CN105177079B - 一种提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，包括：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB‑Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40‑65%的条件下活化培养7‑10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180转速/分钟的条件下，培养72‑96小时；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180转速/分钟的条件下，培养144‑196小时；且在发酵过程中添加氯化钙的水溶液，从而来提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵水平。用本发明所建立的发酵工艺进行吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵水平已明显超过原工艺的水平，且该技术操作简单，有效地克服了现有发酵方法的不足，为下一阶段的工业产业化的实现奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及海洋来源吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵工艺优化方法，属于生物工程领域，具体说是通过添加金属钙离子来提高海洋来源吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的一种发酵工艺。
背景技术
南京大学谭仁祥教授等从海洋共生弯孢霉IFB-Z10的发酵液中，得到了稳定的吲哚里西啶生物碱Curvulamine，其具有极好的抗菌和乙酰胆碱酯酶的抑制活性。由于其在国内外均为首创，于2013年8月申请并获得了中国发明专利（专利号：ZL201310362976.9）。然而，目前关于吲哚里西啶生物碱Curvulamine的现有发酵工艺都只是一些常规的发酵生产方式，实际生产中所存在的突出问题是发酵产量低，并且费时费力，往往达不到生产化的要求。
而微量的金属离子，作为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂，对于微生物的生长和发酵过程具有巨大的影响。其中钙离子能够控制细胞透性，是多种激酶的辅酶或辅因子并可以调控丝状真菌的菌丝生长，进而影响微生物的生理代谢。
因此，如何通过添加金属离子来提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，成为了本发明人目前致力于研究的课题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种通过添加金属钙离子来提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，以提高发酵产量，节约生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下方式来实现：
一种提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，包括如下步骤：
将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180转速/分钟（rpm）的条件下，培养72-96小时（h）；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180转速/分钟（rpm）的条件下，培养144-196小时（h）；且在发酵过程中添加氯化钙的水溶液，从而来提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵水平。
作为优选方案之一，在发酵过程中，将氯化钙的水溶液添加到发酵摇瓶或发酵罐中后，使得发酵摇瓶或发酵罐中的钙离子浓度为0.5-10毫摩尔/升（mM/L）。
更优选的，在钙离子浓度相同的情况下，在发酵初始时添加氯化钙水溶液得到的产率最高。
微量的金属离子，作为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂，对于微生物的生长和发酵过程具有巨大的影响。而其中钙离子能够控制细胞透性，是多种激酶的辅酶或辅因子并可以调控丝状真菌的菌丝生长，进而影响微生物的生理代谢。
与现有技术比较，本发明通过添加氯化钙水溶液，不仅解决了限制吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵水平的技术难题，而且该工艺方法生产成本低，操作简单，不需特殊设备，可大规模应用于生产。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵初始时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为1mM。
实施例2：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵初始时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为3mM。
实施例3：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵初始时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为5mM。
表1为金属钙离子添加工艺（添加量）在摇瓶上的实验结果。
表1
| 项目 | 对照 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 金属离子 | -- | 氯化钙:1mM | 氯化钙:3mM | 氯化钙:5mM |
| Curvulamine（mg/L） | 18.93 | 34.85 | 53.31 | 63.31 |
实施例4：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵第24小时时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为5mM。
实施例5：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵第48小时时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为5mM。
实施例6：将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65%的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养72-96h；按12%接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180rpm的条件下，培养144-196h；且在发酵第72小时时添加氯化钙的水溶液，使钙离子的浓度为5mM。
表2为金属钙离子添加工艺（添加时间）在摇瓶上的实验结果。
表2
综上所述可以看出，按照适当的比例将氯化钙加入到发酵过程中，吲哚里西啶生物碱Curvulamine的产量均有所提高，说明了本发明工艺方法的有效性，同时也为工业放大应用做好了准备。
需要说明的是，以上较佳实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所作出各种变换或变型，均属于本发明的范畴。
Claims (3)
1.一种提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，其特征在于，该发酵工艺包括如下步骤：
将冷冻保存的海洋共生弯孢霉Curvularia sp IFB-Z10菌解冻后，在固体平板培养基中央进行点样，在温度28±1℃，湿度40-65％的条件下活化培养7-10天；再从固体平板培养基中接种至种子培养基，在温度28±1℃，180转速/分钟的条件下，培养72-96小时；按12％接种量接种于发酵培养基中，在温度28±1℃，180转速/分钟的条件下，培养144-196小时，且在发酵过程中添加氯化钙的水溶液来提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine的发酵水平。
2.根据权利要求1所述的提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，其特征在于，在发酵过程中，将氯化钙的水溶液添加到发酵摇瓶或发酵罐中后，发酵摇瓶或发酵罐中的钙离子浓度为0.5-10毫摩尔/升。
3.根据权利要求1或2所述的提高吲哚里西啶生物碱Curvulamine产量的发酵工艺，其特征在于，在钙离子浓度相同的情况下，在发酵初始时添加氯化钙水溶液得到的产率最高。
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| Digar Singh •Gurvinder Kaur."Swainsonine, a novel fungal metabolite: optimization of fermentative production and bioreactor operations using evolutionary programming".《Bioprocess Biosyst Eng》.2014,(第37期),全文. * |
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