CN112725508B - 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途 - Google Patents

用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途。本发明的试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中该通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。本发明的试剂盒可实现对多种毛霉真菌的一次性检测，检测时间不超过2小时，还能进一步在一次检测中确定毛霉的具体类型。

Description

用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途
技术领域
本发明涉及真菌检测领域，具体地涉及用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途。
背景技术
毛霉菌病是一种罕见且病死率极高(可达50％以上)的侵袭性真菌感染，疾病的特征是血管侵犯和随后的血栓形成引起的组织坏死。毛霉菌病多发于存在明显危险因素或诱发因素的人群，包括器官移植、恶性血液病、糖尿病或肾功能衰竭患者，常为基础疾病所掩盖，所以临床误诊、漏诊率较高。毛霉菌病进展迅速，控制原发病、抗真菌治疗及外科手术清除局部病灶成为降低病死率的关键。
由于缺乏实验室检查支持，仅凭临床经验难以做出诊断。近年来开展的真菌抗原检测如血清1-3-β-D葡聚糖抗原(G试验)在毛霉感染时阴性。因此，毛霉感染只有通过真菌学和病理学组织学检查才能确诊。一旦在病灶刮片或培养中找到接合菌，或者在组织切片中发现侵入血管壁的菌丝即可确诊。呼吸道分泌物或异常组织涂片检查结果不很可靠，痰培养往往阴性，血培养的阳性率比痰培养更低。文献报道，痰培养阳性患者中，最后经纤支镜活检证实为肺毛霉感染者仅为50％，由开胸活检证实者仅为32％。由此可见，痰培养可导致假阳性，因此在临床标本中检出毛霉时通常被视为污染菌。对那些无法确诊的患者常需采用创伤性检查来明确诊断，如经支气管镜肺活检、经皮肺穿刺活检或开胸肺活检。
在诊断领域，已公开了多种针对真菌的检测。例如，CN 109706145 A公开了一种用于毛霉目的4种真菌LAMP引物组合及其应用。可应用于检测是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉，可应用于检测待测样本中是否含有稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌和/或微小根毛霉。虽然该引物组合具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测，但是该方法使用多对引物，引物并没有通用性。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，发明人在深入研究后发现在能够引发肺毛霉菌病的众多真菌中存在一组特定的真菌组合，即米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌，它们虽然属于不同的种属，但是却存在特定的保守区。由此发明人设计了一组能够在一次同时检出多种真菌的引物。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中，所述通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。
根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，所述通用引物的序列如SEQ ID NO:1-4所示。
根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含特异性探针组，其序列如SEQ ID NO:5-9所示。
根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含用于构建反应液的缓冲液，其中，所述反应液为扩增反应的体系，其包含8-20mM Tris-HCl、40-60mMKCl、0.05-0.5％乙基苯基聚乙二醇和2-8mM MgSO4，且pH值为8.5-9.0。
根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含内部质控和阳性质控。
根据本发明所述的用于肺毛霉菌病检测的试剂盒，优选地，进一步包含热启聚合酶。
本发明的第二方面，提供试剂盒的使用方法，其包括使用所述通用引物和可选的特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。
根据本发明所述的使用方法，优选地，所述PCR扩增包括：
(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；
(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、55-58℃退火、延伸，共30-50个循环。
本发明的第三方面，提供试剂盒在用于制备肺毛霉菌病致病菌检测的医疗装置中的用途。
本发明的试剂盒为商品化的毛霉实时PCR检测试剂盒，只需通过一对简单引物即可实现对多种毛霉真菌的检测，检测时间不超过2小时。在某些实施方案中，本发明的试剂盒还能进一步同时检测毛霉的具体类型。
附图说明
图1为使用引物对1和2检测匍枝根霉(A)和微小根毛霉(B)的扩增曲线图。
图2为使用不同反应液的结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的试剂盒能够一次性检测出样本中是否存在引发肺毛霉菌病的致病菌，特别是是否存在米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌。优选地，本发明的试剂盒还能够进一步鉴定致病菌的具体类型。
本发明的试剂盒可构建多重实时荧光PCR反应的反应体系。试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组。其中，通用引物能够结合至多种不同属致病菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自这些致病菌的保守片段，特异性探针组包括能够与保守片段的部分序列互补结合的多条探针。
在某些实施方案中，本发明的特异性探针组的某些探针中存在核苷酸类似物，从而使多条探针在同时检测时具有类似的Tm值。优选地，不同探针之间的Tm值相差在0.1-5℃范围内，优选1-5℃范围内。如果不同探针之间的Tm值相差过大，但在不同探针混合使用时不能进行同时检测。本发明中，核苷酸类似物的实例包括但不限于LNA、BNA和MGB。本发明的一条探针中可存在一个或多个核苷酸类似物，在存在多个核苷酸类似物的情况下，这些核苷酸类似物可以是同一种类似物，也可以是多种不同的核苷酸类似物。例如，在同一探针中同时存在LNA、BNA和MGB。在探针中引入核苷酸类似物从而使其Tm值升高，例如，升高1℃以上、优选2℃以上、更优选3℃以上，还优选4℃以上，例如5℃。通过引入核苷酸类似物可使多条探针之间的Tm值相差在所需范围内。优选地，特异性探针组的探针Tm值在60-68℃之间。例如60-65℃。
在一种示例性实施方式中，本发明的所有引物和探针以干燥粉末的混合物形式存在于容器，如小瓶。在另一示例性实施方案中，所有引物和探针溶解于缓冲液以形成混合物的形式存在于容器，如小瓶。本发明中，为了能够实现同时检测的目的，本发明的缓冲液可包含Tris-HCl、KCl、乙基苯基聚乙二醇和MgSO4。优选地，控制本发明的缓冲液在较低的离子强度范围内，从而能够由于引入核苷酸类似物而产生的不利影响，提高检测的特异性。在引入核苷酸类似物后，如果离子强度高，则非特异性结合变强，从而容易产生假阳性。在示例性实施方案中，缓冲液能够确保得到包含8-20mM Tris-HCl、40-60mM KCl、0.05-0.5％乙基苯基聚乙二醇和2-8mM MgSO4，且pH值为8.5-9.0的反应液或反应体系。由此可使反应体系中的离子强度适于特异性扩增。
本发明的特异性探针组中不同探针之间具有不同的荧光基团，从而使不同的探针对应于多重PCR的不同通道。作为荧光基团的实例包括但不限于FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX。本发明的探针优选还进一步包括荧光猝灭基团，其实例包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse。
本发明的试剂盒中，通用引物中正向引物和反向引物的量优选实质上相等。在某一具体实施方案中，本发明的正反向引物的量能够使其在反应体系中的最终浓度为0.1-0.4μM，优选0.2-0.3μM。
除了通用引物、特异性探针组外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸组)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
实施例1
本实施例为一种示例性毛霉菌检测试剂盒，其为基于荧光定量PCR技术，旨在检测米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌等。
本实施例的试剂盒包括PCR混合液(优化)、引物和荧光探针组成。
3.试剂盒组成如表1所示：
表1试剂盒组成
组份名称 规格(μl) 管盖颜色
毛霉属PCR混合液 >250 琥珀色
热启聚合酶 >25 紫色
稀释液 >950 透明
内部质控 >500 黑色
阳性质控 >125 白色
其中，PCR混合液包含10mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)、50mM KCl、0.08％乙基苯基聚乙二醇，引物如表2为所示的引物对1和2。
质控包括作为内部质控(IC)的M13，其Ct值在30.0-38.0之间，和作为阳性质控(PC)的Mucorales spp，其Ct值在25.0-29.0之间。
实施例2
本实施例为另一种示例性毛霉菌检测试剂盒，其为基于荧光定量PCR技术，旨在检测米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌，并确认其具体类型。除了下述说明外，其余与实施例1相同。
本实施例的试剂盒包括优化反应液、引物和荧光探针组成。
其中，PCR混合液包含10mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)、50mM KCl、0.08％乙基苯基聚乙二醇、2mM MgSO4。
其中，引物为表1的示的引物对1，并进一步包含探针组，其由五条分别标记不同荧光的探针组成，探针2、4和5中分别引入核酸类似物以提高其Tm值。
表2引物及探针序列及浓度
Figure BDA0002928929000000071
Figure BDA0002928929000000081
注：+G、+C、+T分别表示对应的LNA碱基，通过这些核苷酸类似物使探针组中各探针的Tm值在60-65℃范围内。
实施例3
本实施例为使用试剂盒的实验例。
1、样本与试剂盒的保存条件
检测试剂盒的组分应在-15℃至-30℃的避光条件下储存，避免反复冻融；样品应尽快运送到实验室，最好直接处理或在-20℃或-70℃条件下保存，避免反复冻融。
2、操作步骤
(1)核酸提取：
建议使用
Figure BDA0002928929000000082
Easy
Figure BDA0002928929000000083
自动提取仪，依照设定好的反应程序，每1ml样本可以得到50μl核酸。
(2)PCR检测：
反应体系配制：按下表进行体系配制，注意在冰盒上操作。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002928929000000084
(3)加样：
在配好的反应体系中加入5μl核酸样本(或PC或NC)，混匀，离心。
(4)上机：
本实施例使用实时荧光PCR仪：
Figure BDA0002928929000000085
480II(LC480II；Roche)和
Figure BDA0002928929000000086
Q(RGQ；QIAGEN)，按下表设定PCR反应程序：
表4 PCR反应程序
Figure BDA0002928929000000091
#：收集荧光信号
3、结果判读
选择二阶导数函数自动读取Ct值。实施例1的试剂盒对于样本结果判读方法如下所示：
表5样本结果判读
Figure BDA0002928929000000092
表6质控结果判读
Figure BDA0002928929000000093
注：在Mucorales spp阴性样本中，需检测到IC的阳性信号。
4、实验结果
经测试实施例1的试剂盒能够有效地检测样本中的根霉属、毛霉属、地衣、短刺小克银汉霉和根毛霉属。图1示例性示出了使用引物对1和2检测匍枝根霉(A)和微小根毛霉(B)的扩增曲线图。
图2示出了使用不同反应液的结果图。图2中使用引物对1、2U/反应的热启酶检测微小根毛霉样本进行反应液的性能测试。右图使用下述示性性反应液作为本发明的反应液，左图使用比较用反应液。
本发明的示例性反应液(X10)：
100mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)
500mM KCl
0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇P40
6mM MgSO4
适量dNTP
比较用反应液(X5)：
500mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)
200mM KCl
1mM MgSO4
适量dNTP
另外，使用引物1还检测了多种菌的最低检测限。具体地，将米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌株进行梯度稀释，浓度分别为1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL、0.1copies/μL，通过20个重复检测中检出率≥95％来确定最低检测限。最终检测限浓度如下表7：
表7最低检测限
名称 LOD浓度(copies/μl)
米根霉 1.5
微小根毛霉 2.2
伞枝横梗霉 0.5
匍枝根霉菌 1.7
刺孢小克银汉霉 1.2
接下来，使用四通道PCR测试实施例2的试剂盒性能。表8示出了不同PCR仪器的荧光通道设置。
表8不同PCR仪器的荧光通道设置
Figure BDA0002928929000000101
表9 PCR反应程序设置
Figure BDA0002928929000000102
表10以LC480 II为例示例性说明通过一次性检测可得到三种真菌的结果。
表10检测真菌的结果判定
Figure BDA0002928929000000111
备注：+表示阳性，-表示阴性，+/-表示可为阳性或阴性。其中，探针组包含探针1、探针2和探针3，且探针1的荧光基团为FAM，探针2的荧光基团为HEX，探针3的荧光基团为ROX。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途
<130> BH2000471-1
<141> 2021-02-02
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 9
atctgtttca gtaccattca aacatct 27

Claims (6)

1.一种用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，和用于构建反应液的缓冲液，其中，所述通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区；
所述通用引物的序列如SEQ ID NO:1和2所示，所述特异性探针组的探针序列如SEQ IDNO:5-9所示，且各探针的Tm值在60-65℃范围内，不同探针之间具有不同的荧光基团；
所述反应液为扩增反应的体系，其包含8-20mM Tris-HCl、40-60mM KCl、0.05-0.5%乙基苯基聚乙二醇和2-8mM MgSO4，且pH值为8.5-9.0。
2.根据权利要求1所述的用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒，其特征在于，进一步包含内部质控和阳性质控。
3.根据权利要求2所述的用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒，其特征在于，进一步包含热启聚合酶。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒的非诊断或治疗目的使用方法，其特征在于，包括使用所述通用引物和特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。
5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述PCR扩增包括：
(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；
(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、55-58℃退火、延伸，共30-50个循环。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒在用于制备肺毛霉菌病致病菌检测的医疗装置中的用途。
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