CN103120143B - 一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，包括以下步骤：1）以包含鸡VLDLR基因的DNA序列为模板，设计一对引物，利用PCR-RFLP方法进行样本鸡个体基因分型；2）利用基因效应分析模型，确定选留基因型；3）将符合选留基因型的公母鸡个体组建家系；4）提取选留家系鸡后代的DNA，以步骤1）中的一对引物进行PCR-RFLP分析，选留其中为步骤2）中选留基因型的鸡；5）重复步骤3）和4）继代选育至少三代，得到低蛋黄胆固醇含量蛋鸡。本发明采用极低密度脂蛋白受体VLDLR基因分子标记辅助选择育种方法，培育出的蛋鸡蛋黄胆固醇含量可比原有水平降低20%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，属于禽类遗传育种技术领域。
背景技术
胆固醇是动物细胞各种膜相结构及神经髓鞘的重要组成部分，是胆汁酸、类固醇激素及维生素D3的前体，具有重要的生理功能。但是机体如果摄入大量的胆固醇会导致血液中其含量明显升高，而这正是引起冠状动脉硬化、脑血栓等心血管疾病发生的重要因素之一。美国心脏研究协会早在上世纪70年代初推荐每天胆固醇摄入量应低于300毫克。膳食胆固醇来源于动物性食物，而鸡蛋是动物性食品中胆固醇含量较高的一种。研究表明，鸡蛋中的胆固醇是影响人血浆中总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）水平的重要因素。从改善人们的饮食和健康、提高养殖水平的角度考虑，降低鸡蛋中胆固醇含量具有非常重要的意义。目前降低鸡蛋中胆固醇的方法主要有两种：一是通过常规育种途径选择低蛋黄胆固醇含量的蛋鸡新品系；二是通过饲料营养调控，即采用在饲粮中添加一些营养性、非营养性的添加剂或降脂药物等。但是采用常规育种技术，由于历经时期长，育种进展缓慢，费力、费资金；采用饲料营养调控的方式，虽效果明显但其中的添加剂或药物残留问题以及对生产性能和环境卫生的影响也不容忽视。因此，解决蛋黄胆固醇含量高的问题，最根本的途径还是通过现代的分子育种技术培育低蛋黄胆固醇含量蛋鸡新品系。
发明内容
本发明的目的是提供一种历时短、成本低、安全的低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，包括以下步骤：
1）提取样本鸡DNA，以包含鸡VLDLR基因的DNA序列为模板，设计一对引物，利用PCR-RFLP方法进行样本鸡个体基因分型；PCR-RFLP酶切片段是一个片段，片段大小为293bp，命名为TT型；PCR-RFLP酶切片段是两个片段，片段大小分别为214bp和79bp，命名为CC型；PCR-RFLP酶切片段是三个片段，片段大小分别为293bp、214bp和79bp，命名为CT型；
2）利用基因效应分析模型，将不同基因型与样本鸡个体蛋黄胆固醇含量及全蛋胆固醇含量进行关联分析，比较不同基因型的蛋黄胆固醇含量，确定选留基因型；
3）将符合选留基因型的公母鸡个体组建家系，繁殖下一代；
4）提取选留家系鸡后代的DNA，以步骤1）中的一对引物进行PCR-RFLP分析，选留其中为步骤2）中选留基因型的鸡；
5）重复步骤3）和4）继代选育至少三代，得到低蛋黄胆固醇含量蛋鸡。
所述引物为：
正向引物：5'-CTCGCTGAGGCTCGTGTT-3′；
反向引物：5'-GAAATGGTATGCCGAAGT-3′。
所述PCR反应体系为：超纯水3.5μL，10pmol/μL的上游引物0.5μL，10pmol/μL的下游引物0.5μL，50ng/μL DNA模板0.5μL，2×Taq Master Mix5.0μL，反应总体积10μL。
所述PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃充分延伸10min，4℃保存，其中变性、退火、延伸共30个循环。
所述PCR-RFLP酶切体系为：Eco72I内切酶0.3μL，10×PCR Buffer2μL，PCR产物10μL，超纯水7.7μL，反应总体积20μL。
所述基因效应分析模型：Y=μ+G+E，其中：Y为蛋品质测定的观察值；μ为群体平均值；G为基因型固定效应；E为随机误差。
所述选留基因型为TT型。
所述步骤3）的具体方法为：采用闭锁群选育法进行纯系选育，组建家系50个，公母比例1:10，个体笼饲养至40周龄，记录每只母鸡的产蛋数，40周龄时的平均蛋重和蛋黄胆固醇含量，计算50个家系全部母鸡和每个家系母鸡的产蛋数、蛋重和蛋黄胆固醇含量3个性状的均值；以蛋黄胆固醇含量为主选性状，兼顾蛋重和产蛋数，选留蛋黄胆固醇含量低于50个家系全部母鸡均值，蛋重和产蛋量高于50个家系全部母鸡均值的前15个家系，繁殖下一代。
本发明采用VLDLR基因分子标记辅助选择育种方法，缩短世代间隔、提高选种准确性、减少育种群饲养量、降低饲养成本。本发明方法培育出的蛋鸡具有良好的生产性能和鸡蛋品质，其蛋黄胆固醇含量可比原有水平降低20%以上，符合消费者对于鸡蛋消费的健康要求。
附图说明
图1为鸡基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为鸡VLDLR基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为鸡VLDLR基因PCR产物酶切多态电泳图；
图4为鸡不同基因型测序图。
具体实施方式
实施例1
选留样本鸡的筛选
1、样本鸡DNA的提取
在育种的基础群中，选取样本鸡500只单笼饲养，提取样本鸡的DNA，步骤如下：
1）DNA提取：80μL全血中分别加入500μL TE缓冲液，SDS裂解液(25%)12μL，及蛋白酶K(10mg/L)10μL，震荡混匀30min，57℃水浴消化过夜；加入Tris饱和酚602μL，振荡摇匀10min，10,000r/min离心10min；取上清液，加入Tris饱和酚500μL，振荡摇匀10min，10,000r/min离心10min；取上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，缓慢摇匀10min，1,2000r/min离心10min；取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，缓慢摇匀10min，1,0000r/min离心10min；取上清液，加入2倍体积预冷至-20℃无水乙醇，震荡10min，10,000r/min离心10min；弃上清液，加入70%乙醇500μL震荡10min，10,000r/min离心15min，重复两次；倒置自然干燥，加入适量TE溶液溶解DNA。
2）DNA检测：将制胶器清洗干净，插入梳子；秤取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入1×TBE60mL，微波炉中火加热至无气泡；在锥形瓶中加入EB溶液，使其终浓度为0.5μg/mL，轻摇混匀；溶液冷却至60℃，倒入制胶器内；待溶液完全冷却凝固后，拔去梳子，将凝胶转入电泳槽中；向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，液面高出凝胶5mm；DNA样品2μL，加入2μL上样缓冲液混匀后统一上样；120V电压电泳30min后，利用紫外分析仪进行观察；而后用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量及OD260/OD280的比值；如比值大于1.8，则说明有RNA的存在，需进行纯化；如降解明显则重新提取相应样品DNA。
本发明基因组DNA的琼脂糖检测结果见图1。从图1中可以看出，本发明提取的鸡基因组DNA的质量非常高。
2、PCR扩增
1）引物的设计与合成
以Genebank公布的鸡极低密度脂蛋白受体基因（VLDLR）序列（NCBI：NW001488835.1和Ensembl：ENSGALT00000034683）为模板，利用Oligo6.71和Primer Premier5.0引物设计软件在VLDLR基因5′-侧翼区设计引物，如下：
正向引物：5'-CTCGCTGAGGCTCGTGTT-3'（SEQ ID NO:1）
反向引物：5'-GAAATGGTATGCCGAAGT-3'（SEQ ID NO:2）
2）PCR扩增
PCR反应体系如表1。
表1PCR反应体系
| 组分 | 体积 |
| 2×Taq Master Mix | 5μL |
| 上游引物(10pmol/μL) | 0.5μL |
| 下游引物(10pmol/μL) | 0.5μL |
| DNA模板(50ng/μL) | 0.5μL |
| 超纯水 | 3.5μL |
| 总体积 | 10μL |
PCR反应程序如表2。
表2PCR扩增程序
PCR扩增产物4℃保存。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。从图2中可以看出，PCR扩增产物片段大小为293bp，与理论设计的大小一致，因此可以证明已成功扩增出鸡VLDLR基因片段。
3、PCR-RFLP分析
1）酶切消化反应程序如表3。
表3限制性酶切体系
| 组分 | 体积 |
| 10×PCR Buffer | 2μL |
| PCR产物 | 10μL |
| Eco72I内切酶 | 0.3μL |
| 超纯水 | 7.7μL |
| 总体积 | 20.0μL |
2）PCR产物酶切多态电泳图，如图3所示。根据图像中酶切产物的片段大小，人工判断统计基因型。当PCR-RFLP酶切片段是一个片段，片段大小为293bp，命名为TT型；当PCR-RFLP酶切片段是两个片段，片段大小分别为214bp和79bp，命名为CC型；当PCR-RFLP酶切片段是三个片段，片段大小分别为293bp、214bp和79bp，命名为CT型。分别对不同基因型进行测序，结果如图4所示。从图4中可以看出，VLDLR基因的10428bp处为多态位点。
4、胆固醇含量测定
在选择的色谱条件下，胆固醇的保留时间为9min。以胆固醇浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50mg/mL的标准胆固醇工作液上样，上样量为5μL，以峰面积为纵坐标Y、胆固醇浓度为横坐标X绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程为Y=2258X+12.33，相关系数R2=0.999。该群体中鸡蛋蛋黄中胆固醇平均含量及全蛋中胆固醇平均含量分别为13.86mg/g蛋黄和469.83mg/100g全蛋。
5、不同基因型与蛋黄胆固醇含量及全蛋胆固醇含量的关联性分析
利用基因效应分析模型，将不同基因型与蛋黄胆固醇含量及全蛋胆固醇含量的关联性分析结果，结果见表4。基因效应分析模型：
Y=μ+G+E
其中，Y为蛋品质测定的观察值；μ为群体平均值；G为基因型固定效应；E为随机误差。
表4g.10428T>C位点与胆固醇含量的关联分析
注：数值为平均数±标准误；字母相同表示差异不显著，小写字母表示差异显著，无标注表示差异不显著。
从表4可以看出，在g.10428T>C位点上，不同基因型的蛋黄胆固醇含量和全蛋胆固醇含量均差异显著（P<0.05），其中TT型个体蛋黄胆固醇含量（mg/g蛋黄）分别比CC型个体和CT型个体低13.20%和12.29%，TT型个体全蛋胆固醇含量（mg/100g全蛋）分别比CC型个体和CT型低11.91%和12.85%。对选育低蛋黄胆固醇含量的蛋鸡品系来说，g.10428T>C可作为分子标记，TT型为选留基因型。
实施例2
将实施例1中选留基因型的样本鸡采用闭锁群选育法进行纯系选育，组建家系50个，公母比例1:10，个体笼饲养至40周龄，记录每只母鸡的产蛋数，40周龄时的平均蛋重和蛋黄胆固醇含量，计算50个家系全部母鸡和每个家系母鸡的产蛋数、蛋重和蛋黄胆固醇含量3个性状的均值，见表5。以蛋黄胆固醇含量为主选性状，兼顾蛋重和产蛋数，选留蛋黄胆固醇含量低于群体均值，蛋重和产蛋量高于群体均值的前15个家系，繁殖下一代，见表6。
表550个家系全部母鸡和每个家系母鸡的产蛋数、蛋重和蛋黄胆固醇含量3个性状的均值
| 性状 | 家系最低均值 | 家系最高均值 | 群体均值 |
| 产蛋数（个） | 87.34 | 91.12 | 89.09 |
| 蛋重（g） | 49.03 | 52.71 | 50.83 |
| 蛋黄胆固醇含量（mg/g蛋黄） | 11.96 | 13.11 | 12.71 |
其中，群体均值为50个家系全部母鸡的均值。
表6选留家系的产蛋数、蛋重和蛋黄胆固醇含量3个性状的均值
| 性状 | 家系最低均值 | 家系最高均值 | 群体均值 |
| 产蛋数（个） | 89.12 | 91.12 | 89.85 |
| 蛋重（g） | 50.93 | 52.23 | 51.44 |
| 蛋黄胆固醇含量（mg/g蛋黄） | 11.96 | 12.65 | 12.36 |
其中，群体均值为50个家系全部母鸡的均值。
实施例3
提取实施例2中选留家系鸡2周龄后代的DNA，以实施例1中的一对引物进行PCR-RFLP分析，根据候选个体的VLDLR基因分子标记g.10428T>C，选留TT型进行早期分子标记辅助选择。
实施例4
实施例3中选留的TT型个体以实施例2、3的方式进行进一步选择，继代选育3代，得到低蛋黄胆固醇含量蛋鸡。
经测定实施例4的低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的蛋黄胆固醇平均含量已从0世代的13.86mg/g蛋黄下降为3世代的10.72mg/g蛋黄，下降幅度为22.66%。
Claims (7)
1.一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样本鸡DNA，以包含鸡VLDLR基因的DNA序列为模板，设计一对引物，利用PCR-RFLP方法进行样本鸡个体基因分型；PCR-RFLP酶切片段是一个片段，片段大小为293bp，命名为TT型；PCR-RFLP酶切片段是两个片段，片段大小分别为214bp和79bp，命名为CC型；PCR-RFLP酶切片段是三个片段，片段大小分别为293bp、214bp和79bp，命名为CT型；
2）利用基因效应分析模型，将不同基因型与样本鸡个体蛋黄胆固醇含量及全蛋胆固醇含量进行关联分析，比较不同基因型的蛋黄胆固醇含量，确定选留基因型；
3）将符合选留基因型的公母鸡个体组建家系，繁殖下一代；
4）提取选留家系鸡后代的DNA，以步骤1）中的一对引物进行PCR-RFLP分析，选留其中为步骤2）中选留基因型的鸡；
5）重复步骤3）和4）继代选育至少三代，得到低蛋黄胆固醇含量蛋鸡；
所述步骤3）的具体方法为：采用闭锁群选育法进行纯系选育，组建家系50个，公母比例1:10，个体笼饲养至40周龄，记录每只母鸡的产蛋数，40周龄时的平均蛋重和蛋黄胆固醇含量，计算50个家系全部母鸡和每个家系母鸡的产蛋数、蛋重和蛋黄胆固醇含量3个性状的均值；以蛋黄胆固醇含量为主选性状，兼顾蛋重和产蛋数，选留蛋黄胆固醇含量低于50个家系全部母鸡均值，蛋重和产蛋量高于50个家系全部母鸡均值的前15个家系，繁殖下一代。
2.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述引物为：
正向引物：5'-CTCGCTGAGGCTCGTGTT-3'；
反向引物：5'-GAAATGGTATGCCGAAGT-3'。
3.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：超纯水3.5μL，10pmol/μL的上游引物0.5μL，10pmol/μL的下游引物0.5μL，50ng/μL DNA模板0.5μL，2×Taq Master Mix5.0μL，反应总体积10μL。
4.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃充分延伸10min，4℃保存，其中变性、退火、延伸共30个循环。
5.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述PCR-RFLP酶切体系为：Eco72I内切酶0.3μL，10×PCR Buffer2μL，PCR产物10μL，超纯水7.7μL，反应总体积20μL。
6.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述基因效应分析模型：Y=μ+G+E，其中：Y为蛋品质测定的观察值；μ为群体平均值；G为基因型固定效应；E为随机误差。
7.根据权利要求1所述的一种低蛋黄胆固醇含量蛋鸡的培育方法，其特征在于，所述选留基因型为TT型。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |