CN117106935B - 分析山羊有无角性状的分子标记组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种分析山羊有无角性状的分子标记组合及其应用，涉及生物技术领域，本发明提供了能够分析山羊有无角性状特征的1720个分子标记，其物理位置信息基于山羊参考基因组ARS1的基因组序列比对确定，利用1720个SNP分子标记制成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒能够对山羊个体进行遗传评估，对早期难以度量的山羊有无角性状进行个体选择，缩短世代间隔，加速育种进程，从而节约大量的育种成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物检测技术领域，更具体的涉及山羊有无角SNP位点组合及其应用。
背景技术
物种在经历自然环境选择或人工选育的过程中，会逐渐形成独有的外貌形态和体型特征。据统计，目前我国现有山羊品种69个，其中地方品种58个。而山羊的角形态具有遗传多态性(有角或无角，存在遗传变异),确定角性状的遗传基础将为理解自然选择中不同形态的维持提供重要的理论基础。而且，山羊角作为山羊重要性状之一，还因其具有清热、镇惊、明目、解毒作用的药用价值。同时，角作为有蹄类动物的防卫武器，是头部表皮及真皮特化形成的产物。山羊大多无角，少部分品种有角。一般认为无角对有角为显性。角对野生动物非常重要，但在现代密集饲养条件下，角易对家畜造成撞伤，从而影响家畜的胴体、毛皮质量，且容易发生感染。从饲料转化率来讲，角也需要很多的营养物质转化而成。因此无角动物不仅便于管理而且更具经济价值，深受人们喜爱。随着目前高通量测序技术的飞速发展与完善，为从全基因组层面筛选经济性状候选基因成为可能。在品种筛选、品种溯源及种质资源的保护、开发利用也具有重要意义。
针对于目前品种多样且性状多变的山羊，如何快速筛选出有角或无角的山羊品种，分辨山羊角类型成为急需解决的问题，因此，设计一款适用于中国山羊群体且能对有无角性状进行快速有效检测的SNP芯片，有着十分重要的意义。
发明内容
为满足我国当前山羊品种研究以及农业生产上对山羊有无角性状检测的需求，本发明提供了一种分析山羊有无角性状的分子探针组合、基因芯片、试剂盒及应用，利用本发明提供的位点信息，能够快速准确的实现山羊有无角评价、品种筛选、品种鉴定、品种溯源、山羊育种，有利于种质资源保护以及种质资源改良，耗时短、成本低、市场效益广阔。
为实现本发明的技术目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种1720个SNP位点组合在分析山羊有无角的应用，所述1720个SNP位点组合的物理位置如表1所示：
表1 1720个位点组合的位置信息
其物理位置基于山羊参考基因组ARS1基因组序列比对确定。
第二方面提供一种分析山羊有无角的方法，将待测山羊的基因组DNA的1720个SNP位点基因型与对照山羊基因组DNA的所述1720个SNP位点基因型进行比较；
其中，所述1720个SNP位点为表1所述的1720个SNP位点。
第三方面提供一种分析山羊有无角的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于山羊参考基因组ARS1基因组序列比对确定。
第四方面、分析山羊有无角的基因芯片，所述基因芯片负载有第三方面所述的分子探针组合。
第五方面、分析山羊有无角的试剂盒，其具有第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片。
第六方面、分析山羊有无角的方法，应用第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒对待测样品进行检测。
第七方面、第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：
（1）在山羊有无角评价中的应用；
（2）在山羊有无角品种筛选的应用；
（3）在山羊有无角品种鉴定中的应用；
（4）在山羊有无角品种溯源中的应用；
（5）在山羊育种中的应用；
（6）在种质资源保护中的应用；
（7）在种质资源改良中的应用；
（8）在山羊系谱重构中的应用。
有益效果：
1、本发明基于对国内外众多山羊的遗传资源研究，提供一种仅由1720个SNP位点组成的分析山羊有无角的SNP位点组合，本发明提供的SNP位点组合不仅具有国内外通用性好，还能快速从基因水平上对早期不能显现的山羊有无角性状进行评价，获取更准确的育种评估信息，控制育种进程，利用上述位点组合还能对山羊品种进行筛选、鉴定和溯源，为种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。
2、本发明提供的分析山羊有无角的探针组合、基因芯片、试剂盒还具有通量小、成本低，分析更容易的特点，普适性广，市场前景广阔。
附图说明
图1是有角山羊品种和无交山羊品种组的曼哈顿图；
图2是本申请对群体阈值分析的判定结果进行了显著性检验的结果图。
具体实施方式
下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。
在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。
需要说明的是，本发明所称的山羊有无角是根据山羊有无角进行划分。
本发明的所称的SNP是指单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。
需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、MinisatelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。
需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。
需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。在本发明的一个实施例中，其中包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液，或者还检测用的荧光标记。
实施例1 有无角性状SNP位点组合的获得
1、山羊个体的选择
为了实现国内外山羊品种的更加全面的覆盖，本发明对对全球范围内的68个山羊品种的361个个体进行重测序，各个品种为：
Nera Verzasca Goat、Capra Grigia Goat、Peacock Goat孔雀山羊、ValaisBlacknecked Goat瓦莱黑颈羊、St., Gallen Booted Goat、Booted Goat、Appenzell Goat阿彭策尔山羊、Toggenburg Goat吐根堡山羊、Saanen Goat萨能山羊、Chamois ColoredGoat查莫色山羊、Poitevine Goat布瓦特山羊、Lorraine Goat、Savoie Goat萨瓦山羊、Alpine Goat阿尔拜因山羊、Fosses Goat福塞山羊、Pyrenees Goat比利牛斯山羊、Provencale Goat普罗旺斯山羊、Rove Goat罗芙山羊、Modern Old Irish Goat现代老爱尔兰山羊、Grisons Striped Goat条纹灰山羊、Laoshan Dairy Goat崂山奶山羊、NorwegianGoat、Dera Din Panah Goat、Teddy Goat、Barbari Goat巴巴里山羊、Pahari Goat、BeetalGoat甜菜山羊、Nachi Goat、Daer Goat简州大耳羊、Macheng Black Goat麻城黑山羊、Kamori Goat、Pak-Angora Goat巴基斯坦安哥拉山羊、Jining Gray Goat济宁青山羊、Black Bengal Goat孟加拉黑山羊、Leizhou Goat雷州山羊、Longlin Goat、LiaoningCashmere Goat辽宁绒山羊、Cashmere Goat绒山羊、Hamedan Ecotype、Local Population、Soudanaise Goat、Sud Ouest Goat、Naine Goat、Modern Togolese Village Goat现代到哥乡村山羊、Maure Goat摩尔山羊、Targui Goat、Peulh Goat、Guera Goat盖拉山羊、Tunisian Goat、Woyito Guji Goat、Galla Goat五倍子山羊、Pare White Goat白山羊、Maasai Goat马赛山羊、Sonjo Goat松乔山羊、Keffa Goat、Gumez Goat、Abergelle Goat阿伯盖勒山羊、Landin Goat、Mashona Goat、Matebele Goat马特比利、Malya Goat、WhiteChanthangi Goat、Boer Goat波尔山羊、Diana Goat黛安娜山羊、Angora Goat安哥拉山羊、Sofia Goat索菲亚山羊、Androy Goat和罗伊山羊、Menabe Goat梅纳贝山羊。
需要说明的是，上述山羊的部分品种名称暂无正式中文译文，目前仍使用英文名称。
2、山羊全基因的总SNP集合的获得
采用本领域常规方法采集步骤1中山羊个体中载有遗传信息的样本，该样本包括但不限于血液、细胞、组织、皮肤、毛发、排泄物等。提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序，通过SAMtools和GATK两种方式于2016年发布的山羊参考基因组（从NCBI获得）进行比对，两种方式比对获得的共同结果形成一个SNP集合，共包含17,668,737 个全基因组水平的单核苷酸变异。从这些品种中挑选出与有无角相关的山羊个体36个。
需要说明的是，本发明所称的遗传信息（genetic information） 是指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息。
需要说明的是，提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序可以由生物公司完成，例如华大基因公司，illumina公司等，高深度测序方法采用本领域常规方法或生物公司的方法，在本发明的一个实施例中，采用平均测序深度为~25.7×，应用重测序分析流程进行高深度测序。
3、候选基因及所在功能区域的筛选
根据全世界范围内山羊品种在角性状上表现出来的显著差异进行分组，归纳出有角与无角的所有品种个体，按有无角分为两组进行选择消除分析，即将有角的matou goat（马头山羊）、Toggenburg goat（吐根堡山羊）、alpine goat（阿尔拜因山羊）和无角的grisons striped goat（条纹灰山羊）成组进行消除分析。
本发明使用计算π值与fst值扫荡两组山羊之间的核苷酸碱基多态性与基因座等位基因频率差异扫描出与有无角大小相关的功能区域，两种方法的计算结果取交集，筛选出与有无角相关的功能区域，通过π值作出的有无角性状的不同组别产生的如图1所示曼哈顿图，参照已公开的基因研究成果对区域内的基因进行筛选，最终确定1个与有无角性状相关的、功能十分确定的候选基因FOXL2。进而通过perl脚本确定上述候选基因对应的功能区域。
4、有无角的SNP位点组合的获得
利用bedtools在总的SNP集合中寻找步骤3中确定的候选基因所在功能区域对应的SNP位点，得到与FOXL2共1个有无角性状相关的功能基因相关联，且仅包含1720个snp位点的有无角性状位点组合。
实施例2 将有无角性状SNP位点组合用于制备引物组合及探针组合
本领域技术人员根据本发明提供的有无角性状SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。
其中，二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如采用DNA folding form评估其二级结构，具体参见（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form），然后采用软件RaW-Probe评估其Tm值。
上述方法均为常规方法，根据本申请提供的有无角的SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本发明提供的SNP位点组合获得的引物也属于本发明的保护范围。
同样的，利用本发明提供的SNP位点组合制备探针，例如tanqman探针也属于本发明的保护范围。
实施例3 将分析有无角的SNP位点组合用于制备基因芯片
本发明的SNP基因芯片是采用常规方法将实施例2获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。
需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测山羊有无角的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的有无角分析的SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。
实施例4 山羊有无角性状的分析试剂盒
本申请的提供的有无角分析的SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得的为Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶、AceQUniversal U+ Probe Master Mix V2，TaqMan Probe等。
本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的山羊有无角性状检测的SNP试剂盒，但是基于本申请提供的有无角性状SNP位点组合配置的山羊有无角性状SNP检测试剂盒均属于本发明的保护范围。
实施例5 山羊有无角性状的检测
基于本申请的实施例1提供的分析山羊有无角的SNP位点组合对无角和有角的山羊进行基因检测，根据检测结果，并结合已知的角的性状，判断检测的准确性，具体为：
采用常规方法采集山羊的外周血，并提取其中的全基因组DNA，获得全基因组DNA样本；
采用常规方法根据本发明提供的SNP位点组合中的位点信息设计基因芯片，对山羊的全基因组DNA样本进行检测，获得山羊中每个位点的分型结果（即每个位点是否为纯合子、杂合子、突变型纯合子或碱基缺失的结果），计算每个位点的分型结果的频率值，并与群体阈值进行比较，比较结果显示，基因检测结果与相应的山羊角的表型一致。
需要说明的是，本申请的所述群体阈值是通过对有角和无角的群体进行分析获得，方法同上。
本申请对无角山羊群体，有角山羊群体进行分析的判定结果进行了显著性检验（独立样本曼惠特尼U检验），结果如图2所示，根据图中结果可以看出，P<0.01，差异极显著，可见采用本发明方法进行判定的结果具有准确性和有效性。
工业应用
本领域技术人员基于本申请提供的仅由1720个SNP位点组成的分析山羊有无角的SNP位点组合可以制成的分析山羊有无角的SNP探针组合及基因芯片、试剂盒，能够从基因组水平上对山羊个体的有无角进行分析，遗传信息评估、品种筛选、品种鉴定，控制育种进程，还能应用于山羊品种溯源、山羊系谱重构、种质资源保护和种质资源改良。
以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。
Claims (7)
1.1720个SNP位点组合在分析山羊有无角的应用，所述1720个SNP位点组合的物理位置如下表所示：
其物理位置基于山羊参考基因组ARS1的基因组序列比对确定。
2.分析山羊有无角的方法，包括将待测山羊的基因组DNA的1720个SNP位点基因型与对照山羊基因组DNA的所述1720个SNP位点基因型进行比较的步骤；
其中，所述1720个SNP位点为权利要求1中所述的1720个SNP位点。
3.分析山羊有无角的分子探针组合，所述分子探针组合为检测待测山羊样品的基因组中如权利要求1中所示的1720个SNP位点的分子探针组合，所述权利要求1中的位点组合的物理位置信息基于山羊参考基因组ARS1基因组序列比对确定。
4.分析山羊有无角的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求3所述的分子探针组合。
5.分析山羊有无角的试剂盒，其具有权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片。
6.分析山羊有无角的方法，应用权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。
7.权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒在如下任一中的应用：
（1）在山羊有无角评价中的应用；
（2）在山羊有无角品种筛选的应用；
（3）在山羊有无角品种鉴定中的应用；
（4）在山羊有无角品种溯源中的应用；
（5）在山羊有无角育种中的应用；
（6）在山羊系谱重构中的应用。
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