CN103571972A - 检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的rt-pcr引物及试剂盒 - Google Patents

检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的rt-pcr引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒。所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′，所述试剂盒包括所述的引物。采用本发明能检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型是否呈阳性，具有敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低等优点。

Description

检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒
技术领域
本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒。 
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。本病于1996年在我国首次报道。 
依据PRRSV结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型(以Lelystad Virus株为代表)和美洲型（以ATCCVR-232株为代表）两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）、高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）。欧洲地区主要流行欧洲型，美洲及亚太地区则以美洲型为主。尽管PRRSV可以引起同一疾病，但是欧、美两型毒株之间的基因组序列及抗原性存在很大差异，血清学实验表明有一定的交叉反应。目前，我国分离获得的毒株大多数属于美洲型，近年来，有学者通过分子生物学和血清学方法鉴定了欧洲型PRRSV，表明我国猪群中已经存在欧洲型PRRSV。由于临床症状复杂，且多为混合感染，因此需要建立一种快速简便、特异性强的鉴别诊断方法，对国内猪群中的PRRSV进行流行病学监测、跟踪病原，了解欧洲型、美洲型毒株在我国不同地区的流行和分布规律，更好的预防、控制PRRSV的流行和散发。 
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用，几乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法进行特异性检测、诊断，如口蹄疫、猪瘟、蓝耳、伪狂犬病、细小病毒感染、传染性法氏囊病、禽流感等。 
发明内容
本发明的目的是提供一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒，经一次反应便能检测样本是呈猪蓝耳病病毒欧洲型阳性,或者是呈猪蓝耳病美洲型病毒阳性,或 者上述病毒均呈阳性，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。 
本发明的技术方案为： 
一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′。 
一种检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物。 
以上所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照和阳性对照。 
所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇； 
所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物E-Sd； 
所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl2和cDNA； 
所述电泳检测试剂包括：50倍稀释的TAE电泳缓冲液； 
所述阴性对照包括：DEPC水； 
所述阳性对照包括：猪蓝耳病病毒欧洲型、猪蓝耳病病毒美洲型。 
所述猪蓝耳病病毒欧洲型可为猪蓝耳病病毒欧洲型（LV株），如：广西大学传染病与分子病毒学保存猪蓝耳病病毒欧洲型（LV株）；所述猪蓝耳病病毒美洲型可为经典猪蓝耳病病毒或高致病性猪蓝耳病病毒，如：高致病性猪蓝耳病病毒（JXA1-R株），优选高致病性猪蓝耳病疫苗JXA1-R株。 
本发明的具体原理是利用猪蓝耳病病毒欧洲型和美洲型Nsp2基因的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，通过RT-PCR扩增后分别产生不同长度的目的片段，扩增猪蓝耳病病毒欧洲型特异性核酸目的片段长度为574bp，扩增猪蓝耳病病毒美洲型特异核酸目的片段为667bp，从而达到检测样本是否呈猪蓝耳病病毒欧洲型阳性，或者呈猪蓝耳病病毒美洲型阳性，或者上述病毒均呈阳性的目的。试验方法及过程如下： 
1.引物设计： 
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对猪蓝耳病病毒欧洲型及美洲型的代表株VR2332基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下： 
上游引物E-Su序列：5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′ 
下游引物E-Sd序列：5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′ 
2.反应体系的建立和优化： 
将灭活的待检样品用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。 
2.1引物用量的优化在反应体系其他条件相同的情况下，将引物对的用量分别从0.1μL至1.8μL加入体系，通过实验结果分析比较，确定最优引物用量为0.5μL。 
2.2氯化镁浓度的优化在反应体系其他条件相同的情况下通过实验结果分析比较，确定氯化镁的浓度为25mM最佳。 
2.3反转录酶（M-MLV）的优化通过实验结果对比分析，选择200U/μL反转录酶作为反应体系最佳用量。 
2.4Taq DNA聚合酶（Taq酶）的优化通过实验结果对比分析，选择5U/μL酶作为反应体系最佳用量。 
2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，反转录时选择10mM，PCR扩增时选择2.5mM作为反应体系最佳用量。 
利用上述引物和各成分的最终浓度，最后确定采用的RT-PCR反应体系为25μL，所需各组及相应浓度见表1。 
表1检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR反应体系 
Figure DEST_PATH_GDA0000433529090000031
3.RT-PCR反应条件优选如下： 
反转录体系：42℃60min，95℃5min； 
扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。 
本发明的有益效果是： 
1.本发明提供的引物检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有较高的灵敏度。 
2.本发明提供的引物对于无猪蓝耳病病毒欧洲型和/或美洲型的检测样品无扩增带，说明引物对目的基因具有良好的特异性。 
3.本发明是针对猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的典型代表毒株以及高度保守区域进行引物设计，避免了假阴性结果的产生。 
4.本发明设计的引物可以同时对样本进行两种病毒基因的鉴别检测，经一次反应便能检测样本是否呈猪蓝耳病病毒欧洲型阳性,或者呈猪蓝耳病病毒美洲型阳性,或者上述病毒均呈阳性，进行35个循环扩增只需2个小时左右，节约了大量的人工时间、实验耗材，提高实验室工作效率，降低了检测成本。 
附图说明
图1是本发明检测猪蓝耳病病毒欧洲型与猪蓝耳病病毒美洲型的RT-PCR扩增图。M.DNA Marker(DL2000)  1.猪蓝耳病病毒欧洲型（LV株）阳性对照2.猪蓝耳病病毒美洲型（JXA1-R株）阳性对照  3.阴性对照4.猪蓝耳病病毒欧洲型阳性样品  5.猪蓝耳病病毒美洲型阳性样品  6.阴性样品 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围： 
一、检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒 
一种检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒，包括以下试剂，详见表2，所用试剂均可从市场上购买。 
表2检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒 
Figure DEST_PATH_GDA0000433529090000042
二、试剂盒的使用方法 
试剂盒的使用方法，包括以下步骤： 
1.病毒RNA的提取 
①取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟； 
②加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟； 
③低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟； 
④缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管； 
⑤加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟； 
⑥低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃上清； 
⑦用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤； 
⑧将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出； 
⑨加入25μL DEPC水，-20℃保存备用。 
2.RT操作程序 
取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs2μL、M-MLV0.5μL、HIR0.5μL、下游引物E-Sd2μL，RNA15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42℃60min，95℃5min。 
3.PCR操作程序 
上游引物E-Su0.5μL、下游引物E-Sd0.5μL、Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs2μL、MgCl22μL、DEPC水12.3μL,cDNA5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。 
4.电泳 
称1g琼脂糖放于锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100mL，于微波炉中熔解。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将7μL PCR扩增产物加上2μL染色液混匀后点样于琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。 
5.结果判定 
试验结果详见图1。阳性对照出现574bp、667bp扩增带，阴性对照在574bp、667bp扩增带相应位置无带出现时，实验结果成立。 
被检样品出现574bp扩增带为猪蓝耳病病毒欧洲型阳性，被检样品出现667bp扩增带为猪蓝耳病病毒美洲型阳性，被检样品出现574bp和667bp扩增带为猪蓝耳病病毒欧洲型和美洲型阳性，否则为阴性。本方法敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低，具有良好的市场应用前景。 
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物及试剂盒
<160> 2   
                           
<210> 1                                
<211> 19                             
<212> DNA                              
<213> 人工合成的序列
<400> 1
ATGTGGGATA GGGTGGACA   19            
 
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<400> 2
AAGAACCAGA AAAGACACCC AA    22   

Claims (6)

1.一对检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′。
2.一种检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求3所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒, 其特征在于：
（1）所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；
（2）所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物E-Sd；
（3）所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl2和cDNA；
（4）所述电泳检测试剂包括：50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液；
（5）所述阴性对照包括：DEPC水；
（6）所述阳性对照包括：猪蓝耳病病毒欧洲型、猪蓝耳病病毒美洲型。
5.根据权利要求4所述检测猪蓝耳病病毒欧洲型与美洲型的试剂盒，其特征在于，所述猪蓝耳病病毒欧洲型为猪蓝耳病病毒欧洲型LV株；所述猪蓝耳病病毒美洲型为高致病性猪蓝耳病病毒JXA1-R株。
6.一种如权利要求4-5中任一所述检测口蹄疫A型病毒试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）病毒RNA的提取：  
取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；加入25μL DEPC水，-20℃保存备用；
（2）RT操作程序：  
取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs 2μL、M-MLV 0.5μL、HIR 0.5μL、下游引物E-Sd 2μL，RNA 15μL， 将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；
（3）PCR操作程序：
上游引物E-Su 0.5μL、下游引物E-Sd 0.5μL、Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs 2μL、MgCl22μL、DEPC水12.3μL, cDNA 5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94 ℃ 30s ，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环，72 ℃延伸7 min；
（4）电泳操作程序：  
称1g 琼脂糖放于锥形瓶中，加入50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液100 mL，于微波炉中熔解，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将7μL PCR 扩增产物加上2μL染色液混匀后点样于琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。
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