CN115896308A - 检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的snp分子标记组合的试剂 - Google Patents

检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的snp分子标记组合的试剂 Download PDF

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Abstract

本申请是申请日为2020年12月21日、申请号202011520740X，发明名称为“检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂”的发明专利申请的分案申请。本发明公开了检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂，在本发明发现5个与赤点石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP位点，当SNP位点1基因型为GG、SNP位点2基因型为AC、SNP位点3基因型为CC、SNP位点4基因型为TA、SNP位点5基因型为TT，赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于其他基因型的个体。通过检测赤点石斑鱼上述SNPs，能够有效地确定其是否具有神经坏死病毒抗感性状。

Description

检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂
本申请是申请日为2020年12月21日、申请号202011520740X，发明名称为“检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及中的应用。技术领域，具体地，涉及检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂。
背景技术
赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)俗称红斑，鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑鱼属(Epinephelus)，主要分布于北太平洋西部海域。其具有肉质鲜美，营养价值高的特点，是华南沿海地区重要的石斑鱼养殖品种。
赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)，对石斑鱼的成鱼以及幼鱼危害很大，严重时死亡率可达100％，往往给石斑鱼养殖造成巨大的经济损失，严重威胁到石斑鱼养殖产业的健康发展，然而目前针对该病毒引起的疾病仍无有效的治疗手段，主要以防控监测为主。
中国专利CN201610255794.5公开了一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法；CN201610465941.1公开了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用；CN201910873715.0公开了一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法；CN200910039534.4公开了一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒；CN03114369.5公开了石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法，但是缺乏一种检测石斑鱼神经坏死病毒抗性的方法。
全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)，是指在样品的多个个体的全基因组范围内广泛筛选大量的单核苷酸多态性(single nucleotideploymorphism，SNP)分子标记，并获得基因型，后利用这些SNP基因型与样品的表型性状进行关联分析，通过统计分析筛选出能够影响该表型性状的关键突变位点的策略技术。随着基因组学研究及测序技术的发展，研究者们已通过该技术发现并鉴定出大量与表型性状相关联的遗传变异。近年来，该方法在水产经济动物重要经济性状关联基因的筛选和鉴定中得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合的试剂。
本发明的第一个目的是提供检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合中的任意一个或几个分子标记的试剂。
本发明的第二个目的是提供检测所述的SNP位点1的引物。
本发明的第三个目的是提供检测所述的SNP位点2的引物。
本发明的第四个目的是提供检测所述的SNP位点3的引物。
本发明的第五个目的是提供检测所述的SNP位点4的引物。
本发明的第六个目的是提供检测所述的SNP位点5的引物。
本发明的第七个目的是提供所述的试剂，或所述引物的任意一种或几种在在制备石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒。
本发明的第八个目的是提供所述试剂、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在石斑鱼神经坏死病毒抗性神经坏死病毒抗性中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明要求保护检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合中的任意一个或几个分子标记的试剂，所述试剂用于检测SNP位点1、SNP位点2、SNP位点3、SNP位点4和/或SNP位点5的基因型；
所述SNP位点1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列从5’端开始第301bp，当样本基因型为GG时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
所述SNP位点2位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列从5’端开始第300bp，当样本基因型为AC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
所述SNP位点3位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列从5’端开始第301bp，当样本基因型为CC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
所述SNP位点4位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列从5’端开始第300bp，当样本基因型为TA时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
所述SNP位点5位于SEQ ID NO.5所示核苷酸序列从5’端开始第301bp，当样本基因型为TT时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体。
优选地，所示石斑鱼为赤点石斑鱼。
优选地，所述试剂为引物。
本发明还要求保护以下引物：
检测权利要求1中所述的SNP位点1的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示。
检测权利要求1中所述的SNP位点2的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示。
检测权利要求1中所述的SNP位点3的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示。
检测权利要求1中所述的SNP位点4的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示。
检测权利要求1中所述的SNP位点5的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示。
进一步，本发明要求保护所述试剂，或所述引物的任意一种或几种在在制备石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用。
本发明还要求一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒，包括所述的试剂。
优选地，包括检测SNP位点1～5的引物的任意一种或几种。
更优选地，包括检测SNP位点1～5的引物。
进一步更优选地，包括酸序列如SEQ ID NO.6～15所示引物。
最优选地，一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.6～15所示引物，以及PCR试剂。
其使用方法包括以下步骤：试剂盒的使用方法为：
(1)提取待测赤点石斑鱼的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获取的DNA作为模板，以SEQ ID NO.6～7、8～9、10～11、12～13和14～15所示的核苷酸序列作为引物，分别进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，确定待测赤点石斑鱼的SNP位点1～5的基因型；
(4)根据步骤(3)确定的SNP位点1～5的基因型确定待测赤点石斑鱼是否对神经坏死病毒抗感：
SNP位点1位于核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示的引物的扩增产物的5’端的第35bp，当样本基因型为GG时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点2位于核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示的引物的扩增产物的5’端的第265bp，当样本基因型为AC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点3位于核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物的扩增产物的5’端的第181bp，当样本基因型为CC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点4位于核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示的引物的扩增产物的5’端的第69bp，当样本基因型为TA时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点5位于核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示的引物的扩增产物的5’端的第297bp，当样本基因型为TT时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体。
所以本发明还要求保护所述试剂、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在石斑鱼神经坏死病毒抗性神经坏死病毒抗性中的应用。
本发明中，基因组提取不受特别限制，可以采用传统酚氯仿法提取，也可以采用试剂盒提取，本发明中的具体实施例是采用试剂盒提取，试剂盒操作简便、快速、提取的DNA质量高。
另外，本发明中待测赤点石斑鱼个体基因型检测方法不受特别限制，飞行时间质谱、测序、芯片、单链构象多态性聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应等技术均可用于SNP的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在本发明发现5个与赤点石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP位点，当SNP位点1基因型为GG、SNP位点2基因型为AC、SNP位点3基因型为CC、SNP位点4基因型为TA、SNP位点5基因型为TT，赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于其他基因型的个体。因此，通过检测赤点石斑鱼上述SNPs，能够有效地确定其是否具有神经坏死病毒抗感性状。因此，本发明的SNP标记与赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性密切相关，在亲本选育中选择具有抗感基因型的个体将有利于提高后代抗神经坏死病症的能力，利用本发明标记进行辅助育种，可以加快赤点石斑鱼抗病优良品种的培养进程。
利用上述SNP位点的引物对可以有效的检测待测赤点石斑鱼的基因型，其结果一方面可以判断待测赤点石斑鱼是否对神经坏死病毒具有抗感性，另一方面可以为亲本选择提供参考。因此，利用本发明的SNP位点引物可以检测赤点石斑鱼基因型，判断该个体是否对神经坏死病毒具有抗感性，能够有效用于赤点石斑鱼分子标记辅助选择育种，加快赤点石斑鱼抗病优良品种的培育进程。
本发明还提供了一种用于检测所述SNPs标记的试剂盒，该试剂盒可以有效检测赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性状，用于赤点石斑鱼分子标记辅助育种。
附图说明
图1为利用SNP位点1的引物进行PCR扩增的电泳检测图。
图2为利用SNP位点2的引物进行PCR扩增的电泳检测图。
图3为利用SNP位点3的引物进行PCR扩增的电泳检测图。
图4为利用SNP位点4的引物进行PCR扩增的电泳检测图。
图5为利用SNP位点5的引物进行PCR扩增的电泳检测图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1赤点石斑鱼PPAR-δ基因的SNPs的筛选
1、实验方法
(1)赤点石斑鱼样本来源
待测样本赤点石斑鱼取自于厦门小嶝岛石斑鱼养殖场同一批次人工繁殖的2月龄的赤点石斑鱼，随机挑选体重在50g/尾左右的健康鱼苗300尾。
采用腹腔注射法向赤点石斑鱼注射半致死浓度(1×107TCID50/mL)的神经坏死病毒培养液，3天内死亡个体和有典型发病症状个体为易感个体，10天后仍存活并且无明显发病症状的个体为抗感个体。
随机选取50尾抗感个体(抗感组)和50尾易感个体(易感组)，剪取其鳍条，保存于无水乙醇中，用于基因组DNA提取。
(2)石斑鱼样本基因组DNA提取
基因组DNA提取使用TreliefTMAnimal Genomic DNA Kit(TsingKe)试剂盒，按照说明书操作如下：
1)准备组织样品：取适量石斑鱼鳍条组织于1.5mL离心管中，用灭过菌的剪刀将鳍条剪碎；
2)活化硅胶膜：将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μL Buffer BL，12,000g离心1min；
3)样品消化：取20μL Proteinase K至新的1.5mL离心管中，加入200μL ddH2O稀释后的组织碎片，漩涡震荡10s，再加入200μL Buffer gA1，漩涡震荡10s，56℃孵育1～3h或过夜，期间震荡3～5次；
4)孵育结束后，加入200μL无水乙醇，漩涡震荡混匀；
5)将步骤4)所得溶液全部转入Spin Column中，12,000g离心1min，弃滤液；
6)加入500μL Buffer PW，12,000g离心30s，弃滤液；
7)重复步骤6)一次；
8)加入500μL Wash Buffer，12,000g离心30s，弃滤液；
9)12,000g空甩2min，弃滤液，将Spin Column放入新的1.5mL离心管中，开盖晾1min；
10)往吸附膜中央处加50～100μL事先预热到65℃的TE Buffer，室温放置2min，12,000g离心2min；
11)将得到的溶液重新加入Spin Column中，12,000g离心2min；
12)取2μL DNA进行电泳检测，1μL用于测定DNA浓度，-20℃保存。
(3)赤点石斑鱼与神经坏死病毒抗性性状相关的SNPs的获得
随机选取赤点石斑鱼抗感组和易感组各50尾样品的基因组DNA样品送至广州云索生物科技公司进行简化基因组测序，并进行抗感/易感性状的全基因组关联分析，
2、实验结果
获得-log10(P)值最高的5个显著关联位点，即为赤点石斑鱼与神经坏死病毒抗性性状相关SNPs位点。
(1)位点SNP位点1位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列从5’端开始第301bp处，为G/C等位基因突变，基因型为GG或者GC。
(2)位点SNP位点2位于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列从5’端开始第300bp处，为A/C等位基因突变，基因型为AA或者AC。
(3)位点SNP位点3位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列从5’端开始第301bp处，为T/C等位基因突变，基因型为CC或者TC。
(4)位点SNP位点4位于SEQ ID NO.4所示核苷酸序列从5’端开始第300bp处，为T/A等位基因突，基因型为TT或者TA。
(5)位点SNP位点5位于SEQ ID NO.5所示核苷酸序列从5’端开始第301bp处，为T/G等位基因突变，基因型为TT或者TG。
实施例2赤点石斑鱼与神经坏死病毒抗性性状相关的SNPs位点的PCR-测序验证分析
1、实验方法
1)引物设计
根据实施例1得到的5个SNP位点的位置信息，在石斑鱼基因组数据库中调取这些SNP位点的上下游序列，序列信息如图1显示，并根据这些序列信息设计SNP位点引物，引物信息如下所示：
SNP-1：
上游引物F：5’-CCTGCTCACTGGACCCTCAC-3’(SEQ ID NO.6)；
下游引物R:5’-CAGTCCCAAGCCACGAGAATA-3’(SEQ ID NO.7)。
SNP-2：
上游引物F：5’-CTGCCCGTCTGGGAAACTCT-3’(SEQ ID NO.8)；
下游引物R:5’-AGGAAATCGGCTCTGGTGTT-3’(SEQ ID NO.9)。
SNP-3：
上游引物F：5’-CACTTCCCTGCTGTCCTTTG-3’(SEQ ID NO.10)；
下游引物R:5’-CATCCACCCAGTGCTGAGAC-3’(SEQ ID NO.11)。
SNP-4：
上游引物F：5’-GGATGTTGAAAGCCGAGCCT-3’(SEQ ID NO.12)；
下游引物R:5’-AAACTGAAATCTTCTGCGATG-3’(SEQ ID NO.13)。
SNP-5：
上游引物F：5’-GACCTTTCCTTTAATTTCCCTT-3’(SEQ ID NO.14)；
下游引物R:5’-CTGTGGAGATTCAGGCGGTA-3’(SEQ ID NO.15)。
2)PCR扩增
以实施例1的群体样本的基因组DNA为模板，用上述的SNP位点的引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：
PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
94℃4min；94℃10s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
3)测序结果的SNP分型分析
将上述PCR产物送至TsingKe公司进行测序，通过测序结果获得各SNP位点的基因型。并对分型结果与神经坏死病毒抗性进行关联分析，抗神经坏死病毒相关性分析使用SPSS 17.0统计学软件中的卡方检验进行。
二、实验结果
SNP位点的等位基因及基因型在两组间的差异分析结果见表1，P<0.05表示差异显著。
表1：5个SNPs位点在抗感组和易感组的基因型和等位基因频率统计分析
由表1可知，上述5个SNPs位点其基因型和等位基因频率在抗感组和易感组中均有显著差异(P<0.05)，而在这5个SNPs位点中与抗感性状显著关联的基因型分别是：SNP位点1：GG，SNP位点2：AC，SNP位点3：CC，SNP位点4：TA，SNP位点5：TT；与易感性状显著关联的基因型分别是：SNP位点1：GC，SNP位点2：AA，SNP位点3：TC，SNP位点4：TT，SNP位点5：TG。因此本发明的SNPs标记可用于赤点石斑鱼抗病性状选育。
实施例3一种检测赤点石斑鱼抗神经坏死病毒抗性的方法
通过对待测赤点石斑鱼样本进行实施例2的5个SNP位点的检测，确定所述待测赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗病性。
包括以下步骤：
(1)提取待测赤点石斑鱼的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获取的DNA作为模板，以SEQ ID NO.6～7、8～9、10～11、12～13和14～15所示的核苷酸序列作为引物，分别进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，确定待测赤点石斑鱼的SNP位点1～5的基因型；
(4)根据步骤(3)确定的SNP位点1～5的基因型确定待测赤点石斑鱼是否对神经坏死病毒抗感：
SNP位点1位于核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示的引物的扩增产物的5’端的第35bp，当样本基因型为GG时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点2位于核苷酸序列如SEQ ID NO.8～9所示的引物的扩增产物的5’端的第265bp，当样本基因型为AC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点3位于核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物的扩增产物的5’端的第181bp，当样本基因型为CC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点4位于核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示的引物的扩增产物的5’端的第69bp，当样本基因型为TA时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体；
SNP位点5位于核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示的引物的扩增产物的5’端的第297bp，当样本基因型为TT时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体。
实施例4一种检测赤点石斑鱼抗神经坏死病毒抗性的试剂盒
1、组成
核苷酸序列如SEQ ID NO.6～15所示引物，以及PCR试剂。
2、使用方法
同实施例3。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.检测石斑鱼抗神经坏死病毒性状相关的SNP分子标记组合中的分子标记的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测SNP位点3的基因型；
所述SNP位点3位于SEQ ID NO.3所示核苷酸序列从5’端开始第301bp，当样本基因型为CC时，该样本感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述试剂为引物。
3.检测权利要求1中所述的SNP位点3的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.10～11所示。
4.权利要求1或2所述试剂，或权利要求3所述引物的任意一种或几种在在制备石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用。
5.一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的试剂。
6.权利要求1所述试剂、权利要求3所述引物或权利要求5所述试剂盒中的一种或几种在石斑鱼神经坏死病毒抗性神经坏死病毒抗性中的应用。
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