CN107805629A - 溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物。该噬菌体可在短时间内快速抑制弧菌的生长，且抑制作用维持时间长。此外，该噬菌体的杀菌组合物安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物。
背景技术
我国是水产养殖大国。近年来，我国的水产养殖业获得迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大和集约化养殖方式的不断推广，鱼类疾病的频繁发生对海水鱼类规模化养殖的健康发展造成了严重的威胁。鱼类的病原体主要包括细菌、病毒、寄生虫等，其中细菌性疾病是对鱼类危害程度较为严重的一类疾病。
弧菌是能运动的芽孢短杆状细菌，广泛分布于近海岸、河口海区海水及生物体内，是海洋中最常见的细菌类群之一，同时也是引起海水养殖鱼虾细菌性疾病最重要的病原菌之一。弧菌的致病强度与宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素有关，属于条件性致病菌，其主要通过口或伤口感染，产生毒素，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变从而导致鱼虾类的死亡。由弧菌引起的疾病又称弧菌病，具有“流行面积广，发病率高，致死性强”等特点，是水产养殖动物的主要疾病，同时也被确定为是阻碍水产养殖业发展的重要限制性因素，给养殖业造成了巨大的危害。其中，以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)等弧菌引起的弧菌病被认为是鱼虾类养殖中最为严重的病害之一。目前，针对水产养殖相关动物疾病的预防和控制方法主要以化学抗生素法和免疫疫苗法，其中以化学抗生素使用为主。作为当前控制水产动物疾病的主要手段，化学抗生素法具有使用方便、见效快和疗效好等优点。但是，大批量频繁使用抗生素在控制病原菌的同时，极大了助长了病原菌的耐药性，并加速了广谱耐药菌的产生。这使得致病菌的耐药性问题日益严重。此外，化学药物残留也是导致人类食源性疾病产生的重要原因之一，对人类健康造成严重危害。
噬菌体又称细菌性病毒，是一类专一性裂解细菌的病毒，在环境中分布广泛，种类多样，结构简单，具有很强的宿主特异性。最重要的一点，噬菌体裂解细菌的机制不受细菌耐药性的影响，其通过受体识别从而吸附在特定宿主菌表面，将自身遗传物质注入宿主体内进行自我复制组装，并最终通过裂解宿主菌释放子代从而实现自我的生长繁殖。利用噬菌体控制水产致病菌早在噬菌体被发现之前就有应用，但由于对噬菌体的研究不够充分，而抗生素在当时具有广谱抑菌效果，且疗效好见效快，这使得噬菌体应用被大大削弱。近年来，由于抗生素滥用引发的一系列耐药菌问题，使得噬菌体重新回归人们的视野，应用噬菌体控制致病菌的研究也在科学界引起了广泛兴趣。作为应对抗生素抗性的重要武器之一，噬菌体的临床应用潜力巨大，但就其当前单一噬菌体疗法的应用而言，其在应用过程中仍存在一些潜在的缺点，如裂解宿主谱窄，裂解能力持续时间短，宿主菌易产生抗性等，其中以宿主菌易产生抗性为单株噬菌体应用的主要缺陷。
针对以上单一噬菌体疗法存在的不足，将多种噬菌体混合使用的鸡尾酒疗法应运而生。其通过多种噬菌体之间的复配既扩大了宿主谱范围，同时有效的抑制宿主菌抗性的产生，具有快速高效的裂解作用，目前在临床应用的研究中已取得较好的效果。此外，噬菌体鸡尾酒通过噬菌体之间的协同作用降低了在相等条件下单株噬菌体的添加剂量，起到了节约成本的作用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明涉及一种专一性裂解弧菌的溶藻弧菌噬菌体，保藏名为 ValSw3-2，于2017年09月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017503，分类命名为Vibrio phage。
该噬菌体均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间为：2017年09月14日。经保藏中心于2017年09月27日检测为存活菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中的噬菌体筛选流程图；
图2为透射电镜下的各弧菌噬菌体的形态；
a：噬菌体ValDsh1-1；b：VpaSw-1；c：VpaSw-2；d：ValSw3-1；e： ValSw3-2；f:ValSw3-3；
图3为基于16s DNA的宿主菌进化树；
3-副溶血弧菌(Vibrio.parahaemolyticus)；18-溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)；F1-金黄色弧菌(Vibrio.azureus)；F3-溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)；F4-弧菌(Vibrio.sp)；F10-副溶血弧菌(Vibrio. parahaemolyticus)；
图4为不同感染复数(MOI)下单株噬菌体对溶藻弧菌V.alginolyticus 的生长曲线作用图；在不同的MOI(10，1，0.1，0.01，0.001)下，3株噬菌体分别对溶藻弧菌生长曲线(OD600)抑制效果，control组(菌液+培养基)表示不加噬菌体，Blank组(培养基)表示空白对照；
f4-1：ValSw3-1；f4-2：ValSw3-2；f4-3：ValSw3-3；
图5为当MOI＝1时不同噬菌体鸡尾酒组合对6株病原菌生长曲线的作用图；
a—副溶血弧菌(Vibrio.parahaemolyticus)；b—溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)；c—金黄色弧菌(Vibrio.azureus)；d—溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)；e—弧菌(Vibrio.sp)；f:—副溶血弧菌(Vibrio. parahaemolyticus)；
cock-1：ValSw3-1，ValDsh1-1；cock-2：ValSw3-1，VpaSw-1；cock-3： ValSw3-1，VpaSw-2；cock-4：ValSw3-1，ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-1； cock-5：ValSw3-1，ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-2，ValDsh1-1；control：菌液+培养基(不加噬菌体)；Blank：培养基。
本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体ValDsh1-1(Vibrio phage ValDsh1-1)，保藏号为CCTCC NO:M 2017499；
本发明所提供的副溶血弧菌噬菌体VpaSw-1(Vibrio phage VpaSw-1)，保藏号为CCTCC NO:M 2017500；
本发明所提供的副溶血弧菌噬菌体VpaSw-2(Vibrio phage VpaSw-2)，保藏号为CCTCC NO:M 2017501；
本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体ValSw3-1(Vibrio phage ValSw3-1)，保藏号为CCTCC NO:M 2017502；
本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2(Vibrio phage ValSw3-2)，保藏号为CCTCC NO:M 2017503；
本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体ValSw3-3(Vibrio phage ValSw3-3)，保藏号为CCTCC NO:M 2017504；
上述菌株的保藏地址均为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间均为：2017年09月14日。均经保藏中心于2017年09月27日检测为存活菌株。
具体实施方式
本发明针对由弧菌引起的水产养殖上鱼虾类疾病大肆传播的问题上，在抗生素过度使用引起弧菌耐药性菌株产生的基础上，从患病鱼虾病灶中分离致病性弧菌，并通过现场实验确定了该弧菌病原菌的致病性，以该致病性弧菌为宿主，从水环境中分离得到6株新的裂性弧菌噬菌体，通过形态观察，确定了该弧菌噬菌体的分类地位，并通过全基因组测序确定了该6 株噬菌体的基因型。此外，通过平板点滴法，根据透明斑的有无，测定了弧菌噬菌体在29株不同种属菌株下的宿主谱。通过认识单一噬菌体对宿主菌的侵染特性，进一步评估了单株噬菌体在不同梯度感染复数(MOI)下的抑菌能力，进而根据各个噬菌体最病原性弧菌的裂解能力组合了5个噬菌体鸡尾酒组合，通过在单株噬菌体条件下确定的MOI从而进一步评估了该5个组合对病原性弧菌的生长抑制作用，由此我们了确定最佳的弧菌噬菌体鸡尾酒组合。我们该噬菌体在控制由弧菌引起的水产动物致病菌具有一定的潜力，应用空间广泛。
本发明一方面涉及一种溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2，于2017年09月14 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017503，分类命名为Vibrio phage。
本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2在治疗弧菌感染性疾病中具有很多优势，首先其可对耐药菌也具有很好的防治效果；其次，由于噬菌体的杀菌谱较窄，在复杂细菌的环境中——例如动物肠道——发生杀菌作用时，不会对益生菌造成伤害；第三，其效价较高，防治效果好。
然而细菌能通过自然筛选或人工筛选对抗生素产生抗药性，同理，其也能对单一的噬菌体逐渐耐受。有鉴于此，本发明通过认识单一噬菌体对于侵染宿主的特性，评估单一噬菌体的感染能力，采用一定的混合方法构建噬菌体鸡尾酒，最后通过特定指标确定最佳的鸡尾酒组成，该噬菌体鸡尾酒既具有噬菌体的专一性特征，又弥补了单一噬菌体疗法易导致宿主菌抗性的不足，应用前景广泛。
根据本发明的一方面，本发明还涉及含有如上所述的溶藻弧菌噬菌体 ValSw3-2的杀菌组合物。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2以及其它弧菌噬菌体中的至少一种；优选为裂性弧菌噬菌体。
由于同种病毒(噬菌体)之间的感染途径、分子基础均具有很大的相似性，因此当同种噬菌体共同感染宿主时彼此间可能会促进感染效率，发挥协同作用。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物还包括副溶血弧菌噬菌体VpaSw-1，保藏号为：CCTCC NO:M 2017500；
副溶血弧菌噬菌体VpaSw-2，保藏号为CCTCC NO:M 2017501；
溶藻弧菌噬菌体ValSw3-1，保藏号为CCTCC NO:M 2017502；
溶藻弧菌噬菌体ValDsh1-1，保藏号为CCTCC NO:M 2017499；以及
溶藻弧菌噬菌体ValSw3-3，保藏号为CCTCC NO:M 2017504中的一种或多种；
上述噬菌体均于2017年09月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名均为Vibrio phage。
本发明提供的噬菌体杀菌组合物可在短时间内快速抑制弧菌的生长，并抑制该病原菌噬菌体抗性的产生。此外，该噬菌体鸡尾酒安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及VpaSw-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1以及VpaSw-2。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1以及ValSw3-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2以及ValSw3-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、ValSw3-1以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、ValSw3-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、ValDsh1-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2、ValDsh1-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及VpaSw-2。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2以及ValSw3-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2、ValSw3-1以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2、ValSw3-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-2、ValDsh1-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及ValSw3-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及ValSw3-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、ValSw3-1以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、ValSw3-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、ValSw3-1、ValDsh1-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及ValDsh1-1。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、ValDsh1-1以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2以及ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValSw3-2、VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1、ValDsh1-1以及 ValSw3-3。
在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物还包括ValDsh1-1的突变体、VpaSw-1的突变体、VpaSw-2的突变体、VpaSw-3-1的突变体、VpaSw-3-2 的突变体以及VpaSw-3-3的突变体中的一种或多种。
优选的，所述突变体序列至少90％与相应的噬菌体的天然序列相同。
由于病毒在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地测定同源性，例如GCG程序包中提供的缺口程序(威斯康星软件包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机小组，575科学道，麦迪逊市，威斯康星州，美国53711)(Needleman，S.B.与Wunsch，C.D.， (1970)《分子生物学杂质》48,443-453)。通过用于DNA序列比较的下列设置来使用缺口程序：缺口产生罚分5.0，缺口延伸罚分0.3。ValDsh1-1、 VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1、ValSw3-2以及ValSw3-3的突变体至少90％与所述噬菌体的天然序列相同；且所述突变体具有与最初的噬菌体大致相同的灭杀病原菌的功能。更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，ValDsh1-1、 VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1、ValSw3-2以及ValSw3-3的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。
噬菌体ValDsh1-1、VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1、ValSw3-2以及 ValSw3-3的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
如上所述，噬菌体可以以足够高的浓度存在以诱导溶菌作用，当混配成混合物时，优选的，如上所述的杀菌组合物，所述组合物中每种弧菌噬菌体的含量≥106PFU/mL；
优选的，如上所述的杀菌组合物，所述组合物中每种弧菌噬菌体的含量为106PFU/mL～1010PFU/mL，更优选为106PFU/mL～109PFU/mL，更优选为106PFU/mL～108PFU/mL，更优选为106PFU/mL～107PFU/mL，还可以取2 ×106PFU/mL，3×106PFU/mL，4×106PFU/mL，5×106PFU/mL，6× 106PFU/mL，7×106PFU/mL，8×106PFU/mL，9×106PFU/mL，5× 107PFU/mL，5×108PFU/mL，5×109PFU/mL等中间数值。
优选的，当ValDsh1-1与VpaSw-1、VpaSw-2、ValSw3-1、ValSw3-2以及ValSw3-3中的一种或多株进行混配时，按感染复数等比的方式进行混合。
优选的，如上所述的杀菌组合物，所述杀菌组合物还包括辅料；
所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种；
SM缓冲液的配制方法为常规方法，例如：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g， 1mol/L的Tris·HCl 50mL(pH＝7.0)，5mL 2％gelatin，加入纯净水补足至 1000mL。
优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
上述杀菌组合物可作为病毒制剂使用，所用剂型可为各种常见剂型，例如粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂、膏剂等。
优选的，如上所述的杀菌组合物在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用；所述应用为治疗用途或非治疗用途；
优选的，所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌V.alginolyticus、鳗弧菌V.anguillarum、霍乱弧菌V.cholerae、非O1群霍乱弧菌non-O1V.cholerae、费氏弧菌V.fischeri、河流弧菌V.fluvialis、哈维氏弧菌V.harveyi、病海鱼弧菌V.ordalii、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、杀鲑弧菌V.salmonicida、拟态弧菌V.mimicus、灿烂弧菌V.splendidus、金黄色弧菌V.azureus、产气弧菌V.gazogenes、创伤弧菌V.vulnificus、竹荚鱼弧菌V.trachuri、雀鲷弧菌 V.damsela、漂浮弧菌V.natriegen、沙蚕弧菌V.nereis、鱼肠道弧菌V. ichthyoenteri、鲨鱼弧菌V.carchariae、坎氏弧菌V.campbellii以及杀对虾弧菌V.penaeicida中的一种或多种；
更优选的，所述弧菌属微生物包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、溶藻弧菌V.alginolyticus、金黄色弧菌V.azureus。
优选的，如上所述的溶藻弧菌噬菌体、或杀菌组合物在制备用于治疗和/或预防动物弧菌病的药物中的应用；
优选的，如上所述的应用，所述动物包括：温血性动物和部分冷血性动物；
优选的，如上所述的应用，所述动物为人、鱼类、虾或软体动物(例如贝类)。
一种防治动物弧菌病的方法，将如上所述的杀菌组合物作为药物添加到动物饲料中，或对动物体表喷雾，或给动物灌服，或给动物注射，或将所述杀菌组合物溶于水中再与动物接触。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
本发明通过采集水产养殖厂患病的鱼虾类样品，从其病灶中分离得到 6株致病性弧菌，本发明噬菌体的筛选流程图如图1所示。通过现场实验证实了分离弧菌的致病性，确定了其中5株致病性极显著，LD50<104 CFU/mL，作用时间<100h。其次，以致病性弧菌为宿主菌，从环境中分离得到6株噬菌体，裂解直径范围为0.3mm～1mm，其中最大为0.89mm。通过全基因组测序得到本次分离得到的噬菌体为弧菌噬菌体，与基因组数据库比对结果(相似度低于70％，覆盖度低于4％，两两之间比对相似度低于90％)显示该噬菌体均为新的弧菌噬菌体。采用磷钨酸负染法，透射电子显微镜下观察确定了该弧菌噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)下的长尾噬菌体科(Siphoviridae)，弧菌噬菌体形态如图2所示。
通过平板点滴法，根据透明斑的有无，测定了该弧菌噬菌体在29株不同种属菌株下的宿主谱(表1)，得出该噬菌体具有很强的宿主专一性，为弧菌属专一性裂性噬菌体。
表1宿主谱
备注：“+”表示能裂解，“-”表示不能裂解；以上菌株均从水产养殖鱼虾类动物体及养殖水中分离得到；ValDsh1-1，VpaSw-1，VpaSw-2， ValSw3-1，ValSw3-2和ValSw3-3表示弧菌噬菌体编号；“*”表示经检测具有致病性的宿主菌，其进化树如图3所示。
通过认识单一噬菌体对宿主菌的侵染特性，从而评估了宿主谱最广的3株噬菌体在不同梯度感染复数(MOI＝100，10，1，0.1，0.01)下的单株噬菌体对宿主菌的抑菌能力，得出单株条件下当MOI＝10时，其对病原性弧菌的抑制作用显著且持续最长，在15h内OD600低于对照组，当MOI ≤1时抑制效果不显著，由此确定了该弧菌噬菌体的应用条件MOI＝10。根据6株噬菌体的对致病性弧菌的裂解作用及宿主谱特性，确定了5个噬菌体鸡尾酒组合：A(ValSw3-1,ValDsh1-1)；B(ValSw3-1,VpaSw-1)； C(ValSw3-1,VpaSw-2)；D(ValSw3-1,ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-1)； E(ValSw3-1,ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-2，ValDsh1-1)，各组合之间以 1:1比例添加。并在MOI＝10条件下评价上述5个组合对致病性弧菌的生长抑制作用。综合考虑各噬菌体鸡尾酒组合对6株致病性弧菌的抑制效果，确定了组合D(ValSw3-1,ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-1)为最优组合，与对照组比较，对相应致病菌的浓度(OD600)起到了抑制作用，并维持该水平10h以上。由此，我们认为由以上6株噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒在控制由弧菌引起的水产动物致病菌具有一定的潜力，应用空间广泛。
具体的，本发明所提供的溶藻弧菌噬菌体及杀菌组合物通过以下方法筛选得到：
致病性弧菌的筛选：采集水产养殖厂患病的鱼虾类样品，采用选择性培养基从发病的鱼虾病灶中分离纯化得到6株致病性弧菌，试剂盒法 (Omega细菌DNA提取试剂盒)提取单株菌株的基因组DNA，通过16S 测序，与最大相似序列构建进化树，进而确定该6株弧菌的分类地位。
弧菌致病性检测：通过现场实验，以中期对虾为实验对象，评价了8 株弧菌对对虾的致死能力。每组设定30只对虾，每24h观察一次，共观察 1周。
噬菌体筛选：以步骤1、2中确认的6株致病性弧菌为宿主，采用双层平板法并结合样品特征从水环境中分离噬菌体，通过多次感染确定透明斑，经分离纯化后，单株噬菌体于-80℃甘油(20％)保存。
基因组测序：通过对单株噬菌体的富集培养(1012PFU/mL)后，在4℃条件下8000g离心15min，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去除氯仿层和PEG 层后，加入限制性核酸内切酶(Dnase I和Rnase A)消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30 min，最后将透析好的噬菌体一部分预留做电镜观察，一部分采用λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab Biotechnologies Co.,Ltd)进行噬菌体基因组DNA的抽提，将抽提好的基因组DNA通过Nano Drop测定浓度后，用不同限制性内切酶(Takara，宝生物工程有限公司)酶切，电泳检测观察酶切图谱，确定噬菌体基因组非环状后，样品送华大基因生物测序公司进行全基因组测序。
形态观察：对步骤4中透析好的噬菌体，选用磷钨酸进行负染处理后于透射电镜下观察噬菌体大小和形态。
宿主谱测定：采用点滴法，通过观察宿主平板上透明斑形成有无，确定了其对该菌株的裂解性。
感染能力评价：以不同梯度MOI(MOI＝10，1，0.1，0.01，0.001) 混合噬菌体和对数期宿主菌(OD600＝0.3)，采用生长测定仪检测18h内宿主菌的OD600变化，每隔10min记录一次。其中，不同感染复数(MOI) 下ValSw3-1、ValSw3-2、ValSw3-3对溶藻弧菌V.alginolyticus的生长曲线作用结果如图4所示。
弧菌噬菌体鸡尾酒组合：根据6株噬菌体对致病性弧菌的裂解谱，得到5个组合(图5)，分别为：A(ValSw3-1,ValDsh1-1)；B(ValSw3-1, VpaSw-1)；C(ValSw3-1,VpaSw-2)；D(ValSw3-1,ValSw3-2，ValSw3-3， VpaSw-1)；E(ValSw3-1,ValSw3-2，ValSw3-3，VpaSw-2，ValDsh1-1)。图 5中af、bd属于同种下的不同株，对动物的致病性不同。各组合的宿主谱均能覆盖筛选得出的致病性弧菌，组合中各噬菌体之间的比例为1:1。
最佳噬菌体鸡尾酒组合的筛选：通过在单株噬菌体条件下确定的 MOI，评估了各组合对病原性弧菌的生长抑制作用，以短时间内抑制弧菌生长，抑制效果持续时间最长以及弧菌抗性出现时间最晚为要求，得出最佳的弧菌噬菌体鸡尾酒组合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2，于2017年09月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017503，分类命名为Vibrio phage。
2.含有权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2的杀菌组合物；
优选的，所述杀菌组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还包括副溶血弧菌噬菌体VpaSw-1，保藏号为：CCTCC NO:M 2017500；
副溶血弧菌噬菌体VpaSw-2，保藏号为CCTCC NO:M 2017501；
溶藻弧菌噬菌体ValSw3-1，保藏号为CCTCC NO:M 2017502；
溶藻弧菌噬菌体ValDsh1-1，保藏号为CCTCC NO:M 2017499；以及
溶藻弧菌噬菌体ValSw3-3，保藏号为CCTCC NO:M 2017504中的一种或多种；
上述噬菌体均于2017年09月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名均为Vibrio phage。
4.根据权利要求3所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物包括所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2、所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-1以及所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-3；
或，所述杀菌组合物包括所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-2、所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-1、所述溶藻弧菌噬菌体ValSw3-3、所述副溶血弧菌噬菌体VpaSw-2以及所述溶藻弧菌噬菌体ValDsh1-1。
5.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中还包括各噬菌体突变体中的一种或多种；
优选的，所述突变体至少90％与对应的弧菌噬菌体的天然序列相同。
6.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中每种弧菌噬菌体的含量≥106PFU/mL；
优选的，所述组合物中每种弧菌噬菌体的含量为106PFU/mL～107PFU/mL。
7.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还包括辅料；
优选的，所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种；
优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
8.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂、膏剂。
9.权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体、或权利要求2～8任一项所述的杀菌组合物在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用；
所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌V.alginolyticus、鳗弧菌V.anguillarum、霍乱弧菌V.cholerae、非O1群霍乱弧菌non-O1V.cholerae、费氏弧菌V.fischeri、河流弧菌V.fluvialis、哈维氏弧菌V.harveyi、病海鱼弧菌V.ordalii、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、杀鲑弧菌V.salmonicida、拟态弧菌V.mimicus、灿烂弧菌V.splendidus、金黄色弧菌V.azureus、产气弧菌V.gazogenes、创伤弧菌V.vulnificus、竹荚鱼弧菌V.trachuri、雀鲷弧菌V.damsela、漂浮弧菌V.natriegen、沙蚕弧菌V.nereis、鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri、鲨鱼弧菌V.carchariae、坎氏弧菌V.campbellii以及杀对虾弧菌V.penaeicida中的一种或多种。
10.权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体、或权利要求2～8任一项所述的杀菌组合物在制备用于治疗和/或预防动物弧菌病的药物中的应用。
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