morphologiques sélectionnés. Les plantes suppressées ont un aspect proche de celui d’une plante sauvage alors que les plantes non suppressées présentent des petites rosettes, des feuilles de couleur verte foncée et une hauteur des plantes plus petite que celle de plantes sauvages.
L’ADN des plantes suppressées «beem» a été extrait individuellement.Toutes les plantes ont été génotypées par PCR afin de vérifier leur homozygotie pour la mutationesk1. Puis des amorces ont été définies sur les gènes candidats pour lesquels les mutations EMS ont un effet sur la séquence en acides aminés (Tableau 2).
| Chromosome | Amorce | Séquence | Dénomination |
| 1 | AT1G02690 F | 5’ CAATCTCCTGAAGCTAGCCGT 3’ | 44 |
| AT1G02690 R | 3’ CGAGAGTACGTTCTTCGTGTTC 5’ | 45 | |
| AT1G05470 F | 5’ TCCGTGGTAGCAGCAG 3’ | 46 | |
| AT1G05470 R | 3’ TAACAATAGAGGCAAAAGCAT 5’ | 47 | |
| AT1G06410 F | 5’ GGGCTTCATCAAGTTCACGC 3’ | 48 | |
| AT1G06410 R | 3’ TCAATGGCCGGAAAGGGAAA 5’ | 49 | |
| AT1G08620F | 5’ TGGTGTCCAGGGTTTAGCTG 3’ | 50 | |
| AT1G08620 R | 3’ TGATAGCTAGAAAGAGTCGGAGT 5’ | 51 | |
| AT1G09250 F | 5’ AGAGACTTTCCGGCAACCAG 3’ | 52 | |
| AT1G09250 R | 3’ GTGATACGGCGGATCGAGTT 5’ | 53 | |
| AT1G09620 F | 5’ AGCCGGTGATGTCAAGATCG 3’ | 54 | |
| AT1G09620 R | 3’ TCATTCATCTGCTGAGGGCG 5’ | 55 | |
| AT1G12600 F | 5’ TCTTCGCCTTTGTTTCCGGT 3’ | 56 | |
| AT1G12600 R | 3’ CGTTAATGGCATCTGCGAGG 5’ | 57 | |
| 4 | AT4G33240 F | 5’ CTGGACCTTCCCCTAGACCC 3’ | 58 |
| AT4G33240 R | 3’ CAACTTCGGGCTCAAAGGAC 5’ | 59 | |
| 5 | AT5G54920 F | 5’ CCCATGGACCTTGTGAGCTA 3’ | 60 |
| AT5G54920 R | 3’ GTCCAATGTTGCAGGGGAGA 5’ | 61 | |
| Génotypage Esk 1-5 | |||
| ESK1-5 | LP | 5’ GAGTTTCCTTTCTCCACC 3’ | 62 |
| LB | 3’ CAATGGACTCAGGCATTATT 5’ | 63 | |
| Lignée SALK LB | 3’ GCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC 5’ | 64 |
Tableau 2 : Amorces utilisées. Séquences des amorces pour les gènes candidats exclusifs et indépendants responsables de la suppression du phénotype nain de la lignéebeem241C.
Les produits d’amplification sont séquencés par la société Beckman Coulter Genomics (24 plantes suppressées «beem », 7 plantes sœurs avec le phénotypeeskimo-likeet une planteesk1). L’analyse des allèles sauvage ou mutant indique s’il y a une corrélation ou non avec le phénotype des plantes observées en utilisant le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.2 (Qiagen).
Résultats
1. Identification de la mutation
beem
241C
Environ 2000 SNP/INDEL ont été obtenus pour chaque lignéebeem, mais seulement ceux qui sont exclusifs pour la lignéebeem241C et qui répondent aux critères de sélection établis (fréquence allélique 80%-100%, SNP/INDEL situés sur des exons) ont été retenus. Ainsi pour la lignéebeem241C, 29 SNP/INDEL ont été obtenus avec une couverture de 76% pour l’ensemble des chromosomes. Mais seulement neuf gènes candidats répartis sur les chromosomes 1, 4 et 5 sont uniques et apparaissent avec une fréquence allélique allant de 80 à 100%. Ils sont situés dans les régions codantes des gènes (Figure 1 et tableau 3).
Un cluster de mutations sur le haut du chromosome 1 est retrouvé.
| Chr. | Région | Nom | Type | Réf. | Mut. | Couv. | Freq. |
| 1 | 584 922 | AT1G02690 IMPA-6 | SNV | G | A | 50 | 94 |
| 1 609 843 | AT1G05470 CVP2 |
SNV | G | A | 60 | 100 | |
| 1 958 038 | AT1G06410 TPS7 |
SNV | G | A | 63 | 100 | |
| 2 743 086 | AT1G08620 PKDM7D |
SNV | G | A | 51 | 98 | |
| 2 989 893 | AT1G09250 AIF4 | SNV | G | A | 56 | 93 | |
| 3 114 526 | AT1G09620 ATP | SNV | G | A | 53 | 89 | |
| 4 288 712 | AT1G12600 UDP | SNV | A | T | 28 | 89 | |
| 4 | 16 036 646-16 036 647 | AT4G33240 FAB1A | D | TA | - | 46 | 80 |
| 5 | 22 302 999-22 303 000 | AT5G54920 * | I | - | T | 25 | 80 |
Tableau 3 : Gènes candidats repartis sur les chromosomes 1, 4 et 5 retrouvés lors de l’analyse bio-informatique. Chr. Chromosome, Réf. Nucléotide de référence, Mut. Nucléotide de mutant, Couv. Couverture, Freq. Fréquence. (*) Protéine Inconnue, (SNV) Single Nucléotide Variant, (D) Délétion, (I) Insertion, (G) Guanine, (A) Adénine, (T) Thymine.
La plupart des mutations sur le chromosome 1 présentent des changements de G par A. Sur les chromosomes 4 et 5 les variants correspondent à des délétions et insertions rarement retrouvées par mutagenèse chimique EMS. CVP2 et TPS7 sont les variants uniques qui présentent une fréquence de 100% avec 60 et 63 séquences respectivement.
Des plantes M2beem241C ont été rétrocroisées cinq fois avec leur parentesk1. La population F2 résultante a montré une ségrégation pour la taille de la rosette de 138 plantesbeem: 342 plantes non suppressées (Test du Chi2 positif pour la ségrégation espérée 1:3- p-value =0.05778) (Figure. 2). Ce résultat confirme que la mutation responsable du phénotype suppressé est récessive. L’ADN des 138 plantes suppressées a été extrait individuellement pour vérifier par PCR que toutes les plantes sont homozygotesesk1, puis le séquençage des gènes candidats autour du SNP détecté a été réalisé.
La suppression entraîne le changement d’une serine en proline au codon 814 de la séquence codante (CDS) deTPS7conduisant potentiellement à la traduction du domaine TPS complet (Tréhalose Phosphate Synthase) et du domaine TPP modifié (Tréhalose Phosphate Phosphatase) de la protéine.
2) Tests de complémentation avec les mutants d’insertion d’ADN-T dans le gène
TPS7
Les mutantstps7-1, tps7-2, tps7-3 ont été croisés avec le mutantesk1-5afin de sélectionner en F2 les doubles mutantstps7-1esk1-5,tps7-2esk1-5ettps7-3esk1-5en utilisant les amorces identifiées dans le tableau 1.
Pour réaliser le test de complémentation, ces doubles mutants ont été croisés avec le mutantbeem241C et la surface des rosettes des descendances F1 (beem241C tps7 esk1) a été mesurée après 4 semaines de croissance. La surface des rosettes des descendances F1 (beem241C tp7s esk1) observée est similaire à celle debeem241C. Les résultats des tests de complémentation représentés à la Figure. 3 nous indiquent donc quebeem241C esttps7.
On observe aussi que les doubles mutantstps7esk1-5ont un phénotype intermédiaire entre celui de la plante sauvage et celui du mutantesk1-5comme ce qui est observé chez le mutantbeem241C, la taille des rosettes étant plus importante que celle du mutantesk1-5.
3 ) Production de biomasse
Pour évaluer la production de biomasse, les plantes ont été cultivées sur l’automate de phénotypage Phenoscope (Tisneet al.2013), dans des conditions contrôlées et reproductibles. Le poids de matière sèche des rosettes âgées de 44 jours et déshydratées pendant 48 h a été mesuré.
Les résultats de cette mesure sont disponibles dans le tableau 4.
On peut constater que les simples mutantstps7présentent une biomasse significativement plus élevée (23 à 32%) que le sauvage en condition irriguée comme en condition de déficit hydrique.
Les doubles mutantstps7 esk1-5présentent une biomasse supérieure à celle du mutantesk1-5en condition irriguée.
| Biomasse (en g) | N | Biomasse en % | |
| WT (Col-0) | 0.22g +/- 0.04g | 5 | 100% |
| esk1-5 | 0.06g +/- 0.02g | 2 | 27% |
| tps7-1 | 0.27g +/- 0.03g | 5 | 123% |
| tps7-2 | 0.29g +/- 0.04g | 6 | 132% |
| tps7-3 | 0.29g +/- 0.02g | 6 | 132% |
| tps7-1 esk1-5 | 0.13g +/- 0.02g | 6 | 59% |
| tps7-2 esk1-5 | 0.13g +/- 0.02g | 6 | 59% |
| tps7-3 esk1-5 | 0.12g +/- 0.01g | 6 | 54.5% |
Tableau 4 : Biomasse (matière sèche) des rosettesd’A. thalianaâgées de 44 jours prélevées sur le Phenoscope. Le nombre d’individus mesurés dans chaque condition pour chaque génotype est indiqué dans la colonne N.
Exemple 2 :Caractérisation des plantes doubles mutants esk1 et tps7 chez le maïs
- Recherche des orthologuesin silicochez le maïs à partir des plantesd’Arabidopsis thaliana
Sur le site internet https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v4_monocots/,
- dans le moteur de recherche, rentrer le nom du gène ESK1 chezArabidospsis thaliana, à savoir AT3G55990,
- dans la partie « Toolbox, explorer », sélectionner l’onglet « the orthologs using the Integrative Orthology Viewer »,
- sélectionner pour l’espèce “Zea Mays” l’orthologue correspondant au « Best-Hits-and-Inparalogs(BHI)family », en l’occurrence Zm00001d028751,
- dans la partie « Toolbox, view », sélectionner l’onglet « sequences ».
Les séquences nucléotidiques et protéiques de Zm00001d028751 sont alors accessibles.
Pour le gène TPS7, on renouvelle l’opération avec le nom du gène TPS7 chezArabidospsis thaliana, à savoir AT1G06410 et on trouve l’orthologue chez le maïs, sous la référence Zm00001d043469.
1.1. Vérification de la présence des motifs conservés dans les orthologues de maïs
On réalise un alignement protéique entre la séquence d’Arabidopsis thaliana et celle de Zea Mays, à l’aide du site https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/.
La présence du motif GDSL, présent dans le domaine acyl-estérase de la protéine ESK1 est confirmée directement à partir de cet alignement de séquences.
La présence d’un domaine transmembranaire est identifiée via l’outil bioinformatique TMHMM, accessible à partir du site internet http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
1.2. Obtention des mutants de maïs
Il existe 2 gènes orthologues pour le gène ESK1 (AT3G55990) chez le maïs : Zm00001d022582 et Zm00001d028751.
Des transformations génétiques d’embryons immatures de maïs A188 sont réalisées avec le plasmide L1657-ESK (Figure 4) portant entre les bordures du T-DNA le gène codant pour la protéine CAS9 sous le contrôle du promoteur Ubiquitine ainsi que les séquences cibles des gènes d’intérêt. Pour les gènes Zm00001d022582 et Zm00001d028751, les séquences cibles sont respectivement CAGGTCGCACCCGGCAACC et CAGACGTGCGACCTGTACC.
Il existe 3 gènes orthologues pour le gène TPS7 (AT1G06410) chez le maïs:ZM03G31920 (ZmTprs7), ZM03G31900 (ZmTprsS6) et ZM08G34940 (ZmTPrs15) chez le maïs. Pour le gène ZM03G31900, il existe des insertions de transposons mutator comme mu1069747 dans UFMu-08325 et mu1077018 dans UFMu-08873 et pour le gène ZM08G34940, il existe seulement une insertion d’un élément transposable dans la partie exonique : il s’agit de mu1057945 dans la lignée UFMu-07357. Pour le gène ZM03G31920 qui est le plus proche orthologue de AtTPS7, il n’y a aucun élément transposable dans le gène. Une stratégie de mutagenèse par CRISPR/Cas9 est alors nécessaire.
2. Matériels et Méthodes
Les doubles mutantsesk1 tps7ainsi que les simples mutants et les sauvages sont élevés en serre ou plateforme dédiée. Toutes les caractéristiques morphométriques et phénologiques informatives comme la date d’apparition de la troisième feuille ligulée, date de floraison, hauteur des plantes, largeur et longueur de la plus longue feuille sont mesurées.
Les plantes sont prélevées au stade ensilage et au stade grains matures. La teneur en eau des tiges et des feuilles est évaluée par pesée avant et après séchage en étuve à 50°C pendant 4 jours. La biomasse sèche est broyée en poudre fine avec un broyeur à couteaux IKA M20.
La biomasse des différentes lignées est caractérisée comme suit :
1 / La digestibilité par hydrolyses enzymatiques (Virlouvetet al., en préparation).
3 répétitions techniques par échantillon sont effectuées.
30 mg de matière sèche sont incubés 24h à 40°C en présence de HCL0,1N puis 90μl de soude 2M sont ajoutés. Après avoir passé le mélange au vortex, 2 ml de solution de cellulolyse (NaAc 0,1M pH 4,95, Sodium azide 0,4%, Cellulase ONOZUKA R10 8mg.ml-1) sont ajoutés. L’ensemble est placé sous agitation à 50°C pendant 72h. Les tubes sont centrifugés 15 min à 4000 RPM 8°C , les surnageants sont éliminés et 4 ml d’eau sont ajoutés pour laver les culots. Après reprise des culots à l’aide d’un vortex, une nouvelle centrifugation est réalisée pendant 10min. Un nouveau rinçage à l’eau et centrifugation sont réalisés et le surnageant est ensuite éliminés. Les culots sont congelés à -80°C avant lyophilisation pendant 48h minimum. Les culots secs sont ensuite pesés. La perte pondérale est calculée en pourcentage.
2 / Le taux d’acétate selon les recommandations du kit de K-Acetic acid de Megazyme à partir de 25mg de résidus pariétaux obtenus par la méthode Soxhlet.
3 / Le contenu en sucre de 10 mg de résidus pariétaux non cellulosiques obtenus après un traitement à l’acide Triflluoroacétque (TFA) 2,5M. L’analyse est effectuée par HPLC par rapport aux sucres de référence (D(+)-Fucose , D(+)- Arabinose, D(+)- Glucose, D(+)- Galactose, D(+)- Mannose, D(+)-D(+)- Xylose, L-Rhamnose, D(-)-Fructose.
Le dosage du tréhalose-6 phosphate et du tréhalose sont effectués par analyse chimique.
4 / Des observations cytologiques des vaisseaux xylémiens (entrenoeud sous épi) et des racines sont réalisées en microscopie photonique.
Les taux de lignine par la méthode lignin Klason à partir de 150mg de résidus pariétaux selon le protocole décrit par Méchinet al., 2014.
Au stade ensilage, l’acquisition de spectres Infra-rouge avec transformée de Fourier (FTIR) obtenus à partir des tissus xylémiens sur coupe d’entrenoeuds sous épi de 50 μm permet la mise en évidence de l’acétylation des xylanes (Lefebreet al., 2011).
Des colorations histologiques au Fasga des entrenoeuds sous épi permettent de visualiser les tissus lignifiés et non lignifiés, la forme des vaisseaux ainsi que leur densité (Leglandet al., 2017).
Exemple 3 :Caractérisation des plantes triples mutants esk1, tps7 et KAK chez le maïs
- Recherche des orthologuesin silicochez le maïs à partir des plantesd’Arabidopsis thaliana
La recherche de l’orthologue du gène KAK chez le maïs est réalisée comme décrit dans l’exemple 2 avec le nom du gène KAK chezArabidospsis thaliana, à savoir AT4G38600 et on trouve l’orthologue chez le maïs, sous la référence Zm00001d004139.
Il existe 2 gènes orthologues pour le gèneKAK(AT4G38600) chez le maïs : Zm00001d004139 (ZmKak1) et Zm00001d014920 (ZmKak2).
Des plantes homozygotes mutantes dans le gène ZmKak2 ont été obtenues par insertion d’un transposon mutator : mu1057066 dans la lignée UFMu-07383. En ce qui concerne le gèneZmKak1, une stratégie de mutagenèse par CRISPR/Cas9 est plus adaptée.
2. Matériels et Méthodes
Les doubles mutants esk1 tps7 sont croisés avec les doubles mutants esk1 kak. La descendance des plantes F1 (homozygote esk, hétérozygote tps7, hetérozygote kak) est élevée pour produire une descendance F2 par autofécondation. Parmi les plantes F2, 1/16ème de plantes sont triples mutants esk tps7 kak. La sélection des plantes se fait par génotypage par PCR avec les amorces utilisées pour sélectionner les simples mutants.
Les mêmes études que celles décrites dans l’exemple 2 sont menées.
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Claims (8)
- Plante obtenue par mutagénèse telle que :
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée ESK1, et
- l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7,
sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée et la diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéines ESK1 et TPS7 ayant été obtenues par au moins une mutation dans chacun des gènes codant pour les protéines ESK1 et TPS7, et telle que :
- la protéine ESK1 non mutagénisée a au moins 50% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et comprenant les domaines acyl-estérase et transmembranaire, et
- la protéine TPS7 non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprenant les domaines TPS et TPP,
ladite plante n’étant pas exclusivement obtenue par des procédés essentiellement biologiques. - Plante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est telle que l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK sont diminuées, par rapport à une plante parente non mutagénisée, la diminution de l’expression et/ou de l’activité de la protéine KAK ayant été obtenue par au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine KAK, et telle que la protéine KAK non mutagénisée a au moins 60% d’identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 et comprenant les répétitions armadillo ainsi qu’un domaine HECT.
- Procédé de préparation d’une plante à digestibilité améliorée selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes de mutagénèse des gènes codant pour les protéines désignées ESK1 et TPS7,
ladite plante n’étant pas exclusivement obtenue par des procédés essentiellement biologiques. - Procédé selon la revendication 3 de préparation d’une plante selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il comprend une étape additionnelle de mutagénèse du gène codant pour la protéine désignée KAK.
- Procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutationesk1, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée TPS7,
ladite plante n’étant pas exclusivement obtenue par des procédés essentiellement biologiques. - Procédé pour augmenter la croissance d’une plante portant la mutationesk1selon la revendication 5, caractérisé en ce qu’il comporte une étape additionnelle de modification génétique de ladite plante pour diminuer l’expression et/ou l’activité de la protéine désignée KAK.
- Utilisation d’une plante selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, pour la production de biocarburant.
- Utilisation d’une plante selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, pour la nutrition animale.
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