CN105925731A - 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物 - Google Patents

一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物 Download PDF

Info

Publication number
CN105925731A
CN105925731A CN201610542627.9A CN201610542627A CN105925731A CN 105925731 A CN105925731 A CN 105925731A CN 201610542627 A CN201610542627 A CN 201610542627A CN 105925731 A CN105925731 A CN 105925731A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
multiplex pcr
sheep
pcr
primers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610542627.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈素娟
彭大新
秦涛
朱相儒
易成功
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201610542627.9A priority Critical patent/CN105925731A/zh
Publication of CN105925731A publication Critical patent/CN105925731A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物，所述引物的序列如SEQ ID No.1‑4所示。利用本发明提供的2对引物对相应靶基因进行PCR扩增，建立多重PCR检测方法，不但能够在1个反应体系中快速鉴定山羊痘病毒和羊口疮病毒，而且可以同时确定是否为这两种病毒混合感染，在临床样品快速筛检和疾病快速确诊等方面有重要的应用价值。

Description

一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种多重PCR检测山羊痘病毒和羊口疮病毒的引物。
背景技术
山羊痘(Goat pox，GP)是由山羊痘病毒(Goat pox virus，GTPV)引起的急性接触性传染病，在皮肤上发生丘疹-脓疱性痘疹。可感染所有品种、性别和年龄的山羊，有报道称绵羊也可感染，常常造成孕羊流产，经济损失巨大，是OIE规定的必须申报的动物疫病之一。羊口疮是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)引起的绵羊、山羊的一种急性接触性，嗜上皮性传染病。以在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的皮肤和粘膜形成丘疹、水疱、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂为特征。虽然可自行康复，但继发感染和生长缓慢严重影响养殖业的发展。
近年来，羊痘、羊口疮在我国南北省份均有发生，在临床症状上较为相似，血清学上又存在一定的交叉反应，在临床上还可见羊痘与羊口疮混合感染的情况，因而不易鉴别诊断，容易造成误诊，因此，急需建立一种可以同时检测并鉴别GTPV和ORFV的快速诊断方法。
PCR方法因其时间短、方法简单、准确和特异性高而越来越多被应用于疾病的快速诊断。1998年，Ireland等尝试用PCR方法检测组织样品中的羊痘病毒。1999年，Mangana等依据羊痘病毒末端反向重复序列设计PCR引物检测了绵羊痘病毒。2000年，Markoulatos等根据末端反向重复序列和A-微管蛋白基因设计引物检测了绵羊痘病毒。韩若婵等根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列，建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。刘琴等针对羊痘病毒基因组中末端反向重复序列设计、合成1对特异性引物，建立诊断羊痘病毒的PCR方法，这些只是对一种病原的PCR方法。2008年颜新敏等根据羊痘病毒的P32基因和羊口疮病毒H2L基因序列设计合成两对引物，建立了一种快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法。该方法虽可同时检测两种病毒，但可能是由于目的条带基因较大，敏感性相对较低。为此，我们基于保守基因的序列分析，设计了两对分别针对羊痘病毒和羊口疮病毒的引物，建立了多重PCR。
发明内容
本研究对检测山羊痘病毒和羊口疮病毒PCR方法进行进一步探索，设计了针对这两种病毒的保守基因的特异引物，建立了多重PCR检测方法。该方法在同一个PCR反应体系中可以快速鉴定山羊痘病毒或羊口疮病毒感染或是两者混合感染。本发明提供了山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物。
选取山羊痘病毒相对保守的P32基因，羊口疮病毒相对保守的VIR基因分别设计针对这两种病毒的特异性引物。利用所合成的2对引物对相应靶基因进行PCR扩增，建立多重PCR检测方法。
本发明公开了用于山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测的引物，所述引物的序列如SEQ ID No.1-4所示。
利用本发明提供的2对引物对相应靶基因进行PCR扩增，建立多重PCR检测方法，该方法不但能够在1个反应体系中快速鉴定山羊痘病毒和羊口疮病毒，而且可以同时确定是否为这两种病毒混合感染，在临床样品快速筛检和疾病快速确诊等方面有重要的应用价值。本研究建立的多重PCR从样品的处理到报告结果仅需要5小时，与传统电镜观察、细胞培养方法相比，显著缩短了检测时间。为山羊痘和羊口疮的快速诊断提供了新的方法，为疾病的防控提供指导作用。
附图说明
图1 多重PCR特异性试验结果
M：100bp Marker；1：ORFV；2：GTPV；3：ORFV与GTPV混合感染；4：PPRV；5：FMDV。
图2 mPCR敏感性扩增结果
M：100bp DNA Marker；1：100；2：10-1；3：10-2；4：10-3；5：10-4。
图3 mPCR广谱性试验结果
M：100bp DNA Marker；1-3：ORFV病料；4：ORFV细胞毒；5：GTPV病料；6：GTPV细胞毒；7：羊痘病毒疫苗毒；8-9：GTPV and ORFV混合感染；10：阴性对照(超纯水)。
具体实施方式
本发明的具体技术方案如下：
(1)引物的设计
根据实验目的，经过同源性比较，选择山羊痘病毒和羊口疮病毒的保守基因区域，设计特异性引物。引物序列如下：
注：兼并碱基代码R＝A/G Y＝C/T
(2)病毒DNA的提取
取5mg左右的动物组织(采集的病变部位组织)，置于2mL tube中，加入适量体积的四抗PBS(含10000U/mL青霉素，10mg/mL链霉素，250μg/mL庆大霉素，250μg/mL卡那霉素)，组织匀浆机研磨，离心取上清500μL，加入92μL 10％SDS和8μL的蛋白酶K，充分混匀后58℃金属浴30min，之后用等体积酚氯仿抽提2次，吸取400μL上清到新EP管中，加入40μL醋酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和两倍体积的无水乙醇，-20℃作用10min，13000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇清洗沉淀，最后加25μL RTE溶解沉淀，分光光度计测定DNA浓度后-72℃保存备用。
(3)PCR扩增病毒基因片段
取1.5μL DNA模板进行PCR扩增，体系如下：2×Easy MIX 12.5μL，引物P32-S、P32-A、VIR-S、VIR-A各1μL(浓度为50pmol/μL)，9μL超纯水。反应程序：预变性温度为94℃5min，然后按94℃45s，58℃30s，72℃30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。(4)PCR扩增产物的鉴定
取PCR扩增产物10μL，点样于1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，以100bp Laddermarker作为标准参照。于凝胶成像系统中观察记录电泳结果。
(5)多重PCR方法的特异性试验结果
提取病料中山羊痘病毒和羊口疮病毒基因组DNA和口蹄疫、小反刍兽疫疫苗中病毒基因组DNA进行多重PCR，检测其特异性。电泳后可见多重PCR检测羊痘、羊口疮毒株出现各自的特异条带，山羊痘病毒出现500bp左右的特异条带，羊口疮出现200bp左右的特异条带，同时该方法检测PPRV、FMDV结果均为阴性。这些结果表明该方法具有良好的特异性(图1)。
(6)多重PCR敏感性试验结果
将提取的GTPV、ORFV基因组DNA进行10倍倍比稀释，取稀释好的模板DNA进行多重PCR，测定其敏感性。PCR结果显示，GTPV检测下限为0.098ng/μL，ORFV最低检测量为0.46ng/μL(图2)。
(7)多重PCR广谱性试验结果
选择4株羊口疮病毒和3株羊痘病毒，经过多重PCR，4株羊口疮病毒均出现一条200bp特异条带，3株山羊痘病毒均出现型特异500bp条带，2例GTPV、ORFV混合感染病料提取的DNA出现两条特异条带(图3)。

Claims (1)

1.一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物，其特征在于所述引物的序列如SEQ IDNo.1-4所示。
CN201610542627.9A 2016-07-11 2016-07-11 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物 Pending CN105925731A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610542627.9A CN105925731A (zh) 2016-07-11 2016-07-11 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610542627.9A CN105925731A (zh) 2016-07-11 2016-07-11 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105925731A true CN105925731A (zh) 2016-09-07

Family

ID=56827178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610542627.9A Pending CN105925731A (zh) 2016-07-11 2016-07-11 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105925731A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107794313A (zh) * 2017-11-14 2018-03-13 林裕胜 一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276111A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法
CN105331742A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 西北农林科技大学 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276111A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法
CN105331742A (zh) * 2015-11-19 2016-02-17 西北农林科技大学 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. VENKATESANA等: "Multiplex PCR for simultaneous detection and differentiation of sheeppox, goatpox and orf viruses from clinical samples of sheep and goats", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
李前瑞: "羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
郑敏等: "羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR鉴别检测方法的建立", 《中国兽医科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107794313A (zh) * 2017-11-14 2018-03-13 林裕胜 一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105132589B (zh) 一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法
CN103060478B (zh) 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法
CN106065419A (zh) 快速鉴别鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量pcr检测引物及其检测方法
CN105018485A (zh) 一种应用rpa技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针
CN108085395A (zh) 基于高通量测序的宫颈癌多基因甲基化检测的引物组、试剂盒及方法
CN107557494A (zh) 鉴别检测猪腹泻冠状病毒的引物及多重rt‑pcr方法
CN102776286B (zh) 用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒
CN105296673A (zh) 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
CN105112564A (zh) 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN108220393B (zh) 一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法
CN109762940A (zh) 用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒
CN103276111B (zh) 一种用于检测羊痘病毒的试剂盒及其检测方法
CN102559934B (zh) 一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法
CN102373302B (zh) 羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN104561384A (zh) 一种hpv检测试剂盒
CN112831609A (zh) 检测非洲猪瘟病毒mgf-505-1r基因的pcr引物、试剂盒及方法
CN105154584A (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
CN102676697B (zh) 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒
CN105925731A (zh) 一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重pcr检测引物
CN107686865A (zh) 检测i型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒
CN108950085A (zh) 一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒
CN109234451A (zh) 一种罗非鱼细小病毒TiPV CPA检测引物及应用
Sun et al. First identification of a Brucella abortus biovar 4 strain from yak in Tibet, China
CN107267666A (zh) 一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt‑pcr检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160907

RJ01 Rejection of invention patent application after publication