WO2015018156A1 - 一种弧菌属细菌的检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

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刘天强
刘衍鹏
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the invention relates to a detection technology of bacteria, in particular to a detection kit and a detection method of Vibrio bacteria.
  • Vibrio bacteria are a kind of gram-negative, extremely flagellated, mobile, spore-free short rod-shaped bacteria, which is one of the most important pathogens causing bacterial diseases in sea and freshwater fish. Vibrio disease caused by Vibrio has a wide prevalence and high incidence, which has caused great harm to the breeding industry. It is recognized as one of the most serious diseases in fish farming and an important limiting factor for the development of the industry.
  • the present invention provides a detection kit and a detection method for Vibrio bacteria.
  • the kit for detecting bacteria of the genus Vibrio of the present invention comprises a primer pair 1 having a sequence as shown in SEQ ID NOS: 1 to 2, and a gene derived from a bacterium belonging to the genus Vibrio.
  • the method for detecting Vibrio bacteria of the present invention comprises the following steps:
  • extracting the sample DNA extracting the DNA in the sample to be tested
  • Results detection Detection of DNA amplification results.
  • the sample described in step a is aquaculture water.
  • the present invention also provides the use of the oligonucleotide sequence shown by SEQ ID NOS: 1 to 2 for amplifying or detecting a gene derived from a bacterium of the genus Vibrio.
  • the kit and the method provided by the invention can specifically amplify Vibrio bacteria, have high specificity, high sensitivity and short time, and are used for rapid detection of aquaculture water bodies, and can prevent fish diseases from occurring in a timely and effective manner, and has good application prospects. .
  • FIG. 1 Vibrio PCR system test results, 1: negative control; 2: Vibrio parahaemolyticus; 3: Vibrio vulnificus; 4: Vibrio alginolyticus; 5: Vibrio cholerae; 6: Vibrio cholera; Vibrio vibrio; 8: Vibrio harveyi; 9: Vibrio alginolyticus; 10: Vibrio vulnificus; 11: DNA Marker I;
  • FIG. 2 Specificity of Vibrio PCR detection system, M: Marker 2000; 1: Vibrio cholerae; 2: Vibrio alginolyticus; 3: Vibrio harveyi; 4: Aeromonas hydrophila; 5: Dimensions Aeromonas; 6: Aeromonas septicum; ⁇ Aeromonas guinea; 8: Aeromonas sinensis; 9: Flavobacterium columnar; 10: E. faecalis; 11: E.
  • Figure 4 Detection sensitivity of the PCR system to the bacterial solution, 1: blank control; 2: bacterial solution with a concentration of 2.7 ⁇ 10 7 cfu/ml; 3: bacterial solution with a concentration of 2.7 ⁇ 10 6 cfo/ml; 4: concentration 2.7 X 10 5 cfo/ml bacterial solution; 5: concentration of 2.7X10 4 cfu/ml bacterial solution; 6: concentration of 2.7X 10 3 cfu/ml bacterial solution; 7: concentration of 2.7X10 2 cfo/ml Bacterial solution; 8: concentration is 2.7X lO ⁇ fu/ml; M: DNA Marker I.
  • Aeromonas aeruginosa purchased (Wuhan University Culture Collection) ATCC9071 Aeromonas sinensis self-divided, black scorpion HYL1 guinea pig Aeromonas self-divided, group head ⁇ 4LNC210 mild Aeromonas self-divided, squid CR79-1- 1 Streptococcus mutans self-divided, squid 0722XY Streptococcus agalactiae self-divided, tilapia 0718flz Streptococcus mutans (Guangxi Fisheries Research Institute) Sn E.
  • the seven strains of Vibrio in Table 1 were activated by medium.
  • the seven strains were common Vibrio bacteria, of which Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus were model species; after activation, bacterial genome was used.
  • the DNA extraction kit (TIANGEN) extracted DNA from seven strains as a PCR detection template.
  • the genomic DNA of 7 strains of Vibrio spp. extracted in step 2 was used as a template, and ddH 2 0 was used as a blank control.
  • the primers designed in step 1 were used for amplification.
  • the amplification system and procedure were as follows:
  • the total PCR reaction system was 50 and contained l x PCR buffer, 0.4 ⁇ each primer, 0.2 mM dNTP, 1.25 U rTaq enzyme, 2 l l% BSA and 50-100 ng DNA template.
  • PCR reaction conditions Pre-denaturation at 95 °C for 4 min; then 30-35 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 53 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min), and extension at 72 °C for 10 min.
  • the amplified product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis.
  • the electrophoresis conditions were voltage 100 V and time 60 min, and the PCR amplification results were observed under a gel imaging system.
  • the experimental results are shown in Fig. 1.
  • the blank control has no amplified bands, and the 7 strains of Vibrio can expand the target band of 524 bp in length.
  • Example 2 The primer pair in Example 1 (SEQ ID N 0.1 to 2) was taken.
  • Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus
  • Vibrio harveyi Vibrio harveyi
  • other 20 species of Vibrio activated by medium
  • DNA was extracted using the bacterial genomic DNA extraction kit (TIANGEN) as a PCR detection template.
  • PCR amplification The genomic DNA of the three Vibrio species extracted in step 2 and the genomic DNA of 20 non-Vibrio species were used as templates, and dd3 ⁇ 40 was used as a blank control, and the primers shown in SEQ ID N0.1 ⁇ 2 were used. The amplification, amplification system and procedure were the same as in Example 1.
  • Example 2 The primer pair in Example 1 (SEQ ID N 0.1 to 2) was taken.
  • Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus shown in Table 1 were separately activated with the medium before the test.
  • DNA was extracted using the bacterial genomic DNA extraction kit (TIANGEN), and the concentration of the DNA sample was determined by gradient dilution to obtain a concentration of 0.058 fg/ ⁇ 0.58 fg/ ⁇ 5.8 fg/ ⁇ 58 fg/ ⁇ 580 fg, respectively. / ⁇ 5.8 pg/ ⁇ 58 pg/ ⁇ , 580 pg/ ⁇ 5.8 ng/ ⁇ 58 ng/ ⁇ DNA sample solution.
  • TIANGEN bacterial genomic DNA extraction kit
  • the sample solution was diluted with a concentration of 2.7 X 10 7 cfu/ml-2.7 X li ⁇ cfu/ml.
  • the sample solution obtained in the step 2 was used as a template, and dd3 ⁇ 40 was used as a blank control, and amplification was carried out by using the primers shown in SEQ ID N 0.1 to 2.
  • the amplification system and the procedure were the same as those in Example 1.
  • the amplified product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis.
  • the electrophoresis conditions were voltage 100V, time 60min, and the PCR amplification results were observed under the gel imaging system.
  • the experiment shows that the DNA concentration of Vibrio bacteria is not less than 58fg / l or the bacterial liquid in the sample to be tested.
  • concentration is not lower than 2.7 X 10 2 cfu/ml, the method of the invention can achieve accurate detection with high sensitivity.
  • the detection kit and the detection method provided by the invention can specifically amplify Vibrio bacteria, have high specificity, high sensitivity, short time-consuming, rapid detection and good application prospect.

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Abstract

本发明公开了一种弧菌属细菌的检测试剂盒，包含序列如SEQ ID NO：1~2所示的引物对1，扩增来自弧菌属细菌的基因。本发明还公开了一种弧菌属细菌的检测方法。

Description

说 明 书 一种弧菌属细菌的检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及一种细菌的检测技术， 特别是弧菌属细菌的检测试剂盒和检 测方法。
背景技术
弧菌属细菌是一类革兰氏阴性、 具极生鞭毛、 能运动、 无芽孢的短杆状 细菌， 是引起海、 淡水养殖鱼类细菌性疾病最重要的病原菌之一。 由弧菌引 起的弧菌病， 流行面积广， 发病率高， 给养殖业造成了巨大危害， 被公认为 是鱼类养殖中最为严重的病害之一， 是该行业发展的重要限制性因素。
弧菌引起的鱼类感染， 与其他细菌， 如气单胞菌引起的鱼类感染在发病 症状方面非常相似， 都是以出血性败血症为主要特征， 而弧菌与气单胞菌等 细菌的生物特性也非常相似， 难以有效区分， 所以， 如何在临床上对弧菌病 进行快速、 正确的诊断， 对于采取正确的应对措施以控制疾病的进一步发展 非常重要。
发明内容
为了解决上述问题， 本发明提供了一种弧菌属细菌的检测试剂盒和检测 方法。
本发明弧菌属细菌的检测试剂盒， 包含序列如 SEQ ID NO: 1~2所示的 引物对 1， 扩增来自弧菌属细菌的基因。
本发明弧菌属细菌的检测方法， 包括如下步骤：
a， 提取样本 DNA: 提取待检样本中的 DNA;
b， 基因扩增： 用权利要求 1所述的试剂盒对待检样本中的 DNA进行扩 十幽 ·
曰
c， 结果检测： 对 DNA扩增结果进行检测。
其中， 步骤 a所述的样本为养殖水体。
本发明还提供了 SEQ ID NO: 1〜2所示的寡核苷酸序列的用途， 其用于 扩增或检测来自弧菌属细菌的基因。
本发明提供的试剂盒和方法可以特异扩增弧菌属细菌， 特异性强、 灵敏 度高、 耗时短， 用于快速检测养殖水体， 可及时有效地预防鱼病的发生， 具 有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容作进一步的 详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明
图 1 弧菌属 PCR体系测试结果， 1: 阴性对照； 2: 副溶血弧菌； 3: 创 伤弧菌； 4: 溶藻弧菌； 5: 霍乱弧菌； 6: 霍利斯弧菌； Ί 强壮弧菌； 8: 哈 维氏弧菌； 9: 溶藻弧菌； 10: 创伤弧菌； 11: DNA Marker I；
图 2 弧菌属 PCR检测体系的特异性， M: Marker 2000； 1： 霍乱弧菌； 2： 溶藻弧菌； 3: 哈维氏弧菌； 4: 嗜水气单胞菌； 5: 维氏气单胞菌； 6: 舒氏气单胞菌； Ί 豚鼠气单胞菌； 8: 温和气单胞菌； 9: 柱状黄杆菌； 10: 鲶爱德华氏菌； 11: 迟缓爱德华氏菌； 12: 停乳链球菌； 13: 无乳链球菌； 14： 海豚链球菌； 15: 大肠杆菌； 16: 枯草芽孢杆菌； 17: 金黄色葡萄球菌； 18： 弗氏柠檬酸杆菌； 19: 类志贺氏菌； 20: 龟分枝杆菌； 21: 海分枝杆菌； 22： 偶发分枝杆菌； 23: 鯽鱼诺卡氏菌；
图 3 弧菌属 PCR体系的检测灵敏度， 1: 空白对照； 2: 0.058 fg/μΐ; 3：
0.58 fg/μΐ; 4： 5.8 fg/μΐ; 5： 58 fg/μΐ; 6： 580 fg/μΐ; 7： 5.8pg^l; 8： 58 pg/μΐ; 9： 580 pg/μΐ; 10： 5.8ng^l; 11： 58 ng/μΐ; M: DNA Marker I；
图 4 PCR体系对菌液的检测灵敏度， 1: 空白对照； 2: 浓度为 2.7X 107cfu/ml的菌液； 3:浓度为 2.7X 106cfo/ml的菌液； 4:浓度为 2.7 X 105cfo/ml 的菌液； 5:浓度为 2.7X104cfu/ml的菌液； 6:浓度为 2.7X 103cfu/ml的菌液； 7：浓度为 2.7X102cfo/ml的菌液； 8:浓度为 2.7X lO^fu/ml; M: DNA Marker I。
具体实施方式
一、 实验材料和仪器
1、 试验菌株
表 1 试验菌种表
Figure imgf000003_0001
维氏气单胞菌 外购 （武汉大学菌种保藏中心） ATCC9071 舒氏气单胞菌 自分， 乌鳢 HYL1 豚鼠气单胞菌 自分， 团头鲂 4LNC210 温和气单胞菌 自分， 鲫鱼 CR79-1-1 停乳链球菌 自分， 鲟鱼 0722XY 无乳链球菌 自分， 罗非鱼 0718flz 海豚链球菌 外购 （广西水产研究所） Sn 大肠杆菌 外购 （武汉大学菌种保藏中心） ATCC25922 枯草芽孢杆菌 自分 WB600 金黄色葡萄球菌 外购 （武汉大学菌种保藏中心） C1231b 弗氏柠檬酸杆菌 自分， 鲟鱼 AS0902 类志贺氏菌 自分， 鲟鱼 LL1 龟分枝杆菌 自分， 鲟鱼 CST-7.3 海分枝杆菌 自分， 鲟鱼 ASCy- 1.0 偶发分枝杆菌 自分， 鲟鱼 ASCw- 1.3 鯰鱼爱德华氏菌 自分， 黄颡鱼 HSN- 1 迟缓爱德华氏菌 外购 （武汉大学菌种保藏中心） 1101 柱状黄杆菌 自分， 草鱼 G4 鲫鱼诺卡氏菌 自分， 乌鳢 012L1
2、 主要试剂和器材
1、 器材： 常规 PCR仪 (； Bio-Rad：)、 电泳仪 (； Bio-Rad：)、 凝胶成像系统 (Bio-Rad),生物安全柜 (海尔：)、离心机 (；科大中佳：)、移液器 (Eppendorf); 吸头、 离心管；
2、 NB培养基、 细菌基因组 DNA提取试剂盒、 2xPCR mix。 实施例 1 引物设计
一、 实验方法
1、 PCR引物设计与合成
根据弧菌属共有基因的保守序列设计了 3对引物， 其中， 根据弧菌属细 菌共有的 rpoA基因 (基因号： KC456238.1、 KC197037.K CP003972.K JX257011. JX257010.1)保守序列设计的引物， 特异性强、 灵敏度高， 弓 I物 序列如表 2所示， 序列由上海生工合成。
表 2 PCR引物资料
Figure imgf000005_0001
2、 模板制备
用培养基分别活化表 1中弧菌属的 7个菌种，该 7个菌种为常见的弧菌属细 菌， 其中， 霍乱弧菌和副溶血弧菌为模式种； 活化后， 用细菌基因组 DNA提 取试剂盒 （TIANGEN) 分别提取 7个菌种的 DNA, 作为 PCR检测模板。
3、 PCR扩增
分别以步骤 2提取的弧菌属 7个菌种的基因组 DNA作为模板，以 ddH20 为空白对照， 用步骤 1设计的引物进行扩增， 扩增体系和程序如下：
PCR反应总体系为 50 ，包含 l x PCR buffer, 0.4 μΜ每条引物， 0.2 mM dNTP, 1.25 U rTaq酶， 2 l l% BSA和 50-100 ng DNA模板。 PCR反应条 件： 预变性 95 °C 4min; 然后 30~35个循环 (94°C变性 30s， 53 °C退火 30 s， 72°C延伸 lmin), 最后 72°C延伸 10 min。
4、 结果检测
取 5 μΐ,扩增产物， 采用 2%琼脂糖凝胶电泳进行分析， 电泳条件为电压 100V、 时间 60min， 置于凝胶成像系统下观察 PCR扩增结果。
二、 结果
实验结果如图 1所示， 空白对照无扩增条带， 而弧菌属的 7个菌种均能扩 增出长度为 524bp的目标条带。
实验证明， 本发明引物对可以准确扩增弧菌属细菌的基因片段。 实施例 2 特异性试验
一、 试验方法
1、 PCR引物
取实施例 1中的引物对 （SEQ ID N0.1~2 )。
2、 模板制备：
取表 1所示弧菌属的 3个菌种： 霍乱弧菌、 溶藻弧菌、 哈维氏弧菌， 以及 其他 20个非弧菌属的菌种， 用培养基分别活化； 细菌活化后， 用细菌基因组 DNA提取试剂盒 （TIANGEN) 提取 DNA, 作为 PCR检测模板。
3、 PCR扩增 分别以步骤 2提取的 3个弧菌属菌种的基因组 DNA, 以及 20个非弧菌 属菌种的基因组 DNA作为模板， 以 dd¾0为空白对照， 用 SEQ ID N0.1~2 所示引物进行扩增， 扩增体系和程序同实施例 1。
4、 结果检测
取 5 μ 扩增产物， 采用 2%琼脂糖凝胶电泳进行分析， 电泳条件为电压 100V、 时间 60min， 置于凝胶成像系统下观察 PCR扩增结果。
二、 结果
结果如图 2所示， 空白对照无扩增条带， 弧菌属的 3个菌种均扩增出大小 为 524bp的目标条带， 而非弧菌属的 20个菌种均未无扩增条带。
实验证明，本发明检测方法可以准确区分弧菌属细菌与非弧菌属的细菌， 特异性强。 实施例 3 灵敏度试验
一、 试验方法
1、 PCR引物
取实施例 1中的引物对 （SEQ ID N0.1~2)。
2、 模板制备：
试验前用培养基分别活化表 1所示霍乱弧菌和副溶血弧菌。
霍乱弧菌活化后，用细菌基因组 DNA提取试剂盒（ TIANGEN )提取 DNA， 测定 DNA样品的浓度， 梯度稀释， 得到浓度分别为 0.058 fg/μ 0.58 fg/μΚ 5.8 fg/μΚ 58 fg/μΚ 580 fg/μΚ 5.8 pg/μΚ 58 pg/μ, 580 pg/μΚ 5.8 ng/μΚ 58 ng/μΐ 的 DNA样品液。
副溶血弧菌活化后， 梯度稀释， 得菌液浓度为 2.7 X 107cfu/ml-2.7 X li^cfu/ml的样品液。
3、 PCR扩增
分别以步骤 2得到的样品液作模板， 以 dd¾0为空白对照， 用 SEQ ID N0.1~2所示引物进行扩增， 扩增体系和程序同实施例 1。
4、 结果检测
取 5 扩增产物， 采用 2%琼脂糖凝胶电泳进行分析， 电泳条件为电压 100V、 时间 60min， 置于凝胶成像系统下观察 PCR扩增结果。
二、 结果
如图 3所示，样品 DNA浓度为 58fg/ l以上时扩增得到清晰条带，样品 DNA 浓度小于 58fg/ l时无条带出现； 如图 4所示， 样品浓度为 2.7 X 102cfu/ml以上 时扩增得到清晰条带， 样品浓度小于 2.7 X 102cfu/ml时无条带出现。
实验说明， 待检样品中， 弧菌属细菌的 DNA浓度不低于 58fg/ l或者菌液 浓度不低于 2.7 X 102cfu/ml时， 本发明方法可以实现准确检测， 灵敏度高。 工业应用性
本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以特异扩增弧菌属细菌， 特异性 强、 灵敏度高、 耗时短， 检测快速， 具有良好的应用前景。

Claims

权 利 要 求 书
1、一种弧菌属细菌的检测试剂盒，其特征在于：包含序列如 SEQ ID NO: 1~2所示的引物对 1， 扩增来自弧菌属细菌的基因。
2、 一种弧菌属细菌的检测方法， 其特征在于： 包括如下步骤：
a， 提取样本 DNA: 提取待检样本中的 DNA;
b， 基因扩增： 用权利要求 1所述的试剂盒对待检样本中的 DNA进行扩 十幽 ·
曰
c， 结果检测： 对 DNA扩增结果进行检测。
3、根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于： 步骤 a所述的样本为养殖 水体。
4、 SEQ ID NO: 1〜2所示的寡核苷酸序列的用途， 其特征在于： 用于 扩增或检测来自弧菌属细菌的基因。
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