CN103820333A - 一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法。其发酵周期短，发酵菌丝体产量高。本发明采用的技术方案包括为：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；将种子液按体积百分比为10～15%的接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养24～36h，然后加入脱落酸溶液，继续培养56～72h，得到桑黄菌丝体和发酵液；将得到菌丝体和发酵液通过板框压滤机压滤，然后将滤饼在70～80℃的温度下烘干，将滤液通过真空浓缩后在喷雾干燥机进行喷雾干燥成干粉，把两者混合既得桑黄发酵菌丝体。
Description
一、技术领域：
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法。
二、背景技术：
桑黄是一种多年生的药用真菌，是我国最有发展前景的珍稀、濒危中药之一。主要分布于秦岭、陕西与甘肃交界的“子午岭”地区。生长于杨、桑、柳、白桦、榉树、桃等阔叶树的枯立木及树干上。《中药大辞典》记载，其可治血崩、血淋、带下、闭经等妇科疾病。现代研究发现桑黄具有明显的抗肝纤维化作用，并且又是目前国际公认的生物治癌领域有效率排在第一的高等真菌。
随着生物技术的发展，桑黄药理作用不断被揭示，对桑黄多糖类等活性物质研究工作的深入，人们将中药材桑黄作为一种重要生物资源，应用于抗肿瘤产品开发，在科技界和实业界都倾注了很高的热情。
现在社会肿瘤发病率呈上升趋势，肿瘤的转移是导致治疗失败最主要的原因。桑黄多糖对肿瘤转移有着显著抑制作用，1999年Han等研究表明桑黄多糖与阿霉素(ADM)的活性比较，不仅可以抑制肿瘤生长还可以抑制肿瘤转移，单独使用桑黄多糖显著提高了植入黑素瘤B16F10的小鼠的存活率，抑制了裸鼠体内植入的NCI-H23的生长并减少黑素瘤B16F10的肺转移率。阿霉素(ADM)对肿瘤转移的抑制作用较轻，与桑黄多糖合用可使阿霉素(ADM)对肿瘤生长的抑制作用增强，但不论与大剂量或小剂量的阿霉素(ADM)合用都使桑黄多糖对肿瘤细胞转移的抑制率低于单独使用桑黄多糖。
1968年，Ikekawa等报道了云芝和桑黄等11种真菌对小鼠接种肉瘤180ICR的抗肿瘤作用，桑黄水提取物对肿瘤的抑制率最强，抑瘤率可达到96.7%，而且这种提取物对肉瘤180细胞不表现细胞毒性。1993年韩国政府已正式许可桑黄成为菌类抗肿瘤药品。
目前桑黄作为新的生物药品和抗肿瘤制品开发利用，在国内才开始起步，在日本和韩国已有了产品上市。1993年韩国政府正式许可桑黄成为菌类抗肿瘤药品。桑黄子实体国际市场价每公斤2300美元。由于市场需求量增大，价格高，对桑黄进行掠夺性开采现状还是无法杜绝，野生子实体孢子无法大量形成，桑黄本身生理生态的特殊性和复杂性，造成野生桑黄资源难以恢复，甚至即将枯竭。所以对桑黄资源的保护和开发迫在眉睫。因此，采用生物技术进行深层发酵，获取含有效成分的桑黄菌丝体，形成稳定的医药工业产品来源是非常重要的。既促进了桑黄产业的规模化发展，又保护了濒危和紧缺的桑黄资源，保证了中药资源的永续利用。
目前已有一些科研院所及生物公司在用发酵法生产桑黄菌丝体，尚未有从桑黄生物代谢的角度分析研究，对发酵法生产桑黄菌丝体发酵水平的提高有限，发酵周期长，成本高，整体的生产效率较低，远不能满足进一步实现工业化发酵生产的需要。
脱落酸又被称为S-诱抗素，是一种生物抗逆诱导物，最初被认为是一种生长抑制物质，对种子（果实）的发育、成熟，植物和种子休眠，器官脱落等起重要作用。随着研究的不断深入，发现脱落酸在植物干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中起重要作用，它是植物的抗逆诱导因子，因而被称为植物的“胁迫激素”。
液体发酵法生产桑黄菌丝体的发酵条件与自然界的桑黄生长有很大不同，对于长期在自然界生长发育的桑黄菌丝生长来说发酵过程不是一种最适的生长发育环境，而利用脱落酸诱导生物产生各种应对的抵抗能力提高桑黄菌丝体在发酵条件下抗逆作用，使菌丝体生长速度加快，产量提高。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其发酵周期短，发酵菌丝体产量高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的发酵方法包括以下步骤：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按体积百分比为10～15%的接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养24～36h，然后加入脱落酸溶液，然后继续培养56～72h，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
步骤三：将步骤二得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液通过板框压滤机压滤，然后将滤饼在70～80℃的温度下烘干，将滤液通过真空浓缩后在喷雾干燥机进行喷雾干燥成干粉，把两者混合既得桑黄发酵菌丝体。
所述的种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h。
所述的脱落酸溶液的浓度为0.5～1.5ppm/L；脱落酸的浓度为步骤二中整个溶液浓度。
所述的液体培养基为常规综合pda液体培养基。
所述的真空浓缩的真空度0.09～0.1MPa，喷雾干燥工艺的入口温度136～141℃，出口温度81～82℃，蠕泵转速8r/min，风机转速906r/min，工作压力0.23～0.24 MPa。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发酵方法生产桑黄菌丝体产量与已报道的桑黄发酵工艺技术相比，具有发酵周期短且发酵菌丝体产量高的优点，发酵周期92h，菌丝体产量达29.13g/L。
四、具体实施方式：
桑黄，俗称鲍氏层孔、火木层孔、针层孔等，属于担子菌纲、多孔菌目，多孔菌科，层孔菌属，是近几年开发的一种多年生药用真菌。通过对桑黄发酵菌丝体生产过程中添加脱落酸的初步研究，发现脱落酸对桑黄发酵工艺的发酵周期及菌丝体产量具有较大的影响，在优化后的发酵工艺下发酵，发酵周期可由没添加脱落酸的120h缩短为92h，菌丝体产量由22.5g/L提高到29.13g/L，具有工业化生产的潜力。
本发明采用液体深层培养方法通过在发酵过程中添加不同脱落酸浓度对桑黄菌丝体产量的影响，研究桑黄发酵菌丝体发酵过程中最适的脱落酸浓度，筛选出了桑黄发酵过程中添加脱落酸浓度为0.5～1.5ppm/L，发酵周期92h，菌丝体产量达29.13g/L。
实施例1：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按10～15%的体积比接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养24h，然后加入脱落酸溶液，脱落酸的浓度为0.5ppm/L，脱落酸的浓度为步骤二中整个溶液浓度，然后继续培养72h，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
步骤三：将步骤二得到的菌丝体和发酵液的混合液通过板框压滤机压滤，滤饼70～80℃烘干，将滤液通过真空浓缩后在喷雾干燥机进行喷雾干燥成干粉，把两者混合既得桑黄发酵菌丝体，称重。
实施例2：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按10～15%的体积比接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养30h，然后加入脱落酸溶液，脱落酸的浓度为1.0ppm/L，脱落酸的浓度为步骤二中整个溶液浓度，然后继续培养62h，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
步骤三：同实施例1。
实施例3：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按10～15%的体积比接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养36h，然后加入脱落酸溶液，脱落酸的浓度为1.5ppm/L，脱落酸的浓度为步骤二中整个溶液浓度，然后继续培养72h，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
步骤三：同实施例1。
对照实验：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按10～15%的体积比接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养120h，得到桑黄菌丝体和发酵液；
步骤三：同实施例1。
不同脱落酸浓度对发酵菌丝体漆酶产量及发酵周期的影响作用的对比如下表
| 脱落酸浓度 | 培养时间（h） | 桑黄菌丝体产量（g/L） |
| 对照为0 | 120 | 22.50 |
| 实施例1 | 96 | 28.39 |
| 实施例2 | 92 | 29.13 |
| 实施例3 | 108 | 29.13 |
所述的实施例一、实施例二、实施例三和对照试验中所采用的种子发酵培养基为常规的培养基，其原料组成可以为：2%葡萄糖，0.4%蛋白胨，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，VB110 mg/100mL，pH6.5。
所述的实施例一、实施例二、实施例三和对照试验中所采用的液体发酵培养基为常规的培养基，其原料组成可以为：玉米粉1.5%、麸皮1.2%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、维生素B1 10 mg/L。
Claims (5)
1.一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的发酵方法包括以下步骤：
步骤一：将桑黄菌种接种到液体培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数的13%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；
步骤二：将步骤一制得种子液按体积百分比为10～15%的接种量接种于液体发酵培养基中，在温度27～30℃的条件下，液体发酵培养24～36h，然后加入脱落酸溶液，然后继续培养56～72h，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
步骤三：将步骤二得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液通过板框压滤机压滤，然后将滤饼在70～80℃的温度下烘干，将滤液通过真空浓缩后在喷雾干燥机进行喷雾干燥成干粉，把两者混合既得桑黄发酵菌丝体。
2.根据权利要求1所述的一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的种子培养条件为：温度28℃，摇床培养108h。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的脱落酸溶液的浓度为0.5～1.5ppm/L；脱落酸的浓度为步骤二中整个溶液浓度。
4.根据权利要求3所述的一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的液体培养基为常规综合pda液体培养基。
5.根据权利要求4所述的一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法，其特征在于：所述的真空浓缩的真空度0.09～0.1MPa，喷雾干燥工艺的入口温度136～141℃，出口温度81～82℃，蠕泵转速8r/min，风机转速906r/min，工作压力0.23～0.24 MPa。
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