CN103103253A - 鸡mdh基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括以下步骤：一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计；二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段；三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段；四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析；五、MDH基因不同基因频率和基因型频率。本发明的优点是：针对上述MDH基因5′侧翼区的SNP多态性，本发明公开其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增,特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡腹脂重和产蛋数的标记辅助选择（MAS），建立鸡种群。

Description

鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测方法，尤其涉及一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法。 

背景技术

苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)是细胞内糖的三羧酸循环( TCA)的重要氧化还原酶，在线粒体上, 能催化苹果酸氧化成草酰乙酸；在细胞质中, 又能将草酰乙酸还原成苹果酸，苹果酸脱氢酶穿梭于基质和细胞质之间, 维持着酶促反应的动态平衡，MDH 与LDH（乳酸脱氢酶）的比值可用来反映细胞中氧代谢状况，MDH/LDH比值高表明细胞有氧代谢旺盛，有研究表明心肌的MDH/ LDH 比值显著高于骨骼肌，说明心肌中有氧代谢占优势，这明显有助于维持心脏的正常功能，苹果酸脱氢酶广泛分布于动物各组织，尤以肝、肾、骨骼肌最为丰富，其具有多种生物学功能，但是,不同来源的苹果酸脱氢酶的性质差别很大^[4]，研究表明，牦牛、黄牛和水牛心肌的MDH均显著高于骨骼肌，鸡MDH基因于1996年被克隆研究，其全长106kb，由14个外显子和13个内含子组成，编码557个氨基酸，尽管苹果酸脱氢酶具有重要的生理生化功能, 但迄今为止, 对于苹果酸脱氢酶的研究主要集中在分子生物学领域, 国内曾报道过对猪心苹果酸脱氢酶的提取纯化研究，对酶学性质及其稳定性等方面的研究，多数MDH的单核苷酸突变可以影响基因的后续转录和表达进而改变了酶的结构和功能，这是造成个体差异的主要原因，限饲家兔将导致MDH基因表达的降低，同时降低脂肪的沉积，MDH基因在长链氨基酸的生化合成中起重要作用，MDH基因产物的活性与脂肪酸合成速率有很大关系，在家禽和家兔中，MDH基因的活性与脂肪酸合成的速率成正相关，MDH在脂肪代谢中的作用以及酶活性存在明显差异，因此对MDH基因进行多态性的检测是现有技术急需解决的技术难题。 

经对现有技术文献检索发现，目前对于苹果酸脱氢酶的研究主要集中在分子生物学领域, 主要是对酶学性质及其稳定性等方面的研究，少有对其进行分子遗传效应的研究，仅见GUAN Hong-Ying等在《Acta Genetica Sinica》2006，33：501-506上发表的Correlation Analysis Between Single-Nucleotide Polymorphism of Malate Dehydrogenase Gene 5′-Flanking Region and Growth and Body Composition Traits in Chicken，该文提出采用PCR-RFLP法在F2资源群体和高低脂系检测MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法。 

本发明采用的技术方案是：鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤： 

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以多只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为18-25μL，其中包括10×PCR Buffer1.5-2.5μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2-2.5μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs0.5-1.5μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.1-0.5μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板0.5-1.5μL和超纯水11-12.5μL，扩增程序为：控制温度为92-96℃，对PCR反应体系进行4-6 min，保持在温度92-96℃，变性处理40-60s，然后降低温度至45-60℃，进行退火处理40-60 s，退火处理完毕后，升高温度至68-76℃，再进行延伸处理40-60 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30-35个循环，操作完成后控制温度为68-76℃，延伸处理8-11 min，获得多个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的620-680bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水5~6 μL；

b、酶切消化条件：60-70℃恒温水浴消化6~8小时。

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳25~30min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

与现有技术相比，本发明公开的鸡MDH基因5′侧翼区的SNP多态性，是一个与鸡部分生产性状密切相关的单核苷酸多态位点，本发明对京海黄鸡的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与鸡部分经济重要性状（腹脂重，产蛋数）进行关联分析，结果表明该位点能够作为降低腹脂重和提高鸡产蛋数的分子标记。 

本发明的优点是：针对上述MDH基因5′侧翼区的SNP多态性，本发明公开其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增,特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡腹脂重和产蛋数的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传优良的鸡种群。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。 

图1 为鸡MDH基因PCR产物电泳。 

图2 为鸡MDH基因包含5′侧翼区的多态位点657bp的PCR产物PaeI酶切电泳结果，其中泳道2、泳道4和泳道5只有一条657bp的条带，其为BB基因型个体，泳道6包含545bp和112bp条带，为AA基因型个体，泳道1、泳道3包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带，为AB基因型个体，泳道M为Marker(2000p，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)。 

图3 为鸡MDH基因SNP的不同基因型测序图，a为AA基因型图，b为BB基因型图，c为AB基因型图，其中AA基因型为T，BB基因型为C，AB基因型自左向右第6个峰为两个峰。 

具体实施方式

实施例1 

如图1-3所示，本发明的鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以190只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为18μL，其中包括10×PCR Buffer1.5μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs0.5μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.1μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板0.5μL和超纯水11μL，扩增程序为：控制温度为92℃，对PCR反应体系进行4 min，保持在温度92℃，变性处理40s，然后降低温度至45℃，进行退火处理40s，退火处理完毕后，升高温度至68℃，再进行延伸处理40 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30个循环，操作完成后控制温度为68℃，延伸处理8 min，获得190个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的620bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水5μL；

b、酶切消化条件：60℃恒温水浴消化6小时。

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳25min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

若涉及的等位基因为A和B，具体的基因频率计算公式为： 

P_A=(2N_AA+N_AB)/2N

P_B=(2N_BB+N_AB)/2N

式中，P_A 和P_B分别表示等位基因A和B等位基因的频率，N_AA，N_AB和N_BB分别表示AA、AB和BB基因型的个体数量，N表示总群体数目，如表1所示，京海黄鸡MDH基因SNP中的A等位基因频率为0.71。

表1京海黄鸡MDH基因5′侧翼区第236位SNP的基因频率和基因型频率 

实施例2

如图1-3所示，本发明的鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以190只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为20μL，其中包括10×PCR Buffer2μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2.2μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs0.8μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板1μL和超纯水11.8μL，扩增程序为：控制温度为94℃，对PCR反应体系进行5 min，保持在温度94℃，变性处理50s，然后降低温度至56℃，进行退火处理50 s，退火处理完毕后，升高温度至72℃，再进行延伸处理50 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复33个循环，操作完成后控制温度为72℃，延伸处理10 min，获得190个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的657bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水6 μL；

b、酶切消化条件：65℃恒温水浴消化8小时。

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳25~30min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

对鸡MDH基因SNP位点基因型效应的关联分析： 

结果表明（见表2）：在第236位点，BB基因型个体的开产日龄比AA和AB基因型分别迟了5.52天和5.17天，但AA和AB基因型与BB基因型个体的开产日龄差异并不显著(P>0.05)；BB基因型个体的300日龄产蛋数为99.00个，比AA型和AB型分别低10.88个和12.78个，且差异极显著(P<0.01)；BB基因型个体的66周龄产蛋数为148.00枚，比AA型和AB型分别低45.22个和44.50个，且差异极显著(P<0.01)；以上分析说明：第1087位点的TT基因型可以作为一个提高鸡产蛋数的候选分子遗传标记。

表2 京海黄鸡MDH基因不同基因型与母鸡产蛋性能的方差分析（平均数±标准差） 

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

由表3可知，在京海黄鸡公鸡群体中，AB基因型个体的16周龄活重为1605.96g，分别低于AA基因型和BB基因型个体34.94g和102.24g，但差异不显著(P>0.05)；BB基因型个体的腹脂重最低，分别低于AA基因型和BB基因型个体3.75g和4.77g，且差异显著(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂率最低，分别低于AA基因型和BB基因型个体0.36%和0.52%，且差异显著(P<0.05)。

表3京海黄鸡MDH基因不同基因型与公鸡腹脂性状间的关联分析 

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

由表4可见，在母鸡群体中，AB基因型个体的16周龄活重显著低于AA型个体(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂重最低，低于AA基因型个体7.39g，且差异显著(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂率最低，分别低于AA基因型和AB基因型个体0.30%和0.49%，且差异显著(P<0.05)

表4京海黄鸡MDH基因不同基因型与母鸡屠宰性状间的关联分析

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

实施例3

如图1-3所示，本发明的鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以190只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为25μL，其中包括10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2.5μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs1.5μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.5μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板1.5μL和超纯水12.5μL，扩增程序为：控制温度为96℃，对PCR反应体系进行6 min，保持在温度96℃，变性处理60s，然后降低温度至60℃，进行退火处理60 s，退火处理完毕后，升高温度至76℃，再进行延伸处理60 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复35个循环，操作完成后控制温度为76℃，延伸处理11 min，获得多个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的680bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水5 μL；

b、酶切消化条件：70℃恒温水浴消化8小时。

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳30min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因；

对鸡MDH基因SNP位点基因型效应的关联分析：

结果表明（见表2）：在第236位点，BB基因型个体的开产日龄比AA和AB基因型分别迟了5.52天和5.17天，但AA和AB基因型与BB基因型个体的开产日龄差异并不显著(P>0.05)；BB基因型个体的300日龄产蛋数为99.00个，比AA型和AB型分别低10.88个和12.78个，且差异极显著(P<0.01)；BB基因型个体的66周龄产蛋数为148.00枚，比AA型和AB型分别低45.22个和44.50个，且差异极显著(P<0.01)；以上分析说明：第1087位点的TT基因型可以作为一个提高鸡产蛋数的候选分子遗传标记。

表2 京海黄鸡MDH基因不同基因型与母鸡产蛋性能的方差分析（平均数±标准差） 

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

由表3可知，在京海黄鸡公鸡群体中，AB基因型个体的16周龄活重为1605.96g，分别低于AA基因型和BB基因型个体34.94g和102.24g，但差异不显著(P>0.05)；BB基因型个体的腹脂重最低，分别低于AA基因型和BB基因型个体3.75g和4.77g，且差异显著(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂率最低，分别低于AA基因型和BB基因型个体0.36%和0.52%，且差异显著(P<0.05)。

表3京海黄鸡MDH基因不同基因型与公鸡腹脂性状间的关联分析 

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

由表4可见，在母鸡群体中，AB基因型个体的16周龄活重显著低于AA型个体(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂重最低，低于AA基因型个体7.39g，且差异显著(P<0.05)；BB基因型个体的腹脂率最低，分别低于AA基因型和AB基因型个体0.30%和0.49%，且差异显著(P<0.05)

表4京海黄鸡MDH基因不同基因型与母鸡屠宰性状间的关联分析

注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Claims (1)

1.鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括以下步骤：

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以多只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为18-25μL，其中包括10×PCR Buffer1.5-2.5μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2-2.5μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs0.5-1.5μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.1-0.5μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板0.5-1.5μL和超纯水11-12.5μL，扩增程序为：控制温度为92-96℃，对PCR反应体系进行4-6 min，保持在温度92-96℃，变性处理40-60s，然后降低温度至45-60℃，进行退火处理40-60 s，退火处理完毕后，升高温度至68-76℃，再进行延伸处理40-60 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30-35个循环，操作完成后控制温度为68-76℃，延伸处理8-11 min，获得多个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的620-680bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水5~6 μL；

b、酶切消化条件：60-70℃恒温水浴消化6~8小时；

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳25~30min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

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