KR102387431B1

KR102387431B1 - 돈육의 단백질 함량 예측용 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102387431B1
Application number: KR1020200074378A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 신문철; 우제훈; 박남건; 양병철; 강용준
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-04-15
Also published as: KR20210156598A

Abstract

본 발명의 유전자 마커는 돼지의 돈육의 단백질 함량을 예측하기 위한 일배체형 마커로서, 돼지의 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자의 변이영역 분석하여 분자생물학적 수준에서 돈육의 단백질 함량을 예측할 수 있으며, 이를 통해 돈육의 단백질 함량과 근내지방 함량을 조절하여 비선호부위의의 소비를 증가시킬 수 있다.

Description

돈육의 단백질 함량 예측용 마커 및 이의 용도{Marker for predicting protein content of pork and use thereof}

본 발명은 돈육의 단백질 함량 예측용 마커 및 이를 이용한 돈육의 단백질 함량 예측 방법에 관한 것이다.

돼지 산업은 주로 고기의 양(quantity)과 관련된 생산성 향상과 신선육 유통에 초점이 맞춰져 왔으며, 이는 돼지고기 품질의 감소를 수반하여 왔다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 산업 분야에서는 최상의 돼지고기 품질에 대한 소비자의 요구를 만족하는 육질 형질 개량 시스템을 개발하였다.

최근에는, 돈육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돈육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돈육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돈육과 브랜드화되지 않은 돈육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드화되지 않은 돈육을 브랜드화된 돈육으로 속여서 판매하는 방식으로 돈육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다.

돼지의 육질 또는 육량 형질에 관여하는 원인 유전자 발굴 및 유전적 위치를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질관련 유전자 마커 발굴을 위하여 기능 유전자를 대상으로 단일염기다형성(single nucleotide polymor phism, SNP), 삽입결손(Insert/Deletion, indel) 등 유전자 변이 영역을 발굴 및 형질 관련성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질관련 SNP, indel 마커들이 발굴되었다.

게놈 지도의 완성에 따라 SNP의 존재도 밝혀진 경우가 많으나, 아직 발견되지 않은 SNP 역시 존재하며, 발견된 SNP일지라도 표현형에 미치는 영향에 대해서 연구되지 않은 경우가 아직 많이 존재하고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1457942호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용한 돈육의 단백질 함량 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 (a) 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T 또는 A이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, (b) 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드 및 (c) 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 4 내지 200개의 연속적인 염기로 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

상기 일배체형 마커는 돈육의 육색 또는 돈육의 육색소 함량을 추가로 예측할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 일배체형 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

상기 제제는 MYH13 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호4 및 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드, MYH1 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호7 및 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 및 MYH3 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호10 및 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 돈육의 육색 또는 돈육의 육색소 함량을 추가로 예측할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 개체로부터 분리된 시료에서 DNA를 분리하는 단계, b) 상기 DNA를 상기 일배체형 마커를 증폭하는 단계 및 c) 증폭산물의 유전자형을 분석하여 일배체형을 결정하는 단계를 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측 방법을 제공한다.

상기 단계 c)에서 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 결정하고, 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 결정하고, QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 결정하는 것일 수 있다.

상기 일배체형을 QQ 결정하는 경우, qq 및 Qq과 비교하여 돈육의 단백질 함량이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일배체형 마커는 돼지의 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자의 변이영역 분석하여 분자생물학적 수준에서 돈육의 단백질 함량을 예측할 수 있다. 이를 통해 돈육의 단백질 함량과 근내지방 함량을 조절하여 비선호부위의의 소비를 증가시킬 수 있다.

도 1은 돼지 염색체 12번 내의 육질형질(근내지방함량, 적색육 등) 유전자 영역 유전자군을 나타난 것이다.
도 2는 MYH13 유전자형 패턴을 파이로 시퀀싱(PYRO-SEQUENCER)으로 분석한 결과이다.
도 3은 MYH1 유전자형 패턴을 파이로 시퀀싱(PYRO-SEQUENCER)으로 분석한 결과이다.
도 4는 MYH3 프로모터 영역 변이영역을 전기영동 분석한 결과이다.

본 발명은 돈육의 유전자에서 변이를 탐색하고, 이러한 유전자 변이와 돈육의 육색, 돈육의 단백질 함량 그리고 돈육의 육색소 함량과의 연관성을 구명하여 품질이 우수한 돼지를 조기에 선발할 수 있는 분자마커를 개발하고자 한 것이다.

본 발명은 (a) 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T 또는 A이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, (b) 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 (c) 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 4 내지 200개의 연속적인 염기로 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

본 발명에서는 MYH13 유전자, MYH1 유전자 및 MYH3 유전자 변이영역에 따라 돼지의 유전자 일배체형 QQ, Qq, qq 형으로 구분하였으며, 상기 일배체형에 따라 돈육의 단백질 함량이 상이함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 “마커”는 유전자 좌위에 있는 돌연변이 또는 변형에 의해 일어난 다양성을 식별하기 위해 이용되는 짧은 DNA 서열을 의미한다.

본 발명의 목적상, 상기 마커는 돈육 내의 돈육의 단백질 함량에 따라 염기 변이(다형성 또는 삽입결손)이 나타나는 유전자를 의미할 수 있다.

본 발명에서 “일배체형(haplotype) 마커”는 1개의 염색체 상에 다형의 유전자자리가 조밀하게 연쇄하여 존재하는 경우, 동일 염색체 상에 연쇄하는 각 유전자자리의 대립유전자 조합을 포함하는 마커를 의미한다. 상기 일배체형을 이용하면 유전자 영역을 식별할 수 있고, 상기 일배체형을 형성하는 대립유전자는 연쇄불평형 관계가 형성될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 일배체형 마커는 MYH13, MYH1의 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위, 및 MYH3의 삽입결손(indel) 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호1로 구성된 폴리뉴클레오티드(MYH13 유전자)의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드와 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드(MYH1 유전자)의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드, 서열번호3으로 구성된 폴리뉴클레오티드(MYH3 유전자)의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T 또는 A이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 4 내지 200개의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 “MYH13 유전자”는 외적 안구 근육에서 발현되는 마이오신인 MYH13을 코딩하는 유전자를 의미하며, 본 발명에서 상기 MYH13 유전자는 서열번호1의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에서 “MYH1 유전자”는 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 myosin heavy chain 1을 코딩하는 유전자를 의미하며, 본 발명에서 상기 MYH1 유전자는 서열번호2로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에서 “MYH3 유전자”는 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 myosin heavy chain 3을 코딩하는 유전자를 의미하며, 본 발명에서 상기 MYH3 유전자는 서열번호3의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에서 "뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 용어 “다형성(polymorphism)”이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 일 실시예에서 돼지에서 분리한 DNA에서 MYH13, MYH1의 SNP 부위 및 MYH3의 6bp 삽입결손 변이영역의 유전자형을 분석하여 돼지 유전자의 일배체형을 결정하였으며, 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 부위별(등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심)의 돈육의 육색, 돈육의 단백질 함량 그리고 돈육의 육색소를 비교하였다. 구체적으로 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 정의하였으며, 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 정의하였다. 또한, QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 정의하였다.

본 발명의 실시예에서 일배체형에 따른 돈육의 육색을 분석한 결과, 등심, 반막, 대퇴, 상완에서, QQ 유전자형 돈육이 qq 유전자형 돈육보다 적색도(a)와 황색도(b)가 높게 측정되어 돈육의 육색이 우수함을 확인하였다(실시예 1).

따라서 본 발명의 일배체형 마커를 이용하여 돈육의 육색을 예측할 수 있다. 상기 일배체형 마커는 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 돈육의 육색을 예측하고, 이를 통해 돈육의 육색이 우수한 돼지 육성 및 선발에 활용 가능하다.

본 발명의 다른 실시예에서 일배체형에 따른 돈육의 단백질 함량을 분석한 결과, 등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심, 삼겹살에서, QQ 유전자형 돈육이 qq 유전자형 돈육보다 단백질 함량이 감소하고 근내지방 함량이 높아짐을 확인하였다(실시예 2).

따라서 본 발명의 일배체형 마커를 이용하여 돈육의 단백질 함량 또는 근내지방 함량을 예측할 수 있다. 상기 일배체형 마커는 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 돈육의 단백질 함량을 예측하고, 이를 통해 돈육의 단백질 함량을 조절하여 비선호 부위의 소비를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서 일배체형에 따른 돈육의 육색소 함량을 분석한 결과, 등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심에서, QQ 유전자형 돈육이 qq 유전자형 돈육보다 옥시미오글로빈 함량은 증가하지만, 미오글로빈과 메트미오글로빈 함량이 감소함을 확인하였다(실시예 3).

따라서 본 발명의 일배체형 마커를 이용하여 돈육의 육색소 함량을 예측할 수 있다. 상기 일배체형 마커는 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 돈육의 육색소 함량을 예측하고, 이를 통해 우수한 돼지 육성 및 선발에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에서 "미오글로빈(myoglobin)"은 척추동물의 근육세포 내에 존재하는 heme 단백질의 하나로 식육의 살빛 혹은 가공 때의 고기제품의 빛깔에 관여하는 중요한 색소단백질이다. 분자량 17,000, 혈액소인 헤모글로빈과 같이 heme와 글로빈 단백질로 되어 있으며 1 분자당 1개의 heme을 함유한다. 식육의 육색은 주로 미오글로빈 그 자체의 색으로 신선한 날고기의 빛깔은 환원형 미오글로빈의 색이다. 날고기를 장시간 공기에 노출하면 회갈색으로 변화하는데 이것은 고기 표면의 미오글로빈이 산화되어 메트미오글로빈으로 변화하기 때문이다. 이와 같이 heme 이가철이 삼가철로 산화되는 것을 met화라고 하지만 고기를 가열하였을 때에 생기는 갈색의 가열육도 마찬가지로 met화된 것으로 미오글로빈이 metmyochromogen으로 변화한 것이다. 염지할 때 염지생육의 아름다운 적색은 미오글로빈과 산화질소가 결합된 nitrosomyoglobin의 색으로 이것을 가열한 경우 햄이나 소시지의 색은 글로빈 부분이 가열변화하여 생긴 nitrosomyochromogen에 의한 것이다.

본 발명에서 "옥시미오글로빈(oxymyoglobin)"은 미오글로빈 유도체의 일종이며, 헴철(Fe＋2)의 제6배위좌에 산소가 1분자 결합한 것으로 선홍색을 나타낸다. 근육 중에 함유되는 미오글로빈이 산소저장체로서의 생리기능을 갖는 것은 옥시미오글로빈 형으로 산소를 가역적으로 결합하는 성질에 근거하고 있다. 신선한 식육 표면의 적색은 옥시미오글로빈이 존재하기 때문이다. 식육의 내부는 적자색의 환원형 미오글로빈에 의해 암적색이지만 썰면 표면이 공기에 노출되어 환원형 미오글로빈과 산소가 결합하여 옥시미오글로빈을 생성하여 선명한 적색을 나타낸다. 이 현상을 블루밍(blooming)이라고 한다. 식육의 표면이 비교적 오랫동안 적색을 유지하는 것은 옥시미오글로빈이 매우 안정한 성질을 갖는다.

본 발명에서 "메트미오글로빈(metmyoglobin)"은 미오글로빈의 heme 중심에 위치하는 철 원자가 이가에서 삼가로 산화된 배위좌에 물분자가 한개 결합한 상태이다. 신선한 생육 표면은 옥시미오글로빈에 의해 선명한 적색을 띠고 있지만 장시간 저장에 의해 점차 산화되어 메트미오글로빈을 생성하여 갈색으로 변화한다. 메트미오글로빈의 생성량이 미오글로빈 전량의 약 60%에 달하면 식육의 갈색화가 분명하게 일어난다. 고기 표면에서의 메트미오글로빈의 생성에는 pH, 산소분압, 염류 농도, 광선, 온도 등 여러 가지 요인이 관여하고 특히 글로빈 부분이 변성하면 갈색화는 현저히 촉진된다. 메트미오글로빈이 생성하여 갈색으로 변화한 식육은 그 후 다시 공기에 두어도 적색으로 되돌아가지 않기 때문에 상품가치를 잃게 된다.

또한 본 발명은 상기 일배체형 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물은 단일 일배체형 마커를 분석하여 단일 마커와 비교하여 통계적 유의성, 신뢰도 및 정확성 등의 향상된 것일 수 있다.

본 발명에서 개시된 단일염기다형 이외의 돈육의 단백질 함량과 통계적으로 유의성이 입증된 다른 단일염기다형 종류를 포함할 수 있으며, 돈육의 단백질 함량 예측의 통계적 유의성, 신뢰도 및 정확성 등의 향상을 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다

본 발명에서 “검출 또는 증폭할 수 있는 제제”란, 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하여 인식하거나 또는 마커를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적인 상기 유전자 마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에서 “프라이머”는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

상기 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 마커 염기서열과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 마커 염기서열과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 상기 프라이머는 MYH13 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호4 및 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드, MYH1 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호7 및 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 및 MYH3 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호10 및 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

또한 본 발명은 상기 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물을 포함하는 돈육의 단백질 함량 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 키트는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인함으로써 돈육의 단백질 함량 수준을 판단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커의 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 일배체형의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

또한 본 발명은, a) 개체로부터 분리된 시료에서 DNA를 분리하는 단계, b) 상기 DNA를 상기 조성물을 이용하여 증폭하는 단계 및 c) 증폭산물의 유전자형을 분석하여 일배체형을 결정하는 단계를 포함하는 돈육의 단백질 함량 예측 방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”는 돈육의 단백질 함량 수준을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 일배체형 마커에 포함된 SNP의 다형성 부위 및 indel 부위의 유전자형을 분석함으로써 상기 돈육의 단백질 함량 수준을 판단할 수 있다.

본 발명의 “분리된 시료”는 돼지의 개체에서 분리된 시료일수 있으며, 구체적으로 돼지에서 분리된 근육, 표피, 혈액, 뼈, 분리된 조직, 분리된 세포, 타액, 뇨, 각종 체액, 털일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 단계 b)의 증폭은 DNA로부터 본 발명의 마커를 증폭하는 것으로, 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 c)에서 유전자형을 분석은 증폭 산물에 포함된 유전자 마커의 염기를 결정하는 단계도 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specifichybridization; DASH), PCR 연장 분석(예로, 단일 염기연장(single base extension; SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예로, Sequenom의 MassARRAY 시스템), Bio-Plex 시스템(BioRad), 제한효소 절단법 등을 이용하여 수행될 수 있다.

전술한 본 발명의 일 실시예에서 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 정의하였으며, 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 정의하였다. 또한, QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 정의하였다.

따라서 본 발명에서 일배체형 결정은 유전자형 분석결과를 종합하여 일배체형을 QQ, Qq 또는 qq로 결정하는 것이며, 구체적으로 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 결정하고, 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 결정하고, QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 결정하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, MYH13 또는 MYH1 유전자의 SNP 변이를 검출하기 위해 각 유전자에 특이적인 프라이머를 제조한 후, 피로시퀀싱(pyrosequencing)으로 유전자형 분석을 수행하였다.

본 발명에서 “피로시퀀싱(pyrosequencing)”은 표지된 프라이머(labeled primer)가 필요하지 않으며 젤 전기영동 과정이 없이, DNA의 염기 서열을 30~40 염기쌍(bp) 정도만을 염기 서열 분석함으로써 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 피로시퀀싱은 프라이머-디렉티드 PCR에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 이루어지고 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 피로포스페이트는 ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 빛은 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 갖는 피크로 보여지고, 이를 보고 실시간으로 시퀀스를 결정할 수 있다. 종래의 직접적 DNA 시퀀싱 방법은 서열분석에 요구되는 시간이 많은 단점이 있는 반면, 피로시퀀싱은 염기서열 분석할 PCR 산물만 준비된다면 시퀀싱 프라이머를 가지고 반응시키고, 이는 피로시퀀싱 기기에 의해 대략 10분 내에 염기서열의 분석이 가능하여 분석시간을 단축할 수 있다.

따라서 본 발명의 유전자형을 분석하는 방법은 MYH13 또는 MYH1에 특이적인 프라이머 세트를 제조하고 Pyro-sequencer를 이용하여 유전자형 분석을 분석하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, MYH3 유전자 증폭산물에 HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 염기변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하여 6bp 삽입결손 유전형을 확인하였다. 구체적으로 MYH3 프로모터의 변이영역이 6bp(+/+)는 경우, 유전자 절단되지 않아 하나의 밴드로 나타나며, 6bp(-/-)의 경우, 유전자가 절단되어 두 개의 밴드로 나타남을 확인하였다. 또한, 6bp(+/-)의 경우, 세 개의 밴드가 나타남을 확인하였다.

따라서 본 발명의 유전자형을 분석하는 방법은 MYH3 유전자 증폭산물에 HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 염기변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하고 유전자의 절단 양상을 분석하는 것일 수 있다.

또한 전술한 실시예에서 일배체형이 QQ인 경우, qq 및 Qq에 비해 돈육의 단백질 함량이 낮고, 근내지방 함량이 높음을 확인하였는 바, 본 발명의 예측방법은 돼지의 일배체형을 QQ 결정하는 경우, 돈육의 단백질 함량이 qq 및 Qq과 비교하여 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 돼지의 준비

농촌진흥청 국립축산과학원 난지축산연구소에서 사육하고 있는 흑돼지 난축맛돈을 활용하였다. 또한 본 연구의 동물 실험은 국립축산과학원 동물실험윤리위원회의 승인을 받았으며 위원회 규정을 준수하며 수행하였다(No. 2017-241).

2. DNA 분리

돼지(시험축)의 경정맥 또는 생산되는 자돈의 꼬리에서 DNA를 추출하여 유전자 분석을 수행하였다. DNA 분리는 sucrose-proteinase K 방법을 변형하여 수행하였다(Sambrook 등, 1989). 분리된 DNA는 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(spectrophotometer, NanoDrop Technologies, USA)로 흡광도를 측정한 후 A₂₆₀/A₂₈₀비율이 1.8 이상인 genomic DNA를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)의 주형으로 이용하였다.

3. 돈육의 유전자형 분석

돼지 육질 형질을 결정하는 유전자는 12번 염색체의 661kb 영역 내에 존재하며, 상기 영역 내에 존재하는 유전자를 LALD mapping을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, MYH3, MYH1, MYH2, MYH13, ADPRM, SCO1, TMEM220, ENSSSCG00000029441, ENSSSCG00000018006의 9개 유전자가 상기 육질 형질 유전자 영역 내에 존재함을 확인하였다(도 1).

이중 돼지 육질형질 연관 유전자를 마우스에 삽입하여 표현형을 분석한 결과, 돼지 MYH1과 MYH13 유전자를 삽입한 마우스에서는 적색육이 많이 침착이 되어 있음을 확인하였다. 또한, MYH2 유전자는 육질형질과 관련된 유전자 마커가 검출되지 않았다. 따라서 육질형질과 연관 유의성이 높은 유전자 영역은 MYH13에서 MYH3 유전자이다.

이에 육질형질과 연관 유의성이 높은 유전자 영역에 포함된 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형이 돈육 내의 돈육의 육색에 미치는 영향을 분석하고자, 각 유전자에 특이적인 프라이머를 제조하고 이들 유전자형을 분석하였다.

3.1. MYH13 유전자의 유전형 분석

MYH13 유전자의 SNP 변이는 myosin-13 유전자의 프로모터 영역인 염색체 12의 57,934,149번째 염기에 위치하며, T 또는 A이다. 상기 MYH13 유전자 SNP 중심으로 2003개의 뉴클레오티드를 확보하였다(서열번호1). 상기 SNP를 검출하기 위해 표1과 같이 프라이머를 제조하고 Pyro-sequencer를 이용하여 유전자형 분석을 수행하였다.

	염기서열
MYH13 유전자 (서열번호1)	ACAGGCACTGAGATTTGCTCCTATTTGCAAAGTGATGGACACTGTTCTGGACATGGTGGGTGTCCAGGAAGCACTGAACTGAATAGTAATTGCTCTGTAATTCTGGGCATCACACTAGCCATTGCCTCTGGAGCGTCCTATGTAAGTCAGTCTGCGGCCCGGCAAGTTCTATTTGGTATATTCACCCATCTAGCAGGAATCAGCGTCACTCTCTCCTTAGGGGAGAGGGAGTTCAACCCCTTCCACCACCATCTTCCCCTTTCTCTAAAGCAAACATCACAAAAACAAAGCCCAAGCCCTCGGAGAAGGAGACGGGAGCAGGGGTGTGGACCACGGCAGCTTTCACCCGCTGCGTCACTACAGAGCAGAGCAGAGTCTTGTTCTGCCTTCAGGTTCCCACGGAGCAGCATCCACTTTCTAACACTCCAAAGGAAAGTGAGGATGCCCAAGCTGGCAGGGGCATCTGAGCTCAACACTTACCCGGTCATCGAGGGTCTTGACTGTGACCTTGTCGTTCTCCCTGCTCTGGATCATACCCTTCACATACAGTTCCTTATCGTCCACCGCAAAGCAGGCTTTCTTGGAATCGAATGGGCGGTTCTGAGCCTCGATTCTCTCCTTCTCTGATTTCCGCAGGTAGGGAGCTGCCTCTCCAAAGACGGCCATCTCTGCGTCAGAGCTCATGGCTGCAGGGGCTGGGGAGACGGGGGGCTGCTCAGTCTGAAGCCTGGGGAGCGCTCCCGAATCTGGCAGGCCCTGCTCTCTTACTTCCATTCGGACAAGGGGCTGGATTCAGAAGCTCCTGGGATTAACCTAGGTCTTGAGGACTCTAGGACCAGTTCTAGGGGTCTGGCGTGGGCAAGCGGGGATGAGCTAAAGGGAAAATTTTACTCTAAGAAAAACGTTTGAGGGGTCTCTTGAGTGTTGACTTGGAAACATCTTAGTCCAGCTCCAGGTATGGAAGCCAGAAGCTGTGAGAGGAAAGCCAAGCTGAGCCCAAT [T/A] AAGGAGGCCTCGGAAAAGACTTCCTTGATTACACGTCATGTTTGAGCCCCATGGTCTATGTCACTCCCAAATCTTAAATGTGTCTTGGGAGTTCCCATCATGGCTCAGTGGTTGACAAATCCGACTAGGAACCATGAGGTTGTGGGTTCGATCCCTGGCCTCGCTCCGTGGGTTAAGGATCCGGTGTTGCTGTGAGCTGCGGTGTAGGTTGCAGACGTGGCTCGGATCCCACATTGCTGTGGCTCTGCCATAGGCCGGTGGCTACAGCTCCAATTAGACCCCTAGCCTCGGACCCTCCATATATGCAGCAGGTGCAGCCCCAGAACAGACAAAAAGACAGAAAAACAAACAAAAAAAATCTTAAAGCTGTCTGAAAAGAAGTATTGGAATGTTGATAATTCTTAGCAGAAACTTCAGGCAGTCCAGTGAAAAGTGATGACTTGAGTTACAGGTAGCAAGGTGATGGGAGGTGTGATGGTTTAGGGCAGTGGTTCCAAACTTGAACATGCCCCAGAATGAACTGCAGAGATTGTCAAAACACACATGTCTGGGCCCTAACTGCAGAGTTTCTGAATCTGTCGGTGTGGGATGGAGCGTGAGAATATACATTTCTAGCACGTTCCTGGAGATGCTGATGGGGCTGGTCCAGGGACCACACCCTGAGAACGGCTGGGTGTAGGGCCTGCCTGCTCCAAGTGCGGTCCTTGAACAGGTTGCATCAGGAGCTTGTTAGACATTCAGAATCTCAGACCCACCCAGATTACAAAAGCAGCATCTGTATTGTAACAAGCTCTCCAGGTGATTTCTGGGCATATGATAAAATTGACAAGTACTGGGCTGAACGCAGAGGTCTCTGAACTTCAGTTACTGGCAGCATCAGGGGGTGACAAAGAGTGTCTAATTAGATTAACGCCTGCCTAAGAACTCGCTGCCAAATGTGTCTGTTGGATGTGGTGTTTATGTGTCTGTCTGCCTCTCTTTCTCTCTCCCACTCCCTTCTA
MYH13_5U_F (서열번호4)	TGA-GGG-GTC-TCT-TGA-GTG-TTG
MYH13_5U_R (서열번호5)	biotin-CAT-GGT-TCC-TAG-TCG-GAT-TTG
MYH13_MINI_seq1(서열번호6)	AAA-GCC-AAG-CTG-AGC-CCA-AT
MYH13 INPUT seq (서열번호12)	[T/A]AAGGAGGCCTCGGAAAA

상기 프라이머 중, MYH13_5U_R은 그의 5'-말단에 바이오틴이 결합된 형태로 제작하였다. 상기 프라이머를 사용하고 돼지로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR을 수행하여 변이된 유전자 시료를 수득하였다. 상기 수득한 변이된 유전자 시료를 대상으로 Pyro-sequencer를 이용한 유전자형 분석을 수행하였다(도 2).

PCR 반응은 50 ng의 DNA, 10 pmole 프라이머, 10ⅹ 버퍼 2ul, dNTP 5 mM, 2.5 units의 i-Taq DNA polymerase (Intron Biotechnology, South Korea)를 포함하여 20 ul가 되게 첨가하고 Nexus (Eppendorf, Germany)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 95˚C에서 3분 간 초기 변성한 후, 94˚C에서 30초, 62˚C에서 60초, 72˚C에서 60초의 반응을 35 회 반복하고, 72˚C에서 5분간 최종 신장시켰다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스겔(agarose gel) 상에서 확인하였다.

도 2는 Pyro-sequencer를 이용한 MYH13 유전자의 유전자형 분석을 수행하여 상기 SNP 변이를 검출한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 상기 MYH13 유전자의 SNP 변이인 T/T 유전자형, T/A 유전자형 및 A/A 유전자형의 경우 각각 서로 다른 결과를 나타냄을 확인하였다.

3.2. MYH1 유전자의 유전형 분석

MYH1 유전자의 SNP 변이는 myosin-1 유전자의 프로모터 영역인 염색체 12의 57,964,336번째 염기에 위치하며, G 또는 T이다. 상기 MYH1 유전자 SNP 중심으로 2003개의 뉴클레오티드를 확보하였다(서열번호2). 상기 SNP를 검출하기 위해 표 2와 같이 프라이머를 제조하고 Pyro-sequencer를 이용하여 유전자형 분석을 수행하였다.

	염기서열
MYH1 유전자 (서열번호2)	TGGATCTTCTTTAATTTCCTTGATTAATGTTTTATAGTTCTCAGCATATATGTCTTTCACTTCTTTGGTCGAGTTTATTCCTAGGTATTTAATTTTTTGAGGTGTGATTTGAAAAGGTGTATTGTATTTTTATATTCCCTTTCTAATATTTCATTGTTAGTATACAGAAATGCAACCAATTTCTGAATGTTAATCTTGTATCCTGCTACTTTGCTGAATGCTGATCAGTTTGAGTATTTTTTGTGTGGAGTCCTTAGGATTTTCTGTATATAGTGTCATGTCATCTGCATACAGTAACAATTTTACCTTTTCTCTTCCAGTTTGGATACCTTTTATTTTTTTTGTTGTCTGACTGCTATGACTAGGACTTCCAATACTACGTTGAATAAAAGTGGTGGGAGTGGGCATCCTTGTCTTTTTCCAGATTTAGTAGGAAGACTTTTAGCTTTTCTCCATTGAGTATTATATTTGTTCTGGGTTTGTCATAAATGGCTTTTATTATGTTAAGGTATATTCCCTCTATACCCACTTTGGTAAGTGTTTTTATCGTGAATGGATGTTGACTTTGTCAAATGCTTTTTCTGGATCTATTGAGATGATTGTGTGGCTTTCAGTATAACTACTTGGCATTAGTTTTTTTTTTTTTTAATATATATATATGCAGGAAACAAGTTCTTTATCAGGGATATAATTTGCAAATACTTTTTCTCAGTTGGTGGCTTGTTTTTTCCTTCTCTTTAACAGTGTTTCTCAAAGCTCAGAAACTCTGGATTTTGATGAAATCTAATTTATCTTTTTTTTTTTCTTTCTTGGCTTGTGCTTTTGGTGTTGCTAAGACATTTTTGTGTAAACCAAGGTCACAAAAATTTACTCTTATGTTTACTTCTAGGAGTTTTTAGGATTATGTTTTTGGTATCCTCGTCTATCCAAAATTTTGTTTAGGAGCGTGTTTTGAATTTTTTGTTTTAAACTGTTGTTAGTAATTTAATTTTTTTTTTTTT[G/T]GAGACTGTGGCCTGTGTGGTTTATACTGTAAAGGAATGAGGCTGATAGGGGTTTGAGGACAGGAGAGAGTGGATGGTAGGAGGTGGAAGAGGGACACAAGTACACAAAATACATTTATTGTCTACATTGCATTTTGTTCTATTGCCATCTCTCTTTCTAGAAACAAAACTCCTTGTGTTTATACTGCATTGAATCTTGTCTTGTTCTTCCTCTTTTCATAAGTTCTTCCTCTTCTTCCTCTCTTTCTCTGGCCCACTTATCCATCCAATGTATCAGAAAACCCCATGTGGAATTCCTGTTGTGGCTCAGAGGGTTAGGAACCCTACTAGTATCCATGAGGACGCAGGTTTGGTCCCTGGCCTTGCTCAGTGGGTTAAGGAGCTGGTGTTCCTGCAAGCTGTGGTGTAGCTCACAGATGTGGCTTGGATCTGGTGTTGCTGTGGCTGTGGTGTAGATCCAATTCGACCTCTAGCCCACAAACGTCTATATGCCACAGTTGCGGCCCTAAAAAGAAAAAAAGAAAAGAAAACCCCACGTGCACTACCTTCCCAGTACATCTAGAATCCATCCAGTTCTCGTCATCTCCCAATGCCATCTCTCTGGTCCAAGCCACAGGCTTTTTTTTTTTTTTAATCTTTTATTTTGCAGTAAACTCCTAACTGGTCTCCTGGTTTCCACCTCTATCCCCTTTAGTCTGTTCTCAACACAGCAGTAAGAGTGATTCTTTTTAAAAATGTGCTAATATCACTTCTCTGGTCAAAACCTTCTAAAGATTTCACATCTCTTTCTGAGTAAAGACAAAAGTCCTGAGGTGGCCTCAGGCCCTACAGGATCTCTGGGCTCCAGATACCTCTCTTTTGCTGTAACAATCTTGCTCATTCTCCTCTAACCCTGCTAGCCTCCTTCCCAACCTACCAAACTAATCCTGCCTCAGGGCCTTTGCATTTTCTGTTGTTCCTTCCCTTGGAAAGGCTCTGCCTTGTTAATCTCATGGCTTACCC
MYH1_5U_F (서열번호7)	TGT-GTA-AAC-CAA-GGT-CAC-AAA-AA
MYH1_5U_R (서열번호8)	biotin-ATG-GCA-ATA-GAA-CAA-AAT-GCA-A
MYH1_MINI_seq1 (서열번호9)	TAA-TTT-AAT-TTT-TTT-TTT-TTT
MYH1 INPUT seq (서열번호13)	[G/T]GAGACTGTGGCCTGTGTGGTT

상기 프라이머 중, MYH1_R은 그의 5'-말단에 바이오틴이 결합된 형태로 제작하였다. 상기 프라이머를 사용하고 돼지로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR을 수행하여 변이된 유전자 시료를 수득하였다. 상기 수득한 변이된 유전자 시료를 대상으로 Pyro-sequencer를 이용한 유전자형 분석을 수행하였다(도 3).

도 3은 Pyro-sequencer를 이용한 MYH1 유전자의 유전자형 분석을 수행하여 SNP 변이를 검출한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 상기 MYH1 유전자의 SNP 변이인 G/G 유전자형, G/T 유전자형 및 T/T 유전자형의 경우 각각 서로 다른 결과를 나타냄을 확인하였다.

3.3. MYH3 유전자의 유전형 분석

MYH3 유전자의 유전형을 분석하기 위하여, 돼지 MYH3 유전자의 전사시작지점(transcription start site; TSS)으로부터 5'-UTR 3kb, 및 종결코돈(stop codon)으로부터 3'-UTR 1kb 까지의 염기서열을 해독하였다. 그 결과, 육질에 영향을 미치는 MYH3 유전자의 프로모터 영역에서 6 bp의 indel 변이를 확인하였다.

돼지 myh3 프로모터 영역 변이영역(6bp-염기결손)

6bp(-/-)

GACGATCCTAATGAGACAGCAGGA------CGTGTGTTCCCCACACAAGTTGTACAATCAC

6bp(+/+)

GACGATCCTAATGAGACAGCAGGAGGACTGCTGTTGTTCCCCCACAAGTTGTACAATCAC

	염기서열
MYH3 gene 유전자 (서열번호3)	tggtggttat tgccgctgct tccaccctca gggttctcct ggcgagcgga gctccctgcc 60 tacctcggac cctcgttcca tggcccgggc aggcttcttc ccctcgtgcc ttccagcccc 120 tcatgtgcag aagcaggccg tcaggcagat gacccgagac ctcccagccg agcctctgtg 180 ctcgtggagg acgtgtgacg gagagaagga agacaggccg gctgacgggg gaaaagctgg 240 ggtgggaggc cgtcagcctt gagctcgcct tgggctcagg gatgcgacgt ggcttcacgc 300 ttgacaagaa gctcaaagaa atcctgtgtg gaaaacgtcc tctcggtgtc ccggaggtgg 360 gatggatgtg gttgtgcaga ggtgggtgaa ccggcgccaa ctaaaggtca aaagcaagcc 420 ggccccaacc gcggcccctg gtgtttaaga agggaccgcc agcacccttc ccctgaccac 480 ccagcacacg tcacagcctg agacgtagcc agggcccctg cactgtccct cagccccagg 540 gggcttgcta acacctctgc ttccaggtga catgcacctg tcctcaccag gcctcccagg 600 atggctggcc aatggcgcag agagtcaggc cggcgcgtcc ctgggcaggg agaccacgcc 660 ccttcaggac cggagggtcc ttgaggaggg tcgagctctc ttcttggacg aggaggattt 720 ctgggggagg gggtttcagt cccagcggcg gggggtgggc ggtggggcgt gacatgtagc 780 atggcaggtc catgcttcct gactttcctc ctgatggcca cttgcctacc tgctttgatc 840 taaaaatcac caaaatctca gacataatcg agtcaccatt tatccaagaa accatcgagg 900 gtaaagccgc agcttccatt tctttcgatt cttcttccag ggttctgcct tgggcccagc 960 atgcagtggg tgtttaatta atgcccctgc ccctcgggga ctgcagcccc actccccctg 1020 ccccaccccc agcccttaga gtggcctcct ggcccgcgct gcgtgtggct atgctgggag 1080 ggggccgttc ttattctcca gtggggacag ctgacaccag aatgaacgac aacgggttac 1140 ccacaggcca cgctcccaac ggtctgtcag ggaaaaaaag ggaaaaacag acataaagtg 1200 gaataagaat gggcaaacgc ttcagccata cccctctgtg ctcctaaggc tttatttttc 1260 taaccctgat ttagaaacag ccatgctcgt tagacgcccc ctcacccccc tttctctgca 1320 ggccctgcca tccccccacc cccgccccgg ccagcagctg gtctttccta attggtgaca 1380 tgtcttaata actacaggtc cttgagcagc tgtcactgtg gctcctggct ggtgggctac 1440 ctccctctca gtcatttact cgttggtcct actggcgctt aagacagagg tttagttaat 1500 gacgatccta atgagacagc aggacgtgtg ttccccacac aagttgtaca atcacacatt 1560 cctgccacaa ccctgtgttg taacaaaagc cttgctcaaa actccaagag ggtttaaact 1620 tttccgtcct tggcttcatc cctttgccca caggccgaga ttctaggtcc ccgctgtccc 1680 agagaccagg ctcatctcca gccgtgtggc gcctgtggga tggagcgagg gcccccggca 1740 aggctgtccc atcactgagc cgccggttca gagaaaggca tcccaaactt ccagctttct 1800 ccagctagga tcctgtcatt tctatatata cctctctctt ggcagcggca aaaaaaagcg 1860 aggaaggagc tggtcctcac ttgtggtgtc ggtcactctc tttccaaata tagagaagga 1920 atgagtggcg ggggttagca ggggctataa aagcccgcgg ggagcgcccc ttgtagctgc 1980 tctgtgggcg gaggagagtc acagtgcccc ttgtgcgggt ccttcccatc tgaggctcag 2040 aggctcgtgt ggccctgccc ggctttggta aggaccagac gtgcggctga ttctcagccc 2100 ctccccgcct ccagcatccc gcttccttca cctgttctcc cctgccctca tcctccagag 2160 ccttcccggg cagggtccct tcggatgctc tgtggaccac tgccgtcacc ccggcccatg 2220 aacgctgcca cctctctgac ttgtgcagag gccagtgggc ctggccgcct ccccacctgc 2280 gctgcgggcc tgcggtgtct gtcctctcaa ggccacgctg gctgtgcatc cgttggcttg 2340 tctgagactt cgccctgcct gcccacagaa gacagggggc ctggccctgg cttggaggca 2400 caggcttttc aaacagagct tctgtcctga ctgctcacat ctgaggagga ggcatggcag 2460 acagagggtg gtgccacccg ggcaggaggg agccaggtct ggggcggctg ggggctctcc 2520 tgccttcagg gctcacctgt gggccaggtc ccatttgctc ctccagcttg tctctgggcc 2580 aaggctcttt taaagttatt cgtcctttct cttcatttgg ttaattgatt aaggcccatt 2640 cagaactgaa ccagacactc ccacgtctcc tgaccttttg tgtatttatt gcaggtctga 2700 tttctcacgg ctgctgctgt ctgctgtcct cctgcgggtg tgactctcag gtgagaaagc 2760 aggtcaggtc ccctggctca gccatctcca gggtactggt tcccccccgg ccacggcctt 2820 gcggcgagca ggacaggtta ggctggagag gagccccagg gaaggctgcc aagcagatgc 2880 tgatgtgaga agccgcttgt ttgtagaagg gactgaagcc ggtttccagg tgggggatgg 2940 agccaccctg aatccgagcg gttccaaaac tccttagcta tttgcccttt aacacgctct 3000 ttgaagaatg tttgcttttg agagtgttta cctttacgtc ttccctcagc aacccctggc 3060 ttttacagaa gaggaaagcg gggtcccaag agctgcaccc acctctgggc gctctgcccg 3120 ccccagcccc ggctaacggg ggagcttgga ttgcgtgcat cccgtgtcct ctgcacagag 3180 gagctgctca atgaaatgca cccatttgat cccggggggc tggatggcgg cggccttgct 3240 cctgggctcc gcctggaggg cgcctgtggg gtcagggctg gagtctggcc cggggactca 3300 ctggggggtc ccttccagcc gacaccatga gcagcgacac tgaaatggaa gtgttcggca 3360 tagccgctcc cttcctccgc aagtcggaaa aggagaggat 3400
MYH3_F (서열번호10)	TGT-GTA-AAC-CAA-GGT-CAC-AAA-AA
MYH3_R (서열번호11)	biotin-ATG-GCA-ATA-GAA-CAA-AAT-GCA-A

돼지 MYH3 프로모터 영역의 염기변이가 돼지 돈육의 육색에 미치는 영향을 확인하고자, 프라이머(서열번호10 forward: 5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3', 서열번호11 reverse: 5'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-3')를 이용하여 상기 염기 변이를 포함한 부분을 증폭한 뒤, HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하였다. 이후, 제한효소에 의한 돼지 MYH3 유전자의 절단 양상을 확인하였다.

PCR 산물은 제한효소(HpyCH4Ⅳ)를 이용하여 절단하였고, 제한효소반응 조건은 공급자의 매뉴얼에 따라 PCR 산물 3㎕와 10×버퍼 1㎕, 제한효소 0.3㎕, 증류수(DW) 5.7㎕를 혼합하여 37℃에서 overnight 반응하였다. 제한효소 절단 양상은 브롬화 에티듐이 함유된 3% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 유전자 증폭 여부를 확인하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이 돼지 MYH3 프로모터의 변이영역이 6bp(+/+)는 경우 유전자 절단되지 않아 하나의 밴드로 나타나며, 6bp(-/-)의 경우, 유전자가 절단되어 두 개의 밴드로 나타남을 확인하였다. 또한, 6bp(+/-)의 경우, 세 개의 밴드가 나타남을 확인하였다.

3.4. 돼지의 유전자형 haplotype 분석

MYH13, MYH1, MYH3의 유전자형 분석결과를 바탕으로 돼지의 유전자 일배체형을 qq, Qq(qQ), QQ 형으로 분류하였다.

구체적으로 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 결정하고, 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 결정하고, QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 결정하였다.

일배체형 (haplotype)	유전자
일배체형 (haplotype)	MYH13	MYH1	MYH3
QQ	T/T	T/T	6bp(-/-)
qq	A/A	G/G	6bp(+/+)

4. 돈육의 육색 측정 방법

부분육 4개 부위(등심, 반막, 대퇴, 상완)별 색도는 Chroma meter(Minolta Co, CR 301)로 명도(L), 적색도(a), 황색도(b)를 CIE 값으로 측정하였다.

5. 돈육 단백질 함량 측정 방법

돈육 단백질은 AOAC(2006)에 준하여 Kjeltec System(Kjeltec Auto 2400/2460, Foss Tecator AB, Hoganas, Sweden)을 이용하여 분석하였다. 황산과 Kjeltab(분해촉매제)를 넣어 시료를 분해한 후 암모니아로 유리시켜 이를 혼합지시약이 들어 있는 Boric acid 으로 포집후 0.1N 염산으로 적정하였다. 하기 수학식 1로 질소 함량(%)을 계산하고, 이에 질소계수 6.25를 곱하여 단백질 함량(%)으로 표시하였다.

6. 돈육의 육색소 함량 측정 방법

6.1. 돈육의 육색소 함량 측정 원리

신선육의 경우는 환원미오글로빈(자적색, deoxymyoglobin), 산소화미오글로빈(선홍색, oxymyoglobin), 산화미오글로빈(갈색, metmyoglobin)의 상태로 있으며, 이러한 상태에서 흡수 및 반사 스펙트럼이 다르기 때문에 각 상태별로 상대적인 양을 측정할 수 있다. 신선육에서는 이러한 상태가 동시에 존재하기 때문에 전체 미오글로빈 함량은 미오글로빈의 등흡광점(isobestic point)에서 측정한다. 등흡광점은 같은 파장에서 같은 값이 주어질 때 두개 또는 그 이상의 스펙트럼이 교차되는 지점을 말한다. 환원미오글로빈, 산소화미오글로빈, 산화미오글로빈의 등흡광점은 파장이 525㎚이다. 신선육을 발색시켜 전체 육색소를 추출해서 흡광도 572, 565, 545, 525㎚에서 측정한 다음 환원미오글로빈, 산소화미오글리빈, 산화미오글로빈의 상대적인 비율을 나타낸다.

6.2. 시약제조

Sodium phosphate buffer(pH 6.8, 이온강도 0.04)는 하기 단계로 제조하였다. Na₂HPO₄(MW 142.0) 5.68g에 3차 증류수 1ℓ를 맞추어서 만든 후 10일 정도 냉장 보관을 하였다. Na₂HPO₄(MW 120.0) 4.80g에 3차 증류수 1ℓ를 맞추어서 만든 후 10일 정도 냉장 보관하였다. 보관된 Na₂HPO₄(MW 142.0) 40mM에 Na₂HPO₄(MW 120.0) 40mM을 조금씩 넣어 pH를 6.8로 맞추었고, 4℃ 냉장고에 보관하였다.

6.3. 돈육의 육색소 함량 측정 방법

1) 분쇄육을 시료용기에 잘 펴서 1시간 발색을 시켰다. 발색이 이루어지는 동안 얼음이 담겨진 용기에 넣어 두었다.

2) 원심분리 튜브에 발색시킨 분쇄육 4g을 취하여 냉장고에 보관중인 4℃phosphate buffer(pH 6.8, 이온강도 0.04)를 20㎖ 넣은 후 13,000rpm에서 20초간 균질(1 part : 샘플 8개)하였다.

3) 균질액을 호일로 감싸서 빛을 차단하고 냉암소(4℃)에서 1시간 방치하였다.

4) 2 part(샘플 8개)를 분쇄 후 위와 마찬가지로 냉암소에서 1시간 방치하였다.

5) 1 part를 5,000g에서 30분간 원심 분리하였다.

6) 3 part(샘플 8개)를 분쇄 후 3)과 같이 냉암소에서 1시간 방치하였다.

7) 2 part를 5,000g에서 30분간 원심 분리하였다.

8) 1 part를 상층액을 여과지로 여과한 후 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 분광광도계는 흡광도측정 30분전에 미리 켜놓고, 3차 증류수로 blank를 잡았으며, 572, 565, 545, 525㎚에서 흡광도를 측정하였다.

9) 3 part 5000g에서 30분간 원심 분리하였다.

10) 2 part를 여과 후 8)과 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다.

11) 3 part를 여과 후 8)과 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다.

6.4. 돈육의 육색소 함량 계산

돈육의 육색소 함량을 수학식 2 내지 수학식 7을 통해 계산하였다.

[실시예　1］유전자 일배체형에 따른 돈육의 육색

표 5 및 표 6은 돈육의 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 부위별(등심, 반막, 대퇴, 상완) 돈육의 육색을 비교한 결과이다. 표 5는 흑돼지 난축맛돈 집단에서의 분석결과이며, 표 6은 재래돼지 집단에서의 분석결과이다. 적색도(a)와 황색도(b) 수치가 높아질수록 육색이 연붉은색을 나타내며, 소비자의 선호도가 높아진다. 황색도(b)의 경우도 수치가 높아질수록 짙은 황색을 나타내며, 0을 기점으로 높아지면 황색, 낮아지면 청색을 나타낸다.

부분육 부위	CIE	유전자형(Genotype)			p-value
부분육 부위	CIE	qq (17)	Qq (103)	QQ (67)	p-value
등심	L	47.47 ± 3.83	46.95 ± 4.29	48.40 ± 4.06	n.s
	a	7.13 ± 1.11a	9.60 ± 1.26b	10.82 ± 1.99c	2.87E-15
	b	3.37 ± 0.88a	4.53 ± 1.28b	5.56 ± 1.18c	4.02E-11
반막	L	41.25 ± 2.57	40.19 ± 3.62	40.98 ± 3.69	n.s
	a	9.33 ± 1.20a	11.33 ± 1.53b	13.17 ± 2.04c	4.33E-16
	b	2.83 ± 0.73a	3.62 ± 1.25b	4.88 ± 1.29c	5.06E-12
대퇴	L	37.51 ± 2.73a	38.89 ± 4.14a	40.67 ± 3.24b	0.001153
	a	10.67 ± 1.34a	13.03 ± 1.48b	14.39 ± 1.73c	9.97E-16
	b	3.13 ± 0.82a	4.24 ± 1.24b	5.30 ± 1.14c	7.6E-12
상완	L	35.76 ± 1.83a	37.64 ± 2.96b	39.39 ± 2.84c	4.28E-06
	a	11.68 ± 1.70a	14.08 ± 1.52bc	14.24 ± 1.54c	1.42E-08
	b	2.64 ± 0.69a	3.89 ± 1.18bc	4.23 ± 1.14c	3.53E-06

표 5를 살펴보면, 흑돼지 난축맛돈 집단의 경우, 등심, 반막, 대퇴, 상완에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 돈육의 적색도(a)와 황색도(b) 수치가 높아짐을 확인할 수 있다.

유전자형

분석
두수

등심(배최장근)

반막

대퇴

상완

L

a

b

L

a

b

L

a

b

L

a

b

Qq

8

47.81±
2.72

9.91
±
1.62

4.39
±
1.06

40.13±
2.79

12.10±
1.56

3.30
±
0.94

39.33±
3.02

14.13±
1.27

4.16
±
0.93

39.23±
2.11

14.17±
1.94

3.94
±
0.99

QQ

10

47.67±
3.08

11.69±
1.50

4.44
±
1.24

39.65±
2.71

14.51±
1.22

4.12
±
0.69

38.61±
1.86

15.45±
1.29

4.64
±
0.66

38.72±
3.16

14.49±
1.46

3.6
2±
0.62

표 6을 살펴보면, 재래돼지 집단에서도 등심, 반막, 대퇴, 상완에서 QQ 유전자형이 Qq 유전자형보다 돈육의 적색도(a)와 황색도(b) 수치가 높아짐을 확인할 수 있다.

즉, 이러한 결과를 통해, 돼지의 일배체 유전자형을 QQ 형으로 고정하는 경우, qq 유전자형과 비교하여 돈육의 적색도와 황색도가 높아짐을 확인하였다. 따라서 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 돈육의 육색을 예측하고, 이를 통해 돈육의 육색이 우수한 돼지 육성 및 선발에 유용하게 활용할 수 있다.

[실시예 2] 유전자 일배체형에 따른 돈육의 단백질 함량

표 7 및 표 8는 돈육의 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 부위별(등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심, 삼겹살) 단백질 함량과 근내지방 함량을 비교한 결과이다. 표 7은 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 흑돼지 난축맛돈 부분육의 단백질 함량을 나타낸 것이며, 표 8은 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 흑돼지 난축맛돈 부분육의 근내지방 함량을 나타낸 것이다.

부분육 부위	유전자형(Genotype)			p-value
부분육 부위	qq (17)	Qq (103)	QQ (67)	p-value
등심	21.49 ± 0.96^a	20.74 ± 1.18^b	19.90 ± 1.17^c	1.338E-07
반막	22.40 ± 0.58^a	20.96 ± 0.99^b	19.42 ± 1.51^c	3.261E-20
대퇴	21.89 ± 0.54^a	20.37 ± 0.72^b	19.29 ± 0.93^c	7.782E-27
상완	21.17 ± 0.52^a	20.22 ± 0.55^b	19.75 ± 0.62^c	2.212E-16
목심	15.23 ± 1.07	15.51 ± 1.36	15.56 ± 2.16	n.s
삼겹살(상)	12.41 ± 1.30^a	11.57 ± 1.44^ab	11.09 ± 1.88^b	0.007
삼겹살(중)	11.45 ± 1.00^a	10.74 ± 1.23^ab	10.43 ± 1.50^b	0.016
삼겹살(하)	12.38 ± 1.43^a	12.13 ± 1.51^ab	11.48 ± 1.69^b	0.014

표 7을 살펴보면, 등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심, 삼겹살에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 육단백질 함량이 낮아짐을 확인할 수 있다.

근내지방함량	유전자형(Genotype)			p-value
근내지방함량	qq	Qq	QQ	p-value
등심	6.34 ± 2.42^a	8.27 ± 4.05^a	10.20 ± 4.59^b	0.0006
반막	2.34 ± 1.13^a	4.04 ± 2.67^a	6.97 ± 5.39^b	2.86E-07
대퇴	2.53 ± 0.71^a	4.00 ± 1.34^b	5.72 ± 2.33^c	1.04E-12
상완	2.57 ± 0.66^a	3.57 ± 1.01^b	4.36 ± 1.53^c	7.25E-08
목심	28.31 ± 4.65	26.04 ± 5.70	25.45 ± 8.56	n.s
삼겹살(상)	45.74 ± 6.43	47.97 ± 7.10	48.04 ± 9.69	n.s
삼겹살(중)	52.38 ± 5.40	54.69 ± 6.58	55.55 ± 9.42	n.s
삼겹살(하)	47.88 ± 6.64	47.90 ± 7.08	49.69 ± 8.28	n.s

표 8을 살펴보면, 표 7의 육단백질 함량과 정반대로, 등심, 반막, 대퇴, 상완, 목심, 삼겹살에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 근내지방 함량이 증가함을 확인할 수 있다.

즉, 이러한 결과를 통해, 돼지의 일배체 유전자형을 QQ 형으로 고정하는 경우, qq 유전자형과 비교하여 단백질 함량은 줄어들지만 근내지방 함량이 높아짐을 확인하였다. 따라서 MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 돈육 단백질 함량을 예측하고, 이를 통해 돈육의 단백질 함량과 근내지방 함량을 조절함으로써 비선호부위의 소비를 증가시킬 수 있다.

[실시예 3] 유전자 일배체형에 따른 돈육의 육색소 함량

표 9 내지 표 11은 돈육의 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 부위별(등심, 반막, 대퇴, 상완) 돈육의 육색소(미오글로빈, 옥시미오글로빈, 메트미오글로빈) 함량을 비교한 결과이다. 표 9는 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 미오글로빈 함량과의 관계를 나타낸 것이며, 표 10은 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 옥시미오글로빈 함량과의 관계를 나타낸 것이며, 표 11은 유전자 일배체형(qq, Qq, QQ)에 따른 메트미오글로빈 함량과의 관계를 나타낸 것이다.

부분육 부위	유전자형(Genotype)			p-value
부분육 부위	qq (17)	Qq (103)	QQ (67)	p-value
등심	0.28 ± 0.02a	0.26 ± 0.06b	0.25 ± 0.05bc	0.0001
반막	0.27 ± 0.05a	0.24 ± 0.07b	0.24 ± 0.06bc	0.0098
대퇴	0.30 ± 0.03	0.26 ± 0.05	0.26 ± 0.06	n.s
상완	0.28 ± 0.02	0.26 ± 0.06	0.25 ± 0.05	n.s

표 9를 살펴보면, 등심, 반막, 대퇴, 상완에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 미오글로빈 함량이 낮아짐을 확인할 수 있다.

부분육 부위	유전자형(Genotype)			p-value
부분육 부위	qq (17)	Qq (103)	QQ (67)	p-value
등심	0.35 ± 0.07a	0.42 ± 0.14b	0.43 ± 0.11bc	0.0005
반막	0.39 ± 0.12a	0.44 ± 0.14b	0.44 ± 0.12bc	0.0228
대퇴	0.32 ± 0.11	0.4 ± 0.1	0.41 ± 0.13	n.s
상완	0.35 ± 0.07	0.42 ± 0.14	0.43 ± 0.11	n.s

표 10을 살펴보면, 등심, 반막, 대퇴, 상완에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 옥시미오글로빈 함량이 증가함을 확인할 수 있다. 옥시미오글로빈 함량이 높을수록 붉은색을 보유하고 있어 육질이 좋을뿐만 아니라 소비자 기호도가 높다.

부분육 부위	유전자형(Genotype)			p-value
부분육 부위	qq (17)	Qq (103)	QQ (67)	p-value
등심	0.27 ± 0.07a	0.22 ± 0.09b	0.22 ± 0.08bc	0.0022
반막	0.25 ± 0.09	0.22 ± 0.09	0.22 ± 0.07	n.s
대퇴	0.28 ± 0.09	0.25 ± 0.06	0.24 ± 0.08	n.s
상완	0.27 ± 0.07	0.22 ± 0.09	0.22 ± 0.08	n.s

표 11을 살펴보면, 반막, 대퇴, 상완, 목심에서 qq 유전자형, Qq 유전자형, QQ 유전자형 순으로 옥시미오글로빈 함량이 감소함을 확인할 수 있다. 메트미오글로빈 함량이 낮을수록 갈변현상이 적게 나타나서 붉은색의 육색을 보유하고 있어 육질이 좋을뿐만 아니라 소비자 기호도가 높다.

즉, 상기 결과를 통해, 돼지의 일배체 유전자형을 QQ 형으로 고정하는 경우, qq 유전자형과 비교하여 옥시미오글로빈 함량은 증가하지만, 미오글로빈과 메트미오글로빈 함량이 감소함을 확인하였다.

일반적으로 소비자는 선홍색 돈육을 선호하지만 장기간 저장시 갈변현상이 발생하는 것은 자연스러운 현상이다. MYH13, MYH1 및 MYH3 유전자형 분석을 통해 QQ 유전자형으로 고정할 경우, 돈육의 육색소 함량이 예측 가능하므로, 돈육을 장기 보존하더라도 육색의 갈변 정도를 낮추는 효과가 있어 신선육 상태의 적색육으로 장기간 보관이 가능하여 돈육의 품질을 높일 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Marker for predicting protein content of pork and use thereof <130> DP20200068 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH13 gene <400> 1 acaggcactg agatttgctc ctatttgcaa agtgatggac actgttctgg acatggtggg 60 tgtccaggaa gcactgaact gaatagtaat tgctctgtaa ttctgggcat cacactagcc 120 attgcctctg gagcgtccta tgtaagtcag tctgcggccc ggcaagttct atttggtata 180 ttcacccatc tagcaggaat cagcgtcact ctctccttag gggagaggga gttcaacccc 240 ttccaccacc atcttcccct ttctctaaag caaacatcac aaaaacaaag cccaagccct 300 cggagaagga gacgggagca ggggtgtgga ccacggcagc tttcacccgc tgcgtcacta 360 cagagcagag cagagtcttg ttctgccttc aggttcccac ggagcagcat ccactttcta 420 acactccaaa ggaaagtgag gatgcccaag ctggcagggg catctgagct caacacttac 480 ccggtcatcg agggtcttga ctgtgacctt gtcgttctcc ctgctctgga tcataccctt 540 cacatacagt tccttatcgt ccaccgcaaa gcaggctttc ttggaatcga atgggcggtt 600 ctgagcctcg attctctcct tctctgattt ccgcaggtag ggagctgcct ctccaaagac 660 ggccatctct gcgtcagagc tcatggctgc aggggctggg gagacggggg gctgctcagt 720 ctgaagcctg gggagcgctc ccgaatctgg caggccctgc tctcttactt ccattcggac 780 aaggggctgg attcagaagc tcctgggatt aacctaggtc ttgaggactc taggaccagt 840 tctaggggtc tggcgtgggc aagcggggat gagctaaagg gaaaatttta ctctaagaaa 900 aacgtttgag gggtctcttg agtgttgact tggaaacatc ttagtccagc tccaggtatg 960 gaagccagaa gctgtgagag gaaagccaag ctgagcccaa twaaggaggc ctcggaaaag 1020 acttccttga ttacacgtca tgtttgagcc ccatggtcta tgtcactccc aaatcttaaa 1080 tgtgtcttgg gagttcccat catggctcag tggttgacaa atccgactag gaaccatgag 1140 gttgtgggtt cgatccctgg cctcgctccg tgggttaagg atccggtgtt gctgtgagct 1200 gcggtgtagg ttgcagacgt ggctcggatc ccacattgct gtggctctgc cataggccgg 1260 tggctacagc tccaattaga cccctagcct cggaccctcc atatatgcag caggtgcagc 1320 cccagaacag acaaaaagac agaaaaacaa acaaaaaaaa tcttaaagct gtctgaaaag 1380 aagtattgga atgttgataa ttcttagcag aaacttcagg cagtccagtg aaaagtgatg 1440 acttgagtta caggtagcaa ggtgatggga ggtgtgatgg tttagggcag tggttccaaa 1500 cttgaacatg ccccagaatg aactgcagag attgtcaaaa cacacatgtc tgggccctaa 1560 ctgcagagtt tctgaatctg tcggtgtggg atggagcgtg agaatataca tttctagcac 1620 gttcctggag atgctgatgg ggctggtcca gggaccacac cctgagaacg gctgggtgta 1680 gggcctgcct gctccaagtg cggtccttga acaggttgca tcaggagctt gttagacatt 1740 cagaatctca gacccaccca gattacaaaa gcagcatctg tattgtaaca agctctccag 1800 gtgatttctg ggcatatgat aaaattgaca agtactgggc tgaacgcaga ggtctctgaa 1860 cttcagttac tggcagcatc agggggtgac aaagagtgtc taattagatt aacgcctgcc 1920 taagaactcg ctgccaaatg tgtctgttgg atgtggtgtt tatgtgtctg tctgcctctc 1980 tttctctctc ccactccctt cta 2003 <210> 2 <211> 2003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH1 gene <400> 2 tggatcttct ttaatttcct tgattaatgt tttatagttc tcagcatata tgtctttcac 60 ttctttggtc gagtttattc ctaggtattt aattttttga ggtgtgattt gaaaaggtgt 120 attgtatttt tatattccct ttctaatatt tcattgttag tatacagaaa tgcaaccaat 180 ttctgaatgt taatcttgta tcctgctact ttgctgaatg ctgatcagtt tgagtatttt 240 ttgtgtggag tccttaggat tttctgtata tagtgtcatg tcatctgcat acagtaacaa 300 ttttaccttt tctcttccag tttggatacc ttttattttt tttgttgtct gactgctatg 360 actaggactt ccaatactac gttgaataaa agtggtggga gtgggcatcc ttgtcttttt 420 ccagatttag taggaagact tttagctttt ctccattgag tattatattt gttctgggtt 480 tgtcataaat ggcttttatt atgttaaggt atattccctc tatacccact ttggtaagtg 540 tttttatcgt gaatggatgt tgactttgtc aaatgctttt tctggatcta ttgagatgat 600 tgtgtggctt tcagtataac tacttggcat tagttttttt tttttttaat atatatatat 660 gcaggaaaca agttctttat cagggatata atttgcaaat actttttctc agttggtggc 720 ttgttttttc cttctcttta acagtgtttc tcaaagctca gaaactctgg attttgatga 780 aatctaattt atcttttttt ttttctttct tggcttgtgc ttttggtgtt gctaagacat 840 ttttgtgtaa accaaggtca caaaaattta ctcttatgtt tacttctagg agtttttagg 900 attatgtttt tggtatcctc gtctatccaa aattttgttt aggagcgtgt tttgaatttt 960 ttgttttaaa ctgttgttag taatttaatt tttttttttt tkgagactgt ggcctgtgtg 1020 gtttatactg taaaggaatg aggctgatag gggtttgagg acaggagaga gtggatggta 1080 ggaggtggaa gagggacaca agtacacaaa atacatttat tgtctacatt gcattttgtt 1140 ctattgccat ctctctttct agaaacaaaa ctccttgtgt ttatactgca ttgaatcttg 1200 tcttgttctt cctcttttca taagttcttc ctcttcttcc tctctttctc tggcccactt 1260 atccatccaa tgtatcagaa aaccccatgt ggaattcctg ttgtggctca gagggttagg 1320 aaccctacta gtatccatga ggacgcaggt ttggtccctg gccttgctca gtgggttaag 1380 gagctggtgt tcctgcaagc tgtggtgtag ctcacagatg tggcttggat ctggtgttgc 1440 tgtggctgtg gtgtagatcc aattcgacct ctagcccaca aacgtctata tgccacagtt 1500 gcggccctaa aaagaaaaaa agaaaagaaa accccacgtg cactaccttc ccagtacatc 1560 tagaatccat ccagttctcg tcatctccca atgccatctc tctggtccaa gccacaggct 1620 tttttttttt tttaatcttt tattttgcag taaactccta actggtctcc tggtttccac 1680 ctctatcccc tttagtctgt tctcaacaca gcagtaagag tgattctttt taaaaatgtg 1740 ctaatatcac ttctctggtc aaaaccttct aaagatttca catctctttc tgagtaaaga 1800 caaaagtcct gaggtggcct caggccctac aggatctctg ggctccagat acctctcttt 1860 tgctgtaaca atcttgctca ttctcctcta accctgctag cctccttccc aacctaccaa 1920 actaatcctg cctcagggcc tttgcatttt ctgttgttcc ttcccttgga aaggctctgc 1980 cttgttaatc tcatggctta ccc 2003 <210> 3 <211> 3400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH3 gene <400> 3 tggtggttat tgccgctgct tccaccctca gggttctcct ggcgagcgga gctccctgcc 60 tacctcggac cctcgttcca tggcccgggc aggcttcttc ccctcgtgcc ttccagcccc 120 tcatgtgcag aagcaggccg tcaggcagat gacccgagac ctcccagccg agcctctgtg 180 ctcgtggagg acgtgtgacg gagagaagga agacaggccg gctgacgggg gaaaagctgg 240 ggtgggaggc cgtcagcctt gagctcgcct tgggctcagg gatgcgacgt ggcttcacgc 300 ttgacaagaa gctcaaagaa atcctgtgtg gaaaacgtcc tctcggtgtc ccggaggtgg 360 gatggatgtg gttgtgcaga ggtgggtgaa ccggcgccaa ctaaaggtca aaagcaagcc 420 ggccccaacc gcggcccctg gtgtttaaga agggaccgcc agcacccttc ccctgaccac 480 ccagcacacg tcacagcctg agacgtagcc agggcccctg cactgtccct cagccccagg 540 gggcttgcta acacctctgc ttccaggtga catgcacctg tcctcaccag gcctcccagg 600 atggctggcc aatggcgcag agagtcaggc cggcgcgtcc ctgggcaggg agaccacgcc 660 ccttcaggac cggagggtcc ttgaggaggg tcgagctctc ttcttggacg aggaggattt 720 ctgggggagg gggtttcagt cccagcggcg gggggtgggc ggtggggcgt gacatgtagc 780 atggcaggtc catgcttcct gactttcctc ctgatggcca cttgcctacc tgctttgatc 840 taaaaatcac caaaatctca gacataatcg agtcaccatt tatccaagaa accatcgagg 900 gtaaagccgc agcttccatt tctttcgatt cttcttccag ggttctgcct tgggcccagc 960 atgcagtggg tgtttaatta atgcccctgc ccctcgggga ctgcagcccc actccccctg 1020 ccccaccccc agcccttaga gtggcctcct ggcccgcgct gcgtgtggct atgctgggag 1080 ggggccgttc ttattctcca gtggggacag ctgacaccag aatgaacgac aacgggttac 1140 ccacaggcca cgctcccaac ggtctgtcag ggaaaaaaag ggaaaaacag acataaagtg 1200 gaataagaat gggcaaacgc ttcagccata cccctctgtg ctcctaaggc tttatttttc 1260 taaccctgat ttagaaacag ccatgctcgt tagacgcccc ctcacccccc tttctctgca 1320 ggccctgcca tccccccacc cccgccccgg ccagcagctg gtctttccta attggtgaca 1380 tgtcttaata actacaggtc cttgagcagc tgtcactgtg gctcctggct ggtgggctac 1440 ctccctctca gtcatttact cgttggtcct actggcgctt aagacagagg tttagttaat 1500 gacgatccta atgagacagc aggacgtgtg ttccccacac aagttgtaca atcacacatt 1560 cctgccacaa ccctgtgttg taacaaaagc cttgctcaaa actccaagag ggtttaaact 1620 tttccgtcct tggcttcatc cctttgccca caggccgaga ttctaggtcc ccgctgtccc 1680 agagaccagg ctcatctcca gccgtgtggc gcctgtggga tggagcgagg gcccccggca 1740 aggctgtccc atcactgagc cgccggttca gagaaaggca tcccaaactt ccagctttct 1800 ccagctagga tcctgtcatt tctatatata cctctctctt ggcagcggca aaaaaaagcg 1860 aggaaggagc tggtcctcac ttgtggtgtc ggtcactctc tttccaaata tagagaagga 1920 atgagtggcg ggggttagca ggggctataa aagcccgcgg ggagcgcccc ttgtagctgc 1980 tctgtgggcg gaggagagtc acagtgcccc ttgtgcgggt ccttcccatc tgaggctcag 2040 aggctcgtgt ggccctgccc ggctttggta aggaccagac gtgcggctga ttctcagccc 2100 ctccccgcct ccagcatccc gcttccttca cctgttctcc cctgccctca tcctccagag 2160 ccttcccggg cagggtccct tcggatgctc tgtggaccac tgccgtcacc ccggcccatg 2220 aacgctgcca cctctctgac ttgtgcagag gccagtgggc ctggccgcct ccccacctgc 2280 gctgcgggcc tgcggtgtct gtcctctcaa ggccacgctg gctgtgcatc cgttggcttg 2340 tctgagactt cgccctgcct gcccacagaa gacagggggc ctggccctgg cttggaggca 2400 caggcttttc aaacagagct tctgtcctga ctgctcacat ctgaggagga ggcatggcag 2460 acagagggtg gtgccacccg ggcaggaggg agccaggtct ggggcggctg ggggctctcc 2520 tgccttcagg gctcacctgt gggccaggtc ccatttgctc ctccagcttg tctctgggcc 2580 aaggctcttt taaagttatt cgtcctttct cttcatttgg ttaattgatt aaggcccatt 2640 cagaactgaa ccagacactc ccacgtctcc tgaccttttg tgtatttatt gcaggtctga 2700 tttctcacgg ctgctgctgt ctgctgtcct cctgcgggtg tgactctcag gtgagaaagc 2760 aggtcaggtc ccctggctca gccatctcca gggtactggt tcccccccgg ccacggcctt 2820 gcggcgagca ggacaggtta ggctggagag gagccccagg gaaggctgcc aagcagatgc 2880 tgatgtgaga agccgcttgt ttgtagaagg gactgaagcc ggtttccagg tgggggatgg 2940 agccaccctg aatccgagcg gttccaaaac tccttagcta tttgcccttt aacacgctct 3000 ttgaagaatg tttgcttttg agagtgttta cctttacgtc ttccctcagc aacccctggc 3060 ttttacagaa gaggaaagcg gggtcccaag agctgcaccc acctctgggc gctctgcccg 3120 ccccagcccc ggctaacggg ggagcttgga ttgcgtgcat cccgtgtcct ctgcacagag 3180 gagctgctca atgaaatgca cccatttgat cccggggggc tggatggcgg cggccttgct 3240 cctgggctcc gcctggaggg cgcctgtggg gtcagggctg gagtctggcc cggggactca 3300 ctggggggtc ccttccagcc gacaccatga gcagcgacac tgaaatggaa gtgttcggca 3360 tagccgctcc cttcctccgc aagtcggaaa aggagaggat 3400 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH13_5U_F <400> 4 tgaggggtct cttgagtgtt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH13_5U_R <400> 5 catggttcct agtcggattt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH13_MINI_seq1 <400> 6 aaagccaagc tgagcccaat 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH1_5U_F <400> 7 tgtgtaaacc aaggtcacaa aaa 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH1_5U_R <400> 8 atggcaatag aacaaaatgc aa 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH1_MINI_seq1 <400> 9 taatttaatt tttttttttt t 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH3_F <400> 10 tgtgtaaacc aaggtcacaa aaa 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH3_R <400> 11 atggcaatag aacaaaatgc aa 22 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH13 INPUT seq <400> 12 waaggaggcc tcggaaaa 18 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH1 INPUT seq <400> 13 kgagactgtg gcctgtgtgg tt 22

Claims

(a) 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T 또는 A이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드,
(b) 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 1002 번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및
(c) 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기를 포함하는 4 내지 200개의 연속적인 염기로 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측용 일배체형 마커.
삭제
제 1항의 일배체형 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 제제는 프라이머 또는 프로브인 것인, 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 제제는 MYH13 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호4 및 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드, MYH1 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호7 및 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 및 MYH3 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호10 및 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 돈육의 단백질 함량 예측용 조성물.
삭제
제 3항 내지 제 5항의 조성물을 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측용 키트.
a) 개체로부터 분리된 시료에서 DNA를 분리하는 단계,
b) 상기 DNA를 제1항의 일배체형 마커를 증폭하는 단계 및
c) 증폭산물의 유전자형을 분석하여 일배체형을 결정하는 단계를 포함하는, 돈육의 단백질 함량 예측 방법.
제 8항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이며, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 T/T이고, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기인 경우, 일배체형을 QQ로 결정하고,
서열번호1로 표시되는 MYH13 유전자의 1002 번째 염기가 A/A이고, 서열번호2로 표시되는 MYH1 유전자의 1002 번째 염기가 G/G이며, 서열번호3으로 표시되는 MYH3 유전자의 1524번째 내지 1527번째 염기가 ACGT의 연속된 염기와 상이한 경우, 일배체형을 qq로 결정하고,
QQ 및 qq 형을 제외한 나머지 일배체형을 Qq 또는 qQ로 결정하는 것인, 돈육의 단백질 함량 예측 방법.
제 9항에 있어서,
상기 일배체형을 QQ 결정하는 경우, qq 및 Qq과 비교하여 돈육의 단백질 함량이 낮을 것으로 예측하는 것인, 돈육의 단백질 함량 예측 방법.