CN101838691A - 鱼类哈维氏弧菌pcr快速检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法。该试剂盒包括7种试剂：裂解液、PCR反应液、dNTP混合物、Taq酶液、引物对、阳性对照及阴性对照等。哈维氏弧菌DNA的特异引物对：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’和5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’。本发明的突出优点是仅需一对哈维氏弧菌DNA的特异引物，即可对不同样品中哈维氏弧菌进行检测或监控，方法简便、快速、灵敏、应用范围广。不但能对养殖鱼类疾病进行快速诊断，而且可为海水水质监控以及海产品质量控制提供最简便方法。
Description
技术领域
本发明属于水产动物、海产品及海水污染的监测技术。特别是水产养殖动物的哈维氏弧菌感染的检测--鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法。
背景技术
哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中，是引起水产动物感染致病的主要菌源，能引起水产动物的皮肤溃烂、肌体出血和大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，哈维氏弧菌携带的溶血素是水产动物的致病因子即感染致病的根源，对于哈维氏弧菌的检测方法，目前主要有生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术等。但这些方法存在一些缺点和不足：生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰、rRNA基因在物种中非常保守，使得技术特异性不强。目前的PCR虽然是一种具有灵敏度高、特异性强的靶DNA快速检测方法，样品中含有少量的致病因子就能检出。然而，已有的PCR检测技术方法较为繁琐，且对哈维氏弧菌检测识别率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼类哈维氏弧菌的PCR快速检测试剂盒及使用方法，以快速检测和判定或者监测水产动物、海产品及哈维氏弧菌污染的海水，弥补现有技术的不足。
研究表明：哈维氏弧菌携带的溶血素是水产动物感染致病的根源，即本发明所指的致病因子，快速检测样品中的致病因子基因即可判断水产动物是否感染致病，从而为进一步为防治感染提供依据。本发明在克隆出哈维氏弧菌致病因子的编码基因，分析其序列特征的基础上，以该特异基因的保守区段设计特异性引物，并且采用PCR快速技术检测哈维氏弧菌，具有准确、快速、灵敏等优点。可作为水产养殖鱼类疾病的快速、简便、准确的检测方法，也可用作养殖水体、饲料和海产品的质量检测以及海水污染的监控。
本发明的主要原理为：裂解液将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，加入PCR反应试剂和Tag酶等，以哈维氏弧菌致病因子的特异DNA片段引物为模板，对样品中释放出的哈维氏弧菌致病因子DNA进行专一性扩增，浓度达到可检测范围后进行检测。由于设计的特异引物为哈维氏弧菌所特有，因此，样品中含有的哈维氏弧菌就被会被检出。
本发明的PCR快速检测试剂盒包括以下7种试剂：
(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7.5-8.5，其浓度分别为1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；
(2)PCR反应液：含dNTP和MgCL2溶液
dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四种混合物dNTP，其中每种浓度2.0-3.0mmol/L；浓度为20-30mmol/L的MgCL2溶液；
(3)Taq酶液：3U/μL；
(4)引物对：
所述的引物对是人工设计并人工合成的DNA片段，碱基序列分别为：
上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L
下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L
(5)灭菌去离子水
(6)阳性对照
(7)阴性对照。
本发明使用PCR快速检测试剂盒检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于检测程序如下：
a.待检样品的处理及模板DNA制备
待检样品经无菌生理盐水清洗后，取0.1-0.2g待检组织于洁净的灭菌匀浆器中，加入0.5-1.0mLTE缓冲液，充分研磨，取0.5-1.0mL样品液于1.5mL灭菌离心管，用于提取模板DNA。
将上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分钟。冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清200μL作为PCR模板，并于-20℃保存。
海水样品不需要样品处理，可直接进入PCR扩增。
b.PCR扩增
在一个PCR管内加入1μL模板DNA，9μLPCR反应液，1μL酶液，1μL引物，用灭菌去离子水补足到50μL，在3000g离心5秒钟混匀，置于PCR仪中进行扩增使扩增倍数达到107左右。同样制作其它待测样品以及阳性对照和阴性对照品。
PCR扩增条件：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，如此进行25个循环，然后72℃延伸10分钟。
本发明的PCR快速检测结果判定方法：
取10μL PCR产物(加2-6μL 0.25-0.75％澳酚蓝上样缓冲液)加于1.2-2.0％琼脂糖凝胶中(含有溴化乙锭浓度为0.5-1.0μg/mL)，100-150v电压电泳25-30分钟，取凝胶在紫外透射仪下观察。当在622bp出现特异核酸条带，即可判断样品中含有哈维氏弧菌，反之则没有。同样方法可判断海产品及海水受污染情况。
本发明在设计哈维氏弧菌致病因子特异引物并成功建立PCR检测技术的基础上，进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，与现有的哈维氏弧菌病原检测技术相比，本发明具有以下显著特点：本发明的PCR快速检测试剂盒，仅需提供一对针对哈维氏弧菌DNA的特异引物，即可对样品中哈维氏弧菌进行检测或监控，方法简便、快速、灵敏，而为水产养殖、海水水质监控以及海产品加工的质量控制提供准确的、标准的、科学的方法。通过快速检测样品中的致病因子基因即可判断水产动物是否感染致病，从而为进一步防治感染提供依据。
本发明具有的优点如下：
1.检测速度快：1-3小时即可得到检测结果，而其它方法需要一天或一周以上；
2.检测灵敏度较高：检测下限为10个/μL致病菌，其它方法须经过细菌培养增殖后才能进行检测；
3.可以应用于多领域多种类样品的检测水产养殖领域：水生动物遭受哈维氏弧菌感染情况的检测，养殖水体被污染情况的监测，养殖饲料和鲜活饵料遭受哈维氏弧菌污染的品控。
环保领域：海水受污染情况的监控。
食品领域：水产品加工过程中时哈维氏弧菌污染的防控。
具体实施方式
本发明的所述鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其中所述PCR试剂的最佳成分和用量为：
| 试剂盒试剂组成(25个反应) | 体积 |
| (1)裂解液 | 20mL(25x800μL) |
| (2)PCR反应液 | 225μL(25x9μL) |
| (3)Taq酶液 | 25μL |
| (4)PCR引物 | 25(25x1μL) |
| (5)灭菌去离子水 | 1000μL |
| (6)阳性对照 | 25μL |
| (7)阴性对照 | 25μL |
实施例1
1.养殖场病鱼及健康鱼中哈维氏弧菌的检测
取工厂化海水养殖场发病的牙鲆、大菱鲆、鲈鱼及对照健康鱼，样品鱼用无菌生理盐水清洗，无菌取病变部位组织或正常组织0.1g，加0.5mL PH为8.0、浓度为10mmol/L的裂解液，匀浆。然后置100℃水浴中保持10分钟。取出冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清1μL作为PCR模板，加入最终浓度为2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶液、20μmol/L的上下游引物、3U/μL的Taq酶液以及相应体积的灭菌去离子水，进行PCR扩增。
取10μLPCR产物加于1.5％琼脂糖凝胶中，100v电压电泳30分钟，在紫外透射仪下观察。在622bp出现特异条带，此即为样品中含有哈维氏弧菌。健康鱼样品在622bp无特异条带。
实施例2
2.海水中哈维氏弧菌的检测
取工厂化养殖的鱼池、虾池、扇贝育苗池中海水样品。用无菌海水对样品进行5倍稀释，然后置100℃水浴中保持10分钟。取出冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清1μL作为PCR模板，加入最终浓度为2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶液、20μmol/L的上下游引物、3U/μL的Taq酶液以及相应体积的灭菌去离子水，进行PCR扩增。
取10μL PCR产物加于1.5％琼脂糖凝胶中，100v电压电泳30分钟，在紫外透射仪下观察。在622bp出现特异条带，表明该样品中含有哈维氏弧菌，该海水已经被污染。在622bp无特异条带出现，表明该海水未被污染。
实施例3
3.海产品中哈维氏弧菌的检测
取超市购买的鱼片、烤鱼、鱿鱼丝样品0.1g，加0.5mL加0.5mL PH为8.0、浓度为10mmol/L的裂解液，匀浆。然后置100℃水浴中保持10分钟。取出冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清1μL作为PCR模板，加入最终浓度为2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶液、20μmol/L的上下游引物、3U/μL的Taq酶液以及相应体积的灭菌去离子水，进行PCR扩增。
取10μLPCR产物加于1.5％琼脂糖凝胶中，100v电压电泳30分钟，在紫外透射仪下观察。在622bp出现特异条带，此即为样品中含有哈维氏弧菌或残留，卫生不合格或加工原料不合格。卫生合格海产品样品在622bp无特异条带。
<110>中国海洋大学
<120>鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(24)
<400>1
gaaaaccaat acatcgctct gact 24
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(26)
<400>2
ttgacaattg attcgtactt tctagc 26
Claims (4)
1.一种鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括以下7种试剂：
(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7.5-8.5，其浓度分别为1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；
(2)PCR反应液：含dNTP和MgCL2溶液；
dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四种混合物dNTP，其中每种浓度2.0-3.0mmol/L；浓度为20-30mmol/L的MgCL2溶液；
(3)Taq酶液：3U/μL.；
(4)引物对：
上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L
下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L
(5)灭菌去离子水
(6)阳性对照
(7)阴性对照。
2.根据权利要求1所述的鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述PCR试剂的最佳成分为：
PCR反应试剂最佳用量：
3.利用上述鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于检测程序如下：
a.待检样品的处理及模板DNA制备
待检样品经无菌生理盐水清洗后，取0.1-0.2g待检组织于洁净的灭菌匀浆器中，加入0.5-1.0mL TE缓冲液，充分研磨，取0.5-1.0mL样品液于1.5mL灭菌离心管，用于提取模板DNA；
将上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分钟，冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清200μL作为PCR模板，并于-20℃保存；
海水样品不需要样品处理，可直接进入PCR扩增；
b.PCR扩增
在一个PCR管内分别加入1μL模板DNA，9μLPCR反应液，1μL酶液和1μL引物，然后用灭菌去离子水补足到50μL，在3000g离心5秒钟混匀，置于PCR仪中进行扩增使扩增倍数达到107左右；同样制作其它待测样品以及阳性对照和阴性对照品；
PCR扩增条件：94℃预变性3分钟，并且分别以94℃变性1分钟，58℃退火1分钟和72℃延伸1分钟，如此进行25个循环，然后72℃延伸10分钟。
4.根据权利要求1所述的鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于PCR快速检测结果判定方法：
取已加入0.25-0.75％澳酚蓝上样缓冲液的10μL PCR产物，加于含有溴化乙锭浓度为0.5-1.0μg/mL的1.2-2.0％琼脂糖凝胶中，在100-150v电压下电泳25-30分钟，取电泳结束后的凝胶在紫外透射仪下观察，当在622bp出现特异核酸条带，即可判断样品中含有哈维氏弧菌，反之则没有。
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