CN103276111B - 一种用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测羊痘病毒的检测方法，通过设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测；本发明还提供了用上述检测方法检测羊痘病毒的试剂盒。本发明用来检测羊痘病毒的试剂盒设计了针对P32的2条特异引物及1条探针，进行羊痘病毒Taqman实时定量PCR检测，针对该基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊痘病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊痘病毒。

Description

一种用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法，具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、绵羊及牛的导致山羊痘(variolacaprin，Goatpox)、绵羊痘(variolacaprin，Sheeppox和牛的疙瘩皮肤病(Lumpy shindisease)的一种急性、热性、接触性传染病，主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，有较高的病死率，能造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易和养羊业的发展。其中羊痘在非洲，土耳其、印度、亚洲部分国家流行广泛，希腊也有零星分布。所以世界动物卫生组织(OIE)将该病列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。此外，本病在公共卫生方面也有重要意义，中国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道。世界各国都高度重视本病，有本病的国家和地区的易感动物及其有关的产品被世界各国列为严格限制进出口的对象。

CPV基因组长约150kbp，分子量约为73～91MDa，A+T含量约75%，共编码147个开放阅读框(Open reading frame，ORF)。编码密度为93%，所编码的蛋白为53～2027个氨基酸不等，包括保守的痘病毒复制区、结构基因和决定毒力与宿主范围的基因。其中P32基因包含969bp的开放阅读框，编码323个氨基酸，分子量为32KDa。P32蛋白是目前世界各地分离、鉴定的所有羊痘病毒株所共有且特异性很强的具有免疫原性的结构蛋白，基因结构保守，是建立检测方法的首选基因。而且目前市场仅有用来检测羊痘病毒的普通PCR检测试剂盒，该试剂盒操作相对复杂，结果判定需靠电泳条带来确定，费时费力，而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危害人体健康，操作时需格外小心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、准确、快速、特异性和灵敏性好以及低成本的用于检测羊痘病毒的TaqMan Real-time试剂盒和检测方法，本试剂盒及检测方法还适用于检测低微含量的羊痘病毒。

本发明提供了一种用于检测羊痘病毒的检测方法，其特征在于，通过针对羊痘病毒保守区域P32基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，所设计引物和和探针序列如下：

上游引物：5’-GGGGGATATGATTTTACCTTA-3’

下游引物：5’-ATATACCGTTTTTCATTTCGTTAG-3’

探针：5’-FAM-TGCATATGTAATTAGATTATCGTCTGCCATAA-TAMRA-3’。

所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的基因组DNA提取试剂盒进行提取。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：

1)Premix Ex Taq12.5μL；

2)上下游引物及探针，其浓度均为10μM，各取1μL；

3)样品的DNA模板3μL；

4)无RNA酶水6μL；

5）50×ROX Reference Dye0.5μL。

所述实时荧光定量PCR的反应条件如下：94℃预变性2min；94℃40s，54℃40s，72℃50s，40个循环。

本发明还提供了一种用于检测羊痘病毒的试剂盒，包括PremixEx Taq；阳性对照；阴性对照；扩增引物与探针的混合物和50×ROXReference Dye；

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下：

上游引物：5’-GGGGGATATGATTTTACCTTA-3’

下游引物：5’-ATATACCGTTTTTCATTTCGTTAG-3’

探针：5’-FAM-TGCATATGTAATTAGATTATCGTCTGCCATAA-TAMRA-3’。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有羊痘病毒P32基因的质粒。

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。

本发明用来检测羊痘病毒的试剂盒设计了针对P32的2条特异引物及1条探针，进行羊痘病毒Taqman实时定量PCR检测，针对该基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊痘病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊痘病毒。

附图说明

图1为3.1的分别以待检样品DNA、阴性对照和阳性对照为模板的实时荧光定量PCR结果。

图2为3.2的以阳性对照构建的浓度为3.93×10⁷copies/μL的pMD-P32质粒做10倍递减梯度稀释，以6个稀释度的质粒作为模板的实时荧光定量PCR结果。

图3为3.3的分别以羊痘病毒原代牛睾丸细胞毒、市售羊痘疫苗、羊痘病毒田间样品、羊口疮牛睾丸细胞毒的DNA以及阴性对照无RNA酶水为模板的实时荧光定量PCR结果。

图4为3.4的将阳性对照做10倍递减梯度稀释，选取3.93×10⁶～3.93×10⁴copies/μL共3个稀释度的质粒、送检的羊口疮临床组织病料提取的DNA以及阴性对照无RNA酶水作为模板的实时荧光定量PCR结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于羊痘病毒的检测试剂盒，由以下组分组成：

（1）Premix Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司，型号为RR390Q。

（2）阳性对照

本试剂盒发明的阳性对照为含有羊痘病毒P32基因的质粒，所述含有羊痘病毒P32基因的质粒的制备方法如下：从细胞分离的羊痘病毒中提取病毒DNA，扩增得到P32基因，克隆至pMD-18T中，经测序鉴定，将插入序列正确的质粒命名为pMD-P32。应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测出该质粒的浓度为126ng/μL，计算出其拷贝数浓度为3.93×10⁷copies/μL（copies/μL即拷贝/微升，下同），本发明的试剂盒所用阳性对照质粒浓度为3.93×10⁴copies/μL。

（3）阴性对照：无RNA酶水。

（4）扩增引物与探针的混合物。上下游扩增引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。

（5）ROX Reference Dye(50×)。

使用上述试剂盒检测羊痘病毒的方法：

1.引物设计与制备

参照GenBank查找多个毒株，进行序列比对，根据比对结果并参照文献[颜新敏，张强，吴国华等.双重PCR快速鉴别羊痘病毒和羊口疮病毒[J].中国人兽共患病学报，2008，24(10):945-948.]，针对羊痘病毒的保守区域P32基因设计了一对特异引物和一条探针，引物和探针的信息如表1所示：

表1

上述引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

所扩增的靶序列如下：

gggggatatgattttaccttatctgcatatgtaattagattatcgtctgccataaaaataataaacgaaattataaaaaataaaggtatttctaccagtttgagttttgaaatgtataagttggaaaaagaattaaaactcaatagacaagttttaaatgactcatctaagtatatacttcacaatactaagtatttgtcaaaaaaaagagctaacgaaatgaaaaacggtatat

2.待检样品DNA模板的提取

取2g采集的病料组织，按1:10(质量：体积)的比例加入20mlPBS，加入灭菌的石英砂，充分研磨，浸毒（即浸泡）10-12小时，8000转/分钟离心20分钟，吸取上清，使用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.4.0(型号为D824A)]，按照其试剂盒说明书对DNA进行提取，经提取的DNA保存于-20℃保存备用，检测时只需在反应液中加入3μL DNA即可。

3．TaqMan实时荧光定量PCR检测

3.1TaqMan实时荧光定量PCR检测羊痘病毒

PCR反应总体系为25μL，向0.2mL扩增管中加入下列反应物配成反应液：

1)Premix Ex Taq 12.5μL

2)扩增引物与探针的混合物3μL：为上述浓度为10μM的上下游引物及探针各1μL

3)待检样品DNA模板3μL

4)无RNA酶水6μL

5）ROX Reference Dye (50×)0.5μL

反应液配好后9000转/分离心10秒后，将扩增管放入PCR扩增仪中进行扩增，设定PCR扩增条件如下：94℃预变性2min；94℃40s，54℃40s，72℃50s，40个循环。

阴性对照：以无RNA酶水3μL代替上述待检样品DNA模板，同样条件下进行扩增。

阳性对照：取上述制备的浓度为3.93×10⁴copies/μL的pMD-P32质粒3μL为模板代替上述待检样品DNA模板，同样条件下进行扩增。

实验结果分析与判定：

根据扩增结果判定：在NTC（无模板对照，即本试剂盒的阴性对照）没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测，再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。

检测结果如图1所示，阴性对照即NTC没有Ct值，而阳性对照的Ct值为20.72，待检样品的Ct值为25.53，其Ct值均小于35，故判定待检样品为阳性，说明待检样品中有羊痘病毒。

3.2敏感性检测

将阳性对照构建的浓度为3.93×10⁷copies/μL的pMD-P32质粒做10倍递减梯度稀释，将3.93×10⁵～3.93×10⁰copies/μL稀释的样品各取3μL，用上述3.1的检测方法进行，结果如图2所示。

从图中可以看出，3.93×10⁵copies/μL至3.93×10¹copies/μL稀释度的重组质粒均扩增出了S形曲线，仅有3.93×10⁰copies/μL稀释度的重组质粒未扩增出任何峰线。

敏感性测定结果表明，本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测羊痘病毒的检测方法能检测出的最低拷贝数为3.93×10¹copies/μL，相比常规PCR要高出10倍。

3.3特异性检测

DNA模板的制备使用上述的基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.4.0(型号为D824A)]，按照其试剂盒说明书分别提取羊痘病毒原代牛睾丸细胞毒（图中简标为羊痘牛睾丸细胞毒）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）、市售羊痘疫苗（图中标识为羊痘疫苗）（生产厂家：中牧实业股份有限公司兰州生物药厂；生产批号：1202007）、羊痘病毒田间样品（图中简标为田间样品）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）、羊口疮牛睾丸细胞毒（图中简标为羊口疮病毒）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）的DNA，无RNA酶水做为阴性对照（图中标识为阴性对照），各取3μL量作为模板，反应条件同3.1进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，其结果如图3所示。

结果显示羊痘病毒原代牛睾丸细胞毒、市售羊痘疫苗及羊痘病毒田间样品提取的DNA模板均扩增出S形曲线，而羊口疮病毒DNA及阴性对照均未扩增出S形曲线。

3.4待检组织样品的定量分析

将重组质粒（阳性对照构建的浓度为3.93×10⁷copies/μL的pMD-P32质粒）做10倍递减梯度稀释，选取3.93×10⁶～3.93×10⁴copies/μL共3个稀释度的质粒作为标准品，以3.1的TaqMan实时荧光定量PCR检测条件建立标准曲线，对甘肃某养殖场送检的羊口疮临床组织病料进行定量分析，使用上述的基因组DNA提取试剂盒，按照其试剂盒说明书分别提取DNA，无RNA酶水做为阴性对照（图中标识为阴性对照），各取3μL量，反应条件同3.1进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，结果如图4所示。

结果显示3.93×10⁶至3.93×10⁴copies/μL共3个稀释度及待检样品均扩增出S形曲线，阴性样品未出现S形曲线，结果表明该试剂盒完全可用于临床组织样品的检测及定量分析。

Claims (1)

1.一种用于检测羊痘病毒的试剂盒，其特征在于，包括Premix ExTaq、阳性对照、阴性对照、扩增引物与探针的混合物以及50×ROXReference Dye；

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下：

上游引物：5’-GGGGGATATGATTTTACCTTA-3’

下游引物：5’-ATATACCGTTTTTCATTTCGTTAG-3’

探针：5’-FAM-TGCATATGTAATTAGATTATCGTCTGCCATAA-TAMRA-3’；

所述阴性对照为无RNA酶水；

所述阳性对照为含有羊痘病毒P32基因的质粒；

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。