CN113278716B - 分析绵羊毛用性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种分析绵羊毛用性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，涉及生物技术领域，本发明提供了分析绵羊毛用特征的2849个SNP位点组合以及基于该位点组合制成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒，从基因水平对早期难以度量的性状进行检测，不仅能加速育种进程，节约育种成本，还能够用于绵羊品种的筛选、鉴定、绵羊系谱的重构、种质资源的保护以及种质资源的改良。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及绵羊检测技术领域，更具体的涉及分析绵羊毛用性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
绵羊是世界上最重要的经济动物之一，不仅可以作为食物供人类食用，还能作为奶制品的来源，此外，其毛用价值也在社会发展中发挥了重要作用。随着近年来毛织用品市场经济价值的不断走低，我国毛用为主的绵羊数量不断减少，但毛用制品的优势依然存在，为了更好的分析研究绵羊的毛用性能，获得更佳的优质的羊毛，同时也为了保护绵羊品种，已经有越来越多的科研工作者利用基因分析研究绵羊的毛用性状。
目前，分子标记技术由于其准确度高、可操作性强等优点越来越受到重视，其中基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）的分子标记技术应用得越来越广泛。SNP作为生物基因组中的一种遗传分子标记，在动植物遗传进化分析、重要经济形状筛选、分子育种等方面起着越来越重要的作用。基于SNP的SNP芯片是进行现代遗传育种便捷高效的工具，由于其容易实现SNP高通量、自动化检测，可以检测出基因组 DNA上每个碱基对的变化，包括插入、缺失、颠倒、转换等，已经成为非常理想的SNP检测技术，在绵羊育种领域中的运用也越来越多。
尽管已经商业化的绵羊SNP芯片（Illumina Ovine SNP50 Beadchip（50K）、Illumina Sheep HD Genotyping Beadchip（680K）和Illumina Ovine LD（5K）），覆盖了绵羊全基因组的超过 54K 个 SNP 位点，用于遗传育种、全基因组关联分析、数量性状基因座定位、基因优选及比较基因组学等研究。但是现有的绵羊SNP芯片由于主要依据西方品种绵羊的数据，缺乏中国绵羊品种与国外绵羊品种结合的 SNP 数据，仍存在位点均匀性不足、对功能性位点和区域的体现不足、超过10%的位点在中国绵羊群体为极低频位点等诸多问题，因此设计一款适用于中国绵羊群体且能对绵羊毛用性状进行快速有效检测的SNP芯片，有着十分重要的意义。
发明内容
为满足我国当前绵羊品种研究以及农业生产上对绵羊毛用的检测的需求，本发明提供了一种分析绵羊毛用的分子探针组合、基因芯片、试剂盒及应用，利用本发明提供的位点信息，能够快速准确的实现绵羊尾部脂肪沉积评价、品种筛选、品种鉴定、品种溯源、绵羊育种，有利于种质资源保护以及种质资源改良，耗时短、成本低、市场效益广阔。
为实现本发明的技术目的，本发明提供以下技术方案：
①2849个位点组合用于分析绵羊毛用性状的用途，所述2849个位点组合的物理位置信息基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定，所述2849个位点组合的物理信息如表1所示。
表1 2849个位点组合的物理信息
②分析绵羊毛用性状的方法，包括将待测绵羊的基因组DNA的2849个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述2849个SNP位点基因型进行比较；所述2849个SNP位点为表1所示的2849个SNP位点。
③分析绵羊毛用性状的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。
④分析绵羊毛用性状的基因芯片，所述基因芯片负载③所述的分子探针组合。
⑤分析绵羊毛用性状的试剂盒，其具有③所述的分子探针组合或④所述的基因芯片。
⑥分析绵羊毛用性状的方法，包括应用③所述的分子探针组合或④所述的基因芯片或⑤所述的试剂盒对待测样品进行检测。
⑦上述的分子探针组合或基因芯片或试剂盒具有如下任一所述的用途：（1）在评价绵羊毛用性状中的应用；（2）在绵羊品种筛选的应用；（3）在绵羊品种鉴定中的应用；（4）在绵羊品种溯源中的应用；（5）在绵羊育种中的应用；（6）在种质资源保护中的应用；（7）在种质资源改良中的应用；（8）在绵羊系谱重构中的应用。
有益效果：
1、本发明基于对国内外众多绵羊的遗传资源研究，提供一种仅由2849个SNP位点组成的绵羊毛用性状分析的SNP位点组合，本发明提供的SNP位点组合具有国内外通用性好，能快速从基因水平上对绵羊个体的毛用性状进行评价，以获得更准确的育种评估信息，对早期难以度量的毛用性状进行选择，缩短世代间隔，加速育种进程，节约育种成本；此外，利用本发明提供的毛用性状SNP位点组合，还能够从绵羊毛用性能的角度实现绵羊品种的鉴定和溯源，为种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。
2、基于本发明提供的绵羊毛用性状分析SNP位点形成的探针组合、基因芯片、试剂盒具有通量小、成本低，分析更容易，普适性广，市场前景广阔。
附图说明
图1是中国美利奴羊（细毛羊）Vs 阿勒泰羊（MFW versus ALS）组的曼哈顿图；
图2是中国美利奴羊（细毛羊）Vs 滩羊（MFW versus TAN）组的曼哈顿图；
图3是中国美利奴羊（超细毛羊）Vs 阿勒泰羊（MSF versus ALS）组的曼哈顿图；
图4是中国美利奴羊（超细毛羊）Vs 滩羊（MSF versus TAN）组的曼哈顿图；
图5是设德兰羊Vs 阿勒泰羊（SHE versus ALS）组的曼哈顿图；
图6是本申请对群体阈值分析的判定结果进行了显著性检验的结果图。
具体实施方式
下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。
在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。
需要说明的是，本发明所称的绵羊毛用性状是多个指标的综合体现，包括剪毛量、净毛率、毛长、毛细度，其中，剪毛量和净毛率是评价毛用绵羊品种的指标，剪毛量和净毛率越高，则该品种较好；毛吸细度是绵羊毛品质的重要物理指标，在细度相同的情况下，羊毛越长，纺纱性能越高，成品的品质越好。当该品种的剪毛量高、净毛率高，且毛细度好，羊毛长的情况下，则判定该品种的毛用性能好。当然，根据市场需求的不同，上述指标值可以调整，进而调整毛用性能的品种阈值，本发明不做限制。
本发明的所称的SNP是指单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。
需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、MinisatelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。
需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。
需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。在本发明的一个实施例中，其中包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液，或者还检测用的荧光标记。
实施例1 毛用性状SNP位点组合的获得
1、绵羊个体的选择
为了实现国内外绵羊品种的更加全面的覆盖，申请人对遍布于亚洲、欧洲、非洲和中东的248个绵羊个体进行遗传信息采集，其中包括16个野羊亚洲摩弗伦品种、172个地方品种和60个培育品种，具体涉及到中国山东的小尾寒羊、泗水裘皮羊、大尾寒羊、洼地绵羊，中国江苏的湖羊，中国宁夏的滩羊，中国新疆的阿勒泰羊、巴什拜羊、杜泊绵羊、中国美利奴羊（细毛羊）、中国美利奴羊（超细毛羊）、萨福克羊、策勒黑羊、多浪羊、Waggir Sheep羊，芬兰的芬兰羊（Finnsheep）、荷兰的威桑岛羊（Ouessant）、设德兰羊（Shetland）、索洛格诺羊（Solognote）、哥特兰岛羊（Gotland）、德伦特希思羊（Drente Heathen），埃塞俄比亚的邦加羊（Bonga Sheep）、阿法尔羊（Afar Sheep），尼日尔的姆博罗罗羊（Mbororo Sheep），尼日利亚的扬卡羊（Yankasa Sheep），非洲乍得的西非矮羊（West African Dwarf Sheep）、乌达羊（Uda Sheep），非洲布基纳法索的贾隆凯羊（Djallonké Sheep）、摩西羊（Mossi Sheep）、萨赫勒羊（Sahelian Sheep），西非喀麦隆的喀麦隆羊（Cameroon Sheep），伊拉克的阿华西绵羊（Awassi Sheep）、哈姆达尼羊（Hamdani Sheep），阿塞拜疆的马泽克羊（Mazekh Sheep），伊朗的灰设拉子羊（Grey-Shiraz Sheep）、盖泽尔羊（Ghezel Sheep）、阿夫沙里羊（AfshariSheep）、沙尔羊（Shal Sheep）、马奎羊（Makui Sheep）、莫哈尼羊（Moghani Sheep），巴基斯坦的卡拉库尔羊（Karakul Sheep），伊朗舍赫尔科德的亚洲摩弗伦（Asiatic mouflon）。
2、绵羊全基因的总SNP集合的获得
采用本领域常规方法采集步骤1中绵羊个体中载有遗传信息的样本，该样本包括但不限于血液、细胞、组织、皮肤、毛发、排泄物等。提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序，利用SAMtools和GATK两种方式与2015 年发布的绵羊4.0 参考基因组（从NCBI获得）进行对比，并将两种方式获得共同结果形成一个SNP集合，共计2836万个SNP位点，作为绵羊全基因的总SNP集合。
需要说明的是，本发明所称的遗传信息（genetic information）是指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息。
需要说明的是，提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序可以由生物公司完成，例如华大基因公司，illumina公司等，高深度测序方法采用本领域常规方法或生物公司的方法，在本发明的一个实施例中，采用平均测序深度为~25.7×，应用重测序分析流程进行高深度测序。
3、候选基因及所在功能区域的筛选
3.1 对不同毛用的绵羊遗传信息样本处理
筛选毛用的绵羊品种，并根据不同绵羊品种在毛用性状上表现出来的显著差异，对相应的遗传信息样本进行分组，在本发明的一个实施例中，发明人将中国美利奴羊（细毛羊）Vs 阿勒泰羊（MFW versus ALS）设为一组、中国美利奴羊（细毛羊）Vs 滩羊（MFW versusTAN）设为一组、中国美利奴羊（超细毛羊）Vs 阿勒泰羊（MSF versus ALS）设为一组、中国美利奴羊（超细毛羊）Vs 滩羊（MSF versus TAN）设为一组、设德兰羊Vs 阿勒泰羊（SHEversus ALS）设为一组。
3.2 对分组后不同毛用的绵羊遗传信息的处理
应用XP-CLR扫荡每个绵羊组之间的多基因座等位基因频率差异，扫描出与毛用相关的功能区域（扫描得到的曼哈顿图如图1-5所示，同时利用π ratio（即π值）挖掘每组中的绵羊品种中与毛用相关的功能区域，然后取两种结果的交集，筛选出毛用相关的功能区域。
参照已公开的基因研究成果对区域内的基因进行筛选，最终确定20个与毛用相关的、功能十分确定的候选基因BMP4、COL17A1、DSG2、DSG3、DSG4、FGF6、IGF1R、IRF2BP2、KATNAL1、KRT1、KRT17、KRT2、KRT5、KRT71、KRT72、KRT74、KRT77、LRRC15、PRKCA、TP63，进而通过perl脚本确定上述候选基因对应的功能区域。
4、毛用SNP位点组合的获得
利用bedtools在总的SNP集合中寻找步骤3中确定的候选基因所在功能区域对应的SNP位点，得到与BMP4、COL17A1、DSG2、DSG3、DSG4、FGF6、IGF1R、IRF2BP2、KATNAL1、KRT1、KRT17、KRT2、KRT5、KRT71、KRT72、KRT74、KRT77、LRRC15、PRKCA、TP63共20个毛用相关的功能基因相关联，且仅包含2849个snp位点的毛用位点组合。
实施例2引物组合及探针组合的制备
本领域技术人员根据本发明提供的毛用SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。
其中，二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如采用DNA folding form评估其二级结构，具体参见(
)，然后采用软件RaW-Probe评估其Tm值。
上述方法均为常规方法，根据本申请提供的毛用SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本申请提供的毛用SNP位点组合获得引物也属于本发明的保护范围。
同样的，利用本发明提供的毛用SNP位点组合制备探针，例如tanqman探针也属于本发明的保护范围。
实施例3基因芯片的制备
本申请的SNP基因芯片是采用常规方法将实施例2获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。
需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测绵羊毛用的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的毛用SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。
实施例4 绵羊毛用性状的分析试剂盒
本申请的提供的毛用SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得的为Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶、AceQUniversal U+ Probe Master Mix V2，TaqMan Probe等。
本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的绵羊毛用性状检测的SNP试剂盒，但是基于本申请提供的毛用SNP位点组合配置的绵羊毛用性状检测SNP检测试剂盒均属于本发明的保护范围。
实施例5 绵羊毛用性状的检测
基于本申请的实施例1提供的分析绵羊毛用性状的SNP位点组合对采购的绵羊进行毛用检测，同时观察绵羊的剪毛量、净毛率、毛长、毛细度，在本发明的一个实施例中，采用新疆细毛羊品种鉴定的引种的一级标准（GB/T 2426-1981）对绵羊进行观察，具体为：
采用常规方法采集绵羊的外周血，并其中的全基因组DNA；
采用常规方法根据本发明提供的SNP位点组合中的位点信息设计基因芯片，对待测绵羊的全基因组DNA进行检测，获得每只羊羔中每个位点的分型结果（即每个位点是否为纯合子、杂合子、突变型纯合子或碱基缺失的结果），通过计算每个位点的分型结果的频率值，并与群体阈值进行比较，获得检测结果。
观察结果显示，芯片检测结果显示优异的绵羊均为符合一级标准的绵羊，芯片结果显示较差的绵羊其毛用性能劣于符合一级标准的绵羊。
需要说明的是，本申请的所述群体阈值是通过对毛用性状好的群体以及毛用性状差的群体进行分析获得，方法同上。
本申请对毛用性状好的群体以及毛用性状差的群体进行分析的判定结果进行了显著性检验（独立样本曼惠特尼U检验），结果如图6所示，根据图中结果可以看出，P<0.01，差异极显著，可见采用本发明方法进行判定的结果具有准确性和有效性。
工业应用
本领域技术人员基于本申请提供的仅由2849个SNP位点组成的分析绵羊毛用性状的SNP位点组合形成的探针组合、基因芯片和试剂盒，在基因组水平上对绵羊个体的毛用性状进行评价和遗传评估，也可进行品种筛选、品种鉴定。对早期难以度量的性状进行选择，缩短世代间隔，加速育种进程，从而节约大量的育种成本，还能够应用于绵羊品种溯源和种质资源保护和种质资源改良中。
以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。
Claims (7)
1.2849个位点组合用于分析绵羊毛用性状的用途，所述2849个位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定，所述2849个位点组合的物理信息如表1所示。
2.分析绵羊毛用性状的方法，包括将待测绵羊的基因组DNA的2849个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述2849个SNP位点基因型进行比较；所述2849个SNP位点为表1所示的2849个SNP位点。
3.分析绵羊毛用性状的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
4.分析绵羊毛用性状的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求3所述的分子探针组合。
5.分析绵羊毛用性状的试剂盒，其具有权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片。
6.分析绵羊毛用性状的方法，包括应用权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。
7.权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒的用途，所述用途为如下任一所述的用途：
(1)在评价绵羊毛用性状中的应用；
(2)在绵羊品种筛选的应用；
(3)在绵羊品种鉴定中的应用；
(4)在绵羊品种溯源中的应用；
(5)在绵羊育种中的应用；
(6)在种质资源保护中的应用；
(7)在种质资源改良中的应用；
(8)在绵羊系谱重构中的应用。
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