CN105238874B - 用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，可用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对，以其对禾谷丝核菌DNA进行PCR扩增、电泳，若电泳产物为长度为500bp的单一条带，则该菌株为噻呋酰胺抗性菌株，且其RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为络氨酸；该方法简便快捷，可及时了解抗药性发生动态、对有效控制禾谷丝核菌抗药性发生具有重要的意义。

Description

用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒及检 测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是一种用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术
小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是在世界温带麦区广泛分布的土传真菌病害，主要由禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis van der Hoeven(AG-DI融合群)侵染所致。从20世纪70年代中后期开始，随着小麦品种的更替及高产栽培措施(如早播、密植、高肥等)的推广，该病在我国冬麦区普遍发生，现已成为长江流域及黄淮平原麦区的重要病害，目前生产上推广的小麦品种对纹枯病的抗性普遍较差，药剂防治是控制该病害的主要手段。噻呋酰胺(Thifluzamide，满穗)是美国陶氏益农公司开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂类(succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)杀菌剂，对丝核菌有特效，目前已在中国登记用于水稻纹枯病和小麦纹枯病的防治。SDHIs类杀菌剂是被杀菌剂抗性行动委员会(Fungicide Resistance Action Committee，FRAC)新划分出来的一类作用机制和抗性机理相似的化合物。该类杀菌剂从投入市场后很快在多种作物的多种病害上都检测到了抗药性，从而导致了防治的失败，FRAC把该类杀菌剂划分为中高等抗性风险杀菌剂。由于井冈霉素防效较低(30％-40％防效)，噻呋酰胺将成为防治小麦纹枯病的主打药剂。虽然目前田间还未检测到小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性菌株，但提前建立好抗性检测方法，对抗性菌株进行早期检测，这对了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案以及延缓抗药性的产生具有重要意义。
已有研究表明病原菌对SDHIs杀菌剂的抗性机制是由于琥珀酸脱氢酶B、C、D亚基(sdhB,sdhC,sdhD)发生点突变。牟文君等研究了水稻纹病菌(Rhizoctonia solani AG1-IA)对噻呋酰胺的抗性分子机制，结果表明：水稻纹病菌sdhB亚基基因的249位氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸是水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗药性产生的主要原因，并且建立了水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性检测方法。小麦纹枯病菌和水稻纹枯病菌虽同属于丝核菌，但两者在形态和有性态都有很大的差别：前者菌丝细胞为双核，菌丝较细，生长速度较慢，有性态是喙角担菌(Ceratobasidiumcornigerum(Borud.)Rogers)，后者菌丝细胞为多核，菌丝较粗，生长速度较快，有性态是瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk)。这两个病原菌在基因序列上也有较大的差异，申请人曾经根据水稻纹枯病菌的sdhB,sdhC,sdhD基因序列设计引物扩增小麦纹枯病菌这三个基因序列，一直无法获得正确的序列。目前小麦纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性机制还未有报道，明确具体的抗性机制，对建立抗性检测方法以及对抗性菌株进行早期检测具有重要的意义。
传统的抗药性检测方法主要为室内生物学测定，包括菌丝生长速率、孢子萌发等，这些方法步骤繁琐，耗时长，不适用于大规模田间抗性检测。等位特异PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)是在引物的3’端设计一个碱基与突变位点匹配，在PCR扩增时只与抗性菌株结合，而不能与敏感菌株的该位点结合，从而将敏感和抗性菌株区分开来。目前，尚未发现利用AS-PCR技术，针对禾谷丝核菌RCSdhD基因突变位点进行研究的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒和检测方法，该检测方法操作简便，耗时短，效率高，本发明是这样实现的：
一对用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
一种用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
一种禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的检测方法包括利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对对样本基因组DNA进行PCR扩增的步骤。
进一步，本发明中，禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的检测方法，具体步骤如下：
(1)提取禾谷丝核菌样本基因组DNA；
(2)以样本基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增；PCR扩增体系为：2.5μl的10×PCR Buffer,1.5μl的Mg2+,2μl的10mM的dNTP Mix,10mM的引物各0.5μl,1μl的DNA Polymerase,10ng/μl的模板DNA 1μl，加ddH2O至25μl；PCR扩增反应程序为：94℃预变性，5min；94℃变性1min，68℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min；
(3)对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，若电泳产物为长度为500bp左右单一条带，则说明样本菌株为噻呋酰胺抗性菌株，且其RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为组氨酸和酪氨酸杂合物或者纯和的络氨酸。
本发明中，所述噻呋酰胺抗性菌株是指该禾谷丝核菌株在含10μg/mL噻呋酰胺的PDA平板上能够生长，所述噻呋酰胺敏感菌株是指在含0.8μg/mL噻呋酰胺的PDA平板上不能生长的菌株。
本发明中，所述RCSdhD基因突变是指RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为组氨酸和酪氨酸杂合物或者纯和的酪氨酸。
本发明提供一对核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对，利用该引物对进行PCR扩增、电泳检测，即可对禾谷丝核菌株的RCSdhD基因116位氨基酸是否发生组氨酸突变为酪氨酸或者是组氨酸和酪氨酸的杂合物进行准确检测，进而判断该菌株是否对噻呋酰胺产生抗性；该方法简便快捷，可及时了解抗药性发生动态、对有效控制禾谷丝核菌抗药性发生具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例菌株电泳图。
具体实施方式
实施例中涉及的序列：
SEQ ID NO:1：5‘ATCCACGTACGCCAATATGGGAACA’3；
SEQ ID NO:2：5‘CACTAATCTCAACCCGAGCACTCCTT’3
SEQ ID NO:3：
SEQ ID NO:4：
SEQ ID:5：
试剂来源：
Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen,Life Technologies corporation,上海，中国)；
Pfx50TMPCR Mix(Invitrogen,Life Technologies corporation,Shanghai,China)；
Pfx50TMDNA Polymerase(5U/μl,high-fidelity DNA Polymerase,Invitrogen,Life Technologies corporation,Shanghai,China)；
回收试剂盒(Axygen,Union City,CA,USA)；
其他实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本实施例中禾谷丝核菌均为申请人自命名。下述实施例中所涉及的禾谷丝核菌来源：R1404，R1406和R1410是2014年申请人从江苏省泰州市沈高镇采集的发病小麦植株上分离获得，R1019、R1038、R1050、R1055、R1066、R1071和R1097是2010年申请者分别从江苏省徐州市丰县顺河镇、海安市雅周镇、海安市曲塘镇、山东省临沂市平邑县仲村镇、菏泽市巨野郑庄、安徽省蚌埠市淮上区、淮北市采集的发病小麦植株上分离获得。经过ITS测序blast比对鉴定和细胞核数目观察，这10株菌株均为禾谷丝核菌，通过传统的生物测定方法(菌丝生长速率测定)，这些菌株在含0.8μg/mL噻呋酰胺的PDA平板上不能生长，对噻呋酰胺均表现为敏感。
实施例1 噻呋酰胺抗性菌株诱导
由于在田间未检测到对噻呋酰胺表现抗性的禾谷丝核菌菌株，申请人通过室内紫外诱导的方法进行抗性菌株的筛选(在评估杀菌剂抗性风险时也常用该方法)。具体方法如下：从在PDA平板上预培养5天的禾谷丝核菌R1404，R1406和R1410菌落边缘近1/3处打取直径为5mm的菌碟，将其接种到含有0.8μg/mL噻呋酰胺的PDA平板上，每个菌株接种30个平板，每个平板接种6个菌碟，则每个菌株共计有180个菌碟，将这些平板放在紫外灯(15W，具离平板30厘米的距离)下照射10min，照射后立即黑暗保存，14d后开始观察，将长出的菌落挑取到含0.8μg/mL噻呋酰胺的PDA培养基的平板上进行抗性验证。突变频率＝(突变个体数/菌株总数)x100％。结果表明：小麦纹枯病菌容易对噻呋酰胺产生抗性，总计获得20株抗性菌株，其中R1404-T1，R1404-T2，R1404-T3，R1404-T4，R1404-T5，R1404-T6，R1404-T7和R1404-T8是由敏感菌株R1404诱变得到；R1406-T1，R1406-T2，R1406-T3，R1406-T4，R1406-T5和R1406-T6是由敏感菌株R1406诱变得到；R1410-T1，R1410-T2，R1410-T3，R1410-T4，R1410-T5和R1410-T6是由敏感菌株R1410诱变得到，产生抗性频率为3.7％。这结果也表明了小麦纹枯病菌对噻呋酰胺抗性风险较高，在田间长时间单一使用后容易产生抗药性。
实施例2 用传统生物学测定方法测定禾谷丝核菌对噻呋酰胺的敏感性
待测菌株：10株噻呋酰胺敏感菌株，菌株编号为R1404，R1406，R1410，R1019、R1038、R1050、R1055、R1066、R1071和R1097；20株噻呋酰胺抗性菌株，菌株编号为：R1404-T1，R1404-T2，R1404-T3，R1404-T4，R1404-T5，R1404-T6，R1404-T7，R1404-T8，R1406-T1，R1406-T2，R1406-T3，R1406-T4，R1406-T5，R1406-T6，R1410-T1，R1410-T2，R1410-T3，R1410-T4，R1410-T5，R1410-T6。
测定用培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，马铃薯200g，琼脂条17g,葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌30分钟。
实验步骤如下：从预培养5天的待测菌株菌落边缘近1/3处打取直径为5mm的菌碟，将其接种到含有不同浓度噻呋酰胺的PDA平板上，测定噻呋酰胺敏感菌株时噻呋酰胺浓度分别为：0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8μg/mL；测定噻呋酰胺抗性菌株时噻呋酰胺浓度分别为：0.01、0.1、0.2、0.5、1、10、100μg/mL；同时以不含药剂为对照，25℃下培养5d，十字交叉法测量菌落直径；每个处理设置3个重复，试验重复3次。计算并分析待测菌株对噻呋酰胺的敏感性的EC50值。抗性倍数＝噻呋酰胺抗性菌株的EC50/噻呋酰胺敏感菌株的EC50。实验结果如表1所示：
表1禾谷丝核菌对噻呋酰胺敏感性测定结果
菌株名称 EC50 抗性倍数
敏感菌株 R1404 0.06
R1406 0.05
R1410 0.05
R1019 0.05
R1038 0.03
R1050 0.04
R1055 0.04
R1066 0.04
R1071 0.04
R1097 0.03
抗性菌株 R1404-T1 1.87 31.2
R1404-T2 1.37 22.8
R1404-T3 0.78 13.0
R1404-T4 1.67 27.8
R1404-T5 1.41 23.5
R1404-T6 1.94 32.3
R1404-T7 1.34 22.3
R1404-T8 0.69 11.5
R1406-T1 1.22 24.4
R1406-T2 0.81 16.2
R1406-T3 1.23 24.6
R1406-T4 0.89 17.8
R1406-T5 1.12 22.4
R1406-T6 0.60 12.0
R1410-T1 0.83 16.6
R1410-T2 0.55 11.0
R1410-T3 0.87 17.4
R1410-T4 0.77 15.4
R1410-T5 0.98 19.6
R1410-T6 0.84 16.8
由表1可见，10株敏感菌株在含0.8μg/mL噻呋酰胺的平板上完全不能生长，而20株抗性菌株在含100μg/mL噻呋酰胺的平板上能够微弱生长，平均抗性倍数为20倍。
实施例3 禾谷丝核菌中RCSdhD基因的克隆及分析
待测菌株：10株噻呋酰胺敏感菌株，菌株编号为R1404，R1406，R1410，R1019、R1038、R1050、R1055、R1066、R1071和R1097；
20株噻呋酰胺抗性菌株，菌株编号为：R1404-T1，R1404-T2，R1404-T3，R1404-T4，R1404-T5，R1404-T6，R1404-T7，R1404-T8，R1406-T1，R1406-T2，R1406-T3，R1406-T4，R1406-T5，R1406-T6，R1410-T1，R1410-T2，R1410-T3，R1410-T4，R1410-T5，R1410-T6。
第一步：DNA和RNA的提取：将30株测试菌株在铺有玻璃纸的PDA平板上预先培养5d，刮取菌丝，采用CTAB法进行真菌DNA提取，采用Trizol RNA提取试剂盒提取RNA。
第二步：PCR扩增：申请人所在实验室对禾谷丝核菌R1301菌株进行了全基因组测序，获得了禾谷丝核菌的sdhD基因序列如SEQ ID NO.3所示，RCsdhD基因全长为737bp，其中包括4个内含子；cDNA全长为531bp，如SEQ ID NO.4所示；如SEQ ID NO.5所示，共编码176个氨基酸。根据RCsdhD基因序列序列设计引物，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。
表2.RCSdhD基因扩增引物
PCR扩增体系如下：5μl的10×Pfx50TMPCR Mix,1.5μl的dNTP Mix(10mM),1.5μl的Primer Mix(10mM each),1μl的Pfx50TMDNA Polymerase(5U/μl),1μl的模板DNA(10ng/μl)。
PCR扩增反应程序如下：94℃预变性，3min；(94℃变性，15s；68℃退火，30s；68℃延伸，1min；共计35个循环)，最后延伸68℃，5min。
PCR产物电泳回收：将PCR产物跑电泳(2％琼脂糖电泳)，采用回收试剂盒进行目的条带的回收。
PCR产物测序结果：RCSdhD基因全长为737bp，其中包括4个内含子，cDNA全长为531bp，编码176个氨基酸。
第三步：敏感菌株和抗性菌株中RCSdhD基因序列比较
比较10株噻呋酰胺敏感菌株和20株噻呋酰胺抗性菌株的RCSdhD的核苷酸序列和氨基酸序列，结果为：20株噻呋酰胺抗性菌株中有11株是由于RCSdhD基因发生核苷酸点突变，详细描述如下：在敏感菌株和非RCSdhD基因突变菌株中，RCSdhD基因的氨基酸序列自N端起第116位氨基酸为纯和组氨酸(H)，RCSdhD的核苷酸序列自5’端起第448位核苷酸为纯和的胞嘧啶(C)，而在RCSdhD基因突变的抗性菌株中，RCSdhD的氨基酸序列自N端起第116位氨基酸为组氨酸(T)和酪氨酸(Y)杂合，RCSdhD的核酸序列自5’端起第448位核苷酸为胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(T)杂合。因此，推断RCSdhD基因的116位氨基酸突变是禾谷丝核菌对噻呋酰胺产生抗性的重要原因。
实施例4 AS-PCR法检测禾谷丝核菌RCSdhD基因点突变
所用菌株：3株噻呋酰胺敏感菌株，菌株编号为R1404，R1406和R1410；6株非RCSdhD基因突变的噻呋酰胺抗性菌株，菌株编号为R1404-T1，R1404-T6，R1406-T1，R1406-T3，R1410-T1，R1410-T6和R1410-T2；8株是RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为组氨酸和酪氨酸杂合的抗性菌株，菌株编号依次为：R1404-T3，R1404-T5，R1404-T7，R1406-T2，R1406-T4，R1406-T5，R1410-T3，R1410-T4。
设计引物对：根据RCSdhD基因及116位突变位点设计引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。引物对由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，将上述合成好的引物对配制成SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2浓度均为10mM的溶液作为试剂盒，备用。
(1)提取样品DNA：采用CTAB法进行真菌DNA提取。
(2)PCR扩增：PCR扩增体系为：2.5μl的10×PCR Buffer(TAKARA),1.5μl的Mg2+(TAKARA),2μl的dNTP Mix(10mM)(TAKARA),1μl试剂盒溶液,1μl的DNA Polymerase(TAKARA),1μl的样品DNA(10ng/μl),加ddH2O至25μl；
PCR扩增反应程序如下：94℃预变性，5min；(94℃变性，1min；68℃退火，30s；72℃延伸，1min；共计35个循环)，最后延伸72℃，8min。
PCR产物2％琼脂糖电泳结果如图1所示，泳道1-8依次是菌株R1404-T3，R1404-T5，R1404-T7，R1406-T2，R1406-T4，R1406-T5，R1410-T3，R1410-T4；泳道9-17依次是菌株R1404，R1406，R1410，R1404-T1，R1404-T6，R1406-T1，R1406-T3，R1410-T1，R1410-T2。
由图1可见，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增的电泳产物，不能从敏感菌株和非RCSdhD基因突变的噻呋酰胺抗性菌株中扩增出条带，只能从由于RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸的抗性菌株中扩增出长度为500bp单一条带。因此可以采用该对引物SEQ ID:1和SEQ ID:2，进行PCR扩增，可以有效的检测到由RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸而导致的噻呋酰胺抗性菌株。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对、试剂盒及检测方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 2
<211> 26
<212> DNA
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<211> 786
<212> DNA
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atggcctcac taatctcaac ccgagcactc cttggacgag ctcctaggat ccaccaacga 60
gtctttgtct ctgcctttca ctcggctcgc aagaacagtg cagagcccgc ggcaggattg 120
agcaaaagcg agacttaccc atttcttccc ggcggaccta ttctacaggg atccgtcaat 180
gaccccacca ctttcccgcc cgccaaccgt atggatggct ctcatcattg ggcattcgag 240
cggcttctca gtgctgcact tgttcccatg accgtatcag cttttgctgt ctccccgaca 300
gcttacccgg tccttgatgg tgtactcgca gtctccctgg tcattcattc ccatattggc 360
ttcgattcat gtgtagtcga ctaccttcat cctcgcaagt accccaaaat cggacctgtc 420
gtcaaatggg gcctacgagt agcgactgct ggtgcactcg ttggtgtcta ccaattcaat 480
acggaagaca ttggattgac ggagcttgtt cgccgtgttt ggcttgcata a 531
<210> 5
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Met Ala Ser Leu Ile Ser Thr Arg Ala Leu Leu Gly Arg Ala Pro Arg
1 5 10 15
Ile His Gln Arg Val Phe Val Ser Ala Phe His Ser Ala Arg Lys Asn
20 25 30
Ser Ala Glu Pro Ala Ala Gly Leu Ser Lys Ser Glu Thr Tyr Pro Phe
35 40 45
Leu Pro Gly Gly Pro Ile Leu Gln Gly Ser Val Asn Asp Pro Thr Thr
50 55 60
Phe Pro Pro Ala Asn Arg Met Asp Gly Ser His His Trp Ala Phe Glu
65 70 75 80
Arg Leu Leu Ser Ala Ala Leu Val Pro Met Thr Val Ser Ala Phe Ala
85 90 95
Val Ser Pro Thr Ala Tyr Pro Val Leu Asp Gly Val Leu Ala Val Ser
100 105 110
Leu Val Ile His Ser His Ile Gly Phe Asp Ser Cys Val Val Asp Tyr
115 120 125
Leu His Pro Arg Lys Tyr Pro Lys Ile Gly Pro Val Val Lys Trp Gly
130 135 140
Leu Arg Val Ala Thr Ala Gly Ala Leu Val Gly Val Tyr Gln Phe Asn
145 150 155 160
Thr Glu Asp Ile Gly Leu Thr Glu Leu Val Arg Arg Val Trp Leu Ala
165 170 175

Claims (4)

1.一对用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的引物对，所述引物对核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于检测禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求1所述的引物对。
3.一种禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的检测方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述引物对对样本基因组的DNA进行PCR扩增的步骤。
4.根据权利要求3所述禾谷丝核菌RCSdhD基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）提取禾谷丝核菌样本基因组DNA；
（2）以样本基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增；
PCR扩增体系为：2.5μl的10×PCR Buffer, 1.5μl的Mg2+, 2μl的10 mM的dNTP Mix,10mM的引物各0.5μl, 1μl的DNA Polymerase, 10 ng/μl的模板DNA 1μl，加ddH2O至25μl；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性，5 min；94℃变性1 min， 68℃退火30 s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min；
（3）对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，若电泳产物为长度为500bp的单一条带，则说明样本菌株为噻呋酰胺抗性菌株，且其RCSdhD基因的116位氨基酸由组氨酸突变为组氨酸和酪氨酸杂合物或者纯和的酪氨酸。
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