CN102329735A

CN102329735A - 一种弯孢霉菌及吲哚里西啶生物碱的制备方法和应用

Info

Publication number: CN102329735A
Application number: CN201110105504.6A
Authority: CN
Inventors: 谭仁祥; 张高飞; 宋勇春; 崔江涛; 汪伟
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2031-04-27
Also published as: CN102329735B

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及从海洋真菌液体发酵物中提取的吲哚里西啶生物碱及其制备方法与应用。该吲哚里西啶生物碱从海洋来源的弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.）发酵液中分离纯化得到。该类生物碱对乙酰胆碱酯酶具有较强的抑制作用，且对细胞没有毒性，因此该类吲哚里西啶生物碱可作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的先导化合物，并在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中得到应用，可制备成治疗阿尔茨海默症的药物。

Description

一种弯孢霉菌及吲哚里西啶生物碱的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及从海洋真菌IFB-Z10（Curvularia sp.）的液体发酵物中提取的一类新吲哚里西啶生物碱及其制备方法与应用。

背景技术

虽然微生物的次生代谢产物已被广泛研究，但一些特境微生物的代谢产物还是没有引起人们足够重视。海洋环境的特殊性造就了海洋真菌独特的代谢方式和代谢产物。近年来人们不断从各种海洋环境的真菌中寻找到能产生具有新型作用机制的抗生素。除了抗生素以外，海洋真菌还能够产生多种酶的抑制剂，海洋真菌的多样性为次生代谢产物提供了一个丰富的来源。

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一种严重危害人类健康的神经退行性疾病。目前研究认为AD可能与β-淀粉样蛋白沉积、τ蛋白聚集、脑内异常氧化压、低浓度乙酰胆碱等因素有关，其中最为广泛接受的是“胆碱能假说”, 因而提高脑内乙酰胆碱(ACh)的含量是治疗AD 的一个重要途径. 乙酰胆碱酯酶在调控胆碱能系统中发挥关键作用, 因此乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)被认为是治疗 AD 最具疗效的策略之一。

发明内容

本发明需要解决的问题是：

1. 提供具有乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的吲哚里西啶生物碱curvulamine A-C，curvulamide A-B。

2. 提供一种提取、分离吲哚里西啶生物碱curvulamine A-C，curvulamide A-B的方法。

3. 提供吲哚里西啶生物碱curvulamine A-C，curvulamide A-B在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

4. 提供可制备成治疗阿尔茨海默症药物的吲哚里西啶类生物碱curvulamine A-C，curvulamide A-B。

本发明通过下述技术方案予以实现。

本发明所述，从海洋真菌IFB-Z10（Curvularia sp.）液体发酵提取物中分离得到的吲哚里西啶生物碱，其结构式为：

curvulamine A和curvulamine B的单晶结构图见说明书图1和图2。

吲哚里西啶生物碱的制备方法，包括下述步骤：

1. 将从新鲜的白姑鱼中分离、纯化得到的弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.）菌体块接种到改良查氏培养基（蔗糖30 g，酵母膏 1.0 g，NaNO₃3.0 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，1 L 蒸馏水）中，于摇床上，在150 rpm、28℃条件下培养4天作为种子液；

2. 将种子液接种于改良查氏培养基中，在150 rpm、28-30 ℃条件下发酵12天；

3. 将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1；

4. 对浸膏F1进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿，氯仿：甲醇=100:1，氯仿:甲醇=100:2，氯仿:甲醇=100:4，进行洗脱，浓缩100:1段得到黑色浸膏F2；100:4段得到黑色浸膏F3；

5. 对浸膏F2进行Sephadex LH-20分离，得到curvulamine A，及含有curvulamine B和curvulamine C的棕色浸膏F2-1；

6. 对浸膏F2-1用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS 5μm (250×4.6 mm) column；流动相：甲醇/水=80/20，流速：2.0 mL/min)分离得到curvulamine B（保留时间t _R=26.1 min）; curvulamine C（保留时间t _R=22.3 min）；

7. 对浸膏F3用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS 5μm (250×4.6 mm) column；流动相：甲醇/水=48/52，流速：2.0 mL/min)分离得到curvulamide A（保留时间t _R=16.3 min）; curvulamide B（保留时间t _R=18.1 min）。

本发明的吲哚里西啶生物碱具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制剂活性，且不具有细胞毒性，因此该类吲哚里西啶生物碱可作为一种新颖的酶抑制剂，并在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中得到应用；可制备成治疗阿尔茨海默症的药物。

与现有技术相比，本发明具有下述突出优点：

1. 本发明的吲哚里西啶生物碱是结构新颖的化合物，可制备成新型乙酰胆碱酯酶抑制剂或先导化合物。克服现有酶抑制剂的缺点。

2. 本发明的吲哚里西啶生物碱可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。

附图说明

图1为curvulamine A的单晶结构图。

图2为curvulamine B的单晶结构图。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。

实施例1：海洋来源的弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.）的分离与纯化

在无菌条件下解剖白姑鱼，将取出的白姑鱼肠道在75%酒精中表面消毒2分钟，无菌水漂洗3次，后加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，分别取各梯度稀释液0.2毫升涂布于查氏培养基（蔗糖30 g，NaNO₃3.0 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，1 L 蒸馏水）中，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到白姑鱼肠道真菌IFB-Z10，经分子生物学及形态学鉴定为弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.），现保藏中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2011059，保藏日期为2011年3月8日。

实施例2：海洋来源的弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.）的液体发酵

活化海洋来源的弯孢霉IFB-Z10（Curvularia sp.），将新鲜的菌体块接种到1000 ml 锥形瓶中，每瓶含有400 ml的改良查氏培养基，接种5－6瓶于摇床上，在150 rpm、28-30 ℃条件下培养3天作为种子液，然后以20 ml的接种量将种子液接种于含有400 ml的改良查氏培养基的1000 ml 锥形瓶中，在150 rpm、28-30 ℃条件下发酵12天。

实施例3：吲哚里西啶生物碱的提取与分离

实施例2中所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1。对浸膏F1进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿，氯仿：甲醇=100:1，氯仿:甲醇=100:2，氯仿:甲醇=100:4，进行洗脱，浓缩100:1段得到黑色浸膏F2；100:4段得到黑色浸膏F3；然后对浸膏F2进行Sephadex LH-20分离，得到curvulamine A，合并其他流份得到棕色浸膏F2-1；对浸膏F2-1用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS 5μm (250×4.6 mm) column；流动相：甲醇/水=80/20，流速：2.0 mL/min)分离得到curvulamine B（保留时间t _R=26.1 min）; curvulamine C（保留时间t _R=22.3 min）;对浸膏F3用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS5μm (250×4.6 mm) column；流动相：甲醇/水=48/52，流速：2.0 mL/min)分离得到curvulamide A（保留时间t _R=16.3 min）; curvulamide B（保留时间t _R=18.1 min）。

实施例4：吲哚里西啶生物碱的结构鉴定

吲哚里西啶生物碱的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱、X-ray单晶衍射分析和CD分析确定的。

光谱学数据如下：

Curvulamine A (1): 白色固体; [α] -265 (c 0.03 MeOH); UV(MeOH) λ_max 220, 298 nm; CD(MeOH) 221 (Δε +15.7), 298 (Δε-7.6) nm; IR (KBr) ν_max3416, 2969, 1644, 1415, 759 cm^-1; ¹H and ¹³C NMR data见数据表1; HRESIMS m/z 325.1936 [M + H]⁺(calcd for C₂₀H₂₅N₂O₂, 325.1916).

Curvulamine B (2): 白色固体; [α]

-148.7 (c 0.08 MeOH); UV(MeOH) λ_max 220 nm; CD (MeOH) 219 (Δε +6.3), 239 (Δε-10.1) nm; IR (KBr) ν_max 3502, 2946, 1508, 1421, 1035, 763 cm^-1; ¹H and ¹³C NMR data见数据表1; HRESIMS m/z 395.1956 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₁H₂₈N₂O₄Na⁺, 395.1947).

Curvulamine C (3): 无定形粉末; [α]

-181.7 (c 0.09 MeOH); UV(MeOH) λ_max 220 nm; CD (MeOH) 210 (Δε +15.1), 240 (Δε-4.4) nm; IR (KBr) ν_max 3491, 2925, 1417, 1023, 759 cm^-1; ¹H and ¹³C NMR data 见数据表1; HRESIMS m/z 365.1846 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₀H₂₆N₂O₃ Na⁺, 365.1841).

Curvulamide A (4):棕色油状物; [α]

-15.2 (c 0.05 MeOH); UV (MeOH) λ_max 205 nm; IR (KBr) ν_max 3376, 2920, 1620, 1513, 1418, 1380, 1049 cm^-1; ¹H and ¹³C NMR data见数据表2; HRESIMS m/z 204.1021 [M + Na]⁺ (calcd for C₁₀H₁₅NO₂ Na⁺,204.1000 ).

Curvulamide B (5): 棕色油状物; [α]

-47.3 (c 0.02 MeOH); UV(MeOH) λ_max 205 nm; IR (KBr) ν_max 3345, 2976, 2926, 1633, 1511, 1418, 1379, 1079 cm^-1 ; ¹H and ¹³C NMR data see见数据表2; HRESIMS m/z 204.1016 [M + Na]⁺ (calcd for C₁₀H₁₅NO₂ Na⁺, 204.1000 ).

表1. curvulamine A-C (1-3)NMR数据(500 MHz)

Table 1.NMR spectral data of curvulamine A-C

表2. curvulamide A-B(4-5)NMR数据(300 MHz)

Table 2.NMR spectral data of curvulamide A-B

S：单峰，d：双重峰，t：三重峰，dd：四重峰，m：多重峰，br：宽单峰

实施例5：乙酰胆碱酯酶抑制剂活性的测定

表2 化合物的乙酰胆碱酯酶抑制剂活性

化合物	IC₅₀（μM）
		curvulamine A	68.37±2.65
curvulamine B	64.33±2.73
		curvulamine C	76.91±3.28
curvulamide A	6.91±0.97
		curvulamide B	4.33±0.17
tacrine	0.17±0.01

﹡他克林(tacrine)作为阳性对照

以上结果提示，curvulamine A-C具有中等的乙酰胆碱酯酶抑制剂活性；curvulamide A-B具有很强的乙酰胆碱酯酶抑制剂活性，因此本发明的吲哚里西啶生物碱可以开发成新型抗老年痴呆药或先导化合物。

Claims

1.一种弯孢霉菌IFB-Z10，其特征是：从海洋白姑鱼肠道中分离得到，在PDA平板上，菌落中央稍突起，青黑色，菌落质地绒毛状，带絮状，灰白色气生菌丝，背部为黑色，经形态及分子生物学鉴定为弯孢霉Curvularia sp.，现保藏中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2011059，保藏日期为2011年3月8日。

2.一种权利要求1所述弯孢霉IFB-Z10发酵液制备的吲哚里西啶生物碱，其结构为：

。

3.一种权利要求2所述的吲哚里西啶生物碱的制备方法，其特征是由以下步骤构成：

1）将从新鲜的白姑鱼肠道中分离、纯化得到的弯孢霉IFB-Z10菌丝体块接种到改良查氏培养基中，于摇床上，在150 rpm、28℃条件下培养3天作为种子液；改良查氏培养基的组成为：蔗糖30 g，酵母膏 1.0 g，NaNO₃3.0 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，1 L 蒸馏水；

2）将种子液接种于改良查氏培养基中，在150 rpm、28-30℃条件下发酵12天;

3）将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1；

4）对浸膏F1进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿，氯仿：甲醇=100:1，氯仿:甲醇=100:2，氯仿:甲醇=100:4，进行洗脱，浓缩100:1段得到黑色浸膏F2；100:4段得到黑色浸膏F3；

5）对浸膏F2进行Sephadex LH-20分离，得到curvulamine A，合并其他流份得到棕色浸膏F2-1；

6）对浸膏F2-1用高压液相色谱法，色谱柱：Allsphere ODS 5μm column；流动相：甲醇/水=80/20流速：2.0 mL/min分离得到curvulamine B，保留时间t _R= 26.1 min; curvulamine C保留时间t _R=22.3 min;

7）对浸膏F3用高压液相色谱法，色谱柱：Allsphere ODS 5μm column；流动相：甲醇/水=48/52，流速：2.0 mL/min分离得到curvulamide A，保留时间t _R=16.3 min; curvulamide B，保留时间t _R=18.1 min。

4.一种权利要求2所述的吲哚里西啶生物碱在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

5.一种权利要求2所述的吲哚里西啶生物碱在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。