CN105764330A - 与对非生物胁迫的响应相关联的基因座 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用于鉴定和反选择玉米植物的组合物和方法，所述玉米植物在非生物胁迫条件诸如盐胁迫和/或干旱下相对于对照植物具有增强的收率相关的性状。所述方法使用分子遗传标记来鉴定、选择和/或构建盐胁迫耐受性和/或耐旱性玉米植物。还提供了通过利用玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白转化作物植物或者通过经由基因编辑引入玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的有利等位变体来增强作物植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性的方法。

Description

与对非生物胁迫的响应相关联的基因座

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2013年11月27日提交的美国临时申请61/909,565和2014年3月10日的提交的美国临时申请61/950,345的权益，上述申请的全部内容以引用方式并入本文。

以电子方式递交的序列表的引用

通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表递交，该文件名称为“20141118_BB2241PCT_SequenceListing_ST25”，创建日期为2014年11月18日，文件大小为144千字节，并且该文件与本说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的部分并且全文以引用方式并入本文。

技术领域

本领域涉及植物育种以及在非生物胁迫条件诸如盐胁迫或干旱下产生表达增强的收率相关性状的玉米植物的方法。

背景技术

非生物紧张性刺激诸如干旱、盐度、寒冷、洪水和化学污染显著限制了全球的作物产量。据评估这些因素累积地造成平均70％的农业产量减少。土壤盐度为影响全球作物收率和限制其它耕地使用的非生物胁迫(Zia等人，2011.JournalofMedicinalPlantsResearch.5(25)：6040-6047)。然而，目前还没有经济上可持续且有效的方法来克服与土壤盐度相关联的问题，因为土壤盐度涉及作物产量。

一些研究已表明，由盐胁迫引起的细胞毒性作用可通过外源施用化学化合物诸如甘油(Kaya等人，2013.ActaBotanicaCroatica72(1)：157-168)；水杨酸(Tufail等人2013.PakistanJournalofBotany45(1)：75-82)；和激动素[KIN]和吲哚乙酸[IAA](Kaya等人，2010.TurkishJournalofAgricultureandForestry34(6)：529-538；Kaya等人，2010.JournalofPlantNutrition.33(3)：405-422)进行改善。另一些研究已表明，当磷供应充足时，通过其它机制利用真菌接种增强耐盐度(Gu等人，2000.JournalofPlantResourcesandEnvironment.9(2)：22-26)。

另一种方法是通过结合耐盐性基因诸如TaHAK1基因(YuXiang等人，2011.JournalofTriticeaeCrops31(6)：1014-1019)、AtSAT32基因(MinYoung等人，2009.PhysiologiaPlantarum135(4)：426-435.)和MBF1a基因(MinJung等人，2007.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.354(2)：440-446.)产生耐盐性转基因植物。

还有一些研究提出用NaCl引发种子可为增大玉米对盐度耐受性的可靠过程(Frahbakhsh和Saiid.2011.AfricanJournalofAgriculturalResearch.6(28)：6095-6099.)。

培育的新耐盐玉米变体示出改善玉米总产量和有效使用盐化土壤的有效途径(Dong等人，2010.ChlneseAgriculturalScienceBulletin.26(10)：246-249；Nitsch，JP.1950.AmJBotany.37：211-215)。然而，耐盐性是在植物中难以培育的复杂性状。

发明内容

本文提供用于鉴定和反选择更加易于受到高盐土壤(盐胁迫)和/或干旱胁迫的影响的玉米植物的组合物和方法。所述方法还用于鉴定和选择具有提高的对盐胁迫和/或干旱胁迫的耐受性的玉米植物。还提供了可用于产生具有提高的对盐胁迫和/或干旱胁迫的耐受性的植物的方法。

在一个实施方案中，本文示出了鉴定具有降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物的方法。在这些方法中，在玉米植物中检测QTL等位基因，其中所述QTL等位基因与降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联，并且在玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因中在SEQIDNO：15的3311-3314位核苷酸处包括4bp的缺失。如果存在缺失，则然后将玉米植物鉴定为具有QTL等位基因。所述方法还可包括：如果检测出QTL等位基因则从育种程序中反选择玉米植物，或者如果未检测出QTL等位基因则选择玉米植物。

在另一个实施方案中，提供了鉴定具有对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物的方法，其中在玉米植物的基因组中检测以下中的任一项：编码具有SEQIDNO：16所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；编码包含与SEQIDNO：16具有至少80％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述多肽具有反向转运蛋白/钠离子转运蛋白活性；或者在(i)或(ii)的5cM内的一个或多个标记等位基因，其与(i)或(ii)连锁并关联；以及将具有(i)、(ii)或(iii)中任一项的玉米植物鉴定为具有对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

在另一个实施方案中，示出了提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性的方法，其中将包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与EQIDNO：16、17、18、19、20或21进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。然后由可再生的植物细胞再生出转基因植物，并且转基因植物在其基因组中具有重组DNA构建体。转基因植物在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

所述方法可进一步包括从转基因植物中获得子代植物，所述子代植物还包含重组DNA构建体并且在与不具有重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

重组DNA构建体可包含至少一种调控元件(可为启动子)。在一些情况下，启动子可为根特异性启动子。

植物可以是拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高梁、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。在一些情况下，植物是单子叶植物，并且在另一些情况下，植物是玉米。

在另一个实施方案中，示出了提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性的方法，其中在植物中表达编码多肽的重组多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法当与SEQIDNO：16、17、18、19、20或21进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且在与不包含重组多核苷酸的对照植物比较时植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性提高。所述方法可进一步包括获得来源于表达所述重组多核苷酸的植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组多核苷酸并且在与不包含所述重组多核苷酸的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

植物可以是拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高梁、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。在一些情况下，植物为单子叶植物，并且在另一些情况下，植物为玉米。

在另一个实施方案中，提供了鉴定玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体或编码直系同源蛋白的基因的变体的方法，其中所述变体对非生物胁迫耐受表型具有影响。在这些方法中，通过基因改组组合一个或多个核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQIDNO：16、17、18、19、20或21中的一个或多个片段，或者与SEQIDNO：16、17、18、19、20、21或22或它们的片段具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的蛋白质，以在植物中表达时产生表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的变体。所述方法可进一步包括将包含表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的变体的重组DNA构建体引入可再生的植物细胞中，以获得具有提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的转基因植物。

转基因植物可以是拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高梁、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。在一些情况下，植物是单子叶植物，并且在另一些情况下，植物是玉米。

在另一个实施方案中，本文提供了鉴定与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的等位变体的方法。在这些方法中，获得玉米植物种群，其中所述玉米植物具有不同水平的盐胁迫耐受性和/或耐旱性。针对SEQIDNO：15或调控该基因的表达的基因组区域，对等位变体进行评估。然后等位变体可鉴定为与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联。所述方法可进一步包括选择所述等位变体作为玉米育种程序的一部分或者将等位变体引入玉米植物细胞基因组中的靶位点。引入步骤可经由核酸酶进行，所述核酸酶例如但不限于：锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统和大范围核酸酶。

还提供了重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQIDNO：16、17、18、19、20、或21进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。调控序列可在植物细胞中具有任何启动子的功能。还提供了包含重组DNA构建体的转基因植物细胞、植物和种子。植物可以是拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高梁、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。

还提供了如通过本文所公开方法产生的对一种或多种非生物胁迫条件诸如盐和/或干旱胁迫显示出耐受性或改善的耐受性的玉米植物。

附图说明和序列表

根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，下列的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1A-1H示出SEQIDNO：16、17、18、19、20和21的反向转运蛋白/钠离子转运蛋白多肽的氨基酸序列的多重比对。框中包围的是在给定位置处与SEQIDNO：16的残基相同的残基。示出了共有序列，其中如果所有序列中的残基相同，显示该残基，否则用圆点表示。

图2示出图1A-1E中显示的反向转运蛋白/钠离子转运蛋白多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异值。

序列描述和对此所附的序列表遵循适用于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则，如37C.F.R.§1.8211.825中所列。序列表包括用于核苷酸序列特征的单字母编码和用于氨基酸的三字母编码，如遵照NucleicAcidsRes.13：30213030(1985)和BiochemicalJ.219(2)：345373(1984)中的IUPACIUBMB标准所定义，这些文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规定。

SEQIDNO：1是标记PZE-101127875的参考序列。

SEQIDNO：2是标记PZE-101136333的参考序列。

SEQIDNO：3是标记PZE-101137350的参考序列。

SEQIDNO：4是标记PZE-101138119的参考序列。

SEQIDNO：5是标记PZE-101138122的参考序列。

SEQIDNO：6是标记SYN24133的参考序列。

SEQIDNO：7是标记PZE-101143143的参考序列。

SEQIDNO：8是标记PZE-101144216的参考序列。

SEQIDNO：9是标记PZE-101144210的参考序列。

SEQIDNO：10是标记PZE-101144184的参考序列。

SEQIDNO：11是标记SYN11646的参考序列。

SEQIDNO：12是标记SYN11650的参考序列。

SEQIDNO：13是标记PHM7351的参考序列。

SEQIDNO：14是标记PHM5908的参考序列。

SEQIDNO：15是编码玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白的cDNA的核苷酸序列。

SEQIDNO：16是由SEQIDNO：15编码的蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO：17是高粱(Sorghumbicolor)推定的未表征蛋白质(Sb08g023290.1)的氨基酸序列。

SEQIDNO：18是水稻(Oryzasativa)推定的Na+/H+反向转运蛋白(Os12g44360.1)的氨基酸序列。

SEQIDNO：19是大豆(Glycinemax)SOS1蛋白质(Glyma08g09730.1)的氨基酸序列。

SEQIDNO：20是拟南芥(Arabidopsisthaliana)钠/氢离子交换7蛋白质(At2g01980)的氨基酸序列。

SEQIDNO：21是拟南芥(Arabidopsisthaliana)钠/氢离子交换8蛋白质(At1g14660)的氨基酸序列。

SEQIDNO：22是由SEQIDNO：15的3311-3314位核苷酸处的4bp的缺失产生的截短的玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

盐胁迫是限制作物产量的主要约束条件之一。土壤中较高的盐浓度限制水分摄取并导致离子内稳态失调。分子育种提供一种改善主要作物的盐度(盐胁迫)耐受性的有效的方式。关于双亲本种群，通过基因组范围的关联性研究(GWAS)并进行QTL作图，从Pioneer种质的集合鉴定出“早期生长活力”的主要QTL。土壤测试和高NaCl浓度下的溶液培养确定所观察的较差“早期生长活力”表型由对较高的土壤盐浓度的耐受性降低引起，并且所识别的QTL赋予玉米耐盐度。采取基于作图的克隆方法，鉴定出对于QTL的候选基因。候选基因的易感等位基因中编码序列的缺失是可能的原因性突变。

在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制，它当然能够改变。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本说明书和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语例如“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如关于“植物”、“植株”或“作物”还包括多株植物；而且根椐上下文，所用的术语“植物”还可包括遗传学类似的植物或该植物的相同子代；所用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)涵盖许多类似或相同的探针分子。

除非另外说明，核酸是以5′到3′方向从左往右书写。说明书中所述的数字范围包括限定范围的端值并且包括在限定范围内的各个整数或任何非整数的分数。除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的一般理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的测试实践，但本文描述了优选的材料和方法。在本发明的描述和权利要求中，将根据下文陈述的定义使用下列术语。

术语“非生物胁迫”是指在低于最佳水平下减小生长和收率的环境条件。非生物胁迫可为选自下列的至少一种条件：干旱、禁水、洪水、高光强、高温、低温、盐度、黄化、落叶、重金属毒性、无氧生活、营养缺乏、营养过剩、紫外线辐射、大气污染(例如臭氧)和暴露于诱导产生反应性氧物质(ROS)的化学品(例如百草枯)。

术语“等位基因”指在特定基因座处出现的两个或更多个不同的核苷酸序列中的一个。

“等位基因频率”指等位基因存在于个体、一个品系、或种群品系中的基因座处的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5、或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样本的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。相似地，人们能够通过平均化构成该种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就具有限定数目的个体或品系的种群而言，可将等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其它指定组)的计数。

“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的所选择核酸(或其转录形式)的任何过程。典型的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法诸如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成连续的DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或经由它的BAC指纹与其它BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的MaizeGenomeBrowser找到公开的装配。

当等位基因是影响性状表达的DNA序列或等位基因的一部分或与之连锁时，所述等位基因“关联”所述性状。等位基因的存在是该性状将如何被表达的指征。

“BAC”，或细菌人工染色体，是来源于天然存在的大肠杆菌(Escherichiacoli)的F因子的克隆载体，其自身是能够作为环状质粒存在或者能够被整合进细菌染色体的DNA元件。BAC能够接收DNA序列的较大插入序列。在玉米中，各自包含来自玉米近交系B73的玉米基因组DNA的较大插入序列的大量BAC已经装配成为重叠群(重叠的连续基因片段，或“连续DNA”)，并且这一装配可公开获得于因特网。

BAC指纹是分析多个DNA样本之间的相似度的方法，其基于特定限制性位点的存在或缺乏而进行(限制性位点是由切割或“限制”DNA的酶所识别的核苷酸序列)而进行。使用相同的限制性酶组消化两种或更多种BAC样本并且比较所形成的片段的大小，这通常使用凝胶分离进行。

“回交”指其中杂交子代反复与亲本之一来回杂交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待掺入的所需(一种或多种)基因、(一种或多种)基因座或具体表型的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。例如，参见Ragot，M.等人(1995)Marker-assistedbackcrossing：apracticalexample，inTechniquesetUtilisationsdesMarqueursMoleculairesLesColloques，第72卷，第45-56页，以及Openshaw等人，(1994)Marker-assistedSelectioninBackcrossBreeding，AnalysisofMolecularMarkerData，第41-43页。初始杂交产生F1代；于是术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

如本文所用，术语“染色体区间”指位于植物单个染色体上的基因组DNA的连续的线性区域。位于单个染色体区间上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在某些方面，位于单个染色体区间内的遗传因子是遗传连锁的，通常具有例如小于或等于20cM或者小于或等于10cM的遗传重组距离。即，在单个染色体区间内的两个遗传因子发生重组的频率小于或等于20％或10％。

“染色体”是包含许多基因的单独的一段盘绕的DNA，这些基因在细胞分裂过程中作为一个整体起作用和移动并因此能够被称为是连锁的。“染色体”也可称为“连锁群”。

在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座诸如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，或更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

术语“互补序列”指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则而相关联。

术语“连续DNA”指未中断的基因组DNA片段，其由部分重叠的片段或重叠群表示。

当涉及两个遗传因子间的关系时，诸如有助于非生物胁迫耐受性的遗传因子和邻近的标记，“偶联”相连锁指示下述状态：其中在有助于非生物胁迫耐受性的遗传因子处的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在偶联相中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。

术语“受到杂交”或“杂交”是指有性杂交，并且涉及两组单倍体配子通过授粉进行的融合，从而产生二倍体子代(例如，细胞、种子或植株)。该术语包括一株植物被另一株植物授粉和自交(或自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。

SHD或DAYSHD＝DAYSTOPOLLENSHED：意指50％的植物释放花粉的天数。

SLK或DAYSLK＝DAYSTOSILKING：意指50％的植物暴露丝的天数。

“发育调控的启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

本文称为“二倍体”的植株具有两组染色体(基因组)。

本文称为“双单倍体”的植物通过倍增单倍体染色体组进行开发(即，正常染色体数目的一半)。双单倍体植物具有两组相同的染色体，并且认为全部基因座是纯合的。

EGRWTH＝EARLYGROWTH：该性状可以测量为早期幼苗健康状态的视觉评分，标度为1至9，9为最佳。用于评估EGRWTH表型的另一个途径是获得植物幼苗的鲜重。

EARHT＝EARHEIGHT：穗高度为从地面到最高处形成的穗节点连接处的量度并且以英寸测量。

“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。

“外来玉米株系”或“外来玉米种质”是来源于不属于可得的优良玉米品系或种质株系的玉米植物的株系。在杂交发生在两个玉米植物或种质株系之间的情况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序中。

“表达”是指产生功能产物。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“有利等位基因”是在特定基因座处的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的对盐胁迫的耐受性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。对于各个基因图谱，基因座之间的距离通过在种群中它们的等位基因在一起出现的频繁程度(它们的重组频率)而测量。利用DNA或蛋白质标记、或可观察的表型，能够检测等位基因。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的遗传距离可以不同。然而，使用共同标记能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用共同标记位置来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的其它基因座。尽管由于，例如，在不同种群中检测替代性的重复基因座的标记、用于将标记定序的统计方法中的差异、新型突变或实验室误差而在标记顺序上经常存在细微变化，但是基因座的顺序在图谱间不应变化。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，诸如用作探针的核酸。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

“基因组”指总DNA或整组基因，由染色体或染色体组携带。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座处的基因组成。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因型。术语基因型可被用于指个体在单个基因座处的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”是指遗传物质，其属于或来自于个体(例如，植株)、个体的组(例如，植物品系、品种或家族)或来自品系、品种、物种或培养物的克隆，或更一般地某一物种或多个物种的全部个体(例如，玉米种质集合(maizegermplasmcollection)或Andean种质集合(Andeangermplasmcollection))。种质可为生物体或细胞的部分，或者可从生物体或细胞中分离得到。种质通常给遗传物质提供特异性分子构成，该分子构成向生物体或细胞培养物的一些或全部遗传特质提供物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或植株部分诸如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

称为“单倍体”的植物具有一组染色体(基因组)。

“单倍型”是个体的多个基因座处的基因型，即等位基因的组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指位于特定基因座处的等位基因或指沿染色体片段位于多个基因座上的等位基因。

术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座处基因型不同。

相对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

材料的杂交反应或“杂种优势”能够被定义为当与其他不同的或不相关的群杂交时，超过亲本的平均(或高值亲本)的性能。

“杂种优势群”包含一组基因型，它们当与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer等人，(1998)Cornbreeding，第463-564页，在G.F.Sprague和J.W.Dudley(编辑)Cornandcornimprovement)。将近交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人，(1990)Theor.Appl.Gen.80：833-840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“爱荷华刚性茎秆合成群(IowaStiffStalkSynthetic)”(本文中也称为“刚性茎秆”)和“Lancaster”或“LancasterSureCrop”(有时称为NSS或非刚性茎秆)。

一些杂种优势群具有作为雌性亲本所需的性状，而另一些具有用于雄性亲本的性状。例如，在玉米中，产生自从被称为BSSS的群体(爱荷华刚性茎秆合成群)释放的公开的近交系的产出已使得这些近交系以及它们的衍生物成为了美国中部玉米种植带的雌性库。BSSS近交系已与其他近交系(例如SD105和MaizAmargo)杂交，并且这种一般性的材料群体已作为刚性茎秆合成(StiffStalkSynthetics(SSS))为人们所知，尽管并非全部的这些近交系均来源于初始的BSSS群体(Mikel和Dudley(2006)CropSci：46：1193-1205)。默认地，与SSS近交系良好地组合的全部其他近交系被指定为雄性库，其由于缺少更好的名称已被称为NSS，即“非刚性茎秆”。该群体包括了多个主要的杂种优势群，诸如LancasterSurecrop、Iodent、和LeamingCorn。

如果多于一种的等位基因类型存在于给定基因座处(例如二倍体个体具有两个不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则该个体是“杂合的”。

术语“均质性”指一组成员在一个或多个特定基因座处具有相同基因型。

如果个体在给定基因座处仅具有一种类型的等位基因(例如二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的基因座处具有相同等位基因的一个拷贝)，则该个体是“纯合的”。

术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。

“杂交”或“核酸杂交”指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。

术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。

“IBM基因图谱”可指任何下列图谱：IBM、IBM2、IBM2邻接、IBM2FPC0507、IBM22004邻接、IBM22005邻接、IBM22005邻接框、IBM22008邻接、IBM22008邻接框、或maizeGDB网站的最新版本。IBM基因图谱基于B73×Mo17种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组近交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了遗传的或BAC作图的基因座的添加，以及由于从其它遗传图谱或物理图谱、经过清理的数据或新算法的使用获得的信息的整合而提高的图谱精度。

术语“近交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。

植物的“提高的胁迫耐受性”或“提高的对胁迫的耐受性”相对于参照植物或对照植物进行测量，它是相对在相似的胁迫条件下生长的参照或对照植物而言植物在胁迫条件下存活较长时间并且不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。

具有“提高的胁迫耐受性”的植物可对一种或多种不同的胁迫条件表现出提高的耐受性，所述条件包括但不限于盐(盐度)胁迫和干旱。具有提高的胁迫耐受性的植物可在胁迫条件下表现出提高的收率、绿度、生物质、或其它收率相关的性状。收率相关的性状可为早期生长(EGRWTH)、花粉释放的天数(SHD)、抽丝天数(SLK)、植株高度(PLTHT)或穗高度(EARHT)。

术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中可指一个品系相对于第二品系具有插入的核苷酸或DNA片段，或可指所述第二品系相对所述第一品系具有缺失的核苷酸或DNA片段。

术语“基因渗入”是指遗传基因座的所需等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景。例如在特定基因座处的期望等位基因的基因渗入经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。另选地，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中供体原生质体中的至少一个在其基因组中具有期望的等位基因。所期望的等位基因可以，例如，通过关联于表型的标记在QTL、转基因等等中加以检测。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并对期望的等位基因进行选择以产生固定在所选择遗传背景中的等位基因。

当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。

“分离的”指物质，诸如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分去除。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“品系”或“品种”是一组具有相同亲缘关系的个体，它们一般是某种程度的近交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和均一的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的近交体子集，它们与相同祖先来源的其它相似近交体子集遗传上不同。

如本文所用，术语“连锁”用于描述一种标记基因座与另一种标记基因座或其它一些基因座的相关联程度。分子标记和影响表型的基因座之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可表示为所期望的界限或范围。例如，在一些实施方案中，任何标记与任何其他标记当所述标记以单一减数分裂图谱(基于经过一轮减数分裂的群体(诸如，例如F₂)的遗传图谱；IBM2图谱包括多次减数分裂)的小于50、40、30、25、20、或15个图谱单位(或cM)被分离时是(遗传上和物理上)连锁的。在某些方面，限定范围形式的连锁，例如介于10cM和20cM之间、介于10cM和30cM之间、或者介于10cM和40cM之间，是有利的。标记与第二基因座连锁越紧密，标记越可能变成第二基因座的指示。因此，“紧密连锁的基因座”诸如标记基因座和第二基因座显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为相互“邻近”。因为1cM是显示出1％的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与紧邻的任何其它标记紧密连锁(基因上和物理上)，例如等于或小于10cM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可相互定位为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更近。

术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一定长度的染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下共分离，例如约51％至约100％的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同连锁群上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记之间或者标记和影响表型的基因座之间。标记基因座可与性状“相关联”(连锁)。标记基因座和影响表型性状的基因座的连锁程度可以根据，例如，该分子标记与所述表型共分离的统计概率(例如，F统计或LOD评分)加以测量。

连锁不平衡最常见地用量度r²估计，它使用Hill，W.G.和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.38：226-231(1968)描述的式计算。当r²＝1时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着所述标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r²值应依赖于所使用的种群。r²值大于1/3显示了可用于作图的足够强的LD(Ardlie等人，NatureReviewsGenetics3：299-309(2002))。因此，当成对标记座位间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。

“基因座”是染色体上的位置，例如，核苷酸、基因、序列或标记所处的位点。

“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch，Science255：803-804(1992))用于基因区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率为无连锁的概率的1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率为无连锁的概率的100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。LOD评分还可用于在“数量性状基因座”作图中显示标记基因座和数量性状之间的关联强度。在这一情况下，LOD评分大小取决于所述标记基因与影响所述数量性状的基因座之间的接近度，以及所述数量性状效应的大小。

“玉米(maize)”是指玉米(ZeamaysL.ssp.mays)植株并且也称为“玉米(corn)”。

术语“玉米植物”包括整个玉米植物、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、可从其中再生玉米植物的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织、玉米植物丛生物和玉米植物中的完整玉米植物细胞或玉米植物的部分，诸如玉米种子、玉米穗轴、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。

“标记”是发现基因或物理图谱上的位置或发现标记与性状基因座(影响性状的基因座)之间的连锁的手段。标记所检测的位置可通过检测多态性等位基因及其基因作图而获知，或通过对已经进行物理标测的序列进行杂交、序列匹配或扩增而获知。标记可以是DNA标记(检测DNA多态性)、蛋白质(检测所编码多肽的变异)或简单遗传表型(诸如‘蜡质’表型)。可通过基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，通过剪接的RNA或cDNA)开发DNA标记。根据DNA标记技术，所述标记将由侧接所述基因座的互补引物或与该基因座处的多态性等位基因杂交的互补探针组成。DNA标记，或遗传标记，还能够被用于描述其自身染色体上的基因、DNA序列或核苷酸(而不是用于检测基因或DNA序列的组分)，并且当该DNA标记与人类遗传学中的特定性状相关联时经常被使用(例如，针对乳腺癌的标记)。术语标记基因座是该标记所检测的基因座(基因、序列或核苷酸)。

检测种群成员之间的遗传多态性的标记在本领域中是已建立的。标记可由其所检测的多态性的类型以及用于检测所述多态性的标记技术所限定。标记类型包括但不限于：限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性检测(AFLP)、简单重复序列检测(SSR)、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、或单核苷酸多态性检测(SNP)。SNP能够通过，例如，DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ASH)对多核苷酸多态性的检测、动态等位基因特异性杂交(DASH)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶测定、Flap内切核酸酶、5’内切核苷酸、引物延伸、单链构象多态性(SSCP)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)被检测。DNA测序，诸如焦磷酸测序技术，具有能够检测组成单倍型的一系列连锁的SNP等位基因的优点。单倍型倾向于比SNP更具信息性(检测更高水平的多态性)。

“标记等位基因”或“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座处的多个多态性核苷酸序列中的一个。

“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择个体植株的方法。

“标记辅助反选”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植株的方法，所述植株将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中除去。

“标记单倍型”是指在标记基因座处的等位基因的组合。

“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位置，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于跟踪第二连锁基因座的存在情况，例如影响表型性状表达的连锁基因座。例如，标记基因座能够用于监控在遗传上或物理上连锁的基因座处的等位基因的分离。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记座位存在与否的核酸序列或分子，例如与标记座位序列互补的核酸分子探针。包含标记座位的30个或更多连续的核苷酸(标记座位序列的“所有或部分”)的标记探针可用于核酸杂交。另选地，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记或用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，诸如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是能够被用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。另选地，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，诸如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如，SNP技术被用于本文提供的示例。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不出现在包含上述等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“负”相关。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链-或双链的，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基团组成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

术语“可操作地连接”指核酸片段缔合成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

术语“表型”、“表型性状”或“性状”可指基因或系列基因的可观测表达。表型对于肉眼或本领域任何其它已知评估手段而言可以是可观测的，例如称重、计数、测量(长度、宽度、角度等)、显微法、生化分析或机电分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”或“简单遗传性状”。在无较大水平的环境变化时，可在群体中分离单基因性状以给出“定性”或“离散”分布，即表型属于离散类。在其它情况下，表型是若干个基因的结果并且可被视为“多基因性状”或“复杂性状”。在群体中分离多基因性状以给出“定量的”或“连续”分布，即表型不可分为离散类。单一基因和多基因性状均可受到其表达所处的环境的影响，但是多基因性状倾向于具有更大的环境组分。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的和重叠的连续基因片段)并且不基于基因重组(所述基因重组可在不同的种群中有所变化)。

“植株”可为整个植株、其任何部分、或来源于植株的细胞或组织培养物。因此，术语“植株”可指如下中的任何一种：整个植株、植株组分或器官(例如叶、茎、根等)、植株组织、种子、植株细胞、和/或它们的子代。植株细胞是从植株中获得的植株的细胞或来源于从植株中所获得的细胞的培养物。

PLTHT＝PLANTHEIGHT：这是从地面至雄穗顶端之间以英寸计的植物高度的量度。

“来源于刚性茎秆合成群中的近交体”的玉米植物可以是杂交体。

“多态性”是群体内的两个或更多个个体之间DNA的变化。多态性在种群中优选地具有至少1％的频率。可用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)、或插入/缺失多态性，本文也称为“插入缺失”。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将出现在包含上述等位基因的植株中的指示基因时，等位基因与性状“正”相关。

“概率值”或“p-值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，基因座和表型相关联的可能性就越高。概率评分可受到第一基因座(通常是标记基因座)与影响该表型的基因座的邻近度以及表型效应的量级(由等位基因置换导致的表型变化)的影响。在某些方面，认为概率评分“显著”或“不显著”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是关联的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率能够小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01或小于0.001。

“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计用于与多种化学反应和平台一起使用。所使用的标记名称以代表“PioneerHi-Bred标记(PioneerHi-BredMarker)”的前缀PHM开始，然后是从其设计的序列特异性的数字，然后是“.”或“-”，然后是DNA多态性特异性的后缀。还可以接着有标记的版本(A、B、C等)，表示对该特定多态性设计的标记的版本。

术语“子代”指杂交产生的后代。

“子代植物”是通过两个植物间的杂交所生成的植物。

“启动子”是指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”是能够控制

植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

术语“数量性状基因座”或“QTL”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与数量表型性状的差异表达相关联的DNA区域。QTL的区域涵盖影响所考虑的性状的一个或多个基因或与其密切连锁。“QTL的等位基因”可包含连续的基因组区域或连锁群中的多个基因或其它遗传因子，诸如单倍型。QTL的等位基因可表示特定窗口内的单倍型，其中所述窗口是能够用一组的一个或多个多态性标记限定和跟踪的连续的基因组区域。单倍型可被特定窗口内的每一标记处的等位基因的独特“指纹”限定。

“重组体”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。

“重组DNA构建体”是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“重组DNA构建体”和“重组构建体”本文可互换使用。

“参考序列”或“共有序列”是用作序列比对基准的定义序列。PHM标记的参考序列通过对基因座上的多个品系进行测序、以序列比对程序进行核苷酸序列比对(例如Sequencher)、然后获取比对的最常见核苷酸序列来获取。见于个体序列中的多态性标注于该共有序列中。参考序列通常并非任何个体DNA序列的精确拷贝，而是可用序列的混合体并且可用于设计针对该序列内的多态性的引物和探针。

“调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且该核苷酸序列影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控因子”在本文中可互换使用。

在“相斥”相连锁中，在受关注基因座处的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座处的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。

如本文所用，术语“盐胁迫”是指对植物功能或发育造成损伤的高盐度土壤条件，无论该损伤可逆或不可逆。在一些情况下，4.0dS/m用作限定盐化土壤的总电导率阈值；然而，一些作物可在2-4dS/m的电导率下示出症状和减小的收率。如本文所用，盐胁迫可在土壤的电导率为至少约2dS/m、3dS/m、4dS/m、5dS/m、6dS/m、7dS/m、8dS/m、9dS/m或10dS/m时发生。或者，可在土壤中用NaCl浓度来评估盐胁迫。由此，盐胁迫可在土壤的NaCl浓度为至少约20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM时发生。

“顶交测试”是通过将各个体(例如，选择物、近交系、克隆或子代个体)与相同的花粉亲本或“测试物(tester)”(通常是纯合品系)杂交而实施的测试。

“组织特异启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“转化细胞”是已将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。

本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何后续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“转基因的”是指通过异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而改变其基因组的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些初始转基因事件以及从初始转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而创造的那些。如本文所用，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体或染色体外)改变。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源性多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。“转基因植物”还包括对在其基因组中包含多于一种异源多核苷酸的植物。每种异源多核苷酸均可赋予转基因植物不同的性状。

短语“在严格条件下”指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸复合混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况中将会不同。较长序列具体地讲在较高温度下杂交。特定序列在限定离子强度、pH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50％的与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm下，50％的探针被平衡占用)的温度。严格条件应为如下条件：其中在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格杂交条件通常为：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，在42℃下温育，或者5xSSC、1％SDS，在65℃下温育，并用0.2xSSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。对于PCR，约36℃的温度通常用于低严格性扩增，尽管退火温度可根据引物长度在介于约32℃和48℃之间变化。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。

标记的“不利等位基因”是与不利植物表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中去除的植物的有益效果。

术语“收率”指每单位面积具有商业价值的特定植株产品的生产能力。例如玉米收率一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。收率受遗传和环境因素两者的影响。“农学”、“农学性状”、和“农学性能”指给定植株品种的性状(以及产生性状的遗传因子)，所述性状有助于生长季过程的收率。单个农学性状包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、抗除草剂性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等。因此抗是所有农学特性的最终结果。

序列比对和同一性百分比计算可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用CLUSTALV比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))采用默认参数(空位罚分(GAPPENALTY)＝10、空位长度罚分(GAPLENGTHPENALTY)＝10)执行。使用CLUSTALV方法进行蛋白质序列的逐对比对和百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，以及对角线保存(DIAGONALSSAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，WINDOW＝4，以及对角线保存＝4。在序列比对后，使用CLUSTALV程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和受权利要求书保护的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

另选地，可以使用ClustalW比对方法。ClustalW比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))可见于生物信息计算包(Inc.，Madison，Wis.)的MegAlign^TMv6.1程序。用于多重比对的默认参数对应空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、DelayDivergentSequences＝30％、DNATransitionWeight＝0.5、蛋白质权重矩阵＝GonnetSeries、DNA权重矩阵＝IUB。用于配对比对的默认参数是Alignment＝Slow-Accurate(缓慢-准确)，空位罚分＝10.0，空位长度罚分＝0.10，蛋白质权重矩阵＝Gonnet250，以及DNA权重矩阵＝IUB。用ClustalW程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

基因作图

人们早已认识到，与特定的表型(诸如盐和/或干旱耐受性)相关的特定基因座能够在生物体的基因组中被作图。作图可鉴定分子标记，所述标记可有利地用于通过检测标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。作图还可用于鉴定导致特定表型的因果基因和/或基因的因果变体。

本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状诸如耐盐性和/或耐旱性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记座位之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。两种用于检测所关注的性状基因座的此类方法是：1)基于种群的关联分析和2)传统的连锁分析。

在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获得品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和下列观点：在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的相关性将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记座位处的基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记座位和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。

传统连锁分析采用同样的原理；然而，LD是通过用少量创始者构建种群而产生的。选择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Genetics121：185-199(1989)，其中针对控制受关注性状的基因位于该位置的概率来测试沿基因图谱(1cM的区间)的许多位点中的每一个位点。基因型/表型数据用于计算每个测试位置的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位置位于基因图谱上的该位置上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。

本文提供了玉米标记基因座，如通过传统的连锁分析以及通过全基因组关联分析所测定，其示出与对盐胁迫和/或干旱的耐受性统计意义上显著的共分离。这些基因座或另外的连锁基因座的检测可用于标记辅助的玉米育种程序，以产生具有提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的植物并反选择具有的降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物。标记辅助的玉米育种程序的活性可包括但不限于：在新的育种群体中进行选择，以鉴定基于历史基因型和农学性状相关性，哪个群体具有有利的核酸序列的最高频率；在育种群体中的子代中选择有利的核酸序列；在亲本品系中基于对子代性能的预测进行选择；和基于有利的核酸序列的存在，将品系推进用于种质改善活动中。

QTL

染色体1上bin6区的QTL鉴定为在非生物胁迫条件诸如盐和/或干旱胁迫下与收率相关联(实施例1)。QTL位于基于内部产生的专有单一减数分裂的遗传物质上142.6-156.0cM。在双单倍体育种群体中利用传统QTL作图(实施例2)并通过标记辅助选择(实施例3)来验证QTL。发现QTL在盐胁迫条件下与早期生长(EGRWTH)、花粉释放天数(SHD)、抽丝天数(SLK)、植株高度(PLTHT)和穗高度(EARHT)相关联。还发现QTL与耐旱性相关联(实施例6)。

染色体区间

提供了与对于一种或多种非生物胁迫诸如盐和干旱胁迫的耐受性或改善的耐受性相关的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界被划为涵盖将与控制所关注的性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于该区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可被用作非生物胁迫耐受性标记。表2示出本文所示染色体1QTL区域内的标记与盐胁迫耐受性相关联。由SEQIDNO：1-12表示各个标记的参考序列。

每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含多于一个的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的相关性，因为一个标记可显示与多于一个的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每个鉴定相同的QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。

下文描述的区间涵盖了与盐胁迫耐受性共分离的标记。在局部区域内与盐胁迫耐受性共分离的标记的聚簇在染色体上相对小的区域内出现，表明一个或多个QTL在这些染色体区域中的存在。区间扩展到涵盖与盐胁迫耐受性共分离的标记。所述区间由在它们的边界处的标记限定，其中该区间包含图谱中在该区间内的标记以及限定边界的标记。由限定区间端值的末端标记所描述的区间将包括末端标记和定位于该染色体结构域内的任何标记，无论那些标记目前已知或未知。

染色体1区间可涵盖本文鉴定为与盐胁迫耐受性状相关联的任何标记，包括：PZE-101127875、PZE-101136333、PZE-101137350、PZE-101138119、PZE-101138122、SYN24133、PZE-101143143、PZE-101144216、PZE-101144210、PZE-101144184、SYN11646、SYN11650、PHM7351和PHM5908。染色体1区间例如可由标记PZE-101127875和SYN11650(实施例1)或标记PHM7351和PHM5908(实施例2)界定。位于这些区间内的任何标记能够被用作针对盐胁迫耐受性和/或耐旱性的标记，并且能够在本文所述的方法中被用于鉴定和/或选择具有提高的对盐胁迫的耐受性和/或提高的对干旱胁迫的耐受性的玉米植物。

染色体区间也可通过与QTL标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r²是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果，例如，位于或接近于与盐耐受性相关联的QTL的染色体1标记基因座与另一个紧邻的染色体1标记基因座之间的LD的r²值大于1/3(Ardlie等人，NatureReviewsGenetics3：299-309(2002))，则这两个基因座彼此连锁不平衡。

标记和连锁的关系

连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。1cM等于由于在一代中的杂交导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1％(意味着性状99％的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，存在与重组频率相关的近似物理距离。

标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，1cM等于经过单代杂交的标记基因座将与另一个基因座分离的1％的概率。

标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选地约0.5％或更低，或更优选地约0.25％或更低的重组频率。因此，基因座的分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。

尽管特定的标记等位基因能够与盐胁迫耐受性和/或耐旱性共分离，重要的是需注意，该标记基因座不一定负责耐盐表型的表达。例如，不需要标记多核苷酸序列是负责表型的基因的一部分(例如，是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与性状之间的关联性是由于所述标记等位基因与所述等位基因之间在该等位基因所从其来源的祖先玉米品系中的初始的“偶联”连锁态。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。由于上述原因，根据被用于构建分离群体的具有有利性状的亲本中存在的连锁态，有利的标记等位基因可以改变。这不改变可使用标记监控表型的分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。

本文所示方法包括：检测一个或多个与玉米植物提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的标记等位基因的存在，以及然后鉴定和/或选择在那些标记基因座处具有有利等位基因的玉米植物，或者检测与降低的对盐胁迫的耐受性相关联的标记等位基因的存在，然后鉴定和/或反选择具有不利等位基因的玉米植物(例如单倍型“A”)。表2和表3中所列的标记在本文中已被鉴定为与对盐胁迫的耐受性相关联并从而能够被用于预测玉米植物的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。表2和表3中的任何标记的50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM(基于以单次减数分裂为基础的遗传图谱；IBM2距离为平均2.5-3X距离，这是由于该图谱的高分辨性)以内的任何标记也能够被用于预测玉米植物的盐胁迫耐受性和/或干旱耐受性。

在玉米植物中检测不利的QTL等位基因，其中所述不利的QTL等位基因与降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联，并且包括在玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因中SEQIDNO：15的3311-3314位核苷酸处的4bp的缺失。因此，本文方法涉及：检测存在或不存在QTL等位基因，其中可反选择或从育种程序中除去被鉴定为具有不利QTL等位基因的玉米植物，同时可选择被鉴定为具有有利QTL等位基因的玉米植物并通过标记辅助选择方法将其渗入其它玉米植物。

标记辅助选择

分子标记可用于多种植物育种应用(如参见Staub等人，(1996)Hortscience31：729-741；Tanksley(1983)PlantMolecularBiologyReporter.1：3-8。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植物种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定时尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。

当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(Gepts.(2002).CropSci；42：1780-1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致收率减少或其它负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。这有时也称为“收率累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人，(1998)Genetics120：579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人，(1989)Biotechnology7：257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有95％的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的1cM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，同上)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的种群大小中对重组进行选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。

包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见如IBM2Neighbors图谱，该图谱可在MaizeGDB网站上在线获得。

具体实施MAS的关键部分为：(i)限定种群，在该种群中将确定标记-性状关联性，该种群可以是分离种群、或随机或结构化种群；(ii)监控相对于性状的多态性标记的分离或关联性，并且使用统计方法确定连锁或关联性；(iii)基于统计分析的结果限定一组所期望的标记，以及(iv)将该信息用于和/或外推出当前组育种种质，使基于标记的选择决定得以作出。因连锁不平衡，可单独或与其它标记组合的任一类标记(即单倍型)可用于记辅助选择规程，包括但不限于SNP、SSR、表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、以及其它基于核酸的标记。

技术人员将预期在本文鉴定的1号染色体标记内和它们周围的标记基因座可能存在附加的多态性位点，其中一个或多个多态性位点处于与所述单倍型中的一个或多个多态性位点处的等位基因的连锁不平衡(LD)中，并从而能够被用于标记辅助选择程序中，以使所关注的QTL等位基因渗入。不同多态性位点处的两个特定等位基因，在其中一个位点处所述等位基因的存在倾向于推测在相同染色体上的另一位点处存在等位基因的情况下，所述等位基因被称为处于LD(Stevens，Mol.Diag.4：309-17(1999))。标记基因座能够位于盐胁迫耐受性QTL的5cM、2cM、或1cM内(在基于单次减数分裂的遗传图谱上)。

技术人员将理解等位基因频率(进而单倍型频率)可因种质库不同而不同。种质库由于成熟期差异、杂种优势群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其它多态性可能在一些种质库中无法提供信息。

序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游序列或下游序列。这些新序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开内描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在玉米物种中，或甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其它物种，诸如稻、小麦、大麦或高粱。

植物组成

通过任何上文所述的方法鉴定和/或选择的玉米植物也是所关注的。

基因鉴定

玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因(SEQIDNO：15)位于基于内部专有单次减数分裂的基因图谱上151.3cM处。细胞内Na+/H+反向转运蛋白在保持Na+和K+的内稳态中发挥重要作用。在植物中，NHX通过催化Na+和/或K+交换H+来引导Na+或K+跨液泡膜移动并进入液泡(或其它细胞器官)(Eckardt和Berkowitz.2011.PlantCell23：3087-3088)。玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白(即SEQIDNO：16)编码的多肽直系同源于AtSOS1/ATNHX7(SEQIDNO：20)以及来自于高粱(Sorghumbicolor)(SEQIDNO：17)，水稻(Oryzasativa)(SEQIDNO：18)、大豆(Glycinemax)(SEQIDNO：19)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)(SEQIDNO：21)的多肽。

鉴定对非生物胁迫耐受性表型有影响的变体的方法

还提供了鉴定赋予植物提高的对盐胁迫的耐受性的反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体的方法。该方法可包括：(a)通过基因改组组合一个或多个核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQIDNO：16、17、18、19、20或21中的一个或多个片段，或者与SEQIDNO：16、17、18、19、20或21或它们的片段具有至少80％、85％、90％、95％或100％同一性的蛋白质；(b)将得自步骤(a)的经改组序列转化到可再生的植物细胞群中；(c)从步骤(b)的转化的可再生的植物细胞群再生出转化的植物群体；(d)针对提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性，从步骤(c)筛选转化的植物群体；以及(e)鉴定表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的转化的植物的变体。所述方法可进一步包括：(f)将重组构建体引入到可再生的植物细胞中，该构建体包含赋予植物提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的本文所述反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体；(g)在步骤(f)后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(h)选择(g)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

术语“基因改组”和“定向进化”可在本文中互换使用。“基因改组”方法包括反复进行DNA改组，然后通过适当的筛选和/或选择以生成具有改变的生物活性的crw1核酸变体或其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674)：1151-4，美国专利5,811,238和6,395,547)。

还提供了通过传统的传统连锁作图来鉴定与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的等位变体的方法。在一些实施方案中，等位变体通过以下进行鉴定：(a)使两种具有不同水平的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物杂交；(b)在关于编码包括SEQIDNO：16、17、18、19、20或21的蛋白质的多核苷酸序列的子代植物中，或者在调控编码蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，对等位变体进行评估；(c)就对盐胁迫和/或干旱的耐受性而言，对子代植物进行表型分析；(d)使等位变体与所述对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联；以及(e)鉴定与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的等位基因。表型分析步骤(c)可采用本领域已知的任何方法进行。

在其它实施方案中，经由以下步骤通过全基因组关联分析鉴定等位变体：(a)获得玉米植物种群，其中所述玉米植物表现出不同水平的对盐胁迫和/或干旱的耐受性；(b)针对编码包括SEQIDNO：16、17、18、19、20或21的蛋白质的多核苷酸序列，或者在调控编码蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，对等位变体进行评估；(c)使等位变体与对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联；以及(d)鉴定与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的等位变体。

还提供了鉴定表现出提高的对盐胁迫的耐受性的玉米植物的方法，所述方法包括：(a)在玉米植物的基因组中检测与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的至少一种等位变体的存在；以及(b)鉴定包含所述至少一种等位变体的玉米植物。所述方法可进一步包括：(c)使所述玉米植物与第二玉米植物杂交；以及(d)鉴定并选择具有所述等位变体的从所述杂交产生的子代植物。

将等位变体引入玉米基因组的靶位点

上述方法还可包括经由基因编辑将所鉴定的变体引入植物细胞的基因组的靶位点，其中所述植物可为玉米。

可利用蛋白质引入变体，该蛋白质可将DNA损伤引入植物基因组的预选区域。此类蛋白质或催化结构域有时称为“DNA突变酶”。DNA损伤可导致双链DNA的DSB(双链断裂)。DNA突变酶结构域可与结合特定DNA位点的蛋白质融合。

DNA突变酶结构域的示例包括但不限于催化剂结构域诸如DNA转葡糖基酶、DNA重组酶、转座酶和DNA核酸酶(PCT公开WO2014127287；美国专利公布US20140087426；通过引用并入本文)。

DNA转葡糖基酶是一类参与碱基切除修复的酶，通过该机制除去和替换DNA中受损的碱基。DNA转葡糖基酶包括但不限于3-甲基腺嘌呤转葡糖基酶(Mag1p)和尿嘧啶DNA转葡糖基酶。

DNA核酸酶结构域是另一类可用于诱导DNA损伤或突变的酶。DNA核酸酶结构域是致使DNA裂解而导致DSB的酶活性蛋白或其片段。

DNA核酸酶及其它突变酶结构域可与DNA结合结构域融合以在靶DNA中产生DSB。DNA结合结构域包括例如阵列特异性DNA结合结构域和位点特异性DNA结合结构域。位点特异性DNA结合结构域包括但不限于TAL(转录激活因子样效应)或锌指结合结构域。

与DNA核酸酶融合的DNA-结合结构域的示例包括但不限于TALEN和多种TALEN。转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)是由TAL效应DNA结合结构域与DNA酶结构域融合而产生的人造限制性酶。TAL蛋白质由细菌产生并且包括高度保守的33-34个氨基酸DNA结合结构域序列(PCT公开NWO2014127287；美国专利公布US20140087426)。

使用野生型FokI内切核酸酶结构域来制备原TALEN嵌合体。然而，TALEN也可包括由FokI内切核酸酶结构域变体与设计用于改善裂解特异性和裂解活性的突变体制成的嵌合体。在一些情况下，多个TALEN可被表达以靶向多个基因组区域。

锌指是另一类DNA结合结构域，其可用于将突变引入靶DNA中。

各种蛋白质工程技术可用于改变锌指的DNA-结合特异性并且此类经工程化的锌指的串联重复可用于靶向期望的基因组DAN序列。

CRISPR(成簇规则交替的短回文重复)系统的蛋白质是其它DNA-结合和DNA-核酸酶结构域的示例。细菌CRISPR/Cas系统包括利用使Cas9核酸酶定位于靶DNA序列的较短的互补单链RNA靶向DNA(CRISPRRNA或crRNA)(BurgessDJ(2013)NatRevGenet14：80；PCT公开WO2014/127287)crRNA可结合DNA的任一条链并且Cas9将裂解DNA而产生DSB。

“Cas基因”涉及这样的基因，该基因通常与旁侧CRISPR基因座偶联、相关联或接近或在邻近旁侧CRISPR基因座的位置。术语“Cas基因”、“CRISPR-相关联的(Cas)基因”在本文中可互换使用。Cas蛋白质家族的全面综述在Haft等人，(2005)ComputationalBiology，PLoSComputBiol1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。如本文所述，除了四种先前已知的基因家族之外，还描述了41种CRISPR-相关联的(Cas)基因家族。其示出CRISPR体系属于不同的类，具有不同的重复图案、基因组和物种范围。在给定CRISPR基因座处的Cas基因数在物种之间可以不同。

Cas内切核酸酶与由Cas基因编码的Cas蛋白质相关，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入到DNA靶序列中。Cas内切核酸酶由向导多核苷酸引导来识别并任选地在细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂(美国临时申请62/023239，该专利申请提交于2014年7月11日)。向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统包括能够将双链断裂引入DNA靶序列的Cas内切核酸酶和向导多核苷酸的复合物。在由向导RNA识别靶序列时，Cas内切核酸酶退绕紧密靠近基因组靶位点的DNA双链体，并且切割两个DNA链，如果在正确的前间区序列邻近基序(PAM)在靶序列的3′末端处大致取向的话。

Cas内切核酸酶基因可为Cas9内切核酸酶，或其功能片段，诸如但不限于在2007年3月1日公开的WO2007/025097的SEQIDNO：462、474、489、494、499、505和518中所列的Cas9基因。Cas内切核酸酶基因可为植物、玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶，诸如但不限于植物密码子优化的酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)Cas9基因，其可识别任何N(12-30)NGG形式的基因序列。Cas内切核酸酶可通过本领域已知的任何方法直接引入到细胞中，例如但不限于瞬时引入方法、转染和/或局部应用。

如本文所用，术语“向导RNA”是指两个RNA分子、包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPRRNA)以及tracrRNA的合成融合物。在一个实施方案中，向导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域以及可与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。

如本文所用，术语“向导多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，该多核苷酸序列可与Cas内切核酸酶形成复合物并且使Cas内切核酸酶能够识别并且任选地裂解DNA靶位点(美国临时申请62/023239，该申请提交于2014年7月11日)。向导多核苷酸可为单分子或双分子。向导多核苷酸序列可为RNA序列、DNA序列、或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，向导多核苷酸可包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或键修饰，诸如但不限于锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18(六乙二醇链)分子)，或导致环化的5’至3’共价键。仅仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也称为“向导RNA”。

向导多核苷酸可为双分子(也称为双链体向导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子向导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独分子。这两个单独分子可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体向导多核苷酸的第一分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可包括细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段。在一个实施方案中，细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段以本文所公开的cr核苷酸形式存在，其大小范围可为，但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，包含CER结构域的双链体向导多核苷酸的第二分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。在一个实施方案中，引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA为包含双链体crRNA-tracrRNA的双工RNA。

向导多核苷酸也可为单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。所谓“结构域”，意指核苷酸的连续片段，该连续片段可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。单向导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，单向导多核苷酸包括连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含连接到CER结构域的VT结构域)，其中所述键为包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单向导多核苷酸可被称为“单向导RNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导DNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“单向导RNA-DNA”(当由RNA核苷酸和DNA核苷酸的组合构成时)。在本发明的一个实施方案中，单向导RNA包括cRNA或cRNA片段以及可与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述向导RNA/Cas内切核酸酶复合物可引导Cas内切核酸酶至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶将双链断裂引入到基因组靶位点中。使用单向导多核苷酸与双链体向导多核苷酸相比的一个方面是仅需要形成一个表达盒即可表达单向导多核苷酸。

术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用并且包括与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续片段。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列、或它们的任意组合构成。

术语向导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如向导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)，或它们的任何组合组成。

连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的长度可为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施方案中，连接单引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四环序列，诸如但不限于GAAA四环序列。

向导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可选自但不限于5′帽、3′聚腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将向导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供用于蛋白质的结合位点的修饰或序列、锁定核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任意组合。这些修饰可产生至少一种附加的有益特征，其中所述附加的有益特征选自经修饰或调控的稳定性，亚细胞靶向，跟踪，荧光标记，蛋白或蛋白复合物的结合位点，与互补靶序列的经修饰的结合亲和力，经修饰的对细胞降解的抗性，或增加的细胞渗透性。

可利用大范围核酸酶的独特特性，即具有使其高度特异的极长识别序列(＞14bp)以在基因编辑中得到位点特异性DSB；然而，已知或可能知道大范围核酸酶不足以覆盖所有可能的靶序列。可产生大范围核酸酶变体以识别特定系列；然而，对于所有可能的序列，序列特异性酶的构造成本高且耗时。

提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性的转基因植物和方法

通过本公开鉴定的优选的单倍型和QTL可作为候选基因被进一步用于包括在表达构建体内(即，转基因)。通过将作为所关注的单倍型或QTL的基础的核酸可操作地连接至植物中有功能的启动子，能够在植物细胞中表达所述核酸。以使得针对性状的核酸分子被转录为被翻译并表达为蛋白质产物的功能性mRNA分子的方式，组装构建体并将它们引入细胞的方法是本领域中已知的。

由此，本文提供了重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接侄至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQIDNO：16、17、18、19、20、或21进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。调控序列可在植物细胞中具有任何启动子的功能。还提供了包含重组DNA构建体的转基因植物细胞、植物和种子。植物可以是拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高梁、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。

可通过将本文公开的重组DNA构建体引入可再生的植物细胞并再生出转基因植物，利用重组DNA构建体来提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性。子代植物也可得自转基因植物。

堆叠

遗传改良种质的商业开发也已进展到将多种性状引入作物植物的阶段，通常称为基因堆叠方法。在该方法中，可以将赋予不同感兴趣的特性的多个基因引入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及具有不同转基因的品系的杂交。

种子处理

为了保护和增强产量和性状技术，种子处理选项能够提供附加的作物计划灵活性和对昆虫、杂草和病害的节省成本的控制，从而进一步强化本文描述的发明。能够用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养物质、植株生长调节剂和激活剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物处理种子材料，通常为表面处理。这些化合物通常与制剂领域通常采用的另外的载体、表面活性剂或应用促进性助剂一起被配制。可通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿的或干燥的制剂涂覆来施加包衣。下列文献中提供了可用作种子处理的多种类型的化合物的示例：ThePesticideManual：AWorldCompendium，C.D.S.Tomlin编辑，theBritishCropProductionCouncil出版，该文献以引用方式并入本文。

可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于以下中的一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、氨基三唑、戊环唑、固氮螺菌属、印苦楝子素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌(cereus)、坚强芽孢杆菌(fimus)、巨大芽孢杆菌(megaterium)、短小芽孢杆菌(pumilis)、球形芽孢杆菌(sphaericus)、枯草芽孢杆菌(subtilis)和/或苏云金芽孢杆菌(thuringiensis)中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(包括betae、canariense、埃氏慢生根瘤菌(elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(iriomotense)、大豆慢生根瘤菌(japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(liaoningense)、pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(yuanmingense)中的一种或多种的)、克菌丹、萎锈灵、脱乙酰壳多糖、可尼丁、铜、氰虫酰胺、恶醚唑、土菌灵、氟虫腈、咯菌腈、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮类、脂-壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、PCNB、戊苯吡菌胺、青霉菌、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫苯甲酰胺、S-异丙甲草胺、皂草苷、氟唑环菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双灭多威(thiocarb)、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉属、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种子包衣是指EPA注册号00293500419，包含五氯硝基苯和氯唑灵。TCMTB是指2-(硫氰酸基甲硫基)苯并噻唑。

可对产生具有特定性状(诸如对非生物胁迫诸如盐和干旱的耐受性)的植物的种子进行测试来确定何种种子处理选项和施用速度可辅助该植物来提高收率。例如，具有良好的收率潜能但是为丝黑穗病易感的植物可受益于提供对丝黑穗病的防护的种子处理的使用，具有良好的收率潜能但是为胞囊线虫易感的植物可受益于提供对胞囊线虫的防护的种子处理的使用，诸如此类。此外，由种子处理剂的正确使用造成的良好的根建立和早期出苗可导致更有效的氮利用、更好的耐干旱能力以及当与种子处理剂混合时包含某一性状的一种或多种植物的收率潜力的总体增加。

实施例

提供以下实施例以示出受权利要求书保护的本发明，但本发明不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明的实质或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实施例1

关联作图分析

一百一十株优良的非刚性茎杆(NSS)品系生长于位置1的高土壤盐度位置，并且对幼苗活力以每行为基础进行评分，也称为早期生长(EGRWTH)。在整个玉米基因组的56,000个SNP标记上对品系进行基因分型。然后进行基因组范围的关联作图以鉴定与位置1中早期生长(EGRWTH)表型相关联的标记。将所有受试个体的表型和基因型评分输入到各个关联分析中。

在基于单次减数分裂的基因图谱上染色体1的142.6-156.0cM的区域中鉴别早期生长表型的最显著的峰。该区域内的一种单倍型(本文称为单倍型“A”)与较低的早期生长相关联，在1至9的标度内平均得分为3.8，9为最佳。所有其它单倍型的平均得分为介于6和6.6之间。单倍型“A”为存在于测试组中仅对盐敏感的(不利)单倍型，并且在测试组中45％的品系具有单倍型“A”。表1示出在生长于位置1的110株非刚性茎杆近交体的组中所表示的单倍型平均得分。表2提供示出与耐盐表型连锁不平衡的玉米标记(采用关联作图方法)。估计的IBM2基因图谱位置通过特异性SNP定位于其上的B73BAC上的其它标记的IBM2图谱位置来确定。

表1：各个单倍型的平均EGRWTH得分

单倍型	平均EGRWTH	N＝
			A	3.8	50
B	6.5	24
			C	6.2	20
D	6.0	5
			E	6.5	2
F	6.0	2
			杂项	6.6	7

表2：与盐耐受性显著相关联的玉米标记

标记等位基因和表型独立分离的统计概率反映在表2的关联作图概率值(p值)中，其是从基因型和表型之间的关联分析得出的概率(P)。概率值越低，该基因座处的标记基因型与对盐胁迫条件的耐受性水平之间的关联越显著。

实施例2

使用双单倍体育种群体进行QTL作图

通过使两种优良的非刚性茎杆近交体(本文称为近交体A和近交体B)杂交且与耐盐表型进行对比而产生双亲本作图种群。从该杂交的F₁个体产生179种双单倍体品系。双单倍体群体生长于具有高水平土壤盐度的田间的位置1。收集群体的生长和开花性状数据，包括幼苗活力也称为早期生长(EGRWTH)、花粉释放天数(SHD)、抽丝天数(SLK)、植株高度(PLTHT)和穗高度(EARHT)。EGRWTH性状为早期幼苗健康状态的视觉评分，标度为1至9，9为最佳。在WinQTLCartographer中利用复合区间作图进行QTL作图，并且对于全部五种农学性状观察染色体1的145.1cM至169.6cM上(在基于得自内部的单次减数分裂的基因图谱上)强的QTL。QTL由PHM7351-8和PHM5908-10界定并包括PHM7351-8和PHM5908-1(对于标记信息参见表3)。EGRWTH、SHD、SLK、PLTHT和EARHT性状分别具有44、23、29、29和34的LOD得分。在染色体1上的该QTL处，近交体B包含对盐敏感的单倍型并且群体内的胁迫效应为EGRWTH(-3.2得分)、DAYSHD(+6.8天)、DAYSLK(+9天)、PLTHT(-17.6英寸)，EARHT(-12.3英寸)。较短植物和推迟开花的表型符合对于环境胁迫条件的常见响应。

表3：PHM7351-8和PHM5908-10的标记信息

在高土壤盐度位置(位置1)和平均土壤盐度位置(位置2)两者处评估另外三种双单倍体群体。通过使优良的非刚性茎杆近交体杂交至测试物品系，然后利用所得F₁个体来产生种群大小分别为149、174和40的双单倍体群体，来产生双单倍体群体。优良的非刚性茎杆近交体在染色体1QTL上均包括盐敏感的单倍型，其与位置1的较短植物和开花推迟相关联但是却在位置2具有可忽略的影响(表4)。

表4：在高土壤盐度(位置1)和平均土壤盐度水平(位置2)下三种 双单倍体群体的QTL1的影响

实施例3

不同盐度耐受性形成的早期生长表型

采用从用于实施例1的测试组选择的近交体进行溶液培养研究，以在受控环境中验证待用于染色体1QTL的基于作图的基因克隆的替代测定。选择对位置1的土壤盐度具有不同响应的九种近交体以用于在高盐度溶液培养条件下测试。每种近交体的十株植物在正常条件和100mMNaCl条件下生长四周。四周后，根据1至9的标度对植物进行评分，9为最健康且最大的植物并且1为最小或死亡的植物。对每种近交体的十株植物进行平均化，以给出单个得分(表5)。对位置1的高土壤盐度条件响应的近交体与对溶液培养研究中100mM盐条件响应的近交体之间具有强相关性。具有单倍型A的近交体示出在高盐土壤和溶液培养研究中100mM盐条件两者中幼苗活力均相当小。

表5：在高盐田间条件和高盐溶液培养条件下近交系的比较。

实施例4

QTL在杂交组合中的影响

分离种群的收率数据指出在高盐度土壤条件下QTL对杂交体收率具有影响。近交体AX近交体B群体的179种双单倍体品系顶交为待用于收率测试试验的刚性茎杆测试物。顶交的群体生长在两种高盐位置(本文称为位置3和4)。在两种位置上，具有耐盐单倍型的杂交体品系示出更高的穗高度和植株高度；此外，具有耐盐单倍型的杂交体品系示出位置3和位置4的收率分别增加5.3bu/a和4.0bu/a(表6)。

表6：收率测试实验中QTL1的影响

实施例5

赋予盐度耐受性的基因的克隆

使用基于作图的克隆方法来鉴定和克隆负责盐度耐受性的基因。首先，在QTL上鉴定350个预先存在的双单倍体群体与对比单倍型。使用由4130个双单倍体品系组成的二十四个较大双单倍体群体以用于精细作图和克隆。使用分子标记来鉴定在QTL区间内具有重组事件的双单倍体品系，并且挑选出所选择的重组植物用于表型分析(采用溶液培养评估)和基因分型。在正常条件和100mM盐水溶液两者中使各个品系的十株植物与近交亲本对照一起生长4周。在五轮连续的溶液培养表型分析和基因分型之后，QTL区域被进一步界定为单次减数分裂基因图谱上染色体1的150.96-151.93cM区域。

150-151.6区域中的68SNP的分析显示出单倍型A和B(参见实施例1；表1)看起来产生自共同祖先。然而，具有单倍型“B”的品系是耐盐的，而具有单倍型“A”的品系是对盐敏感的。

该区域的进一步分析鉴定151.27cM处(在单次减数分裂基因图谱上)编码反向转运蛋白/钠离子转运蛋白(SEQIDNO：15和16分别表示基因和蛋白质序列)的基因。针对NCBInr数据库的BLASTP结果示出SEQIDNO：16以99.9％类似于玉米(Zeamays)假定蛋白(NCBIGINo.414869179)。

单倍型“A”在该基因的编码序列(SEQIDNO：15的第3311-3314位核苷酸)中具有4bp缺失，导致编码序列移码，这改变蛋白质的最后78个氨基酸(所得序列通过SEQIDNO：22表示)。其它识别的单倍型不具有此类4-bp缺失。

实施例6

QTL1对耐旱性的影响

进行溶液培养试验研究来估计包含不利单倍型“A”的品系在与包含有利单倍型(例如单倍型“B”)的品系相比时的耐旱性。在自身实验中和在顶交实验(在杂交组合中)中，就早期生长表型而言评估三对近等基因品系(NIL)。在三个自身NIL实验的两个中，观察具有单倍型“A”的品系与具有单倍型“B”的品系之间的显著的差异。也在第三组NIL中观察差异，然而，在统计意义上差异并不显著。表7示出了溶液培养实验的结果。

表7：QTL处的单倍型及其与耐旱性的关联

实施例7

玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因用作转基因来产 生具有提高的盐度和/或干旱耐受性的玉米植物

本文所述玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因还能够作为转基因得到表达，并且允许在不同环境下调控其表达。玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白候选基因可利用其自身启动子进行表达；在水稻肌动蛋白基因(美国专利5,641,876和5,684,239)或F3.7基因(美国专利5,850,018)的启动子之后处于较低水平；在启动子5’非翻译区和玉米泛素基因的内含子之后在整个植物中处于较高水平(Christensen等人，(1989)PlantMol.Biol.12：619-632；Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；或根优选的，在根优选的启动子，例如但不限于玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GINo.1063664)之后处于较低水平。在所选启动子之后的包含转基因的重组DNA构建体可转化到玉米中，如实施例8所述。

实施例8

农杆菌属介导转化玉米和转基因植物的再生

可使用Zhao(美国专利5,981,840以及PCT专利公布WO98/32326)的方法，用如实施例7所述的所选多核苷酸构建体转化玉米。简而言之，可从玉米中分离未成熟胚芽并使胚芽接触农杆菌属悬浮液，其中所述细菌能够将多核苷酸构建体转移到至少一个未成熟胚芽的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在此步骤中将未成熟胚芽浸入农杆菌属悬浮液中用于启动接种。胚芽与农杆菌属共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，未成熟胚芽在固体培养基上培养。紧接着此共培养时期，进行任选的“休眠”步骤。在此休眠步骤中，在至少一种已知抗生素的存在下，培养胚芽以抑制农杆菌属的生长，同时不加入植物转化体的选择剂(步骤3：休眠步骤)。将未成熟胚芽培养在具有抗生素但无选择剂的固体培养基上，用于消除农杆菌属以及用于受感染细胞的休眠阶段。接下来，将接种胚芽在包含选择剂的培养基中培养，并回收生长的经转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。愈伤组织然后再生成植物(步骤5：再生步骤)，并且在选择培养基中生长的愈伤组织在固体培养基中进行培养以再生植物。

实施例9

用TUSC等位基因验证候选基因

在反向转运蛋白候选基因的第一外显子内采用Mu插入获得TUSC品系。使TUSCMu插入物的植物半合子杂交于PH1V6N——具有易感4-bp缺失等位基因的近交体。当PH1V6N在高盐度溶液培养测定中生长时示出易受影响。在该溶液培养盐度测定内，具有4-bp等位基因的近交体的F₁和耐盐品系相比于易感近交体示出提高的盐耐受性。

在高盐度溶液培养测定中，测试半合子TUSC等位基因和PH1V6N的F1子代的盐度易感性(即对盐胁迫的耐受性)。F₁植物在具有100mM的NaCl浓度的改良Hoaglands营养培养基中生长16天，并保持在65℃的恒定温度下。用Mu特异性引物对84株F₁植物进行基因分型以区分包含Mu插入物的植物与Mu-WT植物。在16天后，对各个植物的新鲜生物质以克进行测量。具有Mu插入物的植物显著小于无Mu插入物的植物(表8)。TUSCMu等位基因不能与4-bp缺失等位基因互补，证明其是等位基因。

表8：互补测试结果

	N	平均鲜重(g)	标准偏差	SE
					4-bp等位基因/无Mu插入	49	9.43	2.31	0.33
4-bp等位基因/Mu插入	35	4.11	3.26	0.55

T检验的不同P值＝0.000

实施例10

拟南芥属的转基因验证

使用Atsosl的突变品系(拟南芥基因同系物)对拟南芥属的玉米转运蛋白候选基因进行转基因验证。当突变Atsosl植物在仅有MS的平板上生长时，突变体无法与野生型区分，然而，当Atsosl植物在MS+100mMNaCl平板上生长时，植物示出易感表型。采用耐受性玉米cDNA和具有4-bp缺失的易感玉米cDNA来转化Atsosl突变品系，并且基因经35S启动子过表达。Atsosl/Zm耐受性cDNA植物示出耐受性表型，并且Atsosl/Zm易感cDNA植物示出易感表型。以拟南芥属验证候选基因，原因是具有4-bp缺失等位基因的玉米cDNA不能与Atsosl互补。

实施例11

在100mMNaCl盐度中QTL的影响

进行溶液培养试验研究来估计包含不利单倍型“A”的品系在与包含有利单倍型(例如单倍型“B”)的品系相比时的盐度耐受性。选择三个具有不利单倍型的轮回亲本来产生NIL(接近等基因品系)。使包含有利单倍型的供体品系回交三代至轮回亲本中。然后使NIL自交两代以产生对于有利单倍型纯合的种子和对于不利单倍型纯合的种子。NIL为BC₃F₃品系。三对近等基因品系(NIL)在改良Hoaglands营养培养基中生长7天，然后将其转移至具有100mM的NaCl浓度的改良Hoaglands营养培养基中以再生长21天。对各个植物的新鲜生物质以克进行测量。在全部三对NIL中，观察具有单倍型“A”的品系与具有单倍型“B”的品系之间的显著的差异。

表9：QTL处的单倍型及其与盐度耐受性的关联

实施例12

直系同源序列的鉴定

用BLAST和分子系统发育分析来鉴定玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白(SEQIDNO：16；NCBIGINo.414869179)的直系同源序列。分析显示出玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白类似于来自以下的多肽：高粱(Sorghumbicolor)(Sb08g023290.1；SEQIDNO：17)，水稻(Oryzasativa)(Os12g44360.1；SEQIDNO：18)、大豆(Glycinemax)(Glyma08g09730.1；SEQIDNO：19)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)(At2g01980(SEQIDNO：20)和At1g14660(SEQIDNO：21))。这些关于玉米(Zeamays)反向转运蛋白/钠离子转运蛋白(SEQIDNO：16)的多肽序列的多重序列对比示出于图1A-1H中。图2显示了图1A-1H中显示的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。用生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序进行图序列比对和同一性百分比计算。用ClustalV比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对，采用默认参数(GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝10)。使用Clustal方法采用以下逐对比对的默认参数：KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5、DIAGONALSSAVED＝5。

可将编码任何直系同源多肽的多核苷酸序列引入重组DNA构建体，然后其可采用本领域的普通技术人员已知的标准技术来用于转化植物，从而提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

Claims (23)

1.一种鉴定具有降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物的方法，

所述方法包括：

a.在玉米植物中检测与降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的QTL等位基因，其中所述QTL等位基因在反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因中SEQIDNO：15的3311-3314位核苷酸处包括4bp的缺失；以及

b.鉴定所述玉米植物具有所述4bp缺失，其中所述玉米植物具有降低的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括从育种程序中反选择所述玉米植物。

3.一种鉴定具有对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米植物的方法，所述方法包括：

a.在玉米植物的基因组中检测以下中的任一项：

i.编码具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

ii.编码具有与SEQIDNO：16的至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述多肽具有反向转运蛋白/钠离子转运蛋白活性；或

iii.在(i)或(ii)的5cM内的一个或多个标记等位基因，其与(i)或(ii)连锁并关联；以及

b.如果检测出(i)、(ii)或(iii)中的任一项，则鉴定玉米植物对盐胁迫和/或干旱具有耐受性。

4.一种提高植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性的方法，所述方法包括：

(a)在植物中表达编码多肽的重组多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法，当与SEQIDNO：16、17、18、19、20或21进行比较时具有至少80％的序列同一性；以及

(b)在与不包含所述重组多核苷酸的对照植物进行比较时，增大植物对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括：

(c)获得来源于表达所述重组多核苷酸的植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组多核苷酸，并且在与不包含所述重组多核苷酸的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。

9.一种鉴定赋予植物提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.通过基因改组组合一个或多个核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQIDNO：16、17、18、19、20或21中的一个或多个片段，或者与SEQIDNO：16、17、18、19、20或21或它们的片段具有至少80％同一性的蛋白质，以产生玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体；以及

b.鉴定表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性的变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

a.将重组构建体引入可再生的植物细胞中，所述重组构建体包含通过根据权利要求9所述的方法鉴定的所述玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的变体；

b.在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

c.选择(b)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

12.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。

14.一种鉴定玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的等位变体的方法，其中所述等位变体与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联，所述方法包括以下步骤：

a.获得玉米植物种群，其中所述玉米植物表现出不同水平的耐盐性和/或耐旱性；

b.针对编码包含SEQIDNO：16、17、18、19、20、21或22的蛋白质的多核苷酸序列，或在调控编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估等位变体；

c.使等位变体与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联；以及

d.鉴定与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的等位变体。

15.根据权利要求14所述的方法，还包括检测与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联的所述等位变体，以及如果检测出所述等位变体则选择玉米植物。

16.一种引入玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因的等位变体的方法，其中所述等位变体与提高的对盐胁迫和/或干旱的耐受性相关联，所述方法包括利用锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或大范围核酸酶将突变引入内源性玉米反向转运蛋白/钠离子转运蛋白基因，使得所述等位变体包含编码与SEQIDNO：16、17、18、19、20、21或22具有至少80％同一性的蛋白质的多核苷酸序列。

17.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于ClustalV比对方法在与SEQIDNO：16、17、18、19、20、或21进行比较时具有至少80％的序列同一性。

18.根据权利要求17所述的重组DNA构建体，其中所述至少一种调控序列在植物细胞中有启动子功能。

19.一种包含根据权利要求17所述的重组DNA构建体的转基因植物细胞。

20.一种包含根据权利要求19所述的转基因植物细胞的转基因植物。

21.根据权利要求20所述的转基因植物，其中所述转基因植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

22.一种由根据权利要求21所述的转基因植物产生的转基因种子。

23.根据权利要求1-5、9-10和14-16中任一项所述的方法，其中所述盐胁迫包括具有至少约2dS/m的电导率的土壤。