CN112111580B - 青峪猪源性成分的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了青峪猪源性成分的鉴别方法。本发明基于19个线粒体SNP位点组合或9个核心线粒体SNP位点组合对青峪猪与其他猪种进行鉴别与区分。上述SNP位点是通过大样本猪线粒体DNA序列比对和智能算法筛选获得的，能够有效区分青峪猪与非青峪猪。采用多重RT‑PCR熔解曲线法能同步鉴定受试验品上述位点组合中的9个核心位点的基因型，进而完成对样品青峪猪或青峪猪肉真伪的鉴定。本方法解决了肉种鉴别领域中地方特色品种鉴定难题，具有检测准确、快速、成本低的优点，对保护优质地方黑猪品牌，促进黑猪产业健康、快速发展具有重要意义。

Description

青峪猪源性成分的鉴别方法
技术领域
本发明属于分子生物学和食品检测技术领域，具体地说，涉及青峪猪源性成分的鉴别方法。
背景技术
青峪猪，作为湖川山地猪的典型代表，是我国优良的地方猪种之一，主产于大巴山地区，属中熟、中型肉脂兼用的山地型地方品种。青峪猪具有适应性强、耐粗性好、生长发育快、抗病力强，富含雪花肉、肉色鲜红、肉味香浓、肉质细嫩等优点，具有较高的营养价值和经济价值。
然而，以价低的普通猪肉冒充价高的地方特色黑猪肉事件频频发生，不仅严重侵害了消费者利益，而且阻碍了猪肉产业的整体结构升级。
目前尚无有效的青峪猪的准确品种鉴别方法，其他地方特色畜禽品种的鉴定大多通过染色体SNP位点组合，结合高分辨质谱的方法鉴定的。染色体SNP的多态性高，非连锁不平衡性位点容易寻找，但正由于其突变几率高、基因型多样，也造成了建模需要样本量大，品种聚类效果不明显，所需SNP位点数多，需要大型精密仪器，检测成本高、时间长、假阳性多等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供青峪猪源性成分的鉴别方法。
本发明的另一目的是提供用于鉴定青峪猪的SNP标记组合及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于鉴定青峪猪的核心SNP标记组合，所述核心SNP标记组合包括SNP1～SNP9共9个SNP位点，各SNP位点的物理位置参考猪线粒体基因组序列GenBank:NC_012095.1确定如下：SNP1位于线粒体上第2179bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP2位于线粒体上第8845bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP3位于线粒体上第12575bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为G或A；SNP4位于线粒体上第1503bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP5位于线粒体上第13692bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP6位于线粒体上第13899bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP7位于线粒体上第10259bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A；SNP8位于线粒体上第10261bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为A或G；SNP9位于线粒体上第10410bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A。
9个位点都为青峪猪基因型时判定待测样品中包含青峪猪源性成分，9个位点中至少有一个是非青峪猪基因型时即判定为非青峪猪，根据建模样本统计计算结果，9个核心SNP位点(SNP1～SNP9)判定准确率理论上≥85.27％。
第二方面，本发明提供用于鉴定青峪猪的SNP标记组合，包括9个核心SNP标记和10个扩展SNP标记；其中，9个核心SNP标记包括上述SNP1～SNP9共9个SNP位点；10个扩展SNP标记包括SNP10～SNP19共10个SNP位点；
对于SNP10～SNP19，各SNP位点的物理位置参考猪线粒体基因组序列GenBank:NC_012095.1确定如下：SNP10位于线粒体上第1119bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP11位于线粒体上第14517bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为C或T；SNP12位于线粒体上第14595bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为A或G；SNP13位于线粒体上第9759bp，多态性为C/A，青峪猪为C，非青峪猪为A或C；SNP14位于线粒体上第14870bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP15位于线粒体上第15037bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP16位于线粒体上第10297bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP17位于线粒体上第4498bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为C或T；SNP18位于线粒体上第4490bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为C或T；SNP19位于线粒体上第1793bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为C或T。
19个位点都为青峪猪基因型时判定待测样品中包含青峪猪源性成分，19个位点中至少有一个是非青峪猪基因型时即判定为非青峪猪，根据建模样本统计计算结果，判定准确率理论上≥94.57％。
第三方面，本发明提供用于检测所述SNP标记组合的引物、探针、芯片、试剂盒等。
其中，用于检测所述核心SNP标记组合的引物，包括引物对QY1-1、QY1-2、QY1-3、QY2-1、QY2-2和QY2-3共6对引物，具体如下：
用于检测SNP1的引物对QY1-1，由QY1-1F和QY1-1R组成，引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；
用于检测SNP2的引物对QY1-2，由QY1-2F和QY1-2R组成，引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；
用于检测SNP3的引物对QY1-3，由QY1-3F和QY1-3R组成，引物序列如SEQ ID NO:5-6所示；
用于检测SNP4的引物对QY2-1，由QY2-1F和QY2-1R组成，引物序列如SEQ ID NO:7-8所示；
用于检测SNP5和SNP6的引物对QY2-2，由QY2-2F和QY2-2R组成，引物序列如SEQ IDNO:9-10所示；
用于检测SNP7、SNP8和SNP9的引物对QY2-3，由QY2-3F和QY2-3R组成，引物序列如SEQ ID NO:11-12所示。
其中，引物对QY2-2与QY2-3中各含有一个碱基错配位点。引物QY2-2F包含1个碱基错配位点，位于线粒体上(GenBank:NC_012095.1)第13691bp，正常碱基为C，错配碱基为G；引物QY2-3R包含1个碱基错配位点，位于线粒体上(GenBank:NC_012095.1)第10409bp，正常碱基为G，错配碱基为A。
第四方面，本发明提供含有SEQ ID NO:1-12所示引物的检测试剂或试剂盒，或者包含用于检测所述核心SNP标记组合或所述SNP标记组合的引物及探针等的检测产品。
第五方面，本发明提供所述引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在青峪猪的鉴定、选育或青峪猪源性成分鉴别中的应用。
第六方面，本发明提供青峪猪源性成分的鉴别方法，包括：提取待测样本DNA，利用SEQ ID NO:1-12所示引物进行实时荧光定量PCR，检测9个核心SNP位点的基因型，通过比较扩增产物的熔解曲线峰是否存在对应阳性峰型，以及根据熔解曲线峰Tm值来判定待测样本是否包含青峪猪源性成分。
前述的方法，优选将引物对QY1-1、QY1-2和QY1-3加至同一反应孔或反应管内，将引物对QY2-1、QY2-2和QY2-3加至另一反应孔或反应管内，同步或分别进行三重实时荧光定量PCR反应。上述引物是根据产物Tm值进行分组的。组内引物特异性较好，无交叉扩增。同一组内不同产物对应不同的Tm值，能够用RT-PCR熔解曲线法进行快速准确区分。
进一步地，实时荧光定量PCR反应体系如下：
反应体系A：Premix预混液12.5μL，5μM QY1-1F和QY1-1R各0.2～0.3μL，5μM QY1-2F和QY1-2R各0.2～0.3μL，5μM QY1-3F和QY1-3R各1.2～1.4μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL；优选地，反应体系A：Premix预混液12.5μL，5μM QY1-1F和QY1-1R各0.3μL，5μM QY1-2F和QY1-2R各0.25μL，5μM QY1-3F和QY1-3R各1.4μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL。
反应体系B：Premix预混液12.5μL，5μM QY2-1F和QY2-1R各0.6～0.7μL，5μM QY2-2F和QY2-2R各0.6～0.8μL，5μM QY2-3F和QY2-3R各1.2～1.4μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL；优选地，反应体系B：Premix预混液12.5μL，5μM QY2-1F和QY2-1R各0.7μL，5μM QY2-2F和QY2-2R各0.8μL，5μM QY2-3F和QY2-3R各1.4μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL。
实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10～15s，58～62℃退火及延伸20～45s，共30个循环。反应条件优选为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，30个循环。
熔解曲线的制作条件为：95℃1min，70℃1min，以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度。
前述的方法，根据熔解曲线峰的数量以及是否出现在对应位置来判定待测样本是否包含青峪猪源性成分；
引物对QY1-1对应的扩增产物Tm值为72.0～74.5℃，引物对QY1-2对应的扩增产物Tm值为75.0～76.5℃，引物对QY1-3对应的扩增产物Tm值为79.0～80.5℃，引物对QY2-1对应的扩增产物Tm值为73.0～75.5℃，引物对QY2-2对应的扩增产物Tm值为77.0～78.5℃，引物对QY2-3对应的扩增产物Tm值为79.0～80.5℃。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种用于鉴定湖川山地猪(青峪猪)的由19个线粒体单核苷酸多态性(SNP)位点组成的位点组合、多重实时荧光链式聚合酶反应(RT-PCR)熔解曲线鉴定方法和试剂盒。SNP位点通过大样本猪线粒体DNA序列比对和智能算法筛选和挖掘出，能够有效区分青峪猪与非青峪猪。多重RT-PCR熔解曲线法能同步鉴定待测样品上述位点组合中的9个位点基因型，进而完成对样品青峪猪或青峪猪肉真伪的鉴定。本发明基于SNP特征位点和碱基错配位点的多重RT-PCR熔解曲线法方法具有良好的特异性和较高的灵敏度，保证该方法能够特异性的检出青峪猪成分，减少了假阳性率。本发明实现了青峪猪低成本快速检测，对于保护地方特色猪种资源，净化和提升黑猪肉价值，铸造高端品牌壁垒，提升龙头企业品牌价值，推动畜牧业高值化发展意义重大，另外有助于提升黑猪产业对假冒肉及其制品的甄别能力，并对净化产业链、提高产业信誉度、避免假冒原料和产品对产业的危害具有重要意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中鉴别青峪猪A组熔解曲线峰。
图2为本发明较佳实施例中鉴别青峪猪B组熔解曲线峰。
图3A和图3B为本发明较佳实施例中多重RT-PCR体系的特异性验证结果。
图4为本发明较佳实施例中部分青峪猪样品验证结果。
图5为本发明较佳实施例中部分市售白猪样品验证结果。
图6为本发明较佳实施例中部分市售非青峪黑猪样品验证结果。
具体实施方式
为填补目前技术空白，本发明提供一种基于特征SNP组合和碱基错配位点的RT-PCR熔解曲线分析识别的青峪猪品种的鉴定方法，该方法能很好的区分青峪猪与非青峪猪，引物组合物特异性好，碱基错配位点提高了方法的分辨率和准确度，利用多重RT-PCR体系可以实现青峪猪品种的快速鉴别。
本发明采用如下技术方案：
首先筛选出青峪猪线粒体DNA上特异性SNP位点组合，然后设计并筛选出鉴别青峪猪品种的特异性引物，所述引物含有6套特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-12所示。
其中，用于设计特异性引物的9个核心SNP位点如下：
各SNP位点的物理位置是基于猪全线粒体标准序列(GenBank:NC_012095.1，共16770bp)比对确定的。具体而言，SNP1位于线粒体上第2179bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP2位于线粒体上第8845bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP3位于线粒体上第12575bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为G或A；SNP4位于线粒体上第1503bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP5位于线粒体上第13692bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP6位于线粒体上第13899bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP7位于线粒体上第10259bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A；SNP8位于线粒体上第10261bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为A或G；SNP9位于线粒体上第10410bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A。
本发明以青峪猪线粒体DNA上SNP位点1～SNP位点9作为引物3’端靶标，共设计6对特异性引物：QY1-1F/R,QY1-2F/R,QY1-3F/R,QY2-1F/R,QY2-2F/R、QY2-3F/R。
本发明分别在QY2-2上游引物和QY2-3下游引物人为设计两个碱基错配位点，使引物与模板之间发生错配反应。错配位点1:QY2-2上游引物3’端第2位碱基由C变为G；错配位点2：QY2-3下游引物3’端第2位碱基由G变为A。
本发明6对特异性引物如表1(SEQ ID NO:1-12)所示，下划线碱基为SNP位点，框内碱基为错配位点：
表1
Figure BDA0002670682040000051
Figure BDA0002670682040000061
本发明将6对特异性引物分在A、B两个反应孔，同步或分别进行三重RT-PCR反应：QY1-1F/R、QY1-2F/R、QY1-3F/R为A反应孔引物组合，QY2-1F/R、QY2-2F/R、QY2-3F/R为B反应孔引物组合。A或B反应孔中各特异性引物扩增产物Tm值具有显著性差异，可通过熔解曲线法进行鉴别。
本发明还提供含有所述特异性引物组合的检测试剂或试剂盒，以及所述检测试剂或试剂盒在鉴别肉或肉制品中青峪猪品种中的应用。
进一步地，本发明提供一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法，应用本发明提供的含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1-12所示的引物组合以及引物中2个碱基错配位点，以待测肉或肉制品的DNA为模板，使用2次三重RT-PCR与微芯片电泳方法进行检测，根据RT-PCR产物片段Tm值来判定结果。
模板的制备方法为：将肉或肉制品与灭菌去离子双蒸水以1:3～1:5比例混合，用组织匀浆机11000～13000r/min均质6～10min，制成组织匀浆液。使用组织DNA提取试剂盒提取样品基因组总DNA。
进一步地，三重RT-PCR方法中25μL反应体系如表2所示：
表2
Figure BDA0002670682040000062
RT-PCR反应条件为：(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：95℃，10～15s；退火及延伸：58～62℃，20～45s，30个循环，(3)熔解曲线制作：95℃、1min，70℃、1min，以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度。
考虑到RT-PCR熔解曲线的迁移规律以及仪器的检测误差，因此针对每种引物给出一个Tm值范围来进行结果判定。其中，A反应孔：熔解曲线峰Tm值范围在72.0～74.5℃范围内的为QY1-1产物的SNP1位点；熔解曲线峰Tm值范围在75.0～76.5℃范围内的为QY1-2产物的SNP2位点；熔解曲线峰Tm值范围在79.0～80.5℃范围内的为QY1-3产物的SNP3位点。B反应孔：熔解曲线峰Tm值范围在73.0～75.5℃范围内的为QY2-1产物的SNP4位点；熔解曲线峰Tm值范围在77.0～78.5℃范围内的为QY2-2产物的SNP5/6位点；熔解曲线峰Tm值范围在79.0～80.5℃范围内的为QY2-3产物的SNP7/8/9位点。
本发明提供上述方法在肉或肉制品青峪猪鉴别中的应用。青峪猪鉴定标准为：通过对样品进行2次三重RT-PCR熔解曲线分析，出现6个熔解曲线峰且Tm值符合取值范围的，可判定为青峪猪，而不足6个熔解曲线峰的判定为非青峪猪。
本发明通过挖掘猪线粒体DNA地方品种特异性SNP组合。线粒体DNA为母性遗传,具有可溯源性的同时，具有进化和突变速率适中，非编码区域少，具有足够多态性的优点，可作为地方特色猪品种标记使用。建立的多重RT-PCR熔解曲线分析法能一步检测9个位点SNP基因型，进而完成样本是否为青峪猪的鉴定。该方法准确、便捷、快速、成本低，对提高工作效率和技术水平具有重要意义。对保护优质地方黑猪品牌，促进黑猪产业健康、快速发展具有重要意义。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
主要仪器设备：实时荧光定量PCR仪(Roche480，瑞士)、高速台式离心机(Eppendorf5417R，德国)、微量移液器(2.5μL、10μL、100μL、1000μL)、均质仪(Omni Prep，美国)、荧光酶标仪(Bio tek Synergy H4，美国)等。
主要试剂：血液和动物组织的DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；Premix预混液购于Roche公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例1 SNP位点组合区分猪品种能力
1、线粒体DNA序列信息获取
通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载、样品测序等方式获得猪线粒体基因共计258条，用于构建青峪猪鉴定方法，其中通过NCBI网站下载得到国内外猪线粒体基因172条，通过对猪肉样品DNA测序获得线粒体基因88条，共涉及国内外52个猪品种。对于采购猪肉样品，使用DNeasy动物组织的DNA提取试剂盒提取DNA。提取出的DNA采用荧光酶标仪测定260nm和280nm处的吸光值，计算DNA浓度和纯度，然后通过PCR扩增、产物测序得到线粒体基因信息。
2、SNP位点筛选与理论准确率
通过Python程序和Mega软件对收集到的258条线粒体基因信息进行处理，挑选青峪猪种内保守其他品种多态性高的SNP位点，从4000多个位点中选出19个位点，作为鉴定是否为青峪猪猪肉样品的特征标记，各SNP位点的物理位置是基于猪全线粒体标准序列(GenBank:NC_012095.1，共16770bp)比对确定的。19个位点都为青峪猪基因型时判定待测样品中包含青峪猪源性成分，19个位点中至少有一个是非青峪猪基因型时即判定为非青峪猪，根据建模样本统计计算结果，方法准确率理论上≥94.57％(表3)。
表3青峪猪鉴别方法理论准确率
Figure BDA0002670682040000081
实施例2三重RT-PCR反应体系的建立及特异性考察
1、样品处理方法
分别称取25mg青峪猪与14其他常见品种猪肉样品至离心管中。
2、DNA提取方法
使用DNeasy动物组织的DNA提取试剂盒提取各物种DNA，按照试剂盒说明书进行操作，或者公认的、具有相同效力的其他提取方法。提取的DNA采用荧光酶标仪测定260nm和280nm处的吸光值，计算DNA浓度和纯度。
3、引物序列
以青峪猪线粒体DNA上SNP位点1～SNP位点9合计9个SNP位点作为引物3’端靶标，共设计36对引物，从中筛选出6对特异性引物：QY1-1F/R,QY1-2F/R,QY1-3F/R,QY2-1F/R,QY2-2F/R、QY2-3F/R。为提高方法分辨率和准确度，人为引入2个引物碱基错配位点。
本发明将6对特异性引物分在2个反应孔，同步或分别进行三重RT-PCR反应：QY1-1F/R、QY1-2F/R、QY1-3F/R为A反应孔引物组合，QY2-1F/R、QY2-2F/R、QY2-3F/R为B反应孔引物组合。A或B反应孔中各特异性引物扩增产物Tm值具有显著性差异，可通过熔解曲线法进行鉴别。
A反应孔各特异性引物序列如下(SEQ ID NO:1-6)：
QY1-1F：CCTATGGAGCTTTAATTAACTAT
QY1-1R：TGCTAGTCCATGTTAAGTTATGT
QY1-2F：AAGGCCACCACACATCAGTC
QY1-2R：AAGAACAGAACCTCGGAAATA
QY1-3F：CCTTAATAGAAACTAACAAACTAG
QY1-3R：AGAAAGCGTGCATGCAGATA
B反应孔各特异性引物序列如下(SEQ ID NO:7-12)：
QY2-1F：CCTTAAAAATACCCCAAAAACCC
QY2-1R：CCTACTATGGTAGTATTAAGATT
QY2-2F：AGCTTCCTCACTAAAAAACCGT
QY2-2R：TTTGATTTATTTGGGGGGTATG
QY2-3F：AAACACAACATAATCTGAATCAATG
QY2-3R：GGGATTGGCTAGCTATTAAT
4、三重PCR反应体系的优化实验
4.1反应体系优化实验
将引物组合按照反应体系A：Premix预混液12.5μL，5μM的QY1-1F和QY1-R各0.1-1.0μL，5μM QY1-2F和QY1-2R各0.1-1.0μL，5μM QY1-3F和QY1-3R各0.5-2.0μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL，来优化各引物的添加量；
将引物组合按照反应体系B：Premix预混液12.5μL，5μM QY2-1F和QY2-1R各0.2-1.0μL，5μM QY2-2F和QY2-2R各0.5-1.5μL，5μM QY2-3F和QY2-3R各1.0-2.0μL，0.5ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL，来优化各引物的添加量。
4.2反应条件优化实验
主要对退火及延伸温度(56℃,58℃,60℃,62℃)、退火延伸时间(15s,30s,45s,60s)以及循环数(25,30,35,40)进行优化。
4.3三重RT-PCR反应体系优化结果
通过对三重RT-PCR反应体系进行优化，如表4所示。
表4三重RT-PCR反应体系组分及配比(总体积25μL)
Figure BDA0002670682040000091
Figure BDA0002670682040000101
4.4 RT-PCR反应条件优化结果
(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：95℃，15s；退火及延伸：60℃，45s，30个循环，(3)熔解曲线制作：95℃、1min，70℃、1min，以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度。
5、熔解曲线分析RT-PCR扩增产物Tm值
A和B反应孔的三重RT-PCR扩增产物通过熔解曲线分析法检测，检测结果如图1～图2所示。由检测结果可知，每一种特异性扩增产物长度代表一种特定的青峪猪SNP位点，其中，A反应孔：熔解曲线峰Tm值范围在72.0～74.5℃范围内的为QY1-1产物的SNP1位点；熔解曲线峰Tm值范围在75.0～76.5℃范围内的为QY1-2产物的SNP2位点；熔解曲线峰Tm值范围在79.0～80.5℃范围内的为QY1-3产物的SNP3位点。B反应孔：熔解曲线峰Tm值范围在73.0～75.5℃范围内的为QY2-1产物的SNP4位点；熔解曲线峰Tm值范围在77.0～78.5℃范围内的为QY2-2产物的SNP5/6位点；熔解曲线峰Tm值范围在79.0～80.5℃范围内的为QY2-3产物的SNP7/8/9位点。
6、为考察多重RT-PCR体系特异性，分别提取杜长大猪、大白猪、长白猪、莱芜黑猪、沂蒙黑猪、北京黑猪、吉林山黑猪样品的DNA，将DNA样品浓度均稀释至0.5ng/μL，作为检测模板。然后同时进行2个三重RT-PCR熔解曲线分析，结果如图3A和图3B所示，青峪猪出现6个熔解曲线峰，且熔解曲线峰的Tm值均符合范围，而其余7个品种猪熔解曲线峰个数均小于6，从而说明多重RT-PCR体系特异性较好，可实现青峪猪的准确鉴别。
实施例3样品检测及方法准确率考察
1、采集样品，制备模板
随机新采集猪肉样品126份，用于验证方法准确性，其中青峪猪样品30份，市售白猪样品48份，市售黑猪样品(非青峪猪)48份，用于验证方法的准确率。按照参照实施例2中的DNA提取方法，分别提取样品DNA，计算DNA浓度和纯度。将DNA样品浓度均稀释至0.5ng/μL，作为检测模板。
2、三重RT-PCR反应验证
参照实施例2的RT-PCR反应流程，将132份样品DNA模板同步或分别进行A、B反应孔三重RT-PCR熔解曲线分析，计算Tm值并统计熔解曲线峰个数。
3、猪肉样品验证
青峪猪判定标准：通过对样品同时进行2个三重RT-PCR熔解曲线分析，出现6个熔解曲线峰且Tm值符合取值范围的，可判定为青峪猪，而不足6个熔解曲线峰的判为非青峪猪，部分猪肉样品结果如图4～图6所示。通过对126个猪肉样品进行鉴别，结果显示准确率达到85.71％(表5)，证明方法有较高的准确性和实用性。
表5青峪猪鉴别方法实际准确率
Figure BDA0002670682040000111
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国肉类食品综合研究中心
<120> 青峪猪源性成分的鉴别方法
<130> KHP201114982.8
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctatggagc tttaattaac tat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctagtcca tgttaagtta tgt 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggccacca cacatcagtc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagaacagaa cctcggaaat a 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttaataga aactaacaaa ctag 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaaagcgtg catgcagata 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttaaaaat accccaaaaa ccc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctactatgg tagtattaag att 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcttcctca ctaaaaaacc gt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttgatttat ttggggggta tg 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacacaaca taatctgaat caatg 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggattggct agctattaat 20

Claims (7)

1.用于鉴定青峪猪的核心SNP标记组合的检测引物，其特征在于，
所述核心SNP标记组合包括SNP1~SNP9共9个SNP位点，各SNP位点的物理位置参考猪线粒体基因组序列GenBank: NC_012095.1确定如下：SNP1位于线粒体上第2179bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP2位于线粒体上第8845bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP3位于线粒体上第12575bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为G或A；SNP4位于线粒体上第1503bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP5位于线粒体上第13692bp，多态性为T/C，青峪猪为T，非青峪猪为T或C；SNP6位于线粒体上第13899bp，多态性为C/T，青峪猪为C，非青峪猪为T或C；SNP7位于线粒体上第10259bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A；SNP8位于线粒体上第10261bp，多态性为G/A，青峪猪为G，非青峪猪为A或G；SNP9位于线粒体上第10410bp，多态性为A/G，青峪猪为A，非青峪猪为G或A；
所述检测引物包括引物对QY1-1、QY1-2、QY1-3、QY2-1、QY2-2和QY2-3共6对引物，分别如下：
用于检测SNP1的引物对QY1-1，由QY1-1F和QY1-1R组成，引物序列如SEQ ID NO:1-2所示；
用于检测SNP2的引物对QY1-2，由QY1-2F和QY1-2R组成，引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；
用于检测SNP3的引物对QY1-3，由QY1-3F和QY1-3R组成，引物序列如SEQ ID NO:5-6所示；
用于检测SNP4的引物对QY2-1，由QY2-1F和QY2-1R组成，引物序列如SEQ ID NO:7-8所示；
用于检测SNP5和SNP6的引物对QY2-2，由QY2-2F和QY2-2R组成，引物序列如SEQ ID NO:9-10所示；其中，引物QY2-2F包含1个碱基错配位点，位于线粒体上第13691bp，正常碱基为C，错配碱基为G；
用于检测SNP7、SNP8和SNP9的引物对QY2-3，由QY2-3F和QY2-3R组成，引物序列如SEQID NO:11-12所示；其中，引物QY2-3R包含1个碱基错配位点，位于线粒体上第10409bp，正常碱基为G，错配碱基为A；
其中，上述碱基错配位点是参考猪线粒体基因组序列GenBank: NC_012095.1确定的。
2.含有权利要求1所述引物的检测试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在青峪猪的鉴定、选育或青峪猪源性成分鉴别中的应用。
4.青峪猪源性成分的鉴别方法，其特征在于，包括：提取待测样本DNA，利用权利要求1所述引物进行实时荧光定量PCR，检测9个SNP位点的基因型，通过比较扩增产物的熔解曲线峰是否存在对应阳性峰型，以及根据熔解曲线峰Tm值来判定待测样本是否包含青峪猪源性成分；
出现6个熔解曲线峰且Tm值符合取值范围的，判定为青峪猪，不足6个熔解曲线峰的判定为非青峪猪；
其中，引物对QY1-1对应的扩增产物Tm值为72.0~74.5℃，引物对QY1-2对应的扩增产物Tm值为75.0~76.5℃，引物对QY1-3对应的扩增产物Tm值为79.0~80.5℃，引物对QY2-1对应的扩增产物Tm值为73.0~75.5℃，引物对QY2-2对应的扩增产物Tm值为77.0~78.5℃，引物对QY2-3对应的扩增产物Tm值为79.0~80.5℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将引物对QY1-1、QY1-2和QY1-3加至同一反应孔或反应管内，将引物对QY2-1、QY2-2和QY2-3加至另一反应孔或反应管内，同步或分别进行三重实时荧光定量PCR反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系如下：
反应体系A：Premix预混液12.5μL，5 μM QY1-1F和QY1-1R各0.2~0.3μL，5 μM QY1-2F和QY1-2R各0.2~0.3μL，5 μM QY1-3F和QY1-3R各1.2~1.4μL，0.5 ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL；
反应体系B：Premix预混液12.5μL，5 μM QY2-1F和QY2-1R各0.6~0.7μL，5 μM QY2-2F和QY2-2R各0.6~0.8μL，5 μM QY2-3F和QY2-3R各1.2~1.4μL，0.5 ng/μL模板DNA 2μL，去离子水补齐至25μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10~15s，58~62℃退火及延伸20~45s，共30个循环；
熔解曲线的制作条件为：95℃ 1min，70℃ 1min，以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度。
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