CN104087629A - 利用超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法，属于食品加工技术领域。在菌丝发酵不同阶段（2~6d）进行超声波处理，超声波水浴26℃辅助桑黄菌菌丝体发酵，超声波处理的频率和功率分别设定为68kHz和600W。超声波处理时间为30min~90min，超声间歇比为20s/5s～30s/5s，对菌丝体胞内多糖含量进行了测定，可以显著提高桑黄菌菌丝体发酵过程中胞内多糖的产量（2.51%~22.67%），过程简单、高效。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，特别涉及一种利用超声波辅助桑黄菌菌丝发酵提高胞内多糖的方法。
背景技术
桑黄菌属于担子真菌在中医中是最重要的药用蘑菇之一。多年来桑黄菌在中国，日本，韩国等国家有着广泛的应用。近来，桑黄菌的药用价值备受全世界瞩目，同时吸引了大量的科研工作者致力于此。多糖被认为是桑黄菌中主要的活性成分，其显示出对健康影响和药理活性的广谱性，如抗肿瘤，免疫调节，抗氧化等药用功能。由于野生桑黄菌资源有限，桑黄菌菌丝体的固态和液态深层发酵成为该真菌资源的重要来源。对于获得菌丝体和稳定的生物活性产物如多糖，液态深层发酵相比于固态发酵更有效。因此，通过研究桑黄菌液态深层培养条件来开发一种新颖，高效获得桑黄菌多糖产物的方法成为备受关注的课题。
近年来，高强度的超声波作为一种经济，简单，有效的工业手段经常被用来提高活细胞生物产量和生物活性酶产量。有研究表明超声处理在促进细菌，真菌，和植物培养过程中产生有价值产物起着重要的作用。例如高强度的超声波（20 KHz）对牛奶发酵过程中的糖代谢有着积极的影响，并且在Bifidobacterium lactis发酵牛奶的后期可以促进主要的有机酸合成(Nguyen, Lee, & Zhou, 2012)。有研究表明一种间歇有效的高强度超声处理可以显著促进Trametes versicolor菌丝培养过程中漆酶的产量 (Wang, Ma, Guo, Zhuang, & Liu, 2013)。但是迄今为止通过利用超声波处理提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的文章或专利尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用高强度的间歇超声波来促进桑黄菌菌丝发酵胞内多糖的方法。
实现本发明的技术如下：
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种利用超声波来促进桑黄菌菌丝发酵胞内多糖的方法，按照下述步骤进行：
（1） 培养基及桑黄菌菌丝体培养条件
桑黄菌菌株（Phellinus igniarius），被接种在无菌PDA斜面（PDA培养基配方：马铃薯浸1000ml，葡萄糖 20g，琼脂 20g, pH自然）上26℃培养，一周后将从斜面上切除5块大约为5×5mm的菌丝，并接种于250ml的三角烧瓶中，其中含有100ml无菌种子培养基（PDA液体培养基配方：马铃薯浸1000ml，葡萄糖 20g，pH自然），摇床转速为130转/分钟，26℃培养 8天后利用均质器使培养液中菌丝球分散均匀作为种子液。将种子培养液按10%（v/v）接种量接种至含有100ml无菌发酵培养基的250ml三角烧瓶中，发酵培养基的组成成分（g/L）如下：小麦粉（50）， 麸皮（15），桑枝粉（10），KH2PO4 (2), MgSO4 (1). 三角烧瓶置于摇床上130转/分钟，26℃培养并进行超声波辅助处理。
（2）超声波处理
超声波水浴温度控制在26℃。超声波在菌丝发酵不同阶段（2~6d）进行处理，超声波处理的频率和功率分别设定为68 kHz和600W，超声波处理时间为30min~90min，超声间歇比为20 s/5 s～30 s/5 s。在超声处理结束后，迅速将样品返回至摇床上上持续培养，总发酵时间为8d。
本发明采用超声波技术辅助桑黄菌菌丝体发酵，对菌丝体胞内多糖含量进行了测定。经过超声波处理可以显著提高桑黄菌菌丝体发酵过程中胞内多糖的含量（2.51%~22.67%），过程简单、高效。
附图说明
图1为本发明所使用的超声设备图，其中1为电脑控制器；2为超声波发生器；3为水容器；4为样品；5为转换器；6为进水口；7为温控系统；8为出水口。
具体实施方式
本发明所使用的超声设备如图所示（图1）。超声波发生器2以及对应的可以拆卸的转换器5；电脑控制器1可以数字化设定超声波作用参数，超声波发生器2通过电脑控制器1进行控制；7为本发明中设备的温控系统，根据工作需要调节水容器3中的水温；温控水从入口6进入，从出口8流出。当进行超声波处理时，将样品4置于超声波转换器5的中心位
置，水容器3的水液面和样品4的培养液液面在同一水平。
本发明桑黄菌菌株（Phellinus igniarius）购自国家普通微生物菌种保藏中心编号为5.95。
本发明中多糖作为评价指标，其提取步骤为：
对照例
桑黄菌菌丝发酵全过程无超声处理。培养8天发酵结束后，菌丝通过离心（5000转，10分钟）收集，并用蒸馏水洗涤两次后冷冻干燥。干燥菌丝体研磨成粉末。提取多糖步骤如下：将预处理的干燥菌丝体粉末与10倍体积（V / W）蒸馏水提取在95℃下8小时提取三次。将上清液通过离心（5000转，10分钟）收集，浓缩，55℃旋转蒸发，并用4体积95％的乙醇于4℃过夜沉淀。大多数游离蛋白均通过Sevag方法（Sevag试剂是氯仿和正丁醇的混合溶液[V（氯仿）：V（正丁醇）=4:1]。将1倍体积Sevag试剂与4倍体积多糖水溶液混合,25℃充分搅拌1h，6700转30分钟离心，去除下层Sevag试剂和中层蛋白质，收集上层多糖溶液。重复处理8次。）除去，并在蒸馏水中进行透析（MWCO 8000-12000 Da，美国）48小时，收集截留液冷冻干燥，得到经过纯化的多糖。
实施例1
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为30min；超声间歇比为20s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第4天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例2
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为90min；超声间歇比为30s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第4天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例3
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为30min；超声间歇比为30s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第4天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例4
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为90min；超声间歇比为20s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第4天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例5
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为30min；超声间歇比为25s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第2天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例6
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为90min；超声间歇比为25s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第2天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例7
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为90min；超声间歇比为25s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第6天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例8
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为60min；超声间歇比为20s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第2天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例9
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为60min；超声间歇比为30s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第2天。发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。桑黄菌菌丝体胞内多糖含量见表1。
实施例10
发酵培养超声处理条件为：超声作用时间为60min；超声间歇比为25s/5s；超声作用的桑黄菌发酵阶段为第4天发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖提取方法同对照例。见表1。
表1 不同实施例桑黄菌菌丝体胞内多糖含量
从上表可以看出，桑黄菌菌丝体发酵经过超声波处理后，胞内多糖的含量有不同程度的提高，尤其是发酵培养超声处理条件为:超生作用时间为60min；超声间歇比为25s/5s；超生作用的桑黄菌发酵阶段为第4天发酵结束后桑黄菌菌丝体胞内多糖的含量相比对照有显著性提高22.67%。
Claims (4)
1.一种基于超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
桑黄菌菌株（Phellinus igniarius）被接种在无菌PDA斜面上26℃培养，一周后将从斜面上切除5块大约为5×5mm的菌丝，并接种于250ml的三角烧瓶中，其中含有100ml无菌种子培养基（PDA液体培养基配方：马铃薯浸1000ml，葡萄糖 20g，pH自然），摇床转速为130转/分钟，26℃培养 8天后利用均质器使培养液中菌丝球分散均匀作为种子液，将种子培养液按10%（v/v）接种量接种至含有100ml无菌发酵培养基的250ml三角烧瓶中，
（2）超声波处理
超声波水浴温度控制在26℃；超声波在菌丝发酵不同阶段（2~6d）进行处理，超声波处理的频率和功率分别设定为68 kHz和600W，超声波处理时间为30min~90min，超声间歇比为20 s/5 s～30 s/5 s；在超声处理结束后，迅速将样品返回至摇床上上持续培养，总发酵时间为8d。
2.根据权利要求1所述一种基于超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法，其特征在于PDA培养基配方如下：马铃薯浸1000ml，葡萄糖 20g，琼脂 20g, pH自然。
3.根据权利要求1所述一种基于超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法，其特征在于，其中无菌种子培养基为PDA液体培养基，配方为：马铃薯浸1000ml，葡萄糖 20g，pH自然。
4.根据权利要求1所述一种基于超声波技术提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖产量的方法，其特征在于，发酵培养基的组成成分（g/L）如下：小麦粉（50）， 麸皮（15），桑枝粉（10），KH2PO4 (2), MgSO4 (1). 三角烧瓶置于摇床上130转/分钟，26℃培养并进行超声波辅助处理。
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