CN1970792A - 家蚕的ssr标记及其应用 - Google Patents
家蚕的ssr标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1970792A CN1970792A CN 200610136232 CN200610136232A CN1970792A CN 1970792 A CN1970792 A CN 1970792A CN 200610136232 CN200610136232 CN 200610136232 CN 200610136232 A CN200610136232 A CN 200610136232A CN 1970792 A CN1970792 A CN 1970792A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- silkworm
- ssr
- lepidopterous insects
- gene
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集，本发明还公开了适合于扩增所述的多核苷酸集中相应的多核苷酸的引物对。本发明的多核苷酸集可用于确定鳞翅目昆虫间的亲缘关系；确定鳞翅目昆虫基因的定位；鳞翅目昆虫各物种间的保守性分析；鳞翅目昆虫的进化分析；或鳞翅目昆虫的品种鉴定等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和遗传学领域，具体地，本发明涉及一种适用于对鳞翅目昆虫进行功能基因组研究、基因定位、亲缘关系鉴定、或品种鉴定的包含简单重复序列(SSR)的多核苷酸集及其用途。
背景技术
家蚕(Bombyx mori)是我国重要的经济昆虫。以家蚕为主体的丝绸业一直是我国的优势传统产业，目前全国共有栽桑养蚕农户2000万户，据国家统计局统计，2004年1-12月份全国工业总产值完成1385.35亿元，同比增长26.92％；产品销售收入完成1356.56亿元，同比增长26.98％；利润总额完成41.53亿元，同比增长11.74％。据海关统计，2004年1-12月真丝绸商品出口31.99亿美元，同比增长27.65％。其次，家蚕作为理想的生物反应器也日益受到重视。利用家蚕-NPV表达系统可生产珍贵的有用蛋白。第三，家蚕是理想的全变态型昆虫的模式生物；在卵、幼虫、蛹和成虫各个发育阶段都可以观察到各种性状，已经积累了大批遗传变异的品系。由于在一年之中能够多世代繁殖，雌性个体所产后代数远远大于其它生物种类，有利于遗传学研究和突变体的筛选。第四，危害农林作物的大部分害虫种类与家蚕同属于鳞翅目，家蚕基因组的研究将直接推动对鳞翅目昆虫的比较生物学和功能基因组研究，有可能将鳞翅目昆虫的综合治理提高到一个新的水平。除此之外，蚕桑业是我国古代文明的重要标志之一，数千年前的丝绸之路就是建立在蚕丝所开发的产品之上；对家蚕基因组进行研究，对弘扬我国悠久的历史文明也有重要意义。
遗传图谱是以遗传重组率为图距单位，将染色体上的各种标记按照它们在染色体上的顺序排列而成的一张连锁图谱。遗传图谱不但是进行育种，性状改善检测与选择的依据也是构建物理图谱和序列图谱，进行基因组学研究的基础。最初遗传图谱是由肉眼可辨的形态突变等标记来制作的，当DNA分子标记被发现以来，由于其稳定可靠重复性高操作简便被广泛应用于遗传图谱的制作。
SSR(Simple Sequence Repeat)又称微卫星DNA，是一种新兴的分子标记，它是由2-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，它广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上。不同个体同一座位重复单位的重复数目可能不相同，因而形成多态性，即SSR分子标记。SSR比起RFLP和RAPD等其他的分子标记，具有多态性高，分析简便，易于实现自动化高通量筛选，成本低等优点，知道了其序列后，只要合成引物，做一次PCR反应就可得到结果，是一种理想的分子标记，它被广泛地应用于人类及其他物种的遗传图谱地建立。但是，在家蚕基因组的研究领域还未被运用。目前除SSR外已有多项分子标记技术用于构建家蚕连锁图，如RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphisms)，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)及AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)等，并已取得一定进展。1998年Yasukochi用RAPD构建了一个家蚕高密度连锁图，包含1018个遗传标记，图距约2cM(约500kb)，覆盖27条常染色体和一条Z染色体。2001年，Yuan-De Tan等用AFLP构建了一个家蚕的连锁图。2004年，Xiang ZH等用407个AFLP标记构建了一张家蚕的连锁遗传图，并将Gc基因定位。然而这些遗传图还不能满足生产及研究的需要，以SSR分子标记构建一张遗传图势在必行。
1991年Rhode Island大学的M.R.Goldsmith提出了国际蚕分子育种计划(International silkworm project)，也叫基因标记育种计划。该计划主要包括两步工作：第一步是制作蚕分子基因图，第二步是数量性状(QTL，Quantitative Trait Locus)定位分析。最后利用分子标记直接在DNA水平进行重要经济性状的选择、固定，实施“分子育种”，用很短的时间育成兼具高抗、强健、丝多、质优、易繁等特性的新品种。计划提出之后即与日本和印度蚕业界通过非正式合作，开展了蚕分子遗传图及数量性状定位分析等研究。此外，日本东京大学以家蚕P50品系的丝腺为材料，构建了一个约含35589重组克隆的BAC库，平均插入片段为168kb，丰度(redundancy)为家蚕基因组大小的11.3倍，已有成品出售家蚕基因组由28对染色体构成，总碱基数约470Mb，估计有20,000个功能基因。为了保持我国在蚕桑业上以及在蚕学研究中的领先地位，我国在国际蚕分子育种计划中的研究不能落后于其他国家。因此，构建一张精细的家蚕SSR遗传图谱是其中工作的重中之重，从而为今后的数量性状定位分析(或单基因性状定位分析)，以及分子育种研究工作打下坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于对鳞翅目昆虫进行功能基因组研究、基因定位、亲缘鉴定、或品种鉴定的包含简单重复序列(SSR)的多核苷酸集。
本发明的目的还在于提供适合于扩增所述简单重复序列的引物。
本发明的目的还在于提供采用所述的多核苷酸进行功能基因组研究、基因定位、亲缘鉴定、或品种鉴定等的方法。
在本发明的第一方面，提供一种家蚕的分子连锁遗传图谱，其中，由SSR分子标记制成的高密度遗传连锁图，标记的分布均匀，对未知基因进行定位十分方便。
在本发明的另一优选例中，所述的SSR标记序列单一，每一个标记都有对应的引物序列。
在本发明的另一优选例中，家蚕的分子连锁遗传图谱及其SSR标记以及其序列都是单一的。
在本发明的第二方面，提供所述的家蚕的分子连锁遗传图谱在家蚕各个品种间的亲缘关系鉴定，在鳞翅目昆虫间的亲缘关系研究，以及在家蚕基因的定位研究中的应用。
在本发明的第三方面，提供一种用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO：3n所示的SSR位点序列，其中n为1-518的正整数(即由518个SSR位点序列所构成的多核苷酸集)。
在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸集还包括分别由SEQ ID NO：3n-2所示的正向引物和SEQ ID NO：3n-1所示的反向引物所构成的引物对，其中n为1-518的正整数，并且第n对引物对对应于序列如SEQ ID NO：3n所示的SSR位点序列。
在本发明的第四方面，提供所述的多核苷酸集的用途，所述的多核苷酸集作为SSR标志物用于：
确定鳞翅目昆虫间的亲缘关系；鳞翅目昆虫基因的定位；鳞翅目昆虫各物种间的保守性分析；鳞翅目昆虫的进化分析；或鳞翅目昆虫的品种鉴定。
在本发明的一个优选例中，所述的鳞翅目昆虫选自：家蚕、棉铃虫、或玉米螟等；更优选地，所述的鳞翅目昆虫为蚕。
在本发明的第五方面，提供一种确定两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系的方法，所述方法包括：
(1)从所述的用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集中选出第m个SSR位点序列作为标记，其中m为1-518的正整数；
(2)用对应于该SSR位点的序列如SEQ ID NO：3m-2和3m-1所示引物对，对所述两种鳞翅目昆虫的基因组DNA进行扩增，从而获得扩增产物；
(3)比较两种鳞翅目昆虫的扩增产物，从而确定两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系。
在本发明的另一优选例中，通过电泳分析扩增产物的条带数目和位置情况，扩增产物的条带数目和位置一致性越高，表示两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系越近；扩增产物的条目数目和位置差异越大，表示两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系越远。
在本发明的另一优选例中，所述的电泳是凝胶电泳。
在本发明的另一优选例中，所述的两种鳞翅目昆虫都是家蚕(即可用于种内比较)；或者
所述的两种鳞翅目昆虫中一种昆虫是家蚕，而另一种昆虫不是家蚕(即可用于种间比较)。
在本发明的第六方面，提供一种对鳞翅目昆虫的基因进行定位的方法，所述的方法包括：
(a)提供一鳞翅目昆虫群体，其中所述群体中携带所述基因的个体与不携带所述基因的个体在表型上存在差异；
(b)通过分析所述鳞翅目昆虫中与该基因相关的表型，确定所述鳞翅目昆虫群体中各个体的待定位基因的基因型；
(c)根据待定位基因所在的染色体，从所述的用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集中选出位于同一染色体上的一个或多个SSR位点序列(如第p个SSR位点序列，其中p为1-518的正整数)作为连锁标记；
(d)用对应于该SSR位点序列的引物对，对该鳞翅目昆虫群体中各个体的基因组DNA进行扩增，从而获得扩增产物，并根据扩增产物的特征(更优选的，为扩增产物的电泳条带特征)确定各个体中该SSR位点序列的基因型；
(e)根据该群体中各个体的待定位基因的基因型情况以及该群体中各个体的所述SSR位点序列的基因型情况，确定待定位基因与该SSR位点序列的连锁程度(更优选的，其中遗传距离小就表示两者的连锁程度高，遗传距离大就表示两者的连锁程度低)；
(f)根据步骤(e)中所获得的连锁程度，将所述基因定位于与该基因连锁程度最高的两个SSR位点序列之间。
在本发明的另一优选例中，在同一染色体上选用6-20个SSR序列位点。
在本发明的另一优选例中，对于第p个SSR位点序列，选用对应于该SSR位点序列的序列如SEQ ID NO：3p-2和3p-1所示引物对。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为以同位素标记的探针对基因组文库的原位杂交图。
图2为ABI 377测序仪胶图。
图3为本发明测序方法示意图。
图4-31为连锁遗传图第1-28号染色体图，其中“Chr.”表示染色体(Chromosome)。
图32为mln定位示意图。
图33显示了用S0710和S2306所对应的两对SSR引物对8个家蚕品系的PCR扩增，扩增产物的电泳图谱。其中，M＝marker，Bao＝宝中长，Hua＝华八，Qiu＝秋风，Jing＝菁松，A：用S0710对应的SSR引物扩增的带，B：用S2306对应的SSR引物扩增的带。
图34显示了518个SSR标记及其相应的引物的序列。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，开发出了一种适用于对鳞翅目昆虫进行功能基因组研究、基因定位、亲缘鉴定、或品种鉴定的多核苷酸集，所述的多核苷酸集中包含有多个简单重复序列(SSR)。
更具体的，本发明人以家蚕为研究对象，开发出所述的SSR位点，这些SSR位点可构成一张家蚕基因组的高密度连锁图，所述的SSR的部分或全部可作为分子标记被应用于家蚕的功能基因组研究以及蚕桑业的品种筛选中，提供一个技术平台对一些重要的经济性状基因进行定位克隆，最终实现分子标记辅助选择育种。所述的SSR位点作为标志物或标记还可应用于家蚕以外的其它蚕品种中。
并且，由于鳞翅目昆虫之间具有较近的亲缘关系，所述的SSR位点还可应用于蚕以外的其它鳞翅目昆虫的基因组研究中。
简单重复序列
如本文所用，所述的“简单重复序列(SSR)”又称为“串联重复序列(Short TandemRepeats，STR)，或“微卫星DNA(Microsatellite DNA)”，是指一种短序列，例如一种单、二、三、四、或五-核苷酸，其在某一特定的核苷酸序列中至少重复一次。
尽管所述的多核苷酸集中的各SSR分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用测序或电泳分析等技术就可获得其长度多态性。
由于这些SSR位点序列在鳞翅目不同种中具有高度保守性，因此它们可被广泛地应用。本发明中所提到的SSR位点可以在不同谱系、群体，甚至在属内相近的种之间通用。
由于这些SSR位点均匀地分部在鳞翅目昆虫的各条染色体上，因此利用本发明的微卫星标记可构建高密度遗传连锁图。
引物
本发明还提供了可用于扩增所述的SSR标记引物。所述的引物根据这些SSR位点两端的保守序列进行设计。引物的设计方法为本领域技术人员所熟知的方法。更特别的，本发明在设计引物时，采用相近的Tm温度，以便使这些引物能够在高通量的扩增和检测中使用。
采用所述的引物，可扩增出鳞翅目昆虫基因组中相应的SSR位点。并且，采用相同的引物对，以不同的鳞翅目昆虫的基因组DNA为模板，可获得包含多态性SSR结构(如SSR重复次数不同、或长度不同等)的多核苷酸。
应用
本发明的简单重复序列及其相应的引物具有多种用途。包括但不限于用于：
比较鳞翅目各动物之间的亲缘关系：包括种内比较如不同品系的家蚕之间，或种间的比较如家蚕与棉铃虫之间。
鳞翅目昆虫基因的定位：通过观察待鉴定的基因与其所在染色体上的一些SSR序列位点之间的连锁关系，可将所述基因定位于与该基因连锁程度最高的两个SSR位点序列之间。
鳞翅目昆虫各物种间的保守性分析：通过对这些家蚕SSR位点在其他鳞翅目昆虫中进行扩增，寻找能够在其他鳞翅目昆虫中得以扩增的位点。如果位点能够被成功扩增，说明这个位点在家蚕与家蚕以外的被扩增对象中共同存在，家蚕的这个位点就能被其他昆虫所利用。
鳞翅目昆虫的进化分析：微卫星标记可以作为物种间关系研究的手段，进行物种间的进化分析。根据遗传距离确定物种间的进化关系。
昆虫例如家蚕的品种鉴定：家蚕的品种多达3000多个，仅保留在中国的品种就达到1000多个。传统的方法是利用外部形态标记对这些品种进行鉴定，由于品种多，能够利用的形态标记数量较少，在品种鉴定方面一直是个难点。利用本发明入开发的SSR标记，对家蚕品种进行PCR扩增，寻找每一个品种所对应的品种特异性SSR标记，就能够实现家蚕品种在形态特征结合分子标记的前提下进行品种鉴定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 微卫星标记位点的获得
将家蚕P50品系五龄第三天幼虫的后部丝腺用液氮研磨成粉末，与等体积4×Homogenization Buffer(均质缓冲液，配方：Tris.HCl(pH＝9.5)40mM，EDTA(pH＝8.0)40mM，KCl 40mM，亚精胺16mM)混合，然后埋入两倍体积的低熔点琼脂糖凝胶中。再将此包埋了丝腺组织的胶块，先经消化缓冲液(0.5M EDTA，10％十二烷基肌氨酸钠)平衡，再用蛋白酶K消化。之后用TE洗脱3～4次，去除蛋白酶K的活力。然后先用限制性内切酶消化缓冲液将胶块平衡，再加入限制性内切酶Sau3A1部分酶切(另一部分的DNA采用Tsp 509I部分酶切)。将此胶块埋入0.5％低熔点琼脂糖凝胶中，经脉冲场凝胶电泳，从而分离得到大片段家蚕DNA。割胶回收挑选7kb以上长度的DNA片段，装入pUC18载体(购自华美生物工程公司)，电转入大肠杆菌DH10B(购自国家人类基因组南方研究中心)，构建随机基因组文库。挑选非空载的单克隆菌落于384孔板中培养，然后将384孔板中的克隆(采用机械手，Beckman 3000型)，原位印迹于尼龙膜上培养。用Sambrook的经典杂交法以(CA)12和(CT)12为探针杂交(图1)。杂交得到的阳性克隆用ABI3700自动DNA测序仪测序，通用引物(GT)7或(GA)7，第一次的测序结果用于设计正向引物。用设计的正向引物对同一个克隆进行第二次测序，第二次的测序结构被用于在DNA重复序列的另一边设计反向引物(图3)。引物设计用软件Primer Premier 5.0(Premier Biosoft International，Palo Alto，Calif.)。为了高通量的操作，所有设计的引物都采用同一个标准：55-60℃熔解温度，40-60％的GC含量，18-25bp的引物和100-330-bpPCR产物长度。
以6个家蚕品系：P50，C108，菁松，兰10，法50B，54A为模板，PCR扩增这些SSR标记，通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，然后根据肉眼读带，并在“天能凝胶处理系统”的软件(购自天能公司)帮助下，判断条带的大小区别，以鉴定这些标记的多态性、扩增重复性，最后选取约780个在家蚕品系P50和C108间有多态的SSR引物进行荧光标记(采用的荧光标记为FAM，TET，HEX，或TEMRA)。用此780个SSR标记所对应的引物对含189个个体的回交群体(BCF1群体，P50×C108)×C108)进行PCR扩增和基因型分析(Genotyping)，PCR结果用高通量的ABI377测序仪进行检测，然后进行电泳分析，结果见图2，将出现一条带的个体记做1，为纯合型，将两条带的个体记做2，为杂合型。将这些数据结果用遗传作图软件(Mapmaker 3.0，Lander等，1987，LanderES，Green P，Abrahamson Je等1987.MAPMAKER，an interactive computer package forconstructing primary genetic linkage map of experimental and naturalpopulations.Genomics，1：174-180))进行分析，而将这些SSR标记分为32个连锁群，并精确计算了各个标记的位置及距离，平均图距大致3.5cM(大致550个标记)。进行上述分析的原理是：两个标记的遗传距离与其两者间的交换率成正比，通常将1％的交换率定义为1cM的遗传图距。
然后，再利用家蚕的雌不交换原理，以雌性的F1个体回交亲本，其产生的后代为分析群体来检测各个标记间是否连锁，而将这些标记确定为28个连锁群，与家蚕的28个染色体数一致。最后利用已经定位到各个染色体上形态标记及CAPS(CleavedAmplification Polymorphism Sequence)标记将此28个连锁群与实际的家蚕染色体一一对应，如图4～31所示，最终绘制成家蚕的SSR连锁遗传图，其最终包含SSR标记518个(具体序列详见SEQ ID NO：3n(图34)，其中n＝1-518的正整数)，覆盖3432cM，平均图距6.27cM，每个连锁群含有标记7-40个不等(见图4-31)。所有的SSR标记及其相应的引物见图34所示，而518个SSR标记的正向引物(图34中简称“正向”)序列为SEQID NO：3n-2，反向引物(图34中简称“反向”)序列为SEQ ID NO：3n-1。
实施例2 使用遗传图上的SSR标记鉴定家蚕品种
由于这些SSR标记是根据家蚕的P50品系的基因组文库测序得到的。而家蚕各个品种间的亲缘关系也都很近，所以这些SSR标记也都能应用于其它的家蚕品种中。
微卫星标记的一大特点就是多态性很高，因此，本图谱上的微卫星标记也可应用于各个家蚕品种中。将多个SSR标记在家蚕的各个品种群体间进行PCR反应，用ABI 377测序仪，甚至琼脂糖凝胶电泳都可检测分析这些标记在各个家蚕品种间的片段长度或差别。也可通过这种方法得到家蚕各品种间的指纹图谱，并同时可根据这些指纹图谱鉴定出家蚕的品种。
在本实施例中，随机选取了十几个SSR标记，用这些标记所对应的SSR引物，以8个家蚕的品种8213、799、宝中长(Baozhongchang，简称Bao)、华八(Huaba，简称Hua)、831、秋风(Qiufeng，简称Qiu)、871和菁松(Jingsong，简称Jing)的基因组DNA序列作为模板，进行PCR扩增。
用这些引物在不同的家蚕品种中进行PCR扩增得到了不同的PCR扩增条带组合。根据肉眼读带，并在“天能凝胶处理系统”的软件帮助下，判断条带的大小区别，以鉴定这些标记的多态性以及条带大小组合的区别。结果选出了有代表性的S0710和S2306作为特定SSR标记，它们所对应的两对SSR引物对上述家蚕品种的扩增产物的电泳结果如图33所示。
由上述结果可知，可通过这两个引物进行这8个家蚕品种的品种鉴定。并且，只需要用部分DNA样品，就可以进行。即使是在家蚕的卵或幼虫时期等难以进行鉴定的时期也可进行品种的鉴定，既可节省时间，也可避免错误，结果可靠，因此这在蚕的品种保藏与鉴定方面有着重要的意义。
实施例3 使用遗传图上的SSR标记分析鳞翅目其它代表性昆虫的微卫星位点
家蚕是鳞翅目的代表，而微卫星不但具有多态性高的优点，其两侧的序列也具备保守性高的特点。
由于开发一套SSR标记花费巨大，所以对于每一个物种都进行这样的科学研究是不实际的。如果，在一个物种中开发出的微卫星位点也可应用到与其亲缘关系比较近的物种中，则会节省了大量的时间及费用。因此，本发明人进一步进行了家蚕SSR标记在鳞翅目昆虫中应用的研究。
本发明人从遗传图上的家蚕的各个染色体上都挑选3-10个标记，随机挑选共165个，应用到家蚕以及另外的8个以桑叶为食的鳞翅目的昆虫中：天蚕(大蚕蛾科)；柞蚕(大蚕蛾科)；蓖麻蚕(大蚕蛾科)；桑螟(螟蛾科)；桑尺蠖(尺蛾科)；灯蛾(灯蛾科)；白毛虫(夜蛾科)；棉铃虫(夜蛾科)。
利用这165个SSR标记的相应的引物，以这些昆虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并测定扩增片段的大小后发现：在家蚕中开发的SSR标记在桑叶食性的鳞翅目昆虫中具有一定的保守性，并得到如表1和表2的数据。
表1
| 染色体 | SSR标记 | P50 | 天蚕 | 柞蚕 | 蓖麻蚕 | 桑螟 | 桑尺蠖 | 灯蛾 | 白毛虫 | 棉钤虫 | 玉米螟 |
| 1 | S0101 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | o | o |
| 1 | S0102 | 1 | o | o | o | o | 1 | o | o | 1 | o |
| 1 | S0104 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | o | o | o |
| 1 | S0105 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | o | 1 | o | o |
| 2 | S0201 | 1 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | S0202 | 1 | o | o | 1 | o | o | o | o | o | o |
| 2 | S0206 | 1 | o | o | o | o | 1 | 1 | o | 1 | o |
| 2 | S0210 | 1 | o | o | 1 | o | 1 | o | o | 1 | o |
| 2 | S0214 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 |
| 3 | S0302 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 3 | S0306 | 1 | 1 | o | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 3 | S0314 | 1 | 1 | o | o | o | o | o | o | 1 | 1 |
| 4 | S0401 | 1 | 1 | o | 1 | o | 1 | o | 1 | o | o |
| 4 | S0411 | 1 | o | o | o | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 4 | S0416 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 4 | S0418 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 4 | S0420 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 5 | S0502 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | o | o |
| 5 | S0503 | 1 | o | o | 1 | o | 1 | o | 1 | 1 | 1 |
| 5 | S0504 | 1 | o | o | 1 | 1 | o | 1 | o | 1 | o |
| 5 | S0509 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | S0513 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 24 | S2426 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o | o |
| 24 | S2432 | 1 | 1 | o | 1 | o | o | 1 | o | 1 | o |
| 25 | S2502 | 1 | o | 1 | o | o | o | o | 1 | 1 | o |
| 25 | S2504 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | o | 1 | 1 | o |
| 25 | S2505 | 1 | 1 | o | o | 1 | 1 | o | 1 | 1 | o |
| 25 | S2506 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 25 | S2507 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 25 | S2508 | 1 | o | o | o | o | o | o | 1 | o | o |
| 25 | S2513 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 25 | S2514 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 25 | S2517 | 1 | o | o | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 25 | S2521 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | o | o | o |
| 26 | S2603 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 26 | S2608 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 26 | S2619 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | o | o | 1 | o |
| 26 | S2623 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | o | 1 | 1 | o |
| 26 | S2624 | 1 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 27 | S2702 | 1 | o | o | o | 1 | 1 | 1 | o | o | o |
| 27 | S2703 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 27 | S2704 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 27 | S2705 | 1 | 1 | o | o | o | o | o | o | 1 | 1 |
| 27 | S2708 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | o | 1 | o |
| 27 | S2709 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 27 | S2713 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o |
| 28 | S2801 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | o | o |
| 28 | S2803 | 1 | o | o | o | o | o | o | o | 1 | o |
| 28 | S2808 | 1 | o | o | o | o | 1 | o | o | o | o |
| 28 | S2810 | 1 | 1 | o | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 28 | S2811 | 1 | o | o | 1 | 1 | 1 | o | o | o | o |
表2
| 品种 | 扩增效率 |
| 家蚕(P50)(silkworm P50) | 100％ |
| 天蚕(Antheraea yamamai) | 29.1％ |
| 柞蚕(Chinese tussah silkworm) | 27.7％ |
| 蓖麻蚕(eri-silkworm) | 55.3％ |
| 桑螟(Diaphania Pyloalis) | 56.7％ |
| 桑尺蠖(Sangchihuo) | 69.5％ |
| 灯蛾(Walker) | 48.9％ |
| 白毛虫(Acronicta major) | 65.2％ |
| 棉铃虫(Heliothis armigera) | 74.5％ |
其中，“o”表示未发生扩增，“1”表示发生扩增；扩增效率＝(能够扩增清晰条带的引物数/不能够扩增清晰条带的引物数)×100％。
如表1和表2所示，可以得到，家蚕中开发的SSR标记在其它的昆虫中都有一定比例的保守性，比如S0104可在家蚕、蓖麻蚕、桑螟、桑尺蠖和灯蛾中有效扩增，S0416可在家蚕、天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、桑螟、桑尺蠖、灯蛾、白毛虫和棉钤虫中有效扩增。这些可以扩增的SSR标记便可以直接用于相关昆虫的品种鉴定和亲缘关系分析等，从而避免了重复开发所造成的浪费。因此，这些标记可以用来进行相关常见的鳞翅目害虫的鉴定，遗传图谱构建等工作，也为治理这些害虫提供了有用的信息。
此外，从以上数据中可以看到，虽然棉铃虫是一个外食性的昆虫，并不取食桑叶，但来自家蚕的SSR标记中棉铃虫中的扩增效率是最高的，达74.5％。由此可见，食性性状并非SSR标记在不同物种中保守性的主要影响条件。另外也可初步确定SSR标记在大蚕蛾科与蚕蛾科间的保守性较差。
实施例4 以SSR标记遗传图进行家蚕的mln基因定位
首先可根据之前的研究结果(Doira，1992；Goldsmith，1995 Doira，H.(1992)Genetical Stocks and Mutations of Bombyx mori.In：Important Genetic Resources(ed.：H.Doira)，pp.1-73.Silkworm Genetic Division，Institute of GeneticResources，Faculty of Agriculture，Kyushu University，Fukuoka，Japan.Goldsmith，M.R.(1995)Genetics of the silkworm：revisiting an ancient model system，pp.21-76 inMolecular Model Systems in the Lepidoptera.Cambridge University Press，New York)，mln基因位于家蚕的第18号染色体上，mln在上面的位置是41.5，性状为成虫的体色为暗黑色。
因此，可选取本SSR连锁遗传图上第18号染色体上的标记(如18号染色体上的所有标记，S1801-S1820)去对mln基因进行更加精确的定位。第18号染色体上有20个SSR标记(见图21)，通过对这些标记在mln的作图群体(即：mln与正常个体的杂交型，再与mln个体交配得到的后代群体，共171个个体)中的多态性验证后发现，其中的10个标记：S1801，S1802，S1806，S1807，S1808，S1809，S1811，S1812，S1818，S1819，在作图群体中具有多态性(即是在mln及正常个体的扩增条带有区别)。
使用上述10个标记所对应的引物对，以mln的作图群体中各个体(171个)的DNA为模板，进行PCR扩增，电泳，并采用肉眼分析每个个体的基因型(Genotype)。
PCR结果用高通量的ABI 377测序仪进行检测，将出现一条带的个体记做1，为纯合型，将两条带的个体记做2，为杂合型。而此群体中的mln基因的基因型也将纯合型记为1，杂合型记为2。就可得到在此作图群体中的第一染色体上的SSR标记和mln基因的基因型数据，将这些数据用遗传作图软件(Mapmaker 3.0)分析(根据mln与这些SSR的连锁程度来确定mln与这个标记间的遗传距离)，便可绘制出一张带有这些标记以及mln基因的连锁图，以将mln基因用SSR标记定位。
结果如图32所示，图中绘出了10个有多态的标记中的8个，也标出了mln基因在这些SSR标记中的位置。并且可见，其中的两个SSR标记(S1807，S1808)与mln基因的距离非常近，所以这两个基因为mln基因的育种提供了很大的便利。同时，这为今后对mln基因的克隆打下了良好的基础。
上述结果表明，本发明的遗传图对于基因的定位克隆有着非常重要的意义，提供了一个很好的工作平台。
以上的实施例进一步证明本发明的SSR分子遗传图是一张高密度，高质量，应用广泛的遗传图。其所包含的SSR分子标记是一笔巨大的财富。不但可以用于单一质量性状，而且可以用于数量性状的定位，为下一步的图位克隆打下基础。而且也可以就用于家蚕的分子辅助育种。另外还可以应用于多个方面，比如群体遗传学研究，各物种间的保守性研究，DNA和物种间的进化研究，法医学研究，品种鉴定等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1、一种家蚕的分子连锁遗传图谱，其特征在于由SSR分子标记制成的高密度遗传连锁图，标记的分布均匀，对未知基因进行定位十分方便。
2、如权利要求1所述的分子连锁遗传图谱，其特征在于SSR标记序列单一，每一个标记都有对应的引物序列。
3、如权利要求1所述的分子连锁遗传图谱，其特征在于家蚕的分子连锁遗传图谱及其SSR标记以及其序列都是单一的。
4、如权利要求1所述的家蚕的分子连锁遗传图谱在家蚕各个品种间的亲缘关系鉴定，在鳞翅目昆虫间的亲缘关系研究，以及在家蚕基因的定位研究中的应用。
5、一种用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO：3n所示的SSR位点序列，其中n为1-518的正整数。
6、如权利要求5的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集还包括分别由SEQ ID NO：3n-2所示的正向引物和SEQ ID NO：3n-1所示的反向引物所构成的引物对，其中n为1-518的正整数，并且第n对引物对对应于序列如SEQ ID NO：3n所示的SSR位点序列。
7、如权利要求5所述的多核苷酸集的用途，其特征在于，所述的多核苷酸集作为SSR标志物用于：
确定鳞翅目昆虫间的亲缘关系；鳞翅目昆虫基因的定位；鳞翅目昆虫各物种间的保守性分析；鳞翅目昆虫的进化分析；或鳞翅目昆虫的品种鉴定。
8、一种确定两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)从权利要求5所述的用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集中选出第m个SSR位点序列作为标记，其中m为1-518的正整数；
(2)用对应于该SSR位点的序列如SEQ ID NO：3m-2和3m-1所示引物对，对所述两种鳞翅目昆虫的基因组DNA进行扩增，从而获得扩增产物；
(3)比较两种鳞翅目昆虫的扩增产物，从而确定两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系。
9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过电泳分析扩增产物的条带数目和位置情况，扩增产物的条带数目和位置一致性越高，表示两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系越近；扩增产物的条目数目和位置差异越大，表示两种鳞翅目昆虫之间的亲缘关系越远。
10、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的两种鳞翅目昆虫都是家蚕；或者
所述的两种鳞翅目昆虫中一种昆虫是家蚕，而另一种昆虫不是家蚕。
11.一种对鳞翅目昆虫的基因进行定位的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(a)提供一鳞翅目昆虫群体，其中所述群体中携带所述基因的个体与不携带所述基因的个体在表型上存在差异；
(b)通过分析所述鳞翅目昆虫中与该基因相关的表型，确定所述鳞翅目昆虫群体中各个体的待定位基因的基因型；
(c)根据待定位基因所在的染色体，从权利要求5所述的用于分子连锁遗传分析的多核苷酸集中选出位于同一染色体上的一个或多个SSR位点序列作为连锁标记；
(d)用对应于该SSR位点序列的引物对，对该鳞翅目昆虫群体中各个体的基因组DNA进行扩增，从而获得扩增产物，并根据扩增产物的特征确定各个体中该SSR位点序列的基因型；
(e)根据该群体中各个体的待定位基因的基因型情况以及该群体中各个体的所述SSR位点序列的基因型情况，确定待定位基因与该SSR位点序列的连锁程度；
(f)根据步骤(e)中所获得的连锁程度，将所述基因定位于与该基因连锁程度最高的两个SSR位点序列之间。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610136232 CN1970792A (zh) | 2005-10-14 | 2006-10-13 | 家蚕的ssr标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200510030575.9 | 2005-10-14 | ||
| CN200510030575 | 2005-10-14 | ||
| CN 200610136232 CN1970792A (zh) | 2005-10-14 | 2006-10-13 | 家蚕的ssr标记及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1970792A true CN1970792A (zh) | 2007-05-30 |
Family
ID=38111817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200610136232 Pending CN1970792A (zh) | 2005-10-14 | 2006-10-13 | 家蚕的ssr标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1970792A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286626A (zh) * | 2011-08-30 | 2011-12-21 | 湘潭市祂施尔生物科技有限公司 | 一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒 |
| CN103081872A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-05-08 | 江苏科技大学 | 一种双限性多丝量家蚕品种的选育方法 |
| CN114457172A (zh) * | 2022-03-21 | 2022-05-10 | 江苏科技大学 | 蓖麻蚕est-ssr分子标记及其应用 |
| CN114525345A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-05-24 | 江苏科技大学 | 蓖麻蚕ssr分子标记及其应用 |
-
2006
- 2006-10-13 CN CN 200610136232 patent/CN1970792A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286626A (zh) * | 2011-08-30 | 2011-12-21 | 湘潭市祂施尔生物科技有限公司 | 一种天蚕的分子鉴定方法及其遗传标记物、引物和试剂盒 |
| CN103081872A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-05-08 | 江苏科技大学 | 一种双限性多丝量家蚕品种的选育方法 |
| CN114525345A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-05-24 | 江苏科技大学 | 蓖麻蚕ssr分子标记及其应用 |
| CN114525345B (zh) * | 2022-02-14 | 2023-04-21 | 江苏科技大学 | 蓖麻蚕ssr分子标记及其应用 |
| CN114457172A (zh) * | 2022-03-21 | 2022-05-10 | 江苏科技大学 | 蓖麻蚕est-ssr分子标记及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Plomion et al. | Genomic analysis in maritime pine (Pinus pinaster). Comparison of two RAPD maps using selfed and open-pollinated seeds of the same individual | |
| Lu et al. | Molecular diversity and genome structure in modern sugarcane varieties | |
| Hanley et al. | A genetic linkage map of willow (Salix viminalis) based on AFLP and microsatellite markers | |
| Et-Touil et al. | Localization of a pathogenicity gene in Ophiostoma novo-ulmi and evidence that it may be introgressed from O. ulmi | |
| Kishii et al. | Production of wheat–Leymus racemosus chromosome addition lines | |
| World Health Organization. Regional Office for South-East Asia | Anopheline species complexes in South and South-east Asia | |
| CN105764330A (zh) | 与对非生物胁迫的响应相关联的基因座 | |
| CN109295179B (zh) | 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒 | |
| Gil et al. | Fine-mapping of angular leaf spot resistance gene Phg-2 in common bean and development of molecular breeding tools | |
| CN1970792A (zh) | 家蚕的ssr标记及其应用 | |
| CN101213312A (zh) | 用于筛选基因特异杂交多态性（gshp）的方法及其在遗传作图和标记开发中的用途 | |
| CN111334597B (zh) | 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用 | |
| Framarzpour et al. | Evaluation of genetic diversity of Rapeseed (Brassica napus L.) cultivars using SRAP markers | |
| CN105229174A (zh) | 与肾状线虫抗性连锁的标志物 | |
| Kanazawa et al. | Inter-and intra-specific distribution of Stowaway transposable elements in AA-genome species of wild rice | |
| CN114752683A (zh) | 一种与多鳞鱚性别性状相关的qtl位点的构建方法 | |
| CN110468226B (zh) | 杨树抗叶锈病的分子标记及其应用 | |
| CN109762924B (zh) | 黄麻中耐盐性状的分子标记及其应用 | |
| Scotti et al. | Analysis of the distribution of marker classes in a genetic linkage map: a case study in Norway spruce (Picea abies Karst) | |
| Smith et al. | Genetic analyses of carp, goldfish, and carp-goldfish hybrids in New Zealand | |
| CN105316423B (zh) | 水稻品种光复粳抗黑条矮缩病位点qRBSDV18及其分子标记方法 | |
| CN113999845B (zh) | 与紫花苜蓿矿质营养元素相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN109266777A (zh) | 玉米隐性核雄性不育突变基因ms34新等位基因的发现及其功能标记的开发与应用 | |
| Denda et al. | Hybrid origins of Ixeris nakazonei (Asteraceae, Lactuceae) in the Ryukyu Archipelago, Japan: evidence from molecular data | |
| CN114574608B (zh) | 一种与黄瓜抗靶斑病相关的snp标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |