CN112877456B

CN112877456B - 一种玉米耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记及应用

Info

Publication number: CN112877456B
Application number: CN202110139817.7A
Authority: CN
Inventors: 景海春; 郝怀庆; 刘丽丽
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112877456A

Abstract

本发明公开了一种提高玉米耐旱持绿和磷再动员能力的遗传位点qstg_chr9及其优势单倍型与应用。所述遗传位点位于玉米9号染色体上，其包含的三个基因的不同等位基因组合形成了该位点主要的三种单倍型，鉴定具有耐旱持绿和高效磷再动员能力的优势单倍型的分子标记为Marker1和Marker2。本发明可以应用于分子标记辅助育种，以有效应对作物所面临的“衰老困境”，即衰老过程中持绿和营养转运间的权衡，从而最大程度上实现光合作用和营养转运的效率，提高作物产量及耐旱性。

Description

一种玉米耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记及应用

技术领域

本发明属于作物分子育种领域，具体涉及一种基于GWAS和单倍型分析的调控玉米耐旱持绿和磷再动员的遗传位点qstg_chr9、基因、优势单倍型相关的分子标记及它们的应用。

背景技术

玉米(Zea mays)隶属禾本科玉米属(Zea)，是全球三大粮食作物之一，也是重要的动物饲料、工业原料及能源作物，目前其产量已经超过小麦和水稻而位居第一。随着全球人口的增加、人民生活水平的提高及畜牧业的不断壮大，玉米的工业价值将被不断发现，据联合国粮食及农业组织估计，到2050年全球粮食产量需要在目前的基础上再增加70％才能满足人类的需求，其中约一半的增长需求将来自于玉米产量的提高(Jiang S,Cheng Q,YanJ,Fu R,Wang X.Genome optimization for improvement of maizebreeding.Theoretical and Applied Genetics,2020,133:1491-1502)。而干旱是限制玉米生产的主要限制性因素，在玉米的整个生育期中，抽雄前1周到抽丝后2周对水分最为敏感，此时遭受干旱胁迫，将会导致花发育受到强烈抑制、受精结实率降低、叶片快速衰老、最终影响籽粒灌浆过程，导致产量下降甚至绝产(Blum A.Crop responses to drought andthe interpretation of adaptation.Plant Growth Regulation,1996,20:135-148；

M,Edmeades GO,Beck DL,Bellón MR.Breeding for drought and nitrogenstress tolerance in maize:from theory to practice.Cimmyt,2000；Bruce WB,Edmeades GO,Barker TC.Molecular and physiological approaches to maizeimprovement for drought tolerance.Journal of Experimental Botany,2002,53:13-25；Lopes MS,Araus JL,Van Heerden PD,Foyer CH.Enhancing drought tolerance inC4 crops.Journal of Experimental Botany,2011,62:3135-3153；Fang Y,XiongL.General mechanisms of drought response and their application in droughtresistance improvement in plants.Cellular and Molecular Life Sciences,2015,72:673-689；Ullah A,Sun H,Yang X,Zhang X.Drought coping strategies in cotton:increased crop per drop.Plant Biotechnology Journal,2017,15:271-284)。由于花期受干旱胁迫直接影响玉米的产量，因此开展玉米花后期耐旱性的研究具有非常重要的意义。

持绿作为一个重要的表型性状，与玉米开花后的耐旱适应性和产量密切相关。在玉米遗传改良过程中，持绿一直被作为一个延长有效光合作用时间的重要性状被选育。研究表明，过去几十年中通过持绿选育玉米杂交种，使得其产量提高了60％(Lee EA,Tollenaar M.Physiological basis of successful breeding strategies for maizegrain yield.Crop Science,2007,47:S-202-S-215)。相比于应用的超前，玉米持绿分子基础的研究相对滞后，其分子调控机制仍然不清晰。持绿是由多基因控制的复杂数量性状，其受环境的影响很大，尤其干旱胁迫。目前，主要通过利用遗传群进行QTL定位的方法对调控玉米持绿的位点进行挖掘，鉴于传统QTL定位法具有周期长和分辨率低的特点，虽然已经在玉米的10条染色上获得了大量的QTL，但是只有少数的主效位点和基因被挖掘，限制了在分子水平上推动耐旱持绿和高产玉米新品种的选育。

发明内容

本发明利用基于GWAS和优势单倍型鉴定的方法，在9号染色体上挖掘到一个调控耐旱持绿的重要新位点，并开发了优势单倍型相关的分子标记，旨在为耐旱高产玉米新品种的选育提供重要的分子基础。

本发明第一个发明目的是：提供一个调控玉米耐旱持绿的位点qstg_chr9、相关基因及鉴定该位点优势单倍型的分子标记，所述优势单倍型的表达会促使玉米的耐旱持绿性和磷再动员能力显著提高；

本发明采用如下技术方案：

1)qstg_chr9所示的遗传位点位于玉米9号染色体上，其与玉米的耐旱持绿性显著相关，可以解释4％的表型变异，该位点包含三个基因ZmVPP1(Wang X,Wang H,Liu S,Ferjani A,Li J,Yan J,Yang X,Qin F.Genetic variation in ZmVPP1 contributes todrought tolerance in maize seedlings.Nature Genetics,2016,48:1233)，Zm00001d046592(如SEQ ID No.5所示)和ZmPAP26(González-

E,

-VázquezAO,Montes RA,de Folter S,Andrés-Hernández L,Abreu-Goodger C,Sawers RJ.Themaize(Zea mays ssp.mays var.B73)genome encodes 33members of the purple acidphosphatase family.Frontiers in Plant Science.2015,6:341)，它们都包含两种主要的等位基因；

2)三个基因的不同等位基因组合形成该位点的三种单倍型；

3)鉴定qstg_chr9位点的优势单倍型的分子标记为Marker1和Marker2，各分子标记的引物序列及在优势单倍型中扩增的目的条带长度如下：

Marker1

SEQ ID N0.1：GCCTATGGTCCTATCAGT，

SEQ ID N0.2：CACTCTTCATTGTCATCGC，

Marker2

SEQ ID N0.3：CCAATTGCACGCACCTTATCACAAAC，

SEQ ID N0.4：CGCGTCAAGATCGATGGTAAGTGAT。

Marker1的正向引物序列为SEQ ID N0.1，反向引物序列为SEQ ID N0.2，在优势单倍型中可扩增出长度为560bp的DNA片段；Marker2的正向引物序列为SEQ ID N0.3，反向引物序列为SEQ ID N0.4，在优势单倍型中可扩增出长度为635bp的DNA片段。

4)优势单倍型的表达会促使玉米的耐旱持绿性和磷再动员能力显著提高。

本发明第二个发明目的是：提供位点qstg_chr9优势单倍型及其相关的分子标记在作物中的应用；

在一个技术方案中，所述鉴定位点qstg_chr9的优势单倍型的分子标记在鉴定、筛选耐旱持绿和高效磷再动员的玉米种质资源中的应用；

在一个技术方案中，所述位点qstg_chr9的优势单倍型用于通过转基因(将位点qstg_chr9的优势单倍型，即ZmVPP1^allele1_Zm00001d046592^allele2_ZmPAP26^allel2通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系转入受体玉米品系中)或分子标记辅助育种选育耐旱持绿和高效磷再动员能力的作物新品种的应用；

在一个具体的实施方案中，所述作物包括但不限于高粱、玉米、水稻、谷子及二穗短柄草。

本发明第三个发明目的是：提供了一种在其它植物中获取位点qstg_chr9及相关基因的共线性位点或同源基因的方法及应用。即通过共线性分析及同源基因比对，找到其它植物中的该位点的共线性位点及相关基因的同源基因。

本发明的有益效果是：本发明提供的遗传位点qstg_chr9参与玉米的耐旱持绿和磷再动员过程，该位点优势单倍型的表达，使得玉米的耐旱性和产量显著提高，为作物生长后期所面临的持绿与营养转运间存在“衰老困境”提供有效的解决途径。通过分子标记辅助育种等植物生物技术途径，本发明将在选育耐旱和高产优质作物种质资源中发挥重大作用。

术语定义：

术语“棒三叶”指包裹玉米雌穗的一片叶及其上下的各一片叶，这三片叶称作玉米的棒三叶，棒三叶为玉米的重要功能叶，其光合作用产生的碳水化合物是玉米雌穗发育的主要能量及营养物质来源。

术语“持绿度”指绿色叶面积所占总叶面积的比例。具体调查及计算方式为：将每片叶的绿色面积所占整片叶面积的比例按照0％、10％、25％、50％、75％、90％、100％共七个等级划分，数据采集后计算棒三叶绿叶面积或整株绿叶面积占棒三叶或总叶面积的比例即棒三叶持绿度(Three-Ear-Leaves Stay-Green Degree,ESGD)或整株持绿度(Whole-Plant Stay-Green Degree,WSGD)。

术语“磷吸收效率”指叶片衰老过程中叶片中的磷再动员效率，计算方式为：磷吸收效率(％)＝[[(第0天的叶片总磷含量－干旱处理30天后的叶片总磷含量)]/第0天的叶片总磷含量]×100％。第0天指抽雄前一周的时期，也是干旱处理的第0天。

附图说明：

图1为39,693个SNPs在玉米10条染色体上的分布。

其中，不同的颜色反映1Mb窗口内的SNP数量。

图2为243份玉米自交系的系统进化树。

其中不同颜色的树枝分别代表五个杂种优势群：颜色由浅到深(由右上顺时针到左上)分别为唐四平头(Tang SiPingTou,TSPT)，瑞德(Reid)，兰卡斯特(Lancaster,Lan)，旅大红骨(LvDa Red Cob,LRC)，P群(P Group,PG)。

图3为目的位点qstg_chr9及基因的分析。

其中(a)干旱处理条件下持绿表型ESGD2(GS16)的GWAS结果，包括曼哈顿图(左)和相应的QQ-plot图(右)。虚线表示显著性阈值，设置为0.05/n(n指关联分析所用的SNPs数目＝39,693)。(b)9号染色体上显著性位点qstg_chr9所在的连锁不平衡区块以及区块内包含基因的模式图，LD区块上的每个横向灰色箭头代表此区域内的一个基因。

图4为位点qstg_chr9内三个基因的序列变异分析。

其中基因ZmVPP1(a)、Zm00001d046592(b)和ZmPAP26(c)在野生种mexicana和不同品系中的序列变异。ATG右侧的黑色和灰色方框分别表示外显子和3’非翻译区，左侧的阴影方框表示启动子区的序列插入，在方框下方或上方标出每个插入与缺失(Insertion andDeletions,InDels)或获得与缺失(Presence and Absens Variatons,PAVs)变异的大小。在ZmVPP1中，等位基因ZmVPP1^Allele2启动子区-2476bp到-1043bp的序列被分割成三个片段，这三个片段位于另一等位基因ZmVPP1 ^Allele1的-33kb上游。ZmPAP26编码区序列的第855bp和2037bp位置上发生了非同义突变。

图5为位点qstg_chr9的单倍型分析。

其中(a)三个基因的不同等位基因组合成位点qstg_chr9的三种主要单倍型。每种单倍型中不同颜色及花色的箭头框分别表示三个基因各自的等位基因。(b)干旱条件下不同单倍型品系间的表型差异分析。WSGD2和ESGD2，第30天的整株和棒三叶持绿度；EH，穗位高；PH，株高；HKW，百粒重；EW，穗重；GS16，甘肃2016年的田间试验；BLUPs，最佳线性无偏预测值。误差线代表±标准误差；箱线图上的字母代表干旱处理30天后不同表型在不同单倍型间的差异分析结果，显著性水平为P<0.05。

图6为不同单倍型品系中各基因的表达模式分析。

实验材料包括正常浇水和干旱处理条件下的自交系。每种单倍型选取四个自交系，每个自交系进行三个单株的穗位叶取材。每个样品做3次重复，数值表示平均值±标准误差。柱状图上的字母代表相应处理条件下不同单倍型间相对表达量的差异分析结果，显著性水平为P<0.05。WW，正常浇水处理；DS，干旱处理。

图7为干旱条件下不同单倍型品系中的磷动员分析。

其中(a)不同单倍型品系在0天和第30天叶片中自由Pi和有机Po的含量。每种单倍型选取6-20个不等的自交系，每个自交系进行三个单株的第0天和第30天的穗位叶取材，数值表示平均值±标准误差，显著性为P<0.05。FW，鲜重。(b)不同单倍型品系中磷的吸收效率。**，P<0.01；***，P<0.001。

图8为利用分子标记Marker1和Marker2鉴定优势单倍型HapⅢ。

其中(a)Marker1在优势单倍型HapⅢ材料中的扩增长度为560bp，比其另外一种等位基因多133bp的InDel插入，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。(b)Marker2在优势单倍型HapⅢ材料中的扩增长度为635bp，比其另外一种等位基因缺失8bp的InDel，利用Sanger测序鉴定。

Marker1对应的是持绿耐旱性，Marker2对应的是高效磷动员能力，在HapⅢ和HapI中Marker1扩增的片段都为560bp，在HapⅢ和HapII中Marker2扩增的片段都为635bp，因此在鉴定、筛选、选育HapⅢ时要求这两个marker同时使用，只有当Marker1扩增出560bp且Marker2扩增出635bp时对应的单倍型才是HapⅢ。

图9为位点qstg_chr9的保守性分析。

其中(a)在不同粮食作物中的共线性分析。图上的每个灰色散点代表一个同源基因对，两直线的交叉点表示目标分子模块所在区域。(b)不同粮食作物中位点qstg_chr9周围的共线性区域。玉米中的ZmVPP1、Zm00001d046592和ZmPAP26以及它们在其他作物中的同源基因位置在图中已标识出来。阴影区域相连的为保守基因。15kb的横线表示水稻、二穗短柄草、高粱及谷子中的标尺，30kb的横线表示玉米中的标尺。

具体实施方式

下面结合具体实施例做进一步的阐明，便于更好地理解本发明。下述实施例中所用方法、技术和科学术语如无特别说明均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。以下示例不以任何形式限定本发明。

实施例(一)自交系材料的基因型信息获取及其持绿表型数据调查

1.供试材料

243份具有丰富地理来源及遗传背景的自交系材料。

2.自交系材料的基因型鉴定

利用玉米56K MaizeSNP50 BeadChip对243份玉米自交系材料进行基因型鉴定，将原始数据进行过滤(缺失率<20％、最小等位基因频率>0.03、杂合率<30％)后获得高质量的39,693个SNPs，这些SNPs相对均匀的分布于玉米的10条染色体上(图1)。

3.构建进化树

通过SNPhylo pipeline利用这39,693个SNPs构建进化树，结果发现243份材料分为五大亚群(图2)，这些亚群将是构建杂交群体及杂交种选取亲本材料的重要依据。

4.表型调查和分析

将243份玉米自交系材料在田间进行连续三年两地(甘肃金塔县和内蒙巴彦淖尔临河区)共三个环境的种植。从抽雄前一周开始进行干旱处理，处理30天后恢复浇水。对干旱处理30天后的持绿表型进行调查，持绿表型包括玉米整株的持绿度WSGD和棒三叶的持绿度ESGD。结果显示，两者均表现出显著的表型变异，变异系数分别为0.62和0.69，其中整株的持绿度平均值为0.37(0.00-0.90)，棒三叶的持绿度平均值为0.59(0.00-0.10)(表1)。

表1.自交系群体的持绿表型的统计描述

实施例(二)qstg_chr9位点的定位及基因变异分析

1.利用39,693个SNPs和上述持绿表型进行GWAS关联分析，所采用的模型为FarmCPU(PCA+Kinship)，选取最高的五个主成分和亲缘关系作为协变量控制群体结构。在9号染色体上鉴定到一个重要的持绿位点，其可以解释4％的表型变异(图3)。进一步通过连锁不平衡(Linkage Disequilibrium,LD)区块分析发现，该位点与基因ZmVPP1，Zm00001d046592和ZmPAP26紧密连锁(图3)。其中，ZmVPP1编码一个液泡型H⁺焦磷酸化酶(Vacuolar-type H⁺-Pyrophosphatase)，其可以生成跨液泡膜的H⁺梯度并维持液泡中的酸度，从而提高对非生物胁迫的耐受力，也具有延缓叶片衰老的功能(Sun X,Qi W,Yue Y,Ling H,Wang G,Song R.Maize ZmVPP5 is a truncated Vacuole H⁺-PPase thatconfers hypersensitivity to salt stress.Journal of Integrative Plant Biology,2016,58:518-528；Wang X,Wang H,Liu S,Ferjani A,Li J,Yan J,Yang X,Qin F.Geneticvariation in ZmVPP1 contributes to drought tolerance in maizeseedlings.Nature Genetics,2016,48:1233)。ZmPAP26编码一个紫色酸性磷酸酶(PurpleAcid Phosphatase,PAPase)(González-

E,

-Vázquez AO,Montes RA,deFolter S,Andrés-Hernández L,Abreu-Goodger C,Sawers RJ.The maize(Zea maysssp.mays var.B73)genome encodes 33members of the purple acid phosphatasefamily.Frontiers in Plant Science.2015,6:341)，PAPase参与液泡和细胞外的磷循环过程。而Zm00001d046592(如SEQ ID No.5所示)可能通过参与生长素信号途径介导植物体内的磷稳态(Wang S,Zhang S,Sun C,Xu Y,Chen Y,Yu C,Qian Q,Jiang D,Qi Y.Auxinresponse factor(OsARF12),a novel regulator for phosphate homeostasis in rice(Oryza sativa).New Phytologist,2013,201:91-103)。

2.为了分析候选区段中这三个基因的遗传变异情况，在挑选的97份具有代表性的玉米自交系材料中对这三个基因进行Sanger测序，包括启动子区(ATG上游2.5 kb-3.0kb)、基因区和3’非翻译区，测序引物见表2。分析发现三个基因编码区的变异几乎都是同义突变，同时在它们的启动子区都发现了重要的结构变异，进一步对启动子区的这些重要结构变异分析发现，三个基因均包含两种主要的等位基因(alleles)(图4)。

表2.三个基因的扩增引物

实施例(三)qstg_chr9位点的单倍型分析

1.对上述三个基因的不同等位基因间的组合进行分析发现，该位点包含三种主要的单倍型：HapⅠ(ZmVPP1^allele1_Zm00001d046592^allele1_ZmPAP26^allele1)、HapⅡ(ZmVPP1^allele2_Zm00001d046592^allele2_ZmPAP26^allele2)和HapⅢ(ZmVPP1^allele1_Zm00001d046592^allele2_ZmPAP26^allele2)(图5中a)。在测序的97个自交系中，其中39个属于HapⅠ，51个为HapⅡ，7个为HapⅢ。对干旱条件下的持绿表型分析发现，HapⅢ品系的持绿度(WSGD和ESGD)显著高于HapⅠ和HapⅡ的品系，且HapⅠ品系的持绿度也显著高于HapⅡ的品系(图5中b)。此外，HapⅢ品系的产量显著高于HapⅠ和HapⅡ品系，其株高也表现优异。因此将HapⅢ定义为位点qstg_chr9的优势单倍型。

实施例(四)qstg_chr9位点内基因的表达分析

对不同单倍型材料中的三个基因分别进行实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)表达分析，材料取自三个时期，分别为抽雄前一周的第0天，第15天和第30天，每个株系选取三个单株的穗位叶提取总RNA。qRT-PCR以ZmActin基因作为内参报告基因，引物qPCR1_F(5'-TATTCCTATGCGTGGCAGTT-3')和qPCR1_R(5'-AGGCCAAAGATGACATTCGTA-3')，qPCR2_F(5'-CATGAGTGAGAAGGGCTATGGTCT-3')和qPCR2__R(5'-AGATGAGTTCCAGCTGGCACGTTG-3')，及qPCR3_F(5'-CATCTGCTCACATCATCGTG-3')和qPCR3__R(5'-GCATGAGAACGATAAGCCAG-3')用于在qRT-PCR反应中分别检测基因ZmVPP1、Zm00001d046592和ZmPAP26的表达，引物Actin_F(5'-CATGGAGAAAATCTGGCATCACAC-3')和Actin_R(5'-CTGCGTCATTTTCTCTCTGTTGGC-3')用于检测ZmActin基因的表达。qRT-PCR中每个样品的三个基因和ZmActin基因的PCR反应均设置3个独立重复试验。

qRT-PCR结果分析显示，每个单倍型中的每个基因在正常浇水和干旱处理条件下具有相似的表达模式(图6)。在高度持绿的HapⅢ材料中，三个基因都持续上调表达；在中度持绿的HapⅠ材料中，ZmVPP1在30天中持续上调表达，而ZmPAP26和Zm00001d046592的表达水平却相对较低，且在整个30天中都维持在同一水平；在非持绿单倍型HapⅡ材料中，ZmVPP1的表达水平却相对较弱，而ZmPAP26和Zm00001d046592在整个叶片衰老过程中呈现显著的上调表达。(图6)。这些结果表明，ZmVPP1是持绿的正响应因子，其表达水平的增加显著提高了玉米品系的耐旱持绿系。

实施例(五)不同单倍型材料的磷再动员能力分析

对三种单倍型材料的叶片磷含量进行测定，每个品系选取三个单株采集穗位叶。分别测定总磷和自由磷的含量，结果显示，高度持绿的HapⅢ和非持绿的HapⅡ材料中的自由Pi/有机Po含量的比例及磷吸收效率显著高于中度持绿的HapⅠ材料(图7)。表明ZmPAP26和Zm00001d046592的表达与磷的再动员呈显著正相关。(Zm00001d046592和ZmPAP26为两个很近的基因，它们方向相反，两个基因ATGs之间仅有317bp，这两个基因呈现高度连锁，被看作是共同调控磷再动员的一个分子模块，且这两个基因具有相似的表达模式，其表达与磷的再动员为正相关关系)

实施例(六)鉴定优势单倍型的分子标记开发

由以上实施例分析表明，位点qstg_chr9的优势单倍型HapⅢ既可以提高玉米自交系的耐旱持绿性，同时其具有较高的磷再动员效率，是选育耐旱高产优质玉米种质资源的重要遗传位点。因此开发了鉴定和筛选此单倍型的分子标记Marker1和Marker2，各分子标记的引物序列及在优势单倍型中扩增的目的条带长度如下：

Marker1的正向引物序列为SEQ ID N0.1，反向引物序列为SEQ ID N0.2，在优势单倍型中可扩增出的长度为560bp的DNA片段(图8中a)；

Marker2的正向引物序列为SEQ ID N0.3，反向引物序列为SEQ ID N0.4，在优势单倍型中可扩增出的长度为635bp的DNA片段(图8中b)。

这两个标记对应三个基因，其中Marker1对应ZmVPP1，Marker2对应Zm00001d046592和ZmPAP26，Marker2位于Zm00001d046592的基因区，位于ZmPAP26的启动子区。鉴定和筛选优势单倍型时，Marker1和Marker2需要同时进行分型。首先利用这两个markers对涉及到的样品进行单倍型鉴定，分析结果为这些样品中共有三种单倍型，三种单倍型的表型分析表明HapⅠ材料为中度持绿品系、HapⅡ材料为非持绿的品系、HapⅢ材料为高度持绿的品系，且不同单倍型间的株高和籽粒产量也具有差异。

实验结果表明，能同时扩增出560bp的DNA片段和635bp的DNA片段的单倍型，与表型分析的HapⅢ材料相符，可用于优势单倍型的筛选或鉴定。

实施例(七)位点qstg_chr9及相关的三个基因在玉米、高粱、水稻、谷子和二穗短柄草中的共线性区域及同源基因的分析

利用共线性分析，获得了位点在玉米、高粱、水稻、谷子和二穗短柄草中的共线性区域(图9中a)。利用ZmVPP1，Zm00001d046592和ZmPAP26基因的蛋白质序列，通过blastp获得了该基因在玉米、高粱、水稻、谷子和二穗短柄草中的直系同源基因。高粱中的三个同源基因分别为Sobic.010G205500、Sobic.010G205300和Sobic.010G205200；水稻中的同源基因分别为Os06g0644200、Os06g0644100和Os06g0643900；谷子中的同源基因分别为Seita.4G201600、Seita.4G201800和Seita.4G201900；二穗短柄草中的同源基因分别为Bradi1g30550、Bradi1g30540和Bradi1g30527，不同作物中的同源基因与玉米中的三个基因具有相似的排列方式(图9中b)。

实验表明，在其他植物中找到了目标位点的共线性区域及相关基因的同源基因，表明本发明的方法可以应用在其它作物中的耐旱持绿和磷再动员的研究中。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 一种玉米耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记及应用

<141> 2021-02-02

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctatggtc ctatcagt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactcttcat tgtcatcgc 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaattgcac gcaccttatc acaaac 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgtcaaga tcgatggtaa gtgat 25

<210> 5

<211> 4539

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

aaaccgaacc gaagtgcaac catccgtcac atcacaaacc gaaaaaggcc gcgacgagcc 60

gaccagctct actgccccct tccggccttc ggcgaccgtg acgagcaacg acgaccacgg 120

cgacgatggc cgcttcctcc ctctgccacg ggcacttgct cctgtttctc ctcgtgtccg 180

tcacatcggc ctgcctcggt accgcggcag cgcatcaagc cgggtaggtg tccctgtcct 240

tcacctacgc tcgttccgtg atccgatcgg ccggatgctt tgctgaccgc tctcccgatt 300

tggcgcttgt cgttggtggc tctaggtctg gagagggtta cacgatcgcc ggccgcgtca 360

agatcgatgg taagtgatcc agctcccact gcctaggttt gcatcgttta gggattgtat 420

aagtgtcact cagttctaaa ttagttgctc ctgatgttgc tctggggtat atcttttgca 480

agtttcgatt tagtgctctt tttggttgct ggatatgcct gtattttgtg tggatttcaa 540

acaattcatt catgtaacta aagctgccta ttgaagcagt tttgattgct aggaaattag 600

aggtatgcaa gcatttactg aatgttgaac tgacgcaaat tgatgagagc ccggctgctt 660

gttggtttta ggatcatcca tggtaaatga ttttgtgaag ttttaactaa acttatagct 720

tgcaaactta agtacagccc tgaattgtgc aagtgtgtgt gtgcttttcc tgttctctgg 780

tgtttaatgc aaactaaaat gaatcagcag ctgtgttctg tccgaaaaaa ggggagtata 840

cagatgtaga aattctgttg ttgatatttt gatttctgct aatgtcagtg tagtaaccta 900

atgaatttgc aagaagatct ttcttttatg atagaatgat gccatgccag catggtttgt 960

gataaggtgc gtgcaattgg aggggctctg atatgttttt gtctggcttc tgtctctcca 1020

caccactaaa ctagttttct tgatttgtgg atatccgcgt tgctacgatg ttctgatcaa 1080

tgcttctgaa atggtttgta tgtgtgttgt tccctgagag tactcttagc ttatggatat 1140

agttatggga tttacagtga atgatttgtt aatttaggtt tattgcacct tgaagcatgc 1200

ttgaaaccta aatttcaagc tgaaagctac tatcacatgc tgtccatctg atgttatata 1260

tgtgctatgg ctataggcat gagtgagaag ggctatggtc ttccagccaa gacatcaaac 1320

acaaaagtga tacttaatgg cggccaaagg gttacatttg ccaggccaga cggctacttt 1380

gcattgtatc ctacaaatga ttcattaccg taagtttcaa gtttattttc cattttctag 1440

caaatccaca tgtgttacac tggtatggct catgctatca tacctatgtt ttcaagtcgc 1500

ccgactaatc gtgattagtc aggtgggttg gttttgggtg gccgatcagg gcaggccgat 1560

taggacacct gatcaccctg gccgtttgac cagttgacga ctagcgacga ttagtcgatc 1620

gatcaggagc ttctatccga ccagggttcg ccgcctgtca aattttcgtg ggcttctttt 1680

ggcaggccat gatcgtgtat ggtctgatta tgtgtcttcc atgttgttct aaacctatat 1740

ctgtttatga tcatgtatgg tctgaaatta tgtcttccat gttcctttaa acctctcttc 1800

aacgcctgca ttactttagg gtcattgggg agctactgtt ttcagttgga tgaacaaata 1860

tcttctctta aatcagtatt ccagaattcg cgaaagggcc tctagtgaat tggttaggtg 1920

gtctgggtag cactcctcag gtcataggtt cgacttcccg tgggagcgaa tttcaggctg 1980

tggttaaaaa aaatcccctc gtctgtccca cgccaaagca taggtctaag gctcggcctc 2040

ggtcgcggtc gttctcacat gggcttcgat gccgctgtgt atgggtgggg taggggtttg 2100

ggggttttct cgacctgtgt gagaaggtct tcttaataca atactcgggg gctgtcttac 2160

cccccgcagg tcgagtattg cagaattcat gtcatatgga ctagtggatg actagggtcg 2220

accagaggtc gattagtcga cctagtcgtc gactaatcac gattagttgc ctggtcgctc 2280

aaccagaaaa catagtatca tacatttatc catctgttgc tgataaaatt taccaagcaa 2340

agaagctgta gctctcatca tgtgcatacc attaattctt gtctactctt ggttatatat 2400

ttccttgtat ataaccatag ttcggtctta gcagatctca atatttgctt tattgttgct 2460

ccttgacctg atatacttta gccacaacgt gccagctgga actcatctga ttgaggtctc 2520

ctcaattggt tacttctttt cccctgtaag tatttattac acttgatttt gttggtaagg 2580

tgaatggaaa ttgatatgag taatttactc catatttctg atgcatgata ggtccgagtt 2640

gatataagtg caaggaatcc tggatatatt caagcagcat tgactgaaac cagaagggtt 2700

ctgaatgagc ttgttctgga acctctgaaa gaagagcagt actatgaggt aatggctata 2760

taactttttg tatacttgtt tcctcacttc tcactggtag ctcatgttga gtttgaccca 2820

aacttggtta tgcttggggc taaaaggctt cgttattgtt attgtgtttc ttcacttcgt 2880

gcttttgata agtattatga aagcaacctc gttaaatgtt ctccttttca accttttcaa 2940

ggttagggag ccgttctcca tcatgtcact tttgaagagc cccatggggt taatggttgg 3000

ttttatggtc ttaatggtct ttgtgatgcc caagatgatg gagaacatag gtatatttca 3060

cctcttttac atcgaatgga tacaagcttt cagttattat gtttcactaa agcttgcaac 3120

tagcaaacag cagcttctac gagcagtgtt gcatgataca atggtagagt ttagttctat 3180

ttactgagct ctgtgcaaca gctgactttc aaatttctag agcaagcaag gcatcaagtc 3240

aattagtttg aactgttgca cttctggatt tcttggttat aatgtgtcct ttctgtattt 3300

attaatgaga tgggctttaa ataatgtttt agtgatgatt ttcttaacta aaatttctta 3360

tgtttgtact atttatatta tacctgttga acacattatt tatatttagt tcattgttat 3420

ctacaaccta tgcttctaaa ttgtcttgat tgtttcatct taaaatttga atacagtaag 3480

ttgacaatgt tggcatctcc caaattcact tgagagaaac tttagagtac tgttttttcc 3540

tatcctatca gctgttggcc tcatgatgta cttgtcatca ttgattgcat gtgccctcta 3600

gagcttgtag aacggttcta tgtagataac cttttttagt tattgattgt ggtgggtttt 3660

agttatagtt agggtgtgtt tggcatggct ctgctccacc ccagagcagc tctactctaa 3720

aactctgggt ggagcagctc tgctccagag tttagattgt ttctcataac cagtggcaat 3780

ggcgggtaaa taactcaaaa ctccatgact aggttgcttt tttggagttt tcagagcagc 3840

aaaagaggta ctccaaaaaa ttgtactgca gctccaaaaa ctccatagag tttacaactc 3900

tggagttagg gtgtttggca tgctctggcc agctcctcct tggagttttg ctctggagcc 3960

atgtcaaaca ggcccttaat gctgcctgga agtacagctg cacttcaatt gcgtagtctt 4020

cttcagcatt tgaaatgcta atattgattt catttatata cctgcctaac tgaatttact 4080

ttgtgatgga agatcccgag gagatgaagc aagctcaaga acaaatgagg aacaaccctg 4140

tatcattctc tggcttgctc gccagagcgc agggctagag aagtagactg tagacatgag 4200

gatactgcaa aggtcaaaca ttctagaatg tgagtaagag cactattaaa gtgcttggca 4260

cgtcactcac tcggggcaat ttcctgggga taagaaggaa atcctttccc cctgttttta 4320

ccgtatttta gggctagttt gggaacacca atttcctaaa agatttatat tttcccatgg 4380

gaaaatgaac taatttccct tgggaaaata aaaatctttt ggaaatttgg ggttccaaac 4440

tagcccttaa gttgtaattt gtctgcggtg tagaaccttc tgaaacctct gagctagtga 4500

tgcgtcagat tgagatattt tgttcaatgt ttgctgttt 4539

Claims

1.扩增玉米优势单倍体中耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记Marker1和Marker2的特异性引物对，其中：

Marker1的正向引物序列为SEQ ID No.1，反向引物序列为SEQ ID No.2；

Marker2的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4。

2.鉴定玉米优势单倍体中耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记Marker1和Marker2，其特征在于，以玉米DNA为模板，采用下述特异性引物对扩增得到：

3.权利要求2所述分子标记Marker1和Marker2在筛选和鉴定耐旱持绿和/或高效磷再动员能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，提取玉米基因组DNA，采用下述引物对进行扩增，

Marker2的正向引物序列为SEQ ID No.3，反向引物序列为SEQ ID No.4；

其中Marker1为扩增出的长度为560bp的DNA片段；表明玉米品种为耐旱持绿表型，

Marker2为扩增出的长度为635bp的DNA片段；表明玉米品种为高效磷再动员能力表型。

5.权利要求2所述分子标记Marker1和Marker2通过转基因或分子标记在辅助育种选育耐旱持绿和高效磷再动员能力的作物新品种的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述作物为玉米(Zea mays)、高粱(Sorghumbiocolor)、水稻(Oryza sativa)、谷子(Setaria italica)或二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)。

7.共线性分析及同源基因比对在植物中获取位点qstg_chr9及相关基因的同源基因的应用；所述位点qstg_chr9包含有三个相关基因ZmVPP1，Zm00001d046592和ZmPAP26，所述基因Zm00001d046592的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其中植物为玉米(Zea mays)、高粱(Sorghumbiocolor)、水稻(Oryza sativa)、谷子(Setaria italica)或二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)。