CN106676159A - 一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法 - Google Patents
一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明特别涉及一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法。包括以下步骤：配制液体培养基；在液体培养基中加入重金属；在培养温度为23‑35℃，摇床转速为100‑250r/min的培养条件下进行培养；将培养的菌悬液用纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗，50‑70℃烘干至恒重，称重；对菌丝体中的重金属含量进行测定。本发明研究发现，桑黄对重金属Hg、Pb、Cu、Cd、As的最高富集量明显要低，平菇、蛹虫草对Hg的富集为桑黄的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹虫草对Pb的富集为桑黄的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹虫草对Cu的富集为桑黄的21.13倍、2.75倍；桑黄对Cd没有富集；平菇、蛹虫草对As的富集为桑黄的1.24倍、17.56倍。对于维持桑黄产品较高的安全性具有天然的优势。
Description
（一）技术领域
本发明涉及桑黄，特别涉及一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法。
（二）背景技术
药用真菌桑黄（Phellinus igniarius）具有抗癌、抗氧化、增强免疫调节、抗炎、降血脂和抗病毒等作用 ，在传统中药中，其被用于治疗伤口、腹痛和淋病。最近的研究强调了其抗癌和肝脏保护功能 。 其含有三萜、黄酮、多糖等活性成分。
当前，桑黄产品大部分依赖于桑黄子实体，桑黄子实体生长对环境的依赖性很高，生长周期长，产量不稳定。利用液体培养可以较容易地对各种生长影响因素进行控制和优化，获得稳定高产。
食药用菌有一个共性，即对重金属的富集能力普遍较强，这对食药用菌的安全性有一个潜在的影响。如果桑黄对重金属的富集能力较差，在对培养原料的选择方面会更宽泛，菌丝体的安全性会更容易得到保证。但目前仅有对木耳、银耳、香菇、平菇等对重金属富集能力的研究，还没有关于桑黄对重金属富集能力的研究记载，桑黄在对重金属的规避方面还无据可依。
所以，本专利做了桑黄与平菇、蛹虫草对重金属富集能力的比较研究，以期总结桑黄对重金属富集的规律，为桑黄的工业化扩大培养奠定基础。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，通过该方法可知，桑黄对各种重金属的富集能力明显低于平菇和蛹虫草，这些规律的把握，对于维持桑黄产品较高的安全性具有天然的优势，对于工厂化液体培养时选择适宜的培养基进行桑黄培养具有较高的指导意义。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
（1）配制液体培养基；
（2）在液体培养基中加入重金属；
（3）在培养温度为23-35℃，摇床转速为100-250r/min的培养条件下进行摇床培养；
（4）将培养的菌悬液用纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗，50-70℃烘干至恒重，称重；
（5）对菌丝体中的重金属含量进行测定。
步骤（1）中，配制液体培养基：麦麸放入足量的水中，煮沸20-40min，纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，调pH值为5-7，配制培养基液体培养基，其中，液体培养基中：麦麸2-5%，玉米粉1.5-3.5%，MgSO4·7H2O 0.1-0.2%，KH2PO4 0.05-0.15%。
步骤（2）中，在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设n个浓度，汞的浓度为0-0.06mg/L，铅的浓度为0-7.5mg/L，铜的浓度为0-4mg/L，镉的浓度为：0-0.06mg/L，砷的浓度为：0-0.4mg/L，空白对照不添加任何重金属。
优选，步骤（2）中，在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设七个浓度，汞的浓度设定为0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，铅的浓度设定为0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，铜的浓度设定为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，镉的浓度设定为：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的浓度设定为：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属，每种样三个平行。
步骤（3）中，桑黄培养时间为18-22d。
本发明的有益效果是：本发明对桑黄对各种重金属（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收进行了系列的研究，研究发现，桑黄与平菇、蛹虫草相比，对重金属Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明显要低，平菇、蛹虫草对Hg的最高富集量为桑黄的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹虫草对Pb的最高富集量为桑黄的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹虫草对Cu的最高富集量为桑黄的21.13倍、2.75倍；桑黄对Cd没有富集；平菇、蛹虫草对As的最高富集量为桑黄的1.24倍、17.56倍。这一特点在重金属污染日益严重的今天，具有非常重要的意义，对于维持桑黄产品较高的安全性具有天然的优势，所以，桑黄菌粉及各种活性成分的提取分离的安全性相对较高。
（四）具体实施方式
实施例1
1. 菌种：桑黄；平菇；蛹虫草
2. 培养料：麦麸3.5%，玉米粉2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO4 0.1%，pH 6。
3. 主要试剂：氯化汞[HgCl2]、硝酸铅[Pb(NO3)2]、五水硫酸铜[CuSO4.5H2O]、氯化镉[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上试剂均为国产分析纯试剂）、蒸馏水、三次蒸馏水等。
4. 培养基的配制：
按照配方组成（麦麸3.5%，玉米粉2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO4 0.1%，pH 6）及配制方法（麦麸放入足量的蒸馏水中，煮沸30min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值为6）配制培养基。
在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设七个浓度，汞的浓度设定为0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，铅的浓度设定为0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，铜的浓度设定为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，镉的浓度设定为：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的浓度设定为：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属，每种样三个平行。
5. 培养基的灭菌
将306瓶（每个菌种）装有150ml液体培养基的250ml锥形瓶封装好放进灭菌锅，121℃灭菌30min；
6. 接种及液体培养
超净工作台无菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌饼，每瓶培养基中接种2块菌饼，在培养温度为28℃，摇床转速为160r/min的培养条件下进行摇床培养（桑黄18d，平菇15d，蛹虫草18d）。
7菌丝体干重的测定
将培养的菌悬液用四层纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗3次，置于滤纸上，60℃烘干至恒重，电子天平称重。
8 重金属含量的检测方法
参照食品安全国家标准对菌丝体中的重金属含量进行测定：
GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定（2016-3-21实施）
GB 5009.12-2010 食品安全国家标准 食品中铅的测定(（ 2010-06-01 实施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中铜的测定（2004-01-01实施）
GB 5009.15-2014 食品安全国家标准 食品中镉的测定（2015-07-28实施）
GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定（2016-03-21实施）
9 结果：
对桑黄对各种重金属（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收进行了系列的研究，研究发现，桑黄与平菇、蛹虫草相比，对重金属Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明显要低，平菇、蛹虫草对Hg的最高富集量为桑黄的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹虫草对Pb的最高富集量为桑黄的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹虫草对Cu的最高富集量为桑黄的21.13倍、2.75倍；桑黄对Cd没有富集；平菇、蛹虫草对As的最高富集量为桑黄的1.24倍、17.56倍。
这一特点在重金属污染日益严重的今天，具有非常重要的意义，对于维持桑黄产品较高的安全性具有天然的优势，所以，桑黄菌粉及各种活性成分的提取分离安全性相对较高。
实施例2
1. 菌种：桑黄；平菇；蛹虫草
2. 培养料：麦麸2%，玉米粉3.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.15%，pH 5。
3. 主要试剂：氯化汞[HgCl2]、硝酸铅[Pb(NO3)2]、五水硫酸铜[CuSO4.5H2O]、氯化镉[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上试剂均为国产分析纯试剂）、蒸馏水、三次蒸馏水等。
4. 培养基的配制：
按照配方组成（麦麸2%，玉米粉3.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.15%，pH 5）及配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸20min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值为6）配制培养基。
在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设七个浓度，汞的浓度设定为0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，铅的浓度设定为0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，铜的浓度设定为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，镉的浓度设定为：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的浓度设定为：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属，每种样三个平行。
5. 培养基的灭菌
将306瓶（每个菌种）装有150ml液体培养基的250ml锥形瓶封装好放进灭菌锅，121℃灭菌30min；
6. 接种及液体培养
超净工作台无菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌饼，每瓶培养基中接种2块菌饼，在培养温度为23℃，摇床转速为250r/min的培养条件下进行摇床培养（桑黄22d，平菇15d，蛹虫草18d）。
7菌丝体干重的测定
将培养的菌悬液用四层纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗3次，置于滤纸上，50℃烘干至恒重，电子天平称重。
8 重金属含量的检测方法
参照食品安全国家标准对菌丝体中的重金属含量进行测定：
GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定（2016-3-21实施）
GB 5009.12-2010 食品安全国家标准 食品中铅的测定(（ 2010-06-01 实施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中铜的测定（2004-01-01实施）
GB 5009.15-2014 食品安全国家标准 食品中镉的测定（2015-07-28实施）
GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定（2016-03-21实施）
9 结果：
对桑黄对各种重金属（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收进行了系列的研究，研究发现，桑黄与平菇、蛹虫草相比，对重金属Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明显要低，平菇、蛹虫草对Hg的最高富集量为桑黄的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹虫草对Pb的最高富集量为桑黄的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹虫草对Cu的最高富集量为桑黄的21.13倍、2.75倍；桑黄对Cd没有富集；平菇、蛹虫草对As的最高富集量为桑黄的1.24倍、17.56倍。
实施例3
1. 菌种：桑黄；平菇；蛹虫草
2. 培养料：麦麸5%，玉米粉1.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO4 0.05%，pH7。
3. 主要试剂：氯化汞[HgCl2]、硝酸铅[Pb(NO3)2]、五水硫酸铜[CuSO4.5H2O]、氯化镉[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上试剂均为国产分析纯试剂）、蒸馏水、三次蒸馏水等。
4. 培养基的配制：
按照配方组成（麦麸5%，玉米粉1.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO4 0.05%，pH7）及配制方法（麦麸放入足量的水中，煮沸40min，四层纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值为7）配制培养基。
在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设七个浓度，汞的浓度设定为0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，铅的浓度设定为0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，铜的浓度设定为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，镉的浓度设定为：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的浓度设定为：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属，每种样三个平行。
5. 培养基的灭菌
将306瓶（每个菌种）装有150ml液体培养基的250ml锥形瓶封装好放进灭菌锅，121℃灭菌30min；
6. 接种及液体培养
超净工作台无菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌饼，每瓶培养基中接种2块菌饼，在培养温度为35℃，摇床转速为100r/min的培养条件下进行摇床培养（桑黄18d，平菇15d，蛹虫草18d）。
7菌丝体干重的测定
将培养的菌悬液用四层纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗3次，置于滤纸上，70℃烘干至恒重，电子天平称重。
8 重金属含量的检测方法
参照食品安全国家标准对菌丝体中的重金属含量进行测定：
GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定（2016-3-21实施）
GB 5009.12-2010 食品安全国家标准 食品中铅的测定(（ 2010-06-01 实施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中铜的测定（2004-01-01实施）
GB 5009.15-2014 食品安全国家标准 食品中镉的测定（2015-07-28实施）
GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定（2016-03-21实施）
9 结果：
对桑黄对各种重金属（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收进行了系列的研究，研究发现，桑黄与平菇、蛹虫草相比，对重金属Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明显要低，平菇、蛹虫草对Hg的最高富集量为桑黄的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹虫草对Pb的最高富集量为桑黄的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹虫草对Cu的最高富集量为桑黄的21.13倍、2.75倍；桑黄对Cd没有富集；平菇、蛹虫草对As的最高富集量为桑黄的1.24倍、17.56倍。
Claims (5)
1.一种桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）配制液体培养基；
（2）在液体培养基中加入重金属；
（3）在培养温度为23-35℃，摇床转速为100-250r/min的培养条件下进行摇床培养；
（4）将培养的菌悬液用纱布过滤，得菌丝体，再用蒸馏水冲洗，50-70℃烘干至恒重，称重；
（5）对菌丝体中的重金属含量进行测定。
2.根据权利要求1所述的桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特征在于：步骤（1）中，配制液体培养基：麦麸放入足量的水中，煮沸20-40min，纱布过滤，向滤液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4，调pH值为5-7，配制培养基液体培养基，其中，液体培养基中：麦麸2-5%，玉米粉1.5-3.5%，MgSO4·7H2O 0.1-0.2%，KH2PO4 0.05-0.15%。
3.根据权利要求1或2所述的桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特征在于：步骤（2）中，在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设n个浓度，汞的浓度为0-0.07mg/L，铅的浓度为0-8.5mg/L，铜的浓度为0-5mg/L，镉的浓度为：0-0.07mg/L，砷的浓度为：0-0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属。
4.根据权利要求3所述的桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特征在于：步骤（2）中，在配制的液体培养基中，汞、铅、铜、镉、砷每种重金属设七个浓度，汞的浓度设定为0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，铅的浓度设定为0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，铜的浓度设定为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，镉的浓度设定为：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的浓度设定为：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白对照不添加任何重金属，每种样三个平行。
5.根据权利要求1或2所述的桑黄液体培养对重金属的富集规律的研究方法，其特征在于：步骤（3）中，桑黄培养时间为18-22d。
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| CN116004756A (zh) | 2023-04-25 |
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| PB01 | Publication | ||
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