CN105648097B

CN105648097B - 一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

Info

Publication number: CN105648097B
Application number: CN201610167582.1A
Authority: CN
Inventors: 段传人; 张坤; 崔亚敏; 孙达; 张宝云; 王媛; 罗美玲
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2016-03-22
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-03-22
Also published as: CN105648097A

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒含有前述狗粪便污染检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述试剂盒对狗粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为3.90拷贝数/反应，阳性率高达88%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。

Description

一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。

背景技术

狗是人类饲养率最高的宠物，不论城市，农村到处都可见狗的身影，然而狗粪便污染却少有人研究。一些发展中国家，如印度，受其经济基础所限，很多地区的饮用水均为未处理的地表水或湖泊水，狗在印度作为饲养率最高的动物之一，其粪便造成的饮用水污染对人体的健康造成很大危害。目前，水质监测的生物指标为大肠杆菌数和细菌总数，然而这些指标只能反映水体状况，无法实时监控水体污染，也无法定位水体污染源。

因此，能够准确检测狗粪便污染是当务之急。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种狗粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CAGGCGGACTCTTAAGTC；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GCGATCGGAGTTCTTCAT。

本发明的第二方面，提供了前述狗粪便污染检测引物对在制备狗粪便检测试剂或检测试剂盒中的用途。

本发明的第三方面，提供一种狗粪便污染检测试剂盒，所述试剂盒含有前述狗粪便污染检测引物对。

优选地，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：CTAACTACGTGCCAGCAGCC；所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示，具体为：GCCTTCGCCACTGGTGTTCC。

本发明的试剂盒采用高灵敏性的PCR技术来进行狗粪便Faecalibacterium菌的检测，采用所述狗粪便污染检测引物对进行PCR扩增，根据扩增情况可分析来判断狗粪便Faecalibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒采用的是PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs均为常见组分，其含量亦为常规。

PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以含有2×Power Taq PCR Master Mix。加入本发明的狗粪便污染检测引物对即可获得PCR扩增反应液。

所述试剂盒中还可含有阳性对照。阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列，可为含有Faecalibacterium菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可以为灭活的Faecalibacterium菌培养液。还可采用现有Faecalibacterium菌检测试剂盒中的阳性对照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。

所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水（DEPC-H₂O）、生理盐水等。

本发明的第四方面，提供一种采用前述狗粪便污染检测试剂盒进行狗粪便污染检测的方法，包括如下步骤：

（1）提取样品基因组DNA；

（2）加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管；

（3）PCR扩增：反应管置于PCR仪上，设置反应参数，进行PCR扩增；

（4）PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。

步骤（1）中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，可采用MO-BIO PowerSoil® DNA Isolation kit提取样品基因组DNA。

优选地，步骤（2）中，各反应管中，PCR扩增反应液的体积为15 ul，含样品基因组DNA 1ul，正向引物（10uM/L）0.5ul，反向引物（10uM/L）0.5ul，2×Power Taq PCR MasterMix 7.5ul，无菌水补足至15 ul。

优选地，步骤（3）中，PCR扩增的程序为：预变性96℃/300s；变性96℃/30s，退火64℃/30s，延伸72℃/30s，32次循环。

优选地，步骤（4）中，将扩增产物琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

本发明的第五方面，提供了前述试剂盒在制备狗粪便污染检测产品中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的狗粪便污染检测引物对以及检测试剂盒对狗粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为3.90拷贝数/反应，阳性率高达88%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。

附图说明

图1A：六个物种的ED-1扩增产物5ul用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析所的结果。

图1B：通用引物对FUP对六个物种粪便中Faecalibacterium菌都能扩增并产生相应的条带。

图2：ED-1扩增狗粪便中Faecalibacterium菌的定量PCR标准曲线结果。

图3：50个阳性样品中有44个样品可以通过引物对ED-1进行PCR扩增并可看到明显条带，其阳性率为88%。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 试剂盒的制备

采集176份动物粪便样品（鸡，鸭，人，狗，猪，牛），经高通量测序得到196038条细菌16SrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有粪便样品中Faecalibacterium菌16SrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出一对可特异鉴定狗粪便的DNA引物ED-1（扩增长度：145bp）和一对Faecalibacterium菌16SrDNA通用引物FUP（扩增长度：237bp），引物的具体序列如下表1所示：

表1

正向引物（ ED-1-F ）	CAGGCGGACTCTTAAGTC	SEQ ID NO.1
			反向引物（ ED-1-R ）	GCGATCGGAGTTCTTCAT	SEQ ID NO.2
正向引物（FUP-F）	CTAACTACGTGCCAGCAGCC	SEQ ID NO.3
			反向引物（FUP-R）	GCCTTCGCCACTGGTGTTCC	SEQ ID NO.4

采用现有技术合成上述引物对ED-1和引物对FUP，然后直接将上述引物对ED-1装配入试剂盒，或者上述引物对ED-1和引物对FUP一起装配入试剂盒。

也就是说，本发明的试剂盒，含有引物对ED-1。优选地，还可含有引物对FUP。进一步，所述试剂盒还可以含有2×Power Taq PCR Master Mix等试剂。

实施例2 试剂盒的使用

采用实施例1的试剂盒，对鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的含Faecalibacterium菌粪便样品进行检测。

具体检测步骤如下：

（1）提取样品基因组DNA：

取鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的的新鲜Faecalibacterium粪便样品，分别编号为1、2、3、4、5、6，每个物种设置4个重复；采用现有DNA提取试剂盒（例如：MO-BIOPowerSoil® DNA Isolation kit）分别提取样品基因组DNA；

（2）PCR扩增反应：

取步骤（1）中的各样品基因组DNA，分别以引物对ED-1、引物对FUP作为引物，进行PCR扩增。

PCR扩增反应液如下表2或表3所示：

表2

正向引物（ED-1F）（10uM/L）	0.5ul
		反向引物（ED-1R）（10uM/L）	0.5ul
2×Power Taq PCR Master Mix	7.5ul
		样品基因组DNA	1ul
无菌水补足至	15 ul

表3

正向引物（FUP-F）（10uM/L）	0.5ul
		反向引物（FUP-R）（10uM/L）	0.5ul
2×Power Taq PCR Master Mix	7.5ul
		样品基因组DNA	1ul
无菌水补足至	15 ul

然后进行PCR扩增反应，PCR扩增的程序如下：

ED-1：预变性96℃/300s；变性96℃/30s，退火64℃/30s，延伸72℃/30s ，32次循环。

FUP：预变性95℃/300s；变性94℃/30s，退火60℃/30s，延伸72℃/30s ，32次循环。

（3）特异性验证：

取步骤（2）中所得六个物种的扩增产物5ul用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图1A所示，引物对ED-1能够扩增狗粪便中Faecalibacterium菌并产生相应条带，但是引物对ED-1不能够扩增鸡，鸭，人，猪和牛粪便中的Faecalibacterium菌因而不能够产生相应的条带说明，引物对ED-1能够特异性扩增狗粪便中Faecalibacterium菌，具有100%的特异性。如图1B所示，而通用引物对FUP对六个物种粪便中Faecalibacterium菌都能扩增并产生相应的条带，因此可采用通用引物对FUP作为对照，分别采用引物对ED-1和通用引物对FUP进行PCR扩增，均能产生条带的样品，才判定为狗粪便Faecalibacterium菌阳性，从而提高检测的准确率。

（4）灵敏度验证：

如图2所示的定量PCR标准曲线，经计算，引物对ED-1的最低检测限（LOQs）为3.90拷贝数/反应，充分表明，引物对ED-1具有很高的灵敏度。

（5）阳性率验证：

选取50个狗粪便Faecalibacterium菌阳性样品，按照步骤（1）和（2）中的方法提取样品基因组DNA并进行PCR扩增，扩增产物5ul用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，部分结果如图3所示，50个阳性样品中有44个样品可以通过引物对ED-1进行PCR扩增并可看到明显目的条带，其阳性率为88%，说明引物对ED-1具有较好的稳定性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

<130> PCNS

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ED-1F

<400> 1

caggcggact cttaagtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ED-1-R

<400> 2

gcgatcggag ttcttcat 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FUP-F

<400> 3

ctaactacgt gccagcagcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FUP-R

<400> 4

gccttcgcca ctggtgttcc 20

Claims

1.一种狗粪便污染检测试剂盒，包括狗粪便污染检测引物对，所述狗粪便污染检测引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2×Power Taq PCR Master Mix。

4.根据权利要求1所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照，阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列。

5.根据权利要求1所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴性对照，阴性对照为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液。

6.一种采用如权利要求1-5之任一项所述狗粪便污染检测试剂盒进行狗粪便污染检测方法，包括如下步骤：

提取样品基因组DNA；

加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管；

PCR扩增：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。

7.如权利要求1~5任一权利要求所述试剂盒在制备狗粪便污染检测产品中的用途。