CN104195197B - 一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法。该方法包括：通过生物复合酶法制得马银花叶酶解物，通过虎奶菌接种于添加有龙脑樟的培养基中培养制得龙脑樟降解物，在桑黄液体发酵培养第1天‑5天加入马银花叶酶解物和谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天‑6天后加入龙脑樟降解物和α‑蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天‑5天得到桑黄液体发酵液。本发明根据药用真菌桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性，产品附加值高，是一种极具工业化前景的方法。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。
由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄有效成分由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。
作为目前国际公认的抗癌效果最好的大型药用真菌，桑黄抑制肿瘤的研究主要集中在药理活性成分桑黄多糖上。
漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一种最简单的含铜的多酚氧化酶，它能够催化酚类化合物脱去羟基上的电子或者质子，从而形成自由基，导致木质素及酚类化合物裂解，同时氧被还原为水。漆酶是白腐菌分解木质素的主要酶源之一。
微生物发酵是一个十分复杂的生物化学反应过程。有些次生代谢产物的合成代谢非常复杂，发酵过程的细微差别都会引起产物代谢的不同响应。在真菌不同生长阶段用外源刺激物处理，其细胞生长和次级代谢产物的积累程度不同。因此，通过采用外源刺激物对代谢产物的生物合成进行调控是获得高活性目标产物的主要途径。
通过不同发酵阶段添加不同的复合外源刺激物同时促进桑黄多糖和漆酶产量，并提高其生物活性尚未见报道。
中国专利ZL200910229843.8公开了一种利用真菌诱导子提高桑黄黄酮产量的桑黄菌丝体液体发酵方法，其将真菌诱导子菌种接种活化培养后，取菌块接种培养过滤得到真菌诱导子菌丝体；然后烘干研磨破碎加入乙醇浸泡，过滤并收集滤渣，滤渣依次加入氯仿和正丁醇的混合液、丙酮、水冲洗，风干后干物质加入三氟乙酸，沸水浴0.5-2小时，然后过滤，取滤液中和、静置、0.45μm微孔滤膜过滤除菌，制成真菌诱导子，-10℃至-20℃冷冻保存；将桑黄菌种接种活化培养，后取菌块接种发酵培养；在桑黄液体发酵培养第1-5天，加入真菌诱导子继续培养得到桑黄菌丝体，该方法工艺简单、成本低、效果显著，可大幅度提高桑黄细胞黄酮含量，是一种极具工业化前景的生产方法。这种方法是以桑黄黄酮含量为指标，通过加入真菌诱导子培养得到桑黄菌丝体，以提高桑黄细胞黄酮含量。
中国专利申请CN201010226645.9公开了一种运用植物油用于药用真菌桑黄菌液体培养并提高桑黄菌丝量的方法。培养基初始pH控制在5.5-7.5，灭菌温度115℃-121℃，灭菌时间30min。在发酵初始添加质量浓度为0.5％-5％的不同种类的植物油，包括大豆油、橄榄油、菜籽油等，采用摇瓶发酵或发酵罐发酵工艺，接种量为5％-15％，培养温度为24℃-28℃。这种方法仅以桑黄菌丝量为唯一指标，通过在培养基中添加适量的植物油，油脂类物质在桑黄液体发酵中一方面可以作为消泡剂，另一方面可以作为碳源，可以提高桑黄菌丝体生物量。
中国专利申请CN201010151147.2公开了一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法。该技术是利用灵芝细胞的液体培养，通过在细胞生长的适宜阶段，加入真菌诱导子，诱导一定时间后，可显著提高灵芝漆酶产量，真菌诱导子诱导5-8天后，可使灵芝漆酶酶活最高达到1068.4U/L，是对照组的2.2倍。这种技术仅以生物量、黄酮等单一产物为目标，并未涉及根据药用真菌多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加特定的复合外源刺激物来同时促进桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，该方法通过在不同发酵阶段添加不同的复合外源刺激物有助于提高桑黄胞内多糖和漆酶产量，并促进代谢产物活性提高。
本发明采用的技术方案是：
一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，包括步骤：
(1)桑黄的液体发酵培养：将活化后的桑黄菌种接种于添加桑枝提取物的液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养；
(2)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：在桑黄液体发酵培养第1天-5天，加入占液体种子培养基体积0.02％-0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％-0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天-6天后，加入占液体种子培养基体积0.01％-0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％-0.08％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天-5天，得到桑黄液体发酵液。
本发明根据药用真菌桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性。
所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，所述的桑枝提取物的添加量为液体种子培养基体积的5％-10％。
本发明，添加的桑枝提取物等会溶解于液体种子培养基中，因此添加桑枝提取物前后的液体种子培养基总体积不变。
所述的桑枝提取物可以选用市售产品，优选采用以下制备方法制备的桑枝提取物，包括：
称取一定量的桑枝条，粉碎(优选过40目-100目)，先加占桑枝条重量8倍量-10倍量质量百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液在80℃-85℃浸提1.5h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量8倍量-10倍量水在95℃-100℃下浸提2h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。
所述的桑黄液体发酵培养的温度为20℃-30℃。
步骤(1)中，桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃-30℃，培养时间4天-10天。
所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO41g和MgSO40.5g，用水定容至1000mL。
步骤(2)中，所述的马银花叶酶解物的制备方法，包括：将马银花叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH4.0-5.5，加入由纤维素酶和半纤维素酶构成的第一复合酶，在40℃-50℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH5.0-7.0，加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于50℃-60℃进行酶解反应1小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到马银花叶酶解物。
所述的第一复合酶与马银花叶的质量比优选为1：30-50。
所述的第二复合酶与马银花叶的质量比优选为1：25-60。
所述的纤维素酶与半纤维素酶的质量比优选为1:2至4:1。
所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的质量比优选为1:3至2:1。
所述的中性蛋白酶的酶活力优选为20.0万U/g-30.0万U/g、木瓜蛋白酶的酶活力优选为100.0万U/g-200.0万U/g、半纤维素酶的酶活力优选为3.0万U/g-5.0万U/g、纤维素酶的酶活力优选为2.0万U/g-3.0万U/g。
将马银花叶加水磨成浆液的步骤中，马银花叶与水的重量比优选为1:3-6.0。所述的马银花叶可选用采摘后经清洗、真空冷冻干燥后的马银花叶。
所述的灭酶的条件依据酶失活的条件，一般为：90℃-95℃下灭酶5分钟-8分钟。
所述的马银花叶酶解物的制备方法中，优选：上清液用截留分子量为1kDa-3kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，得到马银花叶酶解物。
步骤(2)中，所述的龙脑樟降解物的制备方法，包括：将虎奶菌接种在添加有龙脑樟的培养基中培养3天-15天(培养温度可保持在自然的环境温度，如21℃-28℃的环境温度)，将培养物过滤，滤液经灭菌、浓缩和真空冷冻干燥得到龙脑樟降解物。
所述的添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
所述的虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)，又名核耳菇、菌核侧耳、茯苓侧耳、南洋获苓，是一种子实体和菌核均可食用的珍稀食用兼药用真菌。虎奶菌的菌丝浸染木材或树桩后，引起木材腐朽，并在地下、木材中或树根之间形成围径10cm-30cm的菌核。所述的虎奶菌菌种可采用任意一种虎奶菌菌种，可采用市售产品。例如虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)CGMCC No.5.731购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述的虎奶菌的菌种的接种量优选为3％-15％。
所述的接种量指接入的菌种体积或接入的培养好的种子液体积与培养基体积之比的百分数。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
本发明，从所述的桑黄液体发酵液中得到桑黄胞内多糖和漆酶，具体包括：将桑黄液体发酵液用多层纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取桑黄胞内多糖；滤液常温下离心，取离心上清液即为粗酶液。
桑枝，又称桑枝条，为桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝。春末夏初采收，去叶，晒干，或趁鲜切片，晒干。
马银花(学名:Rhododendron ovatum)，为杜鹃花科杜鹃属下的一个植物种。始记载于《中国高等植物图鉴》。本发明选用马银花的叶。
龙脑樟(C innamomum camphora(L.)Pres.l)为樟科Laturaceae樟属C innamomum植物的一个化学型，在樟树资源中自然分布的比例只有万分之一左右。龙脑樟是目前已发现的含有天然冰片的植物中鲜叶精油含量和精油中右旋龙脑含量最高的天然冰片新资源。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用药用真菌桑黄菌对桑树特有的寄主性，将桑枝提取物添加到液体种子液中，提高桑黄液体发酵的性能。
(2)根据桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，充分发挥马银花叶酶解物、谷氨酰胺、龙脑樟降解物及α-蒎烯各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性。本发明方法能够使胞内多糖产量达到425.5mg/L，是对照的1.51倍，漆酶活性达到26.69U/mL，是对照的1.55倍，产品附加值高，是一种极具工业化前景的生产方法。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
中性蛋白酶(酶活力为20.0万U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为100.0万U/g)、半纤维素酶(酶活力为5.0万U/g)、纤维素酶(酶活力为3.0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)CGMCC No.5.731购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1L液体种子培养基中接入2cm2大小的菌块(即活化后的桑黄菌种)。
实施例1
1.发酵培养
(1)外源刺激物的制备：
①马银花叶酶解物的制备方法：将采摘的马银花叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加300mL水，磨成浆液，95℃灭菌5min，使各种酶失活；调节浆液pH4.0，加入由1g纤维素酶和1g半纤维素酶构成的复合酶，在45℃进行酶解反应1.0小时，在95℃下灭酶6分钟；然后调节浆液pH6.0，加入由1.75g木瓜蛋白酶和1.75g中性蛋白酶构成的复合酶，于55℃进行酶解反应1.5h，在95℃下灭酶5分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得马银花叶酶解物；
②龙脑樟降解物的制备：将虎奶菌按15％的接种量接种在添加有龙脑樟的培养基中25℃培养10天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空冷冻得到龙脑樟降解物。
添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟28g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
(2)桑黄的液体发酵培养：
称取一定量的桑枝条，粉碎过40目，先加占桑枝条重量10倍量质量百分浓度为70％的乙醇水溶液在80℃浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量8倍量水在95℃下浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间7天，然后取菌块接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基，1L添加有桑枝提取物的液体种子培养基组成为桑枝提取物5％(体积百分比)、葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然；25℃进行桑黄液体发酵培养。
(3)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：
在桑黄液体发酵培养第3天，加入占液体种子培养基体积0.02％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.05％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天后，加入占液体种子培养基体积0.01％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.03％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养5天，得到桑黄液体发酵液。
(4)将桑黄液体发酵液用8层纱布过滤，过滤后菌丝体用于提取桑黄胞内多糖；滤液常温下8000r/min、离心10min，取离心上清液即为粗酶液。
2测定
(1)菌丝生物量的测定
发酵后菌丝体经8层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，称重。
(2)胞内多糖含量的测定
称取适量菌丝体干粉，置于烧杯中，按料液比1:10(质量比)加入蒸馏水，90℃浸提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，50℃下减压浓缩，浓缩液加入4倍体积无水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min、20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀用蒸馏水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即胞内多糖含量。
(3)胞内多糖对DPPH自由基清除能力的测定
取2mL5mg/mL待测样品于试管中，加入2mL0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液(用质量百分浓度95％乙醇水溶液配制)，充分摇匀，室温静置35min，在517nm波长处测定吸光值。以VC为对照，每组做3个重复，求其平均值。计算公式如下:
式中，A1：加入样品后的吸光值；A2：样品本底吸光值；A0：空白吸光值。
(4)胞内多糖对超氧阴离子自由基清除能力的测定
采用邻苯三酚自氧化法。取Tris－HCl缓冲溶液4.5mL，在25℃恒温水浴中保温20min，加入邻苯三酚(25℃预热)，快速振荡混匀，在325nm波长下，每隔0.5min记录一次值，连续记录3min。样品在同样条件下测定吸光值。以VC为对照，每组做3个重复，求其平均值。计算公式如下:
式中，A1：加入样品后的吸光值；A2：样品本底吸光值；A0：空白吸光值。
(5)胞内多糖对羟自由基(.OH)清除能力的测定
利用Fenton反应产生的羟基自由基可氧化水杨酸，使水杨酸产生有色物质，在510nm处有强吸收峰。于2mL5mg/mL待测样品水溶液中加入2mL FeSO4水溶液(6mmol/L)、2mLH2O2(6mmol/L)水溶液，充分摇匀，静置10min。加入6mmol/L的水杨酸水溶液2mL，充分摇匀，静置30min，在510nm处测定其吸光度值。以VC作阳性对照，每个处理试样均做三个平行实验。
计算公式如下:
式中，A1：加入样品后的吸光值；A2：样品本底吸光值；A0：空白吸光值。
(6)桑黄漆酶的提取和检测：
将桑黄液体发酵液经多层纱布过滤，8000r/min离心10min，取上清液，即得漆酶粗酶液。
酶活测定利用漆酶氧化ABTS(2,2＇-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))，用可见紫外分光光度计测定波长420nm处0-3min内吸光度值随时间的变化，求得漆酶反应速率，进而推算酶活。用等体积5mmol/L的ABTS水溶液和酶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加，每分钟使1μmol的ABTS转化所需的酶量为1个活力单位(U)。定义:每1min氧化1μmol的ABTS所需的酶量为1个酶活单位。
检测结果见表1-表2。
实施例2
1.发酵培养
(1)外源刺激物的制备：
①马银花叶酶解物的制备方法：将采摘的马银花叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加600mL水，磨成浆液，90℃灭菌8min，使各种酶失活；调节浆液pH5.5，加入由1.1g纤维素酶和2.2g半纤维素酶构成的复合酶，在40℃进行酶解反应1.5小时，在90℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH5.0，加入由0.5g木瓜蛋白酶和1.5g中性蛋白酶构成的复合酶，于50℃进行酶解反应1h，在90℃下灭酶8分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得马银花叶酶解物；
②龙脑樟降解物的制备：将虎奶菌按10％的接种量接种在添加有龙脑樟的培养基中21℃培养7天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空冷冻得到龙脑樟降解物。
添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟30g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
(2)桑黄的液体发酵培养：
称取一定量的桑枝条，粉碎过60目，先加占桑枝条重量10倍量质量百分浓度为80％的乙醇水溶液在85℃浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量10倍量水在100℃下浸提2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，然后取菌块接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基，1L添加有桑枝提取物的液体种子培养基组成为桑枝提取物9％(体积百分比)、葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。28℃进行桑黄液体发酵培养。
(3)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：
在桑黄液体发酵培养第2天，加入占液体种子培养基体积0.2％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养4天后，加入占液体种子培养基体积0.03％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养4天，得到桑黄液体发酵液。
(4)将桑黄液体发酵液用8层纱布过滤，过滤后菌丝体用于提取桑黄胞内多糖；滤液常温下8000r/min、离心10min，取离心上清液即为粗酶液。
2测定
测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。
实施例3
1.发酵培养
(1)外源刺激物的制备：
①马银花叶酶解物的制备方法：将采摘的马银花叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加400mL水，磨成浆液，92℃灭菌6min，使各种酶失活；调节浆液pH4.5，加入由2g纤维素酶和0.5g半纤维素酶构成的复合酶，在50℃进行酶解反应0.5小时，在93℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH7.0，加入由1.12g木瓜蛋白酶和0.56g中性蛋白酶构成的复合酶，于60℃进行酶解反应1.2h，在92℃下灭酶6分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得马银花叶酶解物；
②龙脑樟降解物的制备：将虎奶菌按8％的接种量接种在添加有龙脑樟的培养基中23℃培养5天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空冷冻得到龙脑樟降解物。
添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟20g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
(2)桑黄的液体发酵培养：
称取一定量的桑枝条，粉碎80目，先加占桑枝条重量9倍量质量百分浓度为75％的乙醇水溶液在82℃浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量9倍量水在97℃下浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度28℃，培养时间5天，然后取菌块接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基，1L添加有桑枝提取物的液体种子培养基组成为桑枝提取物10％(体积百分比)、葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。22℃进行桑黄液体发酵培养。
(3)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：
在桑黄液体发酵培养第5天，加入占液体种子培养基体积0.1％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.08％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养1天后，加入占液体种子培养基体积0.2％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.02％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养4天，得到桑黄液体发酵液。
(4)将桑黄液体发酵液用8层纱布过滤，过滤后菌丝体用于提取桑黄胞内多糖；滤液常温下8000r/min、离心10min，取离心上清液即为粗酶液。
2测定
测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。
实施例4
1.发酵培养
(1)外源刺激物的制备：
①马银花叶酶解物的制备方法：将采摘的马银花叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加350mL水，磨成浆液，93℃灭菌7min，使各种酶失活；调节浆液pH5.0，加入由1.9g纤维素酶和0.95g半纤维素酶构成的复合酶，在48℃进行酶解反应1小时，在95℃下灭酶5分钟；然后调节浆液pH5.5，加入由1.33g木瓜蛋白酶和2.67g中性蛋白酶构成的复合酶，于58℃进行酶解反应1h，在95℃下灭酶8分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得马银花叶酶解物；
②龙脑樟降解物的制备：将虎奶菌按5％的接种量接种在添加有龙脑樟的培养基中26℃培养6天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空冷冻得到龙脑樟降解物。
添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟35g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
(2)桑黄的液体发酵培养：
桑枝提取物同实施例2。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间6天，然后取菌块接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基，1L添加有桑枝提取物的液体种子培养基组成为桑枝提取物8％(体积百分比)、葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。20℃进行桑黄液体发酵培养。
(3)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：
在桑黄液体发酵培养第4天，加入占液体种子培养基体积0.4％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.03％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养1天后，加入占液体种子培养基体积0.4％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.05％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天，得到桑黄液体发酵液。
(4)将桑黄液体发酵液用8层纱布过滤，过滤后菌丝体用于提取桑黄胞内多糖；滤液常温下8000r/min、离心10min，取离心上清液即为粗酶液。
2测定
测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。
实施例5
1.发酵培养
(1)外源刺激物的制备：
①马银花叶酶解物的制备方法：将采摘的马银花叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加500mL水，磨成浆液，95℃灭菌5min，使各种酶失活；调节浆液pH4.8，加入由1.65g纤维素酶和0.55g半纤维素酶构成的复合酶，在43℃进行酶解反应1.5小时，在95℃下灭酶8分钟；然后调节浆液pH6.5，加入由1.5g木瓜蛋白酶和1g中性蛋白酶构成的复合酶，于52℃进行酶解反应1.5h，在90℃下灭酶6分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得马银花叶酶解物；
②龙脑樟降解物的制备：将虎奶菌按3％的接种量接种在添加有龙脑樟的培养基中28℃培养3天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空冷冻得到龙脑樟降解物。
添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟15g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
(2)桑黄的液体发酵培养：
桑枝提取物同实施例3。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度23℃，培养时间4天，然后取菌块接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基，1L添加有桑枝提取物的液体种子培养基组成为桑枝提取物6％(体积百分比)、葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。30℃进行桑黄液体发酵培养。
(3)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：
在桑黄液体发酵培养第1天，加入占液体种子培养基体积0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养1天后，加入占液体种子培养基体积0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.08％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养3天，得到桑黄液体发酵液。
(4)将桑黄液体发酵液用8层纱布过滤，过滤后菌丝体用于提取桑黄胞内多糖；滤液常温下8000r/min、离心10min，取离心上清液即为粗酶液。
2测定
测定方法同实施例1。检测结果见表1-表2。
对照例
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L和MgSO40.5g/L，余量为水。pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将实施例4中活化后的桑黄菌种接入灭菌后液体种子培养基中，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO41g/L和MgSO40.5g/L。pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，120r/min摇床中培养12d。每个试验设3个平行。
检测结果见表1-表2。
表1桑黄液体发酵代谢产物产量检测结果
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。
表2桑黄液体发酵胞内多糖抗氧化检测结果
注：与空白对照组比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。
由表1-表2的数据显示，本发明根据药用真菌桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶的产量及生物活性。与常规培养方法相比，采用本发明方法液体发酵培养的桑黄代谢产物中胞内多糖产量提高了37.3％-50.8％，漆酶活性提高了37.5％-54.8％，胞内多糖抗氧化活性提高了21.27％-56.12％。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响桑黄液体发酵代谢产物产量及产物活性的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现桑黄液体发酵代谢产物产量及产物活性的提高。在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)桑黄的液体发酵培养：将活化后的桑黄菌种接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养；
(2)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：在桑黄液体发酵培养第1天-5天，加入占液体种子培养基体积0.02％-0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％-0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天-6天后，加入占液体种子培养基体积0.01％-0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％-0.08％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天-5天，得到桑黄液体发酵液；
将桑黄液体发酵液用多层纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取桑黄胞内多糖；滤液常温下离心，取离心上清液即为粗酶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的桑枝提取物的添加量为液体种子培养基体积的5％-10％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的桑枝提取物的制备方法，包括：称取一定量的桑枝条，粉碎，先加占桑枝条重量8倍量-10倍量质量百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液在80℃-85℃浸提1.5h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量8倍量-10倍量水在95℃-100℃下浸提2h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的桑黄液体发酵培养的温度为20℃-30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的马银花叶酶解物的制备方法，包括：将马银花叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH4.0-5.5，加入由纤维素酶和半纤维素酶构成的第一复合酶，在40℃-50℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH5.0-7.0，加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于50℃-60℃进行酶解反应1小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到马银花叶酶解物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的第一复合酶与马银花叶的质量比为1：30-50；所述的第二复合酶与马银花叶的质量比为1：25-60。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶与半纤维素酶的质量比为1:2至4:1。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的质量比为1:3至2:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的龙脑樟降解物的制备方法，包括：将虎奶菌接种在添加有龙脑樟的培养基中培养3天-15天，将培养物过滤，滤液经灭菌、浓缩和干燥得到龙脑樟降解物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的添加有龙脑樟的培养基组成为：龙脑樟15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410398817.9A CN104195197B (zh) | 2014-08-14 | 一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法 |
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| CN104195197A CN104195197A (zh) | 2014-12-10 |
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| CN102875225A (zh) * | 2012-09-20 | 2013-01-16 | 福建农林大学 | 桑黄菌株液体发酵培养基和发酵产桑黄多糖的方法 |
| CN103820333A (zh) * | 2014-03-10 | 2014-05-28 | 陕西省微生物研究所 | 一种提高桑黄发酵菌丝体产量的液体发酵方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 丁香桑黄胞外漆酶的分离纯化与性质研究;王珊珊 等;《第十届全国食用菌学水研讨会会议论文集》;20140321;205-213 * |
| 桑黄漆酶发酵条件的优化及其分离纯化;陈晓平 等;《食品与发酵科技》;20131225;第49卷(第6期);22-26 * |
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