CN102559934A - 一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法 - Google Patents
一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及试剂盒，本方法克服了现有方法中存在的不足，可以快速、准确、方便地诊断羊痘病毒，有利于紧急控制和预防羊痘，减少经济方面的损失，具有很高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种羊痘病毒的PCR检测方法，特别涉及一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针荧光PCR检测方法，属于检验检疫技术领域。
背景技术
羊痘是绵羊痘和山羊痘的统称，是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)的绵羊痘病毒(sheeppox virus，SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病，主要表现为发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，是所有动物痘病中最为严重的一种，有较高的死亡率，能造成巨大经济损失。羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部以及印度大部分地区呈地方性流行。我国的贵州、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病发生。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为法定通报传染病，我国将其列为一类动物疾病。有本病的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列为严格限制进出的对象，严重影响国际贸易和养羊业的发展。因此，快速、敏感和特异的诊断羊痘病毒的方法对于紧急控制和预防羊痘、减少经济损失具有重要的实际应用价值。
山羊痘病毒为双链DNA病毒，长度约150kb左右，其中碱基A、T均匀分布于整个基因组，含量约为75％，是A+T含量最高的痘病毒。目前已建立的检测羊痘病毒方法较多，如病毒培养、电镜观察、琼脂扩散、间接荧光抗体染色、血清中和试验、酶联免疫吸附试验检测技术等，但应用常规方法检测羊痘的存在费时、费力，特异性和敏感性不高等缺点。近年来，国内外也已有一些关于利用PCR方法从活体组织、组织培养物中检测羊痘病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针荧光PCR检测方法。本发明方法快速、准确、高通量、灵敏度高且特异性强。
本发明通过以下技术方案实现：
1.合成引物及TaqMan-MGB探针
选取羊痘病毒基因组末端反向重复序列(ITR)的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性的引物及探针，将该引物对扩增并BLAST，结果表明该引物及探针序列高度保守；该引物对及Taqman-MGB探针序列为：
ITRP1：5’-TTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATG-3’，
ITRP2：5’-CATTAGGGAATCATGTGCAGTGAT-3’，
ITRProb e：5’-Fam-CCAATATTCTGCTGCTCTTGC-NFQ-MGB-3’。
或者是，上述引物序列的互补序列；再或者，是上述序列同源性大于75％的序列。
探针序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。
2.构建阳性对照克隆质粒
用于构建ITR基因阳性对照质粒的引物如下：
上游引物：5’-ATTATAAAAAAGCCAATTAAACCTGT-3’
下游引物：5’-TGAAATCATACGTTGAGAGTGTAAGT-3’
以提取的山羊痘病毒ANHUI株基因组DNA为模板，使用上述引物按常规方法进行下列操作：扩增ITR基因片段，将回收目的片段与PCR2.1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆后测序。测序结果与GenBank序列比对无误后，一20℃保存备用。
3.建立荧光PCR反应体系
依次加入以下反应试剂，建立50μL反应体系。
1)Quantitative PCR SuperMix-UDG with ROX 25μL
2)50mM MgCl2 1.5μL
3)ITRP1 1.0μL
4)ITRP2 1.0μL
5)ITRProbe 1.0μL
6)模板5μL
7)ddH2O 补足至50μL
反应参数为：50℃2min，95℃5min，95℃30s，60℃30s，45个循环。
本发明的另一个目的是提供一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测试剂盒，包括：
(1)荧光PCR反应混合液I
(2)荧光PCR混合液II
(3)阳性对照克隆质粒
(4)阴性对照
(5)使用说明书
所述荧光PCR反应混合液I为各种市售的荧光反应液。所述荧光PCR混合液II通过如下方法获得：使用DNA合成装置合成寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法纯化后进行氨解处理；同样合成探针序列，氨解处理后分别在在其5′端标记荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3′端标记非荧光淬灭基团MGB，以FPLC层析法纯化荧光标记探针，然后用双蒸水溶解纯化的引物和探针，浓度为100nmol/L，混匀即成。
本发明方法的优点和特点是：
1.本发明方法相对于常规的PCR技术而言，具有更高的敏感性、特异性
和重复性，同时还具有快速、高通量、污染少等特点。本发明采用新一代Taqman-MGB探针，其淬灭基团采用了非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，与普通Taqman探针相比，降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步增强了方法的特异性；同时探针末端连接着MGB(Minorgroove binder)修饰基团，可以将探针的温度提高10℃左右，相比其他探针更适合于羊痘病毒的检测。
2.从提取样本基因组到试验结束整个检测过程在4h内完成，大大缩短了检测时间，为山羊痘的临床诊断和检疫提供了一种敏感、特异、快速、简便的诊断方法；
3.本方法的最低检出限可以达到1×102copies/μL。
4.特异性：经临床样本检测，表明本发明方法对山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus，SPPV)有特异性，能准确检测到皮肤痘疹材料中羊痘病毒的存在。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
配制PBS溶液：
混匀后，充分溶解，-20℃保存备用。
实施例
1.样本基因组DNA的提取
1)处理用PBS溶液浸洗患病羊皮肤组织，经研磨器研磨，制成1∶10的组织悬液，反复冻融三次，然后600g离心10min，取上清液备用。
2)基因组DNA的提取
采用TIANGEN公司产品血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按如下操作：
(1)取步骤1)所得上清液200μL，加入蛋白酶K溶液，混匀。
(2)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液变清亮为止。
(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。
(4)将上一步所得溶液和可能的絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入另一干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5分钟，以12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到荧光PCR反应用DNA模板。
2.荧光PCR反应
按以下要素依次加入反应试剂，建立50μL反应体系。
同时做阳性对照和阴性对照，加好反应试剂后，封盖或密封，瞬时离心，放入ABI 7000荧光PCR仪中，50℃2min，95℃5min，95℃30s，60℃30s，40个循环。
3.结果判定
当阳性对照样品的荧光扩增曲线的Ct值小于30，而阴性对照样品没有出现荧光扩增曲线时，试验成立。
在试验成立的条件下，如待检样本的荧光扩增曲线的Ct值小于30时判为阳性，大于35时判为阴性，介于30～35时，须重新试验，大于30时判为阴性。
Claims (4)
1.一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法，选取羊痘病毒基因组末端反向重复序列(ITR)的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设定合成引物和TaqMAN-MGB探针对羊痘病毒进行定性检测，其特征在于引物对和Taqman-MGB探针序列为：
I TRP 1：5’-TTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATG-3’，
I TRP2：5’-CATTAGGGAATCATGTGCAGTGAT-3’，
I TRProb e：5’-Fam-CCAATATTCTGCTGCTCTTGC-NFQ-MGB-3’；
探针序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。
2.一种如权利要求1所述的羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法，其特征在于引物对和Taqman-MGB探针是所述引物序列的互补序列。
3.一种如权利要求1所述的羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法，其特征在于引物对和Taqman-MGB探针是所述序列同源性大于75％的序列。
4.一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于包含采用权利要求1、2或3所述引物和探针制备的部件。
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