KR20230173333A - 돈육의 육질 판별용 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 판별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 판별용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돈육의 육질 판별용 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 판별방법에 관한 것이다.
돼지 산업은 주로 고기의 양(quantity)과 관련된 생산성 향상과 신선육 유통에 초점이 맞춰져 왔으며, 이는 돼지고기 품질의 감소를 수반하여 왔다(Cameron, 1990, Cliplef and McKay, 1993). 우리나라의 경우 돼지고기 소비 패턴은 구이와 수육이 대부분을 차지하고 있어 신선육을 많이 소비하고 있다.
기본적으로, 육질은 고기 구입에 중요한 선택 기준이다. 불균일한 고기품질은 소비자 신뢰도를 떨어뜨리고 좋은 고기를 선택하고자 하는 소비자의 의지를 감소시킨다(Jung et al, 2011). 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해, 돼지고기 품질에 대한 소비자의 요구를 만족시키기 위해 육질 형질 개량 시스템을 개발하려고 시도하였다(Lee et al, 2012).
최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵다.
한편, 돼지에서 대부분의 경제형질은 다양한 유전자의 영향을 통해 나타나는 양적 형질로 알려져 있으며 이러한 형질에 관여하는 원인 유전자 발굴 및 유전적 위치를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질관련 유전자 마커 발굴을 위하여 기능 유전자를 대상으로 단일염기다형성(SNP; single nucleotidepolymor phism) 발굴 및 형질 관련성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질관련 SNP들이 발굴되었다.
그러나, 예를 들어, 특허 제10-1941893호에 개시된 것과 같은, SNP 마커를 이용하여 돈육의 육질 형질을 예측하는 PCR(Polymerase Chain Reaction)-RFLP(Restinction Fragment Length Polymorphism)에 기반한 분석방법은, PCR 증폭 후 제한효소를 처리하여 유전자형을 진단하는 과정을 거쳐야 하기 때문에, 최종 분석까지 대략 2일 정도 소요되어 현장 분석에 적용할 수 없었고, 제한효소를 이용하므로 이에 따른 분석비용이 증가되는 문제점이 있었다. 또한, 사용되는 제한효소의 활성이나 처리 시간에 따라 유전자형 판독결과의 오류발생 가능성이 높아, 추가적인 분석을 하여야 하는 문제점도 있었다.
대한민국 등록특허 제10-2019997호(2019.09.10. 공고)에는 MYH3 유전자의 변이 영역에서의 6개 염기서열 결손(6bp-deletion) 유무를 확인하여 PCR-RFLP 방법에서 문제된 제한효소 사용에 따른 판독 오류를 보완하고자 하였으나, 6bp-deletion의 검출 결과에 기초하여 육질 유전자의 존재 가능성에 대한 단순 정보를 제시하는 수준에 그치고 있어, 돈육의 육질을 정확하게 판별하는 데에는 한계가 있었다.
따라서, 당업계에는 제한 효소 사용없이 PCR 기법에 기반하여 돈육의 육질을 정확하게 판별하는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 돈육 육질원인유전자에서 유래한 증폭 산물의 길이 차이를 이용하여 돈육의 육질을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 돈육의 육질 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 돈육의 육질원인유전자인 MYH3 유전자를 이용하여 제작한 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 돈육의 육질 상태를 신속하고 정확하게 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트는 MYH3 유전자를 기반으로 제작한 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 표적 유전자인 MYH3 유전자를 증폭하여 전기영동시 길이 차이를 나타내는 증폭 산물을 생성할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 상기 증폭 산물의 길이가 436bp이면 저육질형 돈육으로, 1248bp이면 고육질형 돈육으로 판정할 수 있다.
본 발명의 육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질과 관련된 것일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 전술한 조성물을 포함하는, 돈육의 육질 판별용 키트를 제공한다.
또다른 양태에서, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 추출된 핵산을 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하여 증폭 산물을 얻는 단계; 및 c) 얻어진 증폭 산물을 전기영동하여 증폭 산물의 크기 차이를 확인하여 돈육의 육질을 결정하는 단계를 포함하는, 돈육의 육질 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 육질 판별 방법에서 단계 b)의 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트는 MYH3 유전자를 기반으로 제작한 것일 수 있다.
본 발명의 육질 판별 방법에서 단계 c)의 전기영동 결과, 증폭 산물이 436bp 단독 밴드로 나타나면 저육질형으로 판정하고, 1248bp 단독 밴드로 나타나면 고육질형으로 판정하고, 436bp 및 1248bp 두 밴드가 모두 나타나면 중간육질형으로 결정할 수 있다.
본 발명의 돈육 육질 판별 방법은 대략 3시간이면 판별 결과를 얻을 수 있다.
본 발명에 따르면, 제한효소 처리 없이 PCR 증폭 후 전기영동에 의한 증폭산물의 길이 차이 판별만으로 돈육의 육질을 저육질형, 중육질형 및 고육질의 등급별로 정확하게 판단할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 PCR 증폭 후 전기영동 만으로 판독결과를 얻을 수 있으므로 대략 3시간 전후의 짧은 시간 내에 돈육의 육질을 정확하게 판별할 수 있고, 고가의 제한효소를 사용하지 않아 분석단가가 매우 저렴하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 PCR 증폭만으로도 육질 원인 유전자형 판독의 오류없이 돈육의 육질을 판별할 수 없으므로, 추가 또는 보조적인 분석을 별도로 수행할 필요가 없어 간편하다.
도 1은 본 발명에 따른 돈육의 돈육의 육질 판별 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 종래의 HpyCH4-RFLP 방법과 본 발명의 돈육의 육질 판별 방법을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 종래의 HpyCH4-RFLP 방법과 본 발명의 돈육의 육질 판별 방법을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 실시형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시형태에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.
또한, 본 명세서에서 수치와 관련하여 용어 “약(about)”, “대략(approximately)” 또는, 적어도(at least)와 같은 유사한 표현이 사용되는 경우, 해당 수치를 기준으로 ±10%, ±7%, ±5%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 이론적, 실험적, 통계적, 또는 경험칙상의 오차가 허용되는 것으로 의도된다.
본 발명자들은 유전 형질을 통해 돈육의 육질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자임을 규명하였으며, 이를 이용하면 유전적으로 결정되는 돈육의 육질 형질을 예측할 수 있음을 확인한 바 있다.
본 발명에 있어, "MYH3 유전자"는 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 myosin heavy chain 3을 코딩하는 유전자를 의미하며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 입수할 수 있다(GenBank Accession No KX549311(LAND), KX549312(KNP)).
본 발명자들은 MYH3 유전자에 의해 돼지의 근내지방함량 및 적색도의 육질 형질이 결정됨을 확인하였으며, 육질 형질이 우수한 재래종과 우수하지 않은 외래종 간에는 유전자에 변이가 존재하므로, 변이를 포함하는 유전자 마커를 검출함으로써 돼지 육질 형질을 판단할 수 있음을 밝혀낸 바 있다.
관련하여, 제주 재래돼지와 랜드레이스 또는 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 돼지의 육질 형질에 대해 QTL 분석 및 Linkage and linkage disequilibrium (LALD) mapping을 수행한 결과, 12번 염색체에 존재하는 MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질에 관여하는 원인 유전자인 것으로 드러났다.
한편, "PCR-RFLP" 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술과 접목하여 제한효소로 처리된 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation)부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 분석 대상의 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정할 수 있는 방법이다.
PCR-RFLP 방법은 돼지의 육질 분석에도 많이 사용되고 있으나, 이 방법에 의하면, 유전자의 증폭에서 유전자형의 판독까지 대략 2일이 소요되어 현장 분석에 적용하기에는 한계가 있다. 또한, 이러한 기존 분석방법은 제한효소를 이용하므로, 제한효소의 활성 등 상태에 따라 판독에 오류가 발생할 가능성이 항시 존재하고, 또한 제한효소 사용에 따른 분석비용이 증가하는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 육질원인유전자로 규명된 MYH3 유전자를 기반으로 PCR-전기영동에 의한 증폭산물의 길이 차이 분석만으로도 돼지의 육질을 등급별로, 즉 저육질, 중육질 및 고육질로 정확하게 진단할 수 있는 프라이머(들)을 설계하였으며, 이렇게 설계한 프라이머 세트가 간편하고 신속하게 돈육의 육질을 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 판별용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 유전자 마커 증폭에 사용되는 프라이머, 적절한 버퍼 등의 적절한 성분(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 프라이머 서열은 유전자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
또한, 프라이머는 변형시킬 수 있는데, 구체적인 예로, 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
본 발명에서 프라이머는, 각각, 서열번호 1, 2, 3 또는 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
당업자는 본 발명에서 개시한 서열번호 1, 2, 3, 또는 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머의 서열정보(뉴클레오티드의 연결순서 및 서열길이 포함)에 기초하여 적절한 변형체를 설계할 수 있으므로, 본 발명에 따른 프라이머의 범위가 반드시 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 염기서열을 갖는 프라이머로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 표적 유전자인 MYH3 유전자를 증폭하여 전기영동시 길이 차이를 나타내는 증폭 산물을 생성할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서는 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 돼지의 육질 내지 육질 형질과 관련된 표적 유전자, 즉 MYH3 유전자를 증폭한 뒤 전기영동을 수행한 다음, 나타나는 증폭 산물의 길이 차이에 따라 돈육의 육질을 판단할 수 있음을 확인하였다(도 1).
상세하게는, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 표적 유전자인 MYH3 유전자를 증폭하고 난 다음 전기영동한 결과, 증폭 산물이 436bp 단독 밴드로 나타나면 저육질형(q)로 판정할 수 있고, 1248bp 단독 밴드로 나타나면 고육질형(Q)로 판정할 수 있으며, 436bp/1248bp 밴드가 모두 나타나면 중간육질형(q/Q)로 판정할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 돈육 육질 판별용 조성물은 PCR 증폭 후 전기영동만으로 분석 대상 돼지의 육질 등급을 더 세분화하여, 즉 고육질형, 중육질형 및 저육질형으로 정확하게 진단, 판정, 또는 예측할 수 있는 것은 물론, 분석시간을 단축시킬 수 있고, 현장분석 적용이 가능하다. 더불어, 본 발명은 제한효소를 사용하지 않기 때문에 분석 비용도 절감되는 효과가 있다.
본 발명의 실시형태에 의하면, 전술한 육질은, 이로만 제한되는 것은 아니나, 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 지방산 조성을 포함하는 육질 형질 관련 인자와 관련된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "육질 형질"은 돼지로부터 얻어진 뼈를 제외한 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현 형질을 의미하며, 이 표현 형질은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 근내지방함량, 육색, 보수력, 전단력 등일 수 있다. 근내지방함량은 근육 내 포함된 지방의 함량, 육색은 육안으로 판단되는 고기의 색, 보수력은 축육이 수분을 유지하는 능력, 전단력은 고기의 찢었을 때 질긴 정도로서, 근내지방함량은 높을수록, 육색은 적색을 나타낼수록, 보수력 및 전단력은 낮을수록 육질의 품질이 높은 것으로 판단할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 돈육의 육질 판별용 조성물을 포함하는 돈육의 육질 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 실시형태에 의하면, 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 임의로 사용설명서를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 돼지 육질 원인 유전자인 MYH3 마커 유전자를 비롯하여 다른 마커 유전자를 PCR 증폭을 통해 확인하거나, 이들 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 육질 형질 수준을 판단할 수 있다. 일예로, 키트는 RT-PCR용 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
RT-PCR용 키트의 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소, 즉 본 발명에 따른 프라이머를 포함하며, 그 외에도 다른 육질 관련 마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 추출된 핵산을 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 c) 증폭 산물을 전기영동하여 증폭 산물의 크기 차이를 확인하여 돈육의 육질을 결정하는 단계를 포함하는, 돈육의 육질 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 육질 판별 방법에서 돼지 시료는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 단계 b)에서 사용되는 프라이머는 MYH3 유전자에 기반하여 제작된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 단계 c)에서 전기영동은 통상적으로 사용되는 아가로즈 겔 상에서 이루어질 수 있다. 전기영동은 50분 이내, 바람직하게는 40분 이내, 더 바람직하게는 30분 이내로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 단계 c)에서 전기영동 결과, 증폭 산물이 436bp 단독 밴드로 나타나면 저육질형으로 판정하고, 1248bp 단독 밴드로 나타나면 고육질형으로 판정하고, 436bp 및 1248bp 두 밴드가 모두 나타나면 중간육질형으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 돈육의 육질 판별의 전체 과정은, 시료 상태, 장비 운영자의 숙련도 등에 따라 변동이 있을 수 있으나, 대략 3시간 이내, 늦어도 5시간 이내에 돈육의 육질 판별이 완료될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[제조예] 돈육의 육질 판별용 프라이머 세트 제작
돈육의 육질을 판별하기 위해 돈육의 육질 원인유전자인 MYH3 유전자의 서열정보에 기초하여 하기와 같이 프라이머를 제작하였다.
프라이머 설계:
MYH3_1Q_F: AGG-ACG-TGT-GTT-CCC-CAC-AC (12/20) (서열번호 1)
MYH3_1Q_R: GGA-ACC-AGT-ACC-CTG-GAG-ATG-G (13/22) (서열번호 2)
MYH3_1q_F: ACg-GCT-GAC-ACC-AGA-ATG-AAC (11/21) (서열번호 3)
MYH3_1q_R: GGG-GAA-CAA-CAG-CAG-TCC-TCC (13/21) (서열번호 4)
[실시예]
돈육 시료 6건(저육질형 2두, 중간 육질형 2두, 고육질형 2두)을 대상으로, 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한 후 분석하였다.
구체적으로, PCR 반응은 상기에 명시된 프라이머 서열번호 1, 2, 3, 4를 모두 한 개에 튜브에 넣은후 각 돼지의 혈액으로부터 분리한 100 ng/㎕의 DNA와 10×반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM의 2쌍의 정방향 및 역방향 프라이머, 1.5 units Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 25 ㎕ 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 총 30 cycle을 수행하였고, 프라이머의 어닐링 온도는 60℃에서 진행하였다. 증폭 산물은 EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 유전자 증폭 여부와 길이를 이용하여 유전자형을 식별하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 저육질형 2두에서는 436bp 밴드가 특이적으로 나타났고, 고육질형 2두에서는 1248bp 밴드가 특이적으로 나타났으며, 중간육질형 2두에서는 436bp와 1248bp 두 밴드가 모두 나타나는 것을 확인할 수 있다.
[비교예]
종래 PCR-RFLP 방법으로 돈육 시료 24건(저육질형 8두, 중간 육질형 8두, 고육질형 8두)을 대상으로 육질을 분석하였다.
구체적으로, 프라이머(forward: 5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3'(서열번호 6), reverse: 5'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-3'(서열번호 7)를 이용하여 상기 염기 변이를 포함한 부분을 증폭하였다. 각 돼지의 혈액으로부터 분리한 100 ng/㎕의 DNA를 주형으로 하였으며, 10×반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM의 정방향 및 역방향 프라이머, 1.5 units Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 25 ㎕ 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 총 30 cycle을 수행하였고, 프라이머의 어닐링 온도는 60℃에서 진행하였다. 증폭 산물은 EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
이후, HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하였다. 증폭한 PCR 산물을 제한효소(HpyCH4Ⅳ)를 이용하여 절단하였고, 제한효소반응 조건은 공급자의 지시에 따라 PCR 증폭 산물 3㎕와 10X buffer 1㎕, 제한효소 0.3㎕, DW 5.7㎕를 혼합하여 37℃에서 밤새 반응하였다. EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여, 제한효소에 의한 랜드레이스 및 제주재래돼지 MYH3 유전자의 절단 양상을 확인하였다.
[시험예] 실시예 방법과 비교예 방법 간의 분석 결과 차이 비교
본 발명에 따른 돈육의 육질 판별방법(실시예)과 종래의 HpyCH-RFLP 분석방법(비교예)을 통해 돈육의 육질을 분석한 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
| 구분 | 기존방법(HpyCh4-RFLP) | 본발명(PCR 증폭 사이즈 차이) | ||||
| 유전자형 | 유전자형 | |||||
| 분석 두수 |
11 | 12 | 22 | 436 | 436/1248 | 1248 |
| 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | |
주) 11: 비절단(저육질형), 12: 헤테로(중간육질형), 22: 절단형(고육질)
상기 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR-전기영동에 기반한 증폭 산물 길이 차이 분석 결과, 436bp 밴드를 나타낸 저육질형 개체가 8두, 1248bp 밴드를 나타낸 고육질형 개체가 8두, 436bp와 1284bp 밴드 둘 모두를 나타낸 중간육질형 개체가 8두인 것으로 확인되었다.
종래의 HpyCH4-RFLP 방법으로 유전자형이 결정된 저육질형(11) 8두, 중간 유질형(12) 8두 및 고육질형(8두) 개체를 판별한 결과와 본 발명에 따라 PCR-전기영동에 기반한 증폭 산물 길이 차이를 이용한 판별 결과가 정확히 일치함을 확인할 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 제한효소 처리 없이 PCR 증폭 후 전기영동에 의한 증폭산물의 길이 차이 판별만으로 단 시간 내에 돈육의 육질을 저육질형, 중육질형 및 고육질형의 등급별로 정확하게 판단할 수 있다.
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gccacgctcc caacggtctg tcagggaaaa aaagggaaaa acagacataa agtggaataa 120
gaatgggcaa acgcttcagc catacccctc tgtgctccta aggctttatt tttcyaaccc 180
tgatttagaa acagccatgc tcgttagacg ccccctcacc cccctttctc tgcaggccct 240
gccatccccc cacccccgcc ccggccagca gctggtcttt cctaattggt gacatgtctt 300
aataactaca ggtccttgag cagctgtcac tgtggctcct ggctggtggg ctacctccct 360
ctcagtcatt tactcgttgg tcctactggc gcttaagaca gaggtttagt taatgacgat 420
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ttccgtcctt ggcttcatcc ctttgcccac aggccgagat tctaggtccc cgctgtccca 600
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Claims (8)
- 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 판별용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 표적 유전자인 MYH3 유전자를 증폭하여 전기영동시 길이 차이를 나타내는 증폭 산물을 생성할 수 있는 것인, 돈육의 육질 판별용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 조성물은 상기 증폭 산물의 길이가 436bp이면 저육질형 돈육으로, 1248bp이면 고육질형 형 돈육으로 판정하는, 돈육의 육질 판별용 조성물. - 제1항에 있어서,
육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질 인자와 관련된 것인, 돈육의 육질 판별용 조성물. - 제1항 내지 제4항에 따른 조성물 및 임의로 사용설명서를 포함하는, 돈육의 육질 판별용 키트.
- a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 추출된 핵산을 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
c) 증폭 산물을 전기영동하여 증폭 산물의 크기 차이를 확인하여 돈육의 육질을 결정하는 단계를 포함하는, 돈육의 육질 판별 방법. - 제6항에 있어서,
단계 c)의 전기영동 결과, 증폭 산물이 436bp 단독 밴드로 나타나면 저육질형로 판정하고, 1248bp 단독 밴드로 나타나면 고육질형으로 판정하고, 436bp 및 1248bp 두 밴드가 모두 나타나면 중간육질형으로 판정하는, 돈육의 육질 판별 방법. - 제6항에 있어서,
3시간 이내에 돈육의 육질 판별이 완료되는, 돈육의 육질 판별 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR101941893B1 (ko) | 2016-11-15 | 2019-01-25 | 대한민국(농촌진흥청장) | 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용 |
| KR102019997B1 (ko) | 2018-02-21 | 2019-09-10 | 대한민국 | 돈육의 육질 예측용 조성물 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법 |
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2022
- 2022-06-17 KR KR1020220073951A patent/KR20230173333A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101941893B1 (ko) | 2016-11-15 | 2019-01-25 | 대한민국(농촌진흥청장) | 돼지의 육질 형질 판단용 유전자 마커 및 이의 이용 |
| KR102019997B1 (ko) | 2018-02-21 | 2019-09-10 | 대한민국 | 돈육의 육질 예측용 조성물 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법 |
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