CN102864220B

CN102864220B - 一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法

Info

Publication number: CN102864220B
Application number: CN201210281520.5A
Authority: CN
Inventors: 刘西莉; 牟文君; 李波涛; 刘鹏飞; 李健强; 王厚涵; 林东
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-08-09
Also published as: CN102864220A

Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的分子检测方法和专用引物。属于分子生物学技术领域。该引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列组成。本发明提供的检测水稻纹枯病菌对噻呋酰胺产生抗药性的点突变的方法，具有高灵敏度、简单快速、稳定性好的特点，可以有效地区分敏感菌株和抗药性菌株，用于检测田间水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性发生发展动态。本发明对于抗性病害的早期预警，以及制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。

Description

一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定水稻纹枯病菌Sdh基因核苷酸点突变及其对噻呋酰胺抗药性的方法和专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的一种世界范围的水稻病害，该病害引起水稻结实率和千粒重显著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻减产的主要原因之一。水稻纹枯病菌属于立枯丝核菌的AG-1融合群，其基因组序列未知，这也为该病原菌的深入研究带来一定困难。随着矮秆、早熟、多蘖型品种的大量推广，以及施肥水平的不断提高，水稻纹枯病危害逐步加重，近年来已成为我国水稻三大病害之首，严重影响了水稻产量和质量。

目前对水稻纹枯病的防治以化学措施为主。噻呋酰胺（thifluzamide）商品名为“满穗”，是陶氏益农公司开发的噻二唑羧酰苯胺类化合物，是近年来推出的新型、高效防治纹枯病药剂。噻呋酰胺属于呼吸抑制剂中作用于复合物II处的琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs），这类药剂还包括萎锈灵、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它们具有相似的作用机制和抗性机制，相互间具有正交互抗药性，多对担子菌或子囊菌特效。使用初期，这类药剂因其用药量少，防效显著而备受青睐，但因其作用位点单一，田间很快就产生了抗药性。已有研究发现，病原菌对此类药剂的抗性机制主要是琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基（sdhB、sdhC、sdhD）发生点突变所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麦壳针孢叶枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三个半胱氨酸簇的保守组氨酸位点发生点突变，灰盖鬼伞病菌、菌核病菌等则在膜锚蛋白sdhC、sdhD位点发生点突变，脱氮副球菌在sdhB、sdhD发生点突变，而链格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均发生突变。水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性机制目前还未明确，明确其具体的抗性基因及抗性检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案，延缓抗药性的产生。

传统的抗性检测方法主要为室内生物学测定，包括菌丝生长速率法、孢子萌发法、菌丝干重法、水平扩散法等。这些传统的敏感性测定方法均需要制备含药培养基，计算抑制中浓度，耗费时间长，工作量大，灵敏度低。随着分子生物学的快速发展，分子技术得以在抗药性检测中应用，其速度快，效率高，是田间抗性检测的理想方法。针对单碱基突变引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功应用于抗性菌株的分子检测。等位特异PCR（Allele-Specific PCR,AS-PCR）是在引物的3’端设计一个碱基与突变位点匹配，在PCR扩增时引物只与突变菌株结合，敏感菌株的DNA则不能扩增，从而将敏感和抗性菌株区分开来。最近的研究发现，在原引物基础上，改变倒数第二个碱基为不同核苷酸后，可以显著提高引物的特异性，使得AS-PCR技术应用更为广泛。CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)是酶切扩增多态性序列标记技术，也称为PCR-RFLP技术，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差异可能导致了酶切位点的改变，对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切，经电泳分离后敏感和抗性菌株的表型不同，从而加以区分。

发明内容

本发明的一个目的是提供两种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。

本发明所提供的第一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出条带，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。

上述过程中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO：4中自5’末端起第975位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为56℃。

本发明所提供的另一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，扩增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切产物中含有230bp片段，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在或候选存在突变位点；

本发明所提供的检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供水稻纹枯病菌中sdhB基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的水稻纹枯病菌中sdhB基因的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T杂合或T纯合。其中，所述sdhB基因的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO：4中自5’末端起第975位核苷酸。

本发明所提供的水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的一个突变位点，为水稻纹枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸为组氨酸与酪氨酸杂合或纯合的酪氨酸。其中，所述sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸也就是SEQ ID NO：3中自N端起第249位氨基酸。

上述任一所述突变位点在鉴定水稻纹枯病菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗噻呋酰胺。

上述应用中，存在所述突变位点的水稻纹枯病菌具有或候选具有抗药性。

SEQ ID NO：3所示蛋白或SEQ ID NO：4所示基因也属于本发明的保护范围。

上述中，任一所述水稻纹枯病菌具体是立枯丝核菌。

上述中，所述敏感菌株为噻呋酰胺的平均EC₅₀小于0.1μg/ml，抗性菌株为噻呋酰胺的平均EC₅₀为19.558μg/ml。

本发明提供的检测水稻纹枯病菌对噻呋酰胺产生抗药性的点突变的方法，对抗性菌株进行高灵敏度、简单快速的分子检测，及时了解抗药性发生动态，对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。

本发明方法具有以下技术优势和特点：

结果可靠：用本发明建立的分子检测方法检测菌株DNA，所有的抗性菌株都能与敏感菌株区分开来，其结果可靠性有保证。

简单快速：传统的生物学测定方法从病菌分离，到敏感性检测，至少需要5天时间，工作量大，周期长。而分子检测从提DNA到PCR或酶切分析，最多需要1.5天时间，省时省工。

附图说明

图1为水稻纹枯病菌敏感与抗性菌株的序列比对。A：sdhB、sdhC、sdhD基因的突变情况，B：sdhB基因975位的碱基杂合，C：敏感菌株与抗性菌株的sdhB氨基酸比对。

图2为抗性与敏感菌株的NlaIV酶切位点。

图3为CAPS方法酶切检测结果。1～4泳道为敏感菌株，5～16泳道为抗性菌株。

图4为AS-PCR方法检测水稻纹枯病菌抗性突变体。A：四对AS-PCR引物在不同温度条件下的电泳结果。B：引物BF975C/BR32在56℃下的扩增结果。S为敏感菌株，R为抗性杂合菌株，T为抗性纯合菌株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中“抗性菌株”均指对噻呋酰胺抗性的立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)；“敏感菌株”均指对噻呋酰胺敏感的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)。

下述实施例中使用的立枯丝核菌为：抗性菌株J-1，J-3，J-3-1、J-6、J-10、J-11、J-14、J-16、J-20、J-24、B-1、B-1-1、B-1-31、T2；敏感菌株FBS-3、B310、D179、JHT158-3、JHM-4和E67。

上述菌株分别采自：FBS-3（福建），B310、B-1、B-1-1、B-1-31（广东），D179（广西），JHM-4、JHT158-3、J-1、J-3、J-3-1、J-6、J-10、J-11、J-14、J-16、J-20、J-24、T2（吉林），E67（江苏）。通过形态学并结合分子生物学方法鉴定所有菌株为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)。

实施例1、立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性测定

五株立枯丝核菌敏感菌株，菌株编号分别为FBS-3，B310，D179，JHT158-3，E67；十株立枯丝核菌抗性菌株，菌株编号分别为J-3，J-3-1，J-24，J-20，B-1，B-1-31，J-14，J-6，J-1和T2。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200g，琼脂粉14g，葡萄糖18g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。

1、实验步骤如下：

1）将噻呋酰胺用二甲基亚砜（DMSO）配成10⁵μg/ml的母液。对于立枯丝核菌敏感菌株的敏感性测定，将噻呋酰胺逐级稀释成500μg/mL,100μg/mL,50μg/mL,25μg/mL,10μg/mL的浓度梯度；对于立枯丝核菌抗性杂合菌株的敏感性测定，将供试药剂噻呋酰胺逐级稀释成2×10⁴μg/mL,5×10³μg/mL,1.5×10³μg/mL,500μg/mL,200μg/mL的浓度梯度；对于立枯丝核菌抗性纯合菌株的敏感性测定，将供试药剂噻呋酰胺逐级稀释成2×10⁵μg/mL,8×10⁴μg/mL,10⁴μg/mL,5×10³μg/mL,2.5×10³μg/mL,10³μg/mL，500μg/mL的浓度梯度。

2）用移液枪吸取噻呋酰胺药液60μl加入已灭菌的冷却至45℃的60ml PDA培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只加60μl二甲基亚砜的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。

3）立枯丝核菌在PDA平板上培养3天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2）中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养，1.5d后测量菌落直径。

4）十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各浓度药剂对供试菌株菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值（Y），药剂浓度转换成以10为底的对数值（X），在Microsoft Excel中作回归直线，求出噻呋酰胺对立枯丝核菌的毒力回归曲线方程Y=a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC₅₀值，并计算抗性倍数。

2.结果

表1.立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性

通过立枯丝核菌对噻呋酰胺的敏感性检测，结果发现5株敏感菌株的平均EC₅₀为0.063μg/ml，均小于0.1μg/ml，而10株抗性菌株的平均EC₅₀为19.558μg/ml，显著高于敏感菌株的EC₅₀，如表1。

实施例2、立枯丝核菌中sdhB基因和sdhB蛋白突变位点的发现

1、菌株：抗性菌株为J-24（杂合CT）、J-3-1（杂合CT）、T2（纯合T），敏感菌株为JHT158-3。

2、方法：

1）菌株培养：将菌株在PDA培养基上于28℃培养2~3天，打取菌饼5~10个在PDB摇培液中摇培3～4天，将菌丝球抽滤、去除培养液，用液氮速冻后于-80℃保存。

2）分别提取两种菌株的基因组DNA。

3）分别提取两种菌株的基因组RNA。

4）RNA反转录。

5）SdhB、C、D基因的克隆

用表2所示引物进行PCR扩增。将DNA和cDNA扩增结果比对，去除内含子，进行了核苷酸和氨基酸序列的分析。

表2.SDH基因全长扩增引物及分析

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

6）测序

将PCR产物进行测序。抗性菌株的sdhB基因基因组全长1116bp，序列如SEQ ID NO：4所示，其中包含136bp的内含子序列，cDNA编码278个氨基酸，序列如SEQ ID NO：3所示。

7）序列比对

比对敏感和抗性菌株的sdhB、sdhC、sdhD基因和蛋白序列。结果如下：

敏感菌株中，蛋白sdhB自N端起第249位氨基酸为纯合的组氨酸（Tyr），基因sdhB的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C纯合；

抗性菌株J-24，J-3-1（杂合）中，蛋白sdhB自N端起第249位氨基酸为组氨酸与酪氨酸的杂合（即SEQ ID NO：3中自N端起第249位氨基酸为组氨酸与酪氨酸的杂合），基因sdhB的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为C和T的杂合（即SEQ IDNO：4中自5’末端起第975位核苷酸为C和T的杂合）；

抗性菌株T2（纯合）中，蛋白sdhB自N端起第249位氨基酸为酪氨酸纯合（即SEQ ID NO：3中自N端起第249位氨基酸为酪氨酸纯合），基因sdhB的基因组序列自5’末端起第975位核苷酸为T纯合（即SEQ ID NO：4中自5’末端起第975位核苷酸为T纯合）；

结果（图1）表明，sdhC、sdhD基因均无氨基酸突变，而中等抗性菌株J-24,J-3-1的sdhB基因的975位核苷酸由敏感菌株的纯合C突变为C和T的杂合，测序结果可以看到明显的套峰，而这一碱基的改变也导致了249位纯合的组氨酸突变为组氨酸与酪氨酸的杂合；高抗菌株T2的249位氨基酸则为纯合的酪氨酸。因此，sdhB基因249位组氨酸突变是导致立枯丝核菌对噻呋酰胺产生抗药性的重要原因。

实施例3、检测立枯丝核菌中突变位点的方法

一、CAPS检测方法

立枯丝核菌抗性和敏感菌株sdhB基因的核苷酸比对结果表明，由于975位的碱基突变导致抗性菌株减少了1个NlaIV酶切位点，即由敏感菌株的5个酶切位点突变为4个（图2）。NlaIV酶切的识别位点为“GGN/NCC”。

PCR扩增待测菌株的sdhB全长后，将胶回收产物进行酶切。酶切体系为：ddH₂O16μL，10×Buffer Tango 2μL，DNA 1μL，NlaIV 1μL，混合离心后37℃酶切16小时。经2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色15min后检测结果。酶切产物中含有161bp片段的为敏感菌株，含有230bp片段的为抗性菌株。敏感和抗性菌株均含有500bp和292bp的酶切片段。

待测菌株为：抗性菌株J-1、J-3、J-6、J-14、J-16、J-20、J-24和B-1，敏感菌株FBS-3、JHT158-3、D179和B310。结果如图3所示。结果表明，本发明鉴定方法能够准确鉴定出敏感菌株和抗性菌株。因此，可以将CAPS方法用于抗性菌株的检测。

二、AS-PCR检测方法

1、引物设计

引物如表3.

表3.AS-PCR检测立枯丝核菌对噻呋酰胺抗药性中使用的引物

Primer	Sequence(5'-3')
		BF975A	GCTTGAGTGTTTACCGGTGCT
BF975B	GCTTGAGTGTTTACCGGTGTT
		BF975C	GCTTGAGTGTTTACCGGTGAT（SEQ ID NO：1）
BF975D	GCTTGAGTGTTTACCGGTGGT
		BR32	TTAGTCTGCTGCCAACTCCTG（SEQ ID NO：2）

本方法在上游引物的最后一个碱基与突变体一致，倒数第二个碱基同时也进行改变，并结合不同退火温度进行扩增，提高引物特异性。反应条件如下：

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

结果（图4A）表明，引物对BF975A、BF975B、BF975D与BR32在65-56℃温度下均能从抗性和敏感菌株的DNA中扩增出片段，不能很好地将之区分开，表明这三对引物不能用来检测突变位点。而引物BF975C/BR32在59℃和56℃下，敏感菌株不能扩增出条带，抗性菌株可以扩增出条带，表明这对引物可以对抗性位点进行检测，而且在56℃下抗性菌株的条带更加明亮，因此选择引物BF975C/BR32作为AS-PCR引物，56℃为退火温度。

引物BF975C/BR32扩增产物为SEQ ID No：4中第955-1116位核苷酸。

2、检测突变位点

以待测的立枯丝核菌基因组DNA为模板，用引物对BF975C和BR32进行PCR扩增，然后进行凝胶电泳检测，若能够从菌株基因组DNA中扩增获得片段，判定所述菌株为抗性菌株；若不能扩增获得片段，则判定所检测的立枯丝核菌为敏感菌株。

PCR扩增体系及反应条件与实验一中一致，退火温度为56℃。

待测菌株为：抗性菌株J-3-1、J-1、J-3，J-6，J-10，J-11，J-14，J-16，J-20，B-1，B-1-1，B-1-31和T2，敏感菌株JHT158-3、FBS-3、B310和D179。

结果如图4B所示。结果表明，仅能从抗性菌株中扩增出目标片段，而不能从敏感菌株中扩增出片段。因此采用引物BF975C和BR32，在退火温度为56℃时进行PCR扩增，可以有效检测立枯丝核菌对噻呋酰胺的抗药性菌株。

Claims

1.一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测水稻纹枯病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，扩增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切产物中含有230bp片段，则所述待测水稻纹枯病菌中sdhB基因存在突变位点；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中，退火温度为56℃。

3.一种检测或辅助检测水稻纹枯病菌中sdhB基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示DNA分子组成。

4.权利要求1或2所述方法或者权利要求3所述的引物对在鉴定水稻纹枯病菌抗药性中的应用；所述抗药性为抗噻呋酰胺。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：存在所述突变位点的水稻纹枯病菌具有抗药性。

6.SEQ ID NO：3所示蛋白。

7.SEQ ID NO：4所示基因。