CN105177183A - 检测禽偏肺病毒的rt-pcr的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测禽偏肺病毒的RT-PCR的方法。该方法特征在于在反转录反应中加入外侧上游引物，其序列如SEQ？ID？NO：10所示，在PCR反应中加入内侧上游引物和内侧下游引物，其序列分别如SEQ？ID？NO：11和SEQ？ID？NO：12所示。经过试验样品和临床样品证实该方法敏感特异，省时省力，节约成本。

Description

检测禽偏肺病毒的RT-PCR的方法
技术领域
本发明涉及检测禽偏肺病毒的特异性RT-PCR的方法，特别是检测禽偏肺病毒aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C亚群的特异性RT-PCR方法。属于病毒检测领域。
背景技术
近年来流行病学调查显示国内种鸡群广泛感染禽偏肺病毒，已经报道存在禽偏肺病毒(aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C)三个亚群。目前套式RT-PCR多用于检测禽偏肺病毒，但套式RT-PCR费时费力而且会增加假阳性率。亚群的特异性的荧光定量RT-PCR价格昂贵，而且对每份样品要一式三份，浪费耗材。
本研究中针对禽偏肺病毒保守的N基因建立了RT-PCR检测方法，可以同时检测禽偏肺病毒，优选是aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C三个亚群。经过试验样品和临床样品证实该方法敏感特异，省时省力，节约成本。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测禽偏肺病毒的RT-PCR的方法，优选检测禽偏肺病毒A亚群(aMPV/A)，禽偏肺病毒B亚群(aMPV/B)和禽偏肺病毒C亚群(aMPV/C)的RT-PCR方法。
在一个方面，所述方法包括通过RT-PCR方法扩增禽偏肺病毒N基因，其中在返转录反应中使用的反转录引物如SEQIDNO：10所示，PCR反应中使用的上游引物序列如SEQIDNO：11所述，下游引物序列如SEQIDNO：12所示。
本发明的另一个目的是提供一种检测禽偏肺病毒的试剂盒，所述试剂盒包含用于反转录反应中的如SEQIDNO：10所示的反转录引物，以及用于PCR反应的上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示。
优选地，所述禽偏肺病毒为禽偏肺病毒A亚群(aMPV/A)，禽偏肺病毒B亚群(aMPV/B)和禽偏肺病毒C亚群(aMPV/C)。
本发明的又一个目的是提供如SEQIDNO：10所示的反转录引物序列，以及用于PCR反应的如SEQIDNO：11所示的上游引物和如SEQIDNO：12所示的下游引物在通过RT-PCR方法检测禽偏肺病毒亚群中的应用。
优选地，所述禽偏肺病毒为禽偏肺病毒A亚群(aMPV/A)，禽偏肺病毒B亚群(aMPV/B)和禽偏肺病毒C亚群(aMPV/C)。
附图说明
图1为RT-PCR引物设计原理图。
图2为RT-PCR敏感性。
图3为本发明RT-PCR反应体系的特异性。
图4为禽偏肺病毒A亚群N基因序列，SEQIDNO：1。
图5为禽偏肺病毒B亚群N基因序列，SEQIDNO：2。
图6为禽偏肺病毒C亚群N基因序列，SEQIDNO：3。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
本发明实施例中所用原料及试验试剂的来源：
(1)禽偏肺病毒A，B和C亚群(aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C)及其它常见禽病毒新城疫病毒(NDV)，鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，禽流感病毒H5亚型(AIVH5)，禽流感病毒H7亚型(AIVH7)，禽流感病毒H9亚型(AIVH9)等购自哈尔滨兽医研究所。
(2)aMPV/A(LAHA，GenBank登录号：AY640317.1)，aMPV/B(VCO3/60616，GenBank登录号：AB548428.1)和aMPV/C(GenBank登录号：AY590688.1)三个亚群N基因第739-971片段(按照Kabat编号)由金唯智生物科技有限公司合成，并克隆到T7启动子之下。
(3)RNA体外转录试剂盒购自(NEB，北京，中国)
(4)反转录试剂盒购自(天根，北京，中国)
(5)PremixTaqTMDNA聚合酶(TaKaRaTaqTMVersion2.0plusdye)为TaKaRa公司产品。
(6)分光光度计购自(IMPLEN，慕尼黑，德国)
实施例1.体外生成RNA
aMPV/A(LAHA，GenBank登录号：AY640317.1，SEQIDNO：1)，aMPV/B(VCO3/60616，GenBank登录号：AB548428.1，SEQIDNO：2)和aMPV/C(GenBank登录号：AY590688.1，SEQIDNO：3)三个亚群N基因(按照Kabat编号，第739-971位置)由金唯智生物科技有限公司合成，并克隆到T7启动子之下，所用引用见表1，其中ANF(SEQIDNO：4)和ANR(SEQIDNO：5)为aMPV/A的N基因引物；BNF(SEQIDNO：6)和BNR(SEQIDNO：7)为aMPV/B的N基因引物；CNF(SEQIDNO：8)和CNR(SEQIDNO：9)为aMPV/C的N基因引物，所述位置编号分别为上述N基因的GenBank登录号的位置Kabat编号)。利用RNA体外转录试剂盒，按照制造商的说明分别生成aMPV/A(LAHA，GenBank登录号：AY640317.1)，aMPV/B(VCO3/60616，GenBank登录号：AB548428.1)和aMPV/C(GenBank登录号：AY590688.1)三个亚群N基因的RNA转录本(233bp)。利用分光光度计测浓度，并利用公式计算拷贝数：
表1体外生成RNA所用引物
注：小写字母为酶切位点，下划线部分序列为各亚群N基因的对应位置的序列。
实施例2.RT-PCR设计
反转录(RT)反应体系中加入一个外侧上游引物(aMPV-Nfp，SEQIDNO：10)，而在PCR反应时加入内侧的上游引物(aMPV-NF，SEQIDNO：11)和内侧的下游引物(aMPV-NR，SEQIDNO：12)(见图1)。这三条引物在禽偏肺病毒A，B，C三个亚群中是保守的。引物序列见表2。
表2RT-PCR引物序列
实施例3.RT-PCR建立
cDNA利用反转录生成，体系如下：2μl10×RTMIX，1μlSuperPuredNTP(2.5mMeach)，1μl外侧上游引物aMPV-Nfp(10nM)，1μlQuantReverseTranscriptase，10μlRNase-FreeddH2O，5μltemplateRNA(50ng/μl).37℃反应1h。
PCR体系如下：12.5μlPremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion2.0plusdye)，1μl内侧上游引物aMPV-NF(10nM)，1μl下游引物aMPV-NR(10nM)，2.5μlcDNA和8μlddH2O.PCR反应条件如下：95℃5min，95℃30s，50℃30s，和72℃1min，进行30个循环，然后72℃7min。
实验结果
1.RT-PCR敏感性
如上所述，将aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C的N基因克隆到T7启动子下游，利用体外转录试剂盒，生成N基因对应的RNA，利用RT-PCR方法检测，结果如图2所示。
RT-PCR能检测到aMPV/A，aMPV/B和aMPV/C的N基因的拷贝数分别为102，103，102拷贝数/微升(拷贝数按照实施例1中的公式计算)。说明该RT-PCR方法敏感性好。
2.RT-PCR特异性
按照常规方法，将常见的禽类病毒：新城疫病毒(NDV)，鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，禽流感病毒H5亚型(AIVH5)，禽流感病毒H7亚型(AIVH7)，禽流感病毒H9亚型(AIVH9)以及aMPV/B亚群)提取RNA，如上所述利用RT-PCR检测，结果如图3。建立的RT-PCR与常见的禽呼吸道RNA病毒不反应，与aMPV/B反应良好。说明该RT-PCR方法特异性良好。
3.符合率实验
为了验证RT-PCR效果，本实验检测了376份临床样品包括咽喉拭子，咽喉组织，肺组织。如上所述提取RNA后，利用建立的RT-PCR方法检测，并利用已发表的RRT-PCR[GuionieO，ToquinD，SellalE，BouleyS，ZwingelsteinF，AlléeC，BougeardS，LemièreS，EterradossiN.Laboratoryevaluationofaquantitativereal-timereversetranscriptionPCRassayforthedetectionandidentificationofthefoursubgroupsofavianmetapneumovirus.JVirolMethods.2007Feb；139(2)：150-8]做平行试验，结果见表3。本实验中建立的RT-PCR与已经发表的RRT-PCR符合率高达98.9％。说明该RT-PCR方法与已建立的RRT-PCR符合率高，适合临床样品检测。
其中RRT-PCR反应体系共为20μL，含2.5μL2×QuantiTectProbeRT-PCRMasterMix，6.75μL水，0.25μLEnzyme，0.125μLProbeGB(20nM)，0.1875μLPrimerGBF(40nM)，0.1875μLPrimerGBR(40nM)。反应条件为：48℃30min，95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。
表3RT-PCR与RRT-PCR检测临床样品

Claims (6)

1.检测禽偏肺病毒的RT-PCR的方法，所述方法包括通过RT-PCR方法扩增禽偏肺病毒N基因，其中在反转录反应中使用的反转录引物如SEQIDNO：10所示，PCR反应中使用的上游引物序列如SEQIDNO：11所述，下游引物序列如SEQIDNO：12所示。
2.权利要求1的方法，其中所述禽偏肺病毒选自禽偏肺病毒A亚群aMPV/A，禽偏肺病毒B亚群aMPV/B和禽偏肺病毒C亚群aMPV/C。
3.检测禽偏肺病毒的试剂盒，所述试剂盒包含用于反转录反应中的如SEQIDNO：10所示的反转录引物，以及用于PCR反应的上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示。
4.权利要求3所述的试剂盒，其中所述禽偏肺病毒选自禽偏肺病毒A亚群aMPV/A，禽偏肺病毒B亚群aMPV/B和禽偏肺病毒C亚群aMPV/C。
5.如SEQIDNO：10所示的反转录引物序列，以及用于PCR反应的如SEQIDNO：11所示的上游引物和如SEQIDNO：12所示的下游引物在通过RT-PCR方法检测禽偏肺病毒亚群中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中所述禽偏肺病毒选自禽偏肺病毒A亚群aMPV/A，禽偏肺病毒B亚群aMPV/B和禽偏肺病毒C亚群aMPV/C。
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