CN103103285B - 一种菲利普孢囊线虫lamp快速检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法及应用。根据菲利普孢囊线虫RAPD特异性片段序列，设计筛选出6条LAMP引物HF11-F3、HF11-B3、HF11-FIP、HF11-BIP、HF11-LB和HF11-LF，通过提取菲利普孢囊线虫基因组DNA，环介导等温扩增体系建立及其优化、扩增产物显色和观察，从而快速检测和鉴定出菲利普孢囊线虫。本发明的检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、高效快捷，结果肉眼即可观察，在菲利普孢囊线虫快速检测和菲利普孢囊线虫病的早期和田间诊断方面具有很高的应用价值。

Description

一种菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

小麦孢囊线虫（cereal cyst nematode，CCN）是全世界范围内分布的禾谷类作物重要病原线虫。该线虫自1874年在德国被发现以来，目前在全世界40多个国家均有发生和危害，其中中国、澳大利亚、欧洲、印度、中东等地区的禾谷孢囊线虫病危害严重并遭受了巨大的经济损失。目前小麦孢囊线虫组（Heterodera avenae group）共包括12种孢囊线虫，其中以禾谷孢囊线虫（H.avenae）、菲利普孢囊线虫（H.filipjevi）和大麦孢囊线虫（H.latipons）危害最为严重。

在我国，禾谷孢囊线虫自1989年在湖北天门县矮黄麦株上首次发现以来[陈品三,王明祖,彭得良.我国小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae wollenweber)鉴定研究[J].植物病理学报,1992,22(4):339—343],目前在我国小麦主产区的河北、河南、北京、山西、内蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治区均有发生和分布，危害面积达400万hm²以上，且有逐渐蔓延之势,目前已成为危害我国麦类作物的重要病原线虫(彭德良等，我国小麦孢囊线虫的新发生分布地区.中国线虫学研究第二卷,2008,2:344-345;黄文坤，叶文兴，王高峰，龙海波，欧师琪，彭德良，宁夏地区禾谷孢囊线虫的发生与分布.华中农业大学学报,2011,30(1):74-77)。据调查，一般病田可减产20%-40%，严重地块减产达70%以上[彭德良，张东升，齐淑华，陈品三等，我国小麦孢囊线虫(Heterodera avenae)发生分布区域和防治初步研究.植物保护研究进展,1995,p53-56.中国科学技术出版社]。

1981年菲利普孢囊线虫最先在塔吉克斯坦被报道（Madzhidov，A.R.1981.Bidera filipjevin.sp.(Heteroderina:Tylenchida)inTadzhikistan.Izv.Akad.NaukTadzh.SSR Otd.Biol.Nauk2:40-44），目前已经在欧洲、亚洲、北美均有发生和分布（Smiley，R.W.,Yan,G.P.,and Handoo,Z.A.2008.First Record ofthe Cyst Nematode Heterodera filipjevi on Wheat in Oregon.PlantDisease92(7):1136；Holgado,R.,Andersson,S.,Rowe,J.A.,and Magnusson,C.2004First recordofHeterodera filipjevi in Norway.Nematologia Mediterranea32(2):205-211；）。彭德良等最先在我国河南汤阴发现菲利普孢囊线虫危害(Peng,D.L.,Ye,W.X.,Peng,H.,and Gu,X.C.2010.First Report ofthe Cyst Nematode(Heterodera filipjevi)on Wheat in Henan Province,China.PlantDisease94(10):1262-1262.)。目前该线虫被认为是国际小麦等禾谷类作物生产中面临的潜在威胁性线虫。菲利普孢囊线虫危害也非常严重，在土耳其该线虫造成冬小麦减产35%（Nicol,J.M.,Bolat,N.,Sahin,E.,Tülek,A.,Ylldlrlm,A.F.,Yorgancllar,A.,Kaplan,A.,and Braun,H.J.2006.The cereal cyst nematode is causing economic damage on rain-fed wheat production systemsofTurkey.Phytopathology96:S196；Yan,G.P.,and Smiley，R.W.2008.First detection ofthe cerealcyst nematode Heterodera filipjevi in North America.Phytopathology98:176），在伊朗最大造成了48%的产量损失（Hajihasani,A.,Tanha Maafi,Z.,Nicol,J.M.,and Rezaee,S.2010.Effect ofthecereal cyst nematode,Heterodera filipjevi,on wheat in microplot trials.Nematology12(3):357-363.）。目前菲利普孢囊线虫病主要发生在河南省，且造成了严重的产量损失，目前已经成为我国的麦类作物生产中的又一严重威胁，严重制约着麦类作物生产的发展，同时该线虫的发生分布还不十分的明确，对该线虫做出快速准确的鉴定是当前麦类作物生产急需解决的问题。

菲利普孢囊线虫和禾谷孢囊线虫的形态学差异非常小，主要在于菲利普孢囊线虫阴门锥有下桥结构，而禾谷孢囊线虫没有该结构，同时孢囊颜色、囊泡，双膜孔的形状也有细微的差异（Subbotin,S.A.,Waeyenberge,L.,Molokanova,I.A.,and Moens,M.1999.Identification ofspecies from the Heterodera avenae group by morphomometrics and ribosomal DNA RFLPs.Nematology(1):195-207），但是这些差异需要丰富的专业知识才能够区分，在生产实际中很难应用，同时传统的形态学鉴定耗时较多，工作量大很难满足目前的高通量快速检测的要求。

今年来，随着分子生物学的快速发展，PCR等快速检测技术已经广泛的运用到植物线虫的快速检测和鉴定中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS-RFLP，PCR，real timePCR等。

zheng等采用ITS-RFLP技术，通过HinfI内切酶酶切ITS区域，发现中国的禾谷孢囊线虫和欧洲H.avenae（A型）和印度群体（B型）均不相同，称其为“C型”（Zheng,J.,SubbotinS.A.,Waeyenberge L.,Moens M.,Molecular characterization of Chinese Heterodera glycines and H.avenae populations based on RFLPs and sequences of rDNA-ITS regions.Russian Journal ofNematology2000,8:109-113.）。彭德良等扩增了中国小麦禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区，用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷孢囊线虫ITS属于“B型”,HinfI酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在明显差异（彭德良,Subbotin S.A.,M.Moens.小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究.植物病理学报,2003,33(4):323-329）。Subbotin等同样采用ITS-RFLP技术通过Cfo Ⅰ内切酶能够有效的区分菲利普孢囊线虫（Subbotin,S.A.,Sturhan,D.,Rumpenhopst,H.J.,andMoens,M.2003.Molecular and morphological characterisation of the Heterodera avenae complexspecies(Tylenchida:Heteroderidae).Nematology5(5):515-538.）。Yan等运用rDNA-ITS区域RFLP结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的禾谷孢囊线虫进行了检测，该方法通过6种限制性内切酶能够有效的区分禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫（Yan,G.P.,and Smiley，R.W.2010.Distinguishing Heterodera filipjevi and H.avenae using polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism and cyst morphology.Phytopathology100(3):216-224.）。Fu等对我国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了ITS和RFLP分析（Fu Bo,Ian T.Riley，Li Honglian,et al.Molecular characterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on the Huang-Huai floodplainof China using RFLP and rDNA-ITS sequence analyses.Australasian Plant Pathol2011,40:277285）。

在孢囊线虫模式线虫甜菜孢囊线虫的检测中，Amiri等通过对H.betae、H.ciceri、H.glycines和H.medicaginis、H.schachtii、H.trifolii的ITS序列进行分析，筛选出特异性引物SHF6，将此引物与AB28（或rDNA2）引物结合，构建了甜菜孢囊线虫一步双重PCR的检测方法（Amiri S.,Subbotin S.A.,Moens M.,An efficient method for identification ofthe Heteroderaschachtii sensu stricto group using PCR with specific primers.Nematol.medit.2001,29:241-246）。

Subbotin S A,Peng D L,Moens M.运用双重PCR检测大豆孢囊线虫的方法，在一个PCR反应体系中同时运用通用引物D3A和D3B以及特异性引物GlyF1和rDNA2，从52个大豆孢囊线虫群体中均扩增出两个DNA片断（181bp and345bp），检测的敏感度高达单个孢囊、单头二龄幼虫的微量DNA（Subboton S.A.,Peng D L,Moens M.,A rapid method for theidentification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR.Nematology2001,vol.3(4):365-371）。Ou,S.Q.和Peng D.L采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，同时和D2A和D3B相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫。在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段（Ou S.Q.,Peng D.L.,Li Y.,Moens M.,Identification ofHeterodera glycinesusing PCR with sequence characterised amplified region(SCAR)primers.Nematology2008,10(3):397-403）。

亓晓莉等采用RAPD的方法，研究出禾谷孢囊线虫特异性SCAR分子标记，该方法能够特异的将禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫、大麦孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和豌豆孢囊线虫区分开，检测灵敏度高达1/80条2龄幼虫（亓晓莉，彭德良，彭焕，龙海波，黄文坤，贺文婷.基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）快速分子检测技术.中国农业科学，2012，45(21):4388-4395）。同时，Ophel-Keller等开发出虫土壤中直接检测禾谷孢囊线虫的realtime PCR检测技术，灵敏度达1个卵/1g(Ophel-Keller Kathy，McKay Alan,Hartley Di,Herdinaand Curran,John.Development of a routine DNA-based testing service for soilborne diseases inAustralia.Australian Plant Pathology，2008,37：243-253)。以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上弥补了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用，在禾谷孢囊线虫发生分布调查和田间快速诊断过程中，迫切需要一种简便快捷的检测手段。

循环恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)是2000年日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。（Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T,Watanabe K,Amino N and Hase T．Loop-mediated isothermalamplification ofDNA［J］．Nucleic Acids Res，2000，28(12):e63．），该技术通过识别靶序列上6个特异区域的特异性引物和利用具有链置换功能的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下能特异、高敏、快速地扩增靶序列。该技术有如下特点：1)特异性强、灵敏度高。LAMP反应正针对靶基因序列的6-8个特异性位点设计出4-6条引物，相比普通其他分子检测方法具有更强的特异性。2)扩增反应时间短、设备要求简单。LAMP反应具有极高的扩增效率，30-90分钟内可将靶基因扩增10⁹-10¹⁰，同时扩增过程无需专业的PCR仪等设备，简单的水浴即可完成反应。3）检测结果可以肉眼直接观察，简便快捷。由于该检测方法具有特异性强，灵敏度高，快速简便等特点，目前已广泛引用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测中。但在植物病原线虫检测中的运用刚刚起步，2008年日本科学家首次利用LAMP技术建立了从病木中直接检测松材线虫LAMP检测的方法（Kikuchi T,Aikawa T,OedaY，Karim N,KanzakiN.A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detecting the Pinewood Nematode Bursaphelenchusxylophilus by Loop-Mediated Isothermal Amplification.Nematology，2009,12:1365-1369）。2011年Niu et al等建立了南方根结线虫LAMP检测技术，能够从土壤和根结中检测出南方根结线虫（Niu J H,Guo Q X,Jian H,Chen C L,Yang D,Liu Q,Guo Y D.Rapid detection ofMeloidogyne spp.by LAMP assay in soil and roots.Crop Protection,2011,8:1063-1069）和象耳豆根结线虫（Niu J H,Jian H,Guo Q X,Chen C L,Wang X Y，Liu Q,Guo Y D.Evaluation ofloop-mediated isothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA-IGS2regions fordetecting Meloidogyne enterolobii.Plant Pathology，2011,02562.x）。2012年彭德良首次以象耳豆根结线虫ITS为靶标，建立了象耳豆根结线虫LAMP快速检测技术，检测灵敏度达到1/200000条幼虫（专利号：201110034960）。2012年彭焕等（Peng H,Peng D L,Hu X Q,He X F,WangQ,Huang W K,He W T.Loop-mediated isothermal amplification for rapid and precise detection ofthe burrowing nematode,Radopholus similis,directly from diseased plant tissues.Nematology，2012,14(8):977-986.）研究出从罹病植物组织中用LAMP快速和特异性检测香蕉穿孔线虫的方法，检测极限达1/20000条幼虫，灵敏度比常规PCR检测高100倍。除此之外，LAMP检测技术在菲利普孢囊线虫上尚无相关报道，本发明首次建立了菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立循环恒温扩增技术（LAMP）检测菲利普孢囊线虫的LAMP快速检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强等特点，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。

一种菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

①HF11-F3：5`-GGCAGCGATCAAAAGACT-3`；

②HF11-B3：5`-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3`;

③HF11-BIP：5`-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3`;

④HF11-FIP：5`-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3`;

⑤HF11-LF：5`-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3`;

⑥HF11-LB：5`-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3`;

其中的LAMP反应体系包括：

1）引物混合液：外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2μmol/L，内引物HF11-FIP和HF11-BIP各1.4μmol/L,环引物HF11-LB和HF11-LF为0.4μmol/L；

2）反应混合液：2.0mmol/L dNTP,20mmol/LTris-HCl(pH8.8),10mmol/L KCl,5mmol/LMgS0₄,10mmol/L(NH4)₂S0₄,0.1%Triton x-100,8U Bst DNA聚合酶大片段；

3）1μlDNA模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μlDNA模板，61～65℃保温30～90min，85℃保温10min。

LAMP反应的最终产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察。

所述显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1：9。

所述DNA模板的提取方法为：挑取单个菲利普孢囊放入装有10μlddH₂O的0.2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用灭菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的LB溶液，2μl的600μg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80℃下冷冻30min。将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后12000rpm离心1min后，上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应，所述LB溶液为500mmol/L KCl，10mmol/LTris-HCl，15mmol/LMgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5%Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

上述任一检测方法在诊断植物、土壤的菲利普孢囊线虫感染情况或鉴别菲利普孢囊线虫中的应用。

本发明利用循环恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplifcation,LAMP）建立针对菲利普孢囊线虫的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物经荧光显色后，结果可以通过肉眼直接判定，适用于各种实验条件下检测工作的使用，特别适合在实验条件不足的室外检测。

本发明的方案具体实施步骤如下：

1．线虫DNA提取试剂配制

1)LB(Lysis Buffer)溶液:500mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,15mmol/L MgCl₂,1.0mmol/LDTT,4.5%Tween20，121℃灭菌15min。

2)蛋白酶K：600μg/ml蛋白酶K，过滤灭菌。

2．DNA的提取

挑取单个菲利普孢囊放入装有10μl ddH₂O的0.2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用无菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的LB溶液，2μl的600μg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80℃下冷冻30min。将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

3.菲利普孢囊线虫PCR扩增及序列分析

采用本实验室开发的菲利普孢囊线虫SCAR特异性分子标记引物

OPK16-HfF2(5`-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3`)和OPK16-HfR2

（5`-AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3`）对菲利普孢囊线虫进行PCR检测。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP4μl，引物

OPK16-HfF2和OPK16-HfR2(10μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl,Takara）0.5μl，模板DNA5μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，58℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。

4.菲利普孢囊线虫LAMP引物设计

根据菲利普孢囊线虫SCAR片段的测序结果为模板，采用在线软件设计、实验筛选出以下6条特意性强，稳定性高的引物，序列如下:

①HF11-F3：5`-GGCAGCGATCAAAAGACT-3`；

②HF11-B3：5`-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3`;

③HF11-BIP：5`-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATT TTGTTGA-3`;

④HF11-FIP：5`-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAA TTGTC-3`;

⑤HF11-LF：5`-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3`;

⑥HF11-LB：5`-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3`;

5．LAMP反应体系配置：外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2μmol/L，内引物HF11-FIP和HF11-BIP各1.4μmol/L，环引物HF11-LB和HF11-LF为0.4μmol/L，2.0mmol/L dNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH8.8),10mmol/L KCl,5mmol/L MgS0₄,10mmol/L(NH4)₂S0₄,0.1%

Triton x-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，1μlDNA模板，用灭菌双蒸馏水补足25μl。

6.LAMP反应扩增条件：将以上混合液置于65℃恒温水浴中等温扩增75min，再85℃保温10min，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后观察结果。

7.LAMP结果检测：结果可以采用以下两种检测方法：

1）将上述反应完的体系中加入1μl的显色剂。轻晃混匀，即可观察；

2）取2μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；

本发明所提供的菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法具有以下优点：

一、灵敏度高。对菲利普孢囊线虫的检测极限可达到1/20000个孢囊水平，比常规PCR检测菲利普孢囊线虫的检测灵敏度高100倍。

二、特异性强。所用的特异引物根据菲利普孢囊线虫的特异性的SCAR片段的八个不同位置设计出6条引物，特异性比常规PCR要强。

三、检测时间短。1.5小时左右可获得检测结果，比常规PCR检测缩短2～4h。

四、对仪器设备要求简单，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统等专业仪器设备，简单的水浴锅或者保温设施就可以完成检测。

五、操作简单、结果直接。整个检测过程不涉及复杂仪器和和实验操作，一般技术人员即可完成检测，结果通过肉眼即可判定。

六、对人和环境友好。检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明比现有的检测菲利普孢囊线虫方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中进行现场应用检测。该技术可应用于对菲利普孢囊线虫田间土壤样品及菲利普孢囊线虫病的发生早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为菲利普孢囊线虫RAPD序列的LAMP引物设计示意图，

图2为菲利普孢囊线虫LAMP方法检测，

A为加荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光，2：阴性对照，为红褐色。

B检测结果为电泳图，M:D2000DNA标准分子量（Takara）1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2：阴性对照，无扩增产物。

图3为菲利普孢囊线虫LAMP检测方法特异性检测结果图

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1-10分别为：禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、大麦孢囊线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫和象耳豆根结线虫。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量（Takara），1-10分别为：禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、大麦孢囊线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫和象耳豆根结线虫。

图4为菲利普孢囊线虫灵敏度检测结果

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量（Takara），1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照。

C为普通PCR法检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量（Takara），1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，所用菲利普孢囊线虫本申请人实验室均有保存，可以免费向公众发放。

主要试剂：Taq DNA聚合酶购自天根公司；DNA marker购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T EasyVector购于美国promega Pro K（蛋白酶K）购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBR green I购自Invitrogen公司。

实施例1菲利普孢囊线虫DNA的提取、RAPD扩增及序列分析

1.1菲利普孢囊线虫DNA的提取

挑取单个菲利普孢囊放入装有10μl ddH₂O的0.2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用无菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的LB溶液，2μl的600μg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80℃下冷冻30min。将离心管取出，在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

1.2菲利普孢囊线虫SCAR片段扩增及序列分析

应用SCAR标记引物OPK16-HfF2(5`-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3`)和OPK16-HfR2（5`-AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3`）扩增菲利普孢囊线虫特异性SCAR片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg²⁺)5μl，10mM dNTP4μl，引物OPK16-HfF2和OPK16-HfR2(10μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl,Takara）0.5μl，模板DNA5μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，58℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。

实施例2LAMP技术检测菲利普孢囊线虫方法的建立

2.1LAMP引物设计

根据菲利普孢囊线虫SACR特异性片段的测序结果，设计并筛选下述LAMP引物（见图1），引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

①HF11-F3：5`-GGCAGCGATCAAAAGACT-3`；

②HF11-B3：5`-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3`;

③HF11-BIP：5`-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3`;

④HF11-FIP：5`-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3`;

⑤HF11-LF：5`-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3`;

⑥HF11-LB：5`-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3`;

2.2LAMP反应体系配置：

引物混合液：外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2μmol/L，内引物HF11-FIP和HF11BIP各1.4μmol/L,环引物HF11-LB和HF11-LF为0.4μmol/L；

反应混合液：2.0mmol/L dNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH8.8),10mmol/L KCl,5mmol/LMgS0₄,10mmol/L(NH4)₂S0₄,0.1%Triton x-100,8U Bst DNA聚合酶大片段，1μlDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

2.3LAMP反应扩增条件：将以上混合液置于65℃恒温水浴中等温扩增75min，85℃保温10min，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后观察结果（图2中A）。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，可看到有LAMP的特征性梯形带（图2中B）。

实施例3菲利普孢囊线虫LAMP特异性检测

收集禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、大麦孢囊线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫、象耳豆根结线虫（见表1），分别提取其DNA作为模板与菲利普孢囊线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测菲利普孢囊线虫LAMP检测方法的特异性。

表1供试的其它植物线虫群体样品代码及来源

上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化，第2管为菲利普孢囊DNA，可以观察到绿色荧光，其他植物线虫和阴性对照为模板的反应均为红褐色（图3A）。取3μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相（图3-B），可看到第2泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物。结果表明上述LAMP引物和反应体系能够特异性的检测菲利普孢囊线虫。

实施例4菲利普孢囊线虫LAMP灵敏度检测

将单头菲利普孢囊二龄幼虫DNA模板按10倍稀释成1～1.0×10^-56个浓度，各取1μlDNA做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后加入1μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(图4-A)，结果表明，1～5管均可以看到绿色荧光；取3μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相（图4-B），在1～5泳道均观察到LAMP的特征性梯形带，说明LAMP的检测灵敏度为1/20000头线虫。同时以上述稀释DNA为模板，以SCAR标记特异性引物cf257和cf594为引物，进行常规PCR检测，体系如下：2.5μl10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2.5μl10mM dNTPs，1μl引物对cf257/cf594(10uM)，0.3μlTaqDNA聚合酶（5U/ul），1μl模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25μl，采用无线虫DNA模板为阴性对照。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，58℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，凝胶电泳观察结果（图4-C）。结果表明在DNA稀释到10^-2倍时，能够观察到扩增条带，10^-3和更低的浓度时常规PCR则不能检测。

以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到1/20000头菲利普孢囊线虫，比常规PCR检测灵敏100倍，具有极高的灵敏度。

Claims (7)

1.一种菲利普孢囊线虫LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

①HF11-F3：5`-GGCAGCGATCAAAAGACT-3`；

②HF11-B3：5`-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3`;

③HF11-BIP：5`-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATTTTGTTGA-3`;

④HF11-FIP：5`-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAATTGTC-3`;

⑤HF11-LF：5`-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3`;

⑥HF11-LB：5`-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3`。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中的LAMP反应体系包括：

1）引物混合液：外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2μmol/L，内引物HF11-FIP和HF11-BIP各1.4μmol/L,环引物HF11-LF和HF11-LB各为0.4μmol/L；

2）反应混合液：3.2mmol/L dNTP,20mmol/L且pH8.8的Tris-HCl,10mmol/L KCl,3mmol/L MgS04,10mmol/L(NH4)2S04,0.1%Triton x-100,8U Bst DNA大片段聚合酶；

3）1μl DNA模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μl DNA模板，61～65℃温育30～90min，85℃保温10min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中LAMP反应的最终产物中加入有显色剂，轻甩离心管即可肉眼观察。

5.根据权利要求4所述的检测方法，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1：9。

6.根据权利要求2所述的检测方法，所述DNA模板的提取方法为：挑取单个菲利普孢囊放入装有10μl ddH2O的0.2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用灭菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μl的LB溶液，2μl的600μg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80℃冷冻30min；将离心管取出，在65℃温育90min，95℃反应10min处理后以上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP反应，所述LB溶液为500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2，1.0mmol/L DTT，4.5%Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

7.权利要求1-6所述任一检测方法在诊断罹病植物、土壤的菲利普孢囊线虫感染情况或鉴别菲利普孢囊线虫中的应用。

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